JPS611384A - Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 - Google Patents
Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法Info
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- JPS611384A JPS611384A JP59122818A JP12281884A JPS611384A JP S611384 A JPS611384 A JP S611384A JP 59122818 A JP59122818 A JP 59122818A JP 12281884 A JP12281884 A JP 12281884A JP S611384 A JPS611384 A JP S611384A
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- dna
- acetylneuraminic acid
- acetylneuraminic
- escherichia coli
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
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- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ産生遺伝子
を含奔する新規な大腸菌を用いるＮ−アセチルノイラミ
ン酸リアーゼの製造法に関する。
を含奔する新規な大腸菌を用いるＮ−アセチルノイラミ
ン酸リアーゼの製造法に関する。
従来技術
Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（Ｅ Ｃ４，Ｃ３，
３，以下ＮＡリアーゼと略記する）はＮ−アセチルノイ
ラミン酸をＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸に分
解する酵素である。また、このＮＡＩＪアーゼは血清等
の生体中のシアル酸含有物質の定量に用いられることは
よく知られている。
３，以下ＮＡリアーゼと略記する）はＮ−アセチルノイ
ラミン酸をＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸に分
解する酵素である。また、このＮＡＩＪアーゼは血清等
の生体中のシアル酸含有物質の定量に用いられることは
よく知られている。
Ｎ Ａ ＩＪアーゼは、動物組織およびガス壊痕菌（Ｃ
ｌｏＳｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ）
、コレラ菌（Ｖｉｂｒ。
ｌｏＳｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ）
、コレラ菌（Ｖｉｂｒ。
ｃｈｏｌｅｒａｅ）等の病原性微生物、および各種の非
病原性微生物等に存在することが知られている。
病原性微生物等に存在することが知られている。
発明が解決しようとする問題点
これらの微生物は、一般の酵素生産に利用される培地で
培養してもその生産量は極めて少量に留まり、培地中に
Ｎ−アセチルノイラミン酸を存在させるときにのみ本酵
素の生産量が上昇することが報告されている（特公昭５
６−５４１５３．特公昭５６−５１７５１）。然るに、
このＮ−アセチルノイラミン酸を大量に使用することは
経済的に不利であり、ＮΔリアーゼの生産にＮ−アセチ
ルノイラミン酸を必要としない微生物を用いる方法の開
発が望まれている。
培養してもその生産量は極めて少量に留まり、培地中に
Ｎ−アセチルノイラミン酸を存在させるときにのみ本酵
素の生産量が上昇することが報告されている（特公昭５
６−５４１５３．特公昭５６−５１７５１）。然るに、
このＮ−アセチルノイラミン酸を大量に使用することは
経済的に不利であり、ＮΔリアーゼの生産にＮ−アセチ
ルノイラミン酸を必要としない微生物を用いる方法の開
発が望まれている。
問題点を解決するための手段
かかる状況に鑑み、工業的に安価にＮＡＩＪアーセを製
造する方法について種々検討した結果、ＮΔリアーセ活
性を有するエシェリヒア・コリよりＮＡリアーゼの遺伝
情報を担うデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を単離し、次い
でこのＮＡＩＪアーゼの遺伝情報を担うＤＮＡをベクタ
ーに組み込ませ、この組み換えＤＮＡをエシェリヒア・
コリに導入することによって得られた微生物がＮ−アセ
チルノイラミン酸の培地への添加なしにＮＡリアーセを
生産することが見出された。
造する方法について種々検討した結果、ＮΔリアーセ活
性を有するエシェリヒア・コリよりＮＡリアーゼの遺伝
情報を担うデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を単離し、次い
でこのＮＡＩＪアーゼの遺伝情報を担うＤＮＡをベクタ
ーに組み込ませ、この組み換えＤＮＡをエシェリヒア・
コリに導入することによって得られた微生物がＮ−アセ
チルノイラミン酸の培地への添加なしにＮＡリアーセを
生産することが見出された。
以下に本発明の詳細な説明する。
ＮＡＩＪアーゼの遺伝情報を担うＤＮＡ（以下、染色体
ＤＮＡと称する）のエシェリヒア・コリからの単離は常
法に従って、例えばＢｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ａｃｔａ、 Ｖｏｌ、 ７２． ｐｐ６１９−６２９
（１９６３）に記載のフェノール法により行うことがで
きる。上記のＤＮＡ供与体としては、ＮΔリアーゼ生産
能を有するエシェリヒア・コリであれば、すべて使用可
能である。
ＤＮＡと称する）のエシェリヒア・コリからの単離は常
法に従って、例えばＢｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ａｃｔａ、 Ｖｏｌ、 ７２． ｐｐ６１９−６２９
（１９６３）に記載のフェノール法により行うことがで
きる。上記のＤＮＡ供与体としては、ＮΔリアーゼ生産
能を有するエシェリヒア・コリであれば、すべて使用可
能である。
次いで、上記で得られたＤＮＡをベクターＤＮＡに組み
込んで組み換えＤＮＡを調製する。染色体ＤＮＡのベク
ターＤＮＡの組み込みは常法に従って、例えば染色体Ｄ
ＮＡ及びベクターＤＮＡを制限酵素で切断して染色体Ｄ
ＮＡ断片及びベクターＤＮＡ断片を調製したのち、両者
の混合物をＤＮＡリガーゼで処理することにより行うこ
とができる。
込んで組み換えＤＮＡを調製する。染色体ＤＮＡのベク
ターＤＮＡの組み込みは常法に従って、例えば染色体Ｄ
ＮＡ及びベクターＤＮＡを制限酵素で切断して染色体Ｄ
ＮＡ断片及びベクターＤＮＡ断片を調製したのち、両者
の混合物をＤＮＡリガーゼで処理することにより行うこ
とができる。
ここで用いられるベクターＤＮＡとしては、エシェリヒ
ア・コリを宿主とするｐＢＲ３２２プラスミド、コリリ
ンＥ１プラスミド、ラムダファージなどが挙げられ、と
りわけｐＢＲ３２２プラスミドが好適に用いられる。ま
た制限酵素としては、例えばＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂａ’ｍ
ＨＩ、ＥｃｏＲＩ。
ア・コリを宿主とするｐＢＲ３２２プラスミド、コリリ
ンＥ１プラスミド、ラムダファージなどが挙げられ、と
りわけｐＢＲ３２２プラスミドが好適に用いられる。ま
た制限酵素としては、例えばＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂａ’ｍ
ＨＩ、ＥｃｏＲＩ。
ＰｓｔＩ、５ａｌｌなどが挙げられ、とりわけＨｉ ｎ
ｄ ＩＩＩが好適に用いられる。更にＤＮＡ ’Ｊガ
ー七としては、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼが好
適に用いられる。
ｄ ＩＩＩが好適に用いられる。更にＤＮＡ ’Ｊガ
ー七としては、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼが好
適に用いられる。
次いで、上記方法で得られた組み換えＤＮＡは常法によ
ってＮΔリアーゼ欠損株に導入することができる。
ってＮΔリアーゼ欠損株に導入することができる。
ＮΔリアーゼの欠損した変異株を取得するに当たっては
、まずエシェリヒア・コリ野生株（例えばエシェリヒア
・コリＣ６００−３Ｆ８）に変異を誘起せしめて、Ｎ−
アセチルノイラミン酸を資化できない変異株を取得する
。変異の誘起は通常の変異誘起処理、例えばＮ−メチル
−Ｎ’−ニトロソ Ｎ−ニトロソグアニジンの如き変異
誘起剤で処理することにより実施できる。
、まずエシェリヒア・コリ野生株（例えばエシェリヒア
・コリＣ６００−３Ｆ８）に変異を誘起せしめて、Ｎ−
アセチルノイラミン酸を資化できない変異株を取得する
。変異の誘起は通常の変異誘起処理、例えばＮ−メチル
−Ｎ’−ニトロソ Ｎ−ニトロソグアニジンの如き変異
誘起剤で処理することにより実施できる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸を資化できない変異株の取得
は変異処理して得られた菌体をクルコース最少培地（例
えば、グルコース２ｇ／Ｌ（ＮＨ＝）２ＳＯ−１ｇ／
１２． Ｋ２ＨＰＯ−７ｇ／ Ｒ，ＫＨ−ＰＯ−３ｇ／
Ａ、 Ｍｇ５Ｏ，４Ｈ２００，１ｇ／Ｌチアミン５μ
ｇ／＋ｎｌ、スレオニン０．２ｍＭ、ロイシン０．２
ｍ Ｍ 。
は変異処理して得られた菌体をクルコース最少培地（例
えば、グルコース２ｇ／Ｌ（ＮＨ＝）２ＳＯ−１ｇ／
１２． Ｋ２ＨＰＯ−７ｇ／ Ｒ，ＫＨ−ＰＯ−３ｇ／
Ａ、 Ｍｇ５Ｏ，４Ｈ２００，１ｇ／Ｌチアミン５μ
ｇ／＋ｎｌ、スレオニン０．２ｍＭ、ロイシン０．２
ｍ Ｍ 。
寒天１５ｇ／Ａの組成の培地）で培養する。その後、生
じたコｒ］ニーをグルコース最少培地とＮ−アセチルノ
イラミン酸最少培地（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン
酸０．２％、 （ＮＨ，）２ＳＯ，ｌ ｇ／β。
じたコｒ］ニーをグルコース最少培地とＮ−アセチルノ
イラミン酸最少培地（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン
酸０．２％、 （ＮＨ，）２ＳＯ，ｌ ｇ／β。
Ｋ、ＩＩＰｏ、 ７ ｇ ／β、 Ｋ１１２Ｐ０．
３ ｇ ／β、 ＭｇＳ［］４・７Ｈ２００、］、
ｇ ／ Ｉ 、チアミン５ μｇ ／ｍｌ 、スレオニ
ン０．２ｍＭ、ｏイシンｏ、２ｍＭ、寒天１５ｇ／βの
組成の培地）にレプリカレ、り゛ルコース最少培地で生
育できて、Ｎ−アセチルノイラミン酸最少培地で生育で
きないコロニーを釣菌分離することにより行う。かくし
て得られるＮΔリアーゼ欠損株の例としては、例えばエ
シェリヒア・コリ（ＩＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏ１
１ ） Ｑ−２が挙げられる。
３ ｇ ／β、 ＭｇＳ［］４・７Ｈ２００、］、
ｇ ／ Ｉ 、チアミン５ μｇ ／ｍｌ 、スレオニ
ン０．２ｍＭ、ｏイシンｏ、２ｍＭ、寒天１５ｇ／βの
組成の培地）にレプリカレ、り゛ルコース最少培地で生
育できて、Ｎ−アセチルノイラミン酸最少培地で生育で
きないコロニーを釣菌分離することにより行う。かくし
て得られるＮΔリアーゼ欠損株の例としては、例えばエ
シェリヒア・コリ（ＩＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏ１
１ ） Ｑ−２が挙げられる。
組み換えＤＮＡの上記Ｎ△リアーゼ欠損株Δ−の導入は
常法に従って行うことが出来、例えばＪ。
常法に従って行うことが出来、例えばＪ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 Ｖｏｌ、 １１９． ｐｐ１
０７２−１０７４ （１９７４）に記載のカルシウムイ
オン処理法により行うことができる。組み換えＤＮＡ（
すなわち、ＮΔリアーゼの遺伝情報を担うＤＮＡを組み
込んだベクターＤＮＡ）を含有する菌株の選択方法は、
当該組み換えＤＮＡを調製するに際して使用した制限酵
素やベクターＤＮＡの種類によっても異なるが、制限酵
素としでＨｉ ｎ ｄ ｍを用い、ベクターＤＮＡとし
てｐＢＲ３２２プラスミドを用いた場合には、次の如く
して行うことができる。すなわち、菌株をアンピンリン
を含むＮ−アセチルノイラミン酸最少培地に培養し、生
じたコロニーを釣菌分離することにより第一次選択する
。次いてＮΔリアーゼ活性の有無で最終的に確認する。
０７２−１０７４ （１９７４）に記載のカルシウムイ
オン処理法により行うことができる。組み換えＤＮＡ（
すなわち、ＮΔリアーゼの遺伝情報を担うＤＮＡを組み
込んだベクターＤＮＡ）を含有する菌株の選択方法は、
当該組み換えＤＮＡを調製するに際して使用した制限酵
素やベクターＤＮＡの種類によっても異なるが、制限酵
素としでＨｉ ｎ ｄ ｍを用い、ベクターＤＮＡとし
てｐＢＲ３２２プラスミドを用いた場合には、次の如く
して行うことができる。すなわち、菌株をアンピンリン
を含むＮ−アセチルノイラミン酸最少培地に培養し、生
じたコロニーを釣菌分離することにより第一次選択する
。次いてＮΔリアーゼ活性の有無で最終的に確認する。
かくして得られた組み換えＤＮＡを含有する微生物の例
としては、例えばエシェリヒア・コリ（ｌＥｓｃｈｃｒ
ｉｃｈｉａ Ｃｏ１１ ）１（３，−４（微工研条寄第
５１３号）が挙げられる。
としては、例えばエシェリヒア・コリ（ｌＥｓｃｈｃｒ
ｉｃｈｉａ Ｃｏ１１ ）１（３，−４（微工研条寄第
５１３号）が挙げられる。
〔Ｎ−アセチルノイラミン酸すアーセの製造〕上記の如
くして取得した本発明の微生物は培養すれば菌体内にＮ
ＡＩＪアーゼを暑中生成蓄積する。
くして取得した本発明の微生物は培養すれば菌体内にＮ
ＡＩＪアーゼを暑中生成蓄積する。
不発明徴生物の培養に用いられる培地としては、炭素源
、窒素源、無機物を含有する合成培地または天然培地の
いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコー
ス、シュクロース１．フラクトース、でん粉、でん粉加
水分解物、糖蜜などの種々の炭水化物が用いられ、その
使用量は５〜５０ｇ／Ａ’程度が好ましい。また窒素源
としては、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム１炭酸アンモニウＡ、酢酸アンモニウムなどの各種の
無機および有機アンモニウム塩類、あるいはペプトン、
酵母エキス、コーンスチープリカー、カセイン加水分解
物などの窒素含有有機物などが用いられ、その使用量は
５〜２０ｇ／Ａ程度が好ましい。更に無機物としては、
例えばリン酸第−水素カリウｌ、、ＩＪン酸第二カリウ
ム、硫酸マグネンウム、硫酸マンガンなどが用いられ、
その使用量は０．０５〜５ｇ／β程度が好ましい。
、窒素源、無機物を含有する合成培地または天然培地の
いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコー
ス、シュクロース１．フラクトース、でん粉、でん粉加
水分解物、糖蜜などの種々の炭水化物が用いられ、その
使用量は５〜５０ｇ／Ａ’程度が好ましい。また窒素源
としては、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム１炭酸アンモニウＡ、酢酸アンモニウムなどの各種の
無機および有機アンモニウム塩類、あるいはペプトン、
酵母エキス、コーンスチープリカー、カセイン加水分解
物などの窒素含有有機物などが用いられ、その使用量は
５〜２０ｇ／Ａ程度が好ましい。更に無機物としては、
例えばリン酸第−水素カリウｌ、、ＩＪン酸第二カリウ
ム、硫酸マグネンウム、硫酸マンガンなどが用いられ、
その使用量は０．０５〜５ｇ／β程度が好ましい。
培養は振とう培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条
件下に行われる。培養温度は２５〜３７℃が好適であり
、培養期間は通常１６〜４８時間程度で完了する。
件下に行われる。培養温度は２５〜３７℃が好適であり
、培養期間は通常１６〜４８時間程度で完了する。
培養を終了した菌体からＮＡＩＪガーゼを精製するに当
たっては、上記培養液から遠心分離等の方法で菌体を集
め、得られた菌体を超音波処理、ガラスピーズを用いる
摩砕処理、フレンチプレス処理等によって破砕し、酵素
を抽出する。抽出液はこれを硫安堰折法、イオン交換樹
脂を用いるクロマトグラフィー、ゲル濾過法等の常法に
より処理して、精製Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ
を得ることができる。
たっては、上記培養液から遠心分離等の方法で菌体を集
め、得られた菌体を超音波処理、ガラスピーズを用いる
摩砕処理、フレンチプレス処理等によって破砕し、酵素
を抽出する。抽出液はこれを硫安堰折法、イオン交換樹
脂を用いるクロマトグラフィー、ゲル濾過法等の常法に
より処理して、精製Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ
を得ることができる。
以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明する。
実施例１゜
（１）ＮＡ！Ｊアーゼの遺伝情報を担う染色体ＤＮＡの
調製 エシェリヒア・コリＫＹ８４８２をＬ−培地（グルコー
ス１ｇ／Ｉｔ、）リプトン１０ｇ／ｊ！。
調製 エシェリヒア・コリＫＹ８４８２をＬ−培地（グルコー
ス１ｇ／Ｉｔ、）リプトン１０ｇ／ｊ！。
酵母エキス５ｇ／１．塩化ナトリウム５ｇ／１２゜ｐＨ
７，２） ３００ｎ＋１中、２８℃で１６時時間表う培
養して得られた菌体を集洗菌後、５ａｉｔｏ ＆Ｍｉｕ
ｒａの方法（Ｂｉ６ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃ
ｔａ、 ７２゜６１９−６２９ （１９６３））でフェ
ノール処理し、染色体ＤＮＡ約２＋ｎｇを得た。
７，２） ３００ｎ＋１中、２８℃で１６時時間表う培
養して得られた菌体を集洗菌後、５ａｉｔｏ ＆Ｍｉｕ
ｒａの方法（Ｂｉ６ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃ
ｔａ、 ７２゜６１９−６２９ （１９６３））でフェ
ノール処理し、染色体ＤＮＡ約２＋ｎｇを得た。
（２）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体Ｄ Ｎ Ａ ２．６μｇをとり、制限エンドヌ
クレアーゼＨｉｎｄＩＩＩと２時間反応させた。また、
ベクターとして使用するｐＢＲ３２２（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製
。
た染色体Ｄ Ｎ Ａ ２．６μｇをとり、制限エンドヌ
クレアーゼＨｉｎｄＩＩＩと２時間反応させた。また、
ベクターとして使用するｐＢＲ３２２（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製
。
ＵＳＡ）２．６μｇも）ｌｉｎｄＩＩＩと２時間反応さ
せ、完全に切断した。両反応液を各々６５℃。
せ、完全に切断した。両反応液を各々６５℃。
１０分間加熱処理した後、両反応液を混合し、Ｔ、ファ
ージ由来のＤＮＡ’Ｊガーゼで４℃。
ージ由来のＤＮＡ’Ｊガーゼで４℃。
１６時間連結反応を行った。次いで、反応液を６５℃、
１０分間加熱した後、この溶液をＤＮＡ溶液とした。
１０分間加熱した後、この溶液をＤＮＡ溶液とした。
（３）ＮＡ！Ｊアーゼの遺伝情報を担ったプラスミドに
よる形質転換 エシェリヒア・コリＣ６００−３Ｆ８より変異誘導した
ＮＡリアーゼ欠損株０−２をＬ−培地４０ｍ１にて対数
増殖中期（ＣＤ６．ｏ＝約０．４０）まで生育させた後
、０．１Ｍ塩化カルシウム溶液で洗浄後、同溶液１ｍｌ
に再懸濁させた。この懸濁液０．１５ｍ１に（２）で得
たＤＮＡ溶液を加え、０℃にて３０分間保持した後、３
７℃で２０分間加熱してＤＮＡを細胞内に取り込ませた
。次いで、この懸濁液をＬ−培地１．５ｍｌに接種し、
２時間振とう培養した。菌体を集洗菌後、２０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含むＮ−アセチルノイラミン酸最少
培地（Ｎ−アセチルノイラミン酸２ｇ／１２． （ＮＨ
４）２ＳＯ４１ｇ／Ｉｌ、 Ｋ２ＨＰＯ４’Ｉｇ／Ｉ
ｔＫＨ２ＰＯ４３ｇ／β、 Ｍｇ５Ｏ＜・７ｏａｏｏ
、１ｇ＃。
よる形質転換 エシェリヒア・コリＣ６００−３Ｆ８より変異誘導した
ＮＡリアーゼ欠損株０−２をＬ−培地４０ｍ１にて対数
増殖中期（ＣＤ６．ｏ＝約０．４０）まで生育させた後
、０．１Ｍ塩化カルシウム溶液で洗浄後、同溶液１ｍｌ
に再懸濁させた。この懸濁液０．１５ｍ１に（２）で得
たＤＮＡ溶液を加え、０℃にて３０分間保持した後、３
７℃で２０分間加熱してＤＮＡを細胞内に取り込ませた
。次いで、この懸濁液をＬ−培地１．５ｍｌに接種し、
２時間振とう培養した。菌体を集洗菌後、２０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含むＮ−アセチルノイラミン酸最少
培地（Ｎ−アセチルノイラミン酸２ｇ／１２． （ＮＨ
４）２ＳＯ４１ｇ／Ｉｌ、 Ｋ２ＨＰＯ４’Ｉｇ／Ｉ
ｔＫＨ２ＰＯ４３ｇ／β、 Ｍｇ５Ｏ＜・７ｏａｏｏ
、１ｇ＃。
チアミン５ ｐ ｇ ／ｍｌ 、スレオニン０．２ｍＭ
、ロイシン０．２ ｍ Ｍ 、寒天１５ｇ／ｊ’、ｐＨ
７，０）に塗布し、３０℃で２日間培養した。生じたコ
ロニーについて更に菌体内のＮＡＩＪアーセ活性を検討
し、形質転換株Ｈ３−４を取得した。
、ロイシン０．２ ｍ Ｍ 、寒天１５ｇ／ｊ’、ｐＨ
７，０）に塗布し、３０℃で２日間培養した。生じたコ
ロニーについて更に菌体内のＮＡＩＪアーセ活性を検討
し、形質転換株Ｈ３−４を取得した。
実施例２゜
下記第１表に示す菌株をＬ−培地および１ｇ／Ｒ。
のＮ−アセチルノイラミン酸を含むし一培地に接種し、
３０℃で１８時間振とう培養した。培養終了後、遠心分
離により菌体を集め、０．８５％生理食塩水で洗浄後、
菌体を超音波処理により破砕し、菌体抽出液を調製し、
その抽出液中のＮＡ’Ｊアーゼ活性を測定した。その結
果は下記第１表の通りであり、形質転換株Ｈ３−４は培
地中にＮ−アセチルノイラミン酸を添加しなくてもＮＡ
リアーゼを生産することができた。
３０℃で１８時間振とう培養した。培養終了後、遠心分
離により菌体を集め、０．８５％生理食塩水で洗浄後、
菌体を超音波処理により破砕し、菌体抽出液を調製し、
その抽出液中のＮＡ’Ｊアーゼ活性を測定した。その結
果は下記第１表の通りであり、形質転換株Ｈ３−４は培
地中にＮ−アセチルノイラミン酸を添加しなくてもＮＡ
リアーゼを生産することができた。
第 １ 表
＊＋：Ｌ、−培地十Ｎ−アセチルノイラミン酸１ｇ／ｆ
ｌ−；Ｌ−培地 実施例３゜ Ｈ３−４株をグルコース１ｇ／Ｉｌ、）リプトン１０ｇ
／ｊ！、酵母エキス５ｇ／Ａ、食塩５ｇ／β。
ｌ−；Ｌ−培地 実施例３゜ Ｈ３−４株をグルコース１ｇ／Ｉｌ、）リプトン１０ｇ
／ｊ！、酵母エキス５ｇ／Ａ、食塩５ｇ／β。
アンピシリン２０μｇ ／ｍ＋より成る培地（ｐＨ７、
０） ３００ｍｌヲ含ム２βエルレンマイヤーフラスコ
に植菌し、３０℃で１８時間振盪培養する。
０） ３００ｍｌヲ含ム２βエルレンマイヤーフラスコ
に植菌し、３０℃で１８時間振盪培養する。
この培養液より遠心分離法にて菌体を集める。得られた
菌体を０． ＯＩ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞２０
ｍ１に懸濁して超音波処理を行い細胞を破砕し、菌体内
の酵素を抽出する。次いで、ここに得られた抽出液に硫
安を加え、硫安３０〜８０％飽和で沈殿する部分を採取
する。この沈殿を少量１（５ｎ＋］）の０．０１ＭＩＪ
ン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，０’）に溶解する。
菌体を０． ＯＩ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞２０
ｍ１に懸濁して超音波処理を行い細胞を破砕し、菌体内
の酵素を抽出する。次いで、ここに得られた抽出液に硫
安を加え、硫安３０〜８０％飽和で沈殿する部分を採取
する。この沈殿を少量１（５ｎ＋］）の０．０１ＭＩＪ
ン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，０’）に溶解する。
この溶液を同緩衝液１！で２４時間透析する。透析液を
同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックス（２５
Ｑｍｌ、口径２．５ ｃｍ ）に通塔する。この操作て
ＮＡリアーゼはＤＥＡＥ−セファデックスに吸着される
。さらに同Ｍ衝液で不純蛋白質を洗い流す。次に０．０
１Ｍリソ１緩衝液（ｐ Ｈ７，０）から１．０ Ｍ食塩
を同緩衝液までの食塩の濃度匂配液で溶出を行う。溶出
してくる活性画分をあわせ、これに硫安を加えて硫安９
０％飽和で沈殿する部分を遠心分離（１２，０００Ｘ工
、２０分）で集め、００１Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ（７，
０）５ｍｌに溶解する。この溶液を同緩衝液１βで２４
時間透析する。
同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックス（２５
Ｑｍｌ、口径２．５ ｃｍ ）に通塔する。この操作て
ＮＡリアーゼはＤＥＡＥ−セファデックスに吸着される
。さらに同Ｍ衝液で不純蛋白質を洗い流す。次に０．０
１Ｍリソ１緩衝液（ｐ Ｈ７，０）から１．０ Ｍ食塩
を同緩衝液までの食塩の濃度匂配液で溶出を行う。溶出
してくる活性画分をあわせ、これに硫安を加えて硫安９
０％飽和で沈殿する部分を遠心分離（１２，０００Ｘ工
、２０分）で集め、００１Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ（７，
０）５ｍｌに溶解する。この溶液を同緩衝液１βで２４
時間透析する。
透析液を凍結乾燥し、ＮＡリアーセの粉末精製酵素標品
２０ｍｇ（比活性 ３．０ ｔＰ−位／ｍｇ）を得る。
２０ｍｇ（比活性 ３．０ ｔＰ−位／ｍｇ）を得る。
Claims (1)
- Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ産生遺伝情報を担う
ＤＮＡを組込んだベクターを導入したエシェリヒア属に
属する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にＮ−アセ
チルノイラミン酸リアーゼを蓄積させ、これを採取する
ことを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼの
製法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59122818A JPH062061B2 (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 |
| US06/743,802 US4670389A (en) | 1984-06-14 | 1985-06-12 | Process for producing N-acetylneuraminate lyase |
| DE8585107297T DE3581958D1 (de) | 1984-06-14 | 1985-06-13 | Verfahren zur herstellung von n-acetylneuraminat-lyase. |
| EP85107297A EP0164754B1 (en) | 1984-06-14 | 1985-06-13 | Process for producing n-acetylneuraminate lyase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59122818A JPH062061B2 (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611384A true JPS611384A (ja) | 1986-01-07 |
| JPH062061B2 JPH062061B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=14845393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59122818A Expired - Lifetime JPH062061B2 (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4670389A (ja) |
| EP (1) | EP0164754B1 (ja) |
| JP (1) | JPH062061B2 (ja) |
| DE (1) | DE3581958D1 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6181786A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-04-25 | Marukin Shoyu Kk | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
| JPS62277A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-01-06 | Rikagaku Kenkyusho | 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物及びそれを用いた有用生理活性物質の製造法 |
| JPS62278982A (ja) * | 1986-05-27 | 1987-12-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製造法 |
| JPH03103338A (ja) * | 1989-09-14 | 1991-04-30 | Sumitomo Electric Ind Ltd | フッ化物ガラスの表面処理方法 |
| US5922098A (en) * | 1995-03-24 | 1999-07-13 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | Cleaning a glass preform with a high temperature inert gas during the drawing of an optical fiber |
| WO2003072783A1 (fr) * | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de fabrication d'acide n-acetylneuraminique |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6156544A (en) * | 1993-06-09 | 2000-12-05 | Glaxo Group Limited | Process for the preparation of N-acetylneuraminic acid |
| US10378034B2 (en) | 2014-05-27 | 2019-08-13 | Universitetet I Tromsø—Norges Arktiske Universitet | Use of a N-acetylneuraminate lyase derived from the bacterium Aliivibrio salmonicida in the production of neuraminic acid and derivatives thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5654153A (en) * | 1979-10-09 | 1981-05-14 | Fujitsu Ltd | Information system of failure congestion |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5550891A (en) * | 1978-10-09 | 1980-04-14 | Marukin Shoyu Kk | Preparation of n-acylneuraminic acid aldolase |
| JPS5550890A (en) * | 1978-10-09 | 1980-04-14 | Marukin Shoyu Kk | Preparation of n-acylneuraminic acid aldolase |
| IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
| US4362817A (en) * | 1981-03-02 | 1982-12-07 | The Upjohn Company | Hybrid plasmid and process of making same |
-
1984
- 1984-06-14 JP JP59122818A patent/JPH062061B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-06-12 US US06/743,802 patent/US4670389A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-13 DE DE8585107297T patent/DE3581958D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-13 EP EP85107297A patent/EP0164754B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5654153A (en) * | 1979-10-09 | 1981-05-14 | Fujitsu Ltd | Information system of failure congestion |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS6181786A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-04-25 | Marukin Shoyu Kk | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
| JPH0559705B2 (ja) * | 1984-08-30 | 1993-08-31 | Marukin Shoyu Kk | |
| JPH0638751A (ja) * | 1984-08-30 | 1994-02-15 | Marukin Shoyu Kk | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 |
| JPS62277A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-01-06 | Rikagaku Kenkyusho | 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物及びそれを用いた有用生理活性物質の製造法 |
| JPS62278982A (ja) * | 1986-05-27 | 1987-12-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製造法 |
| JPH03103338A (ja) * | 1989-09-14 | 1991-04-30 | Sumitomo Electric Ind Ltd | フッ化物ガラスの表面処理方法 |
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| WO2003072783A1 (fr) * | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de fabrication d'acide n-acetylneuraminique |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4670389A (en) | 1987-06-02 |
| EP0164754A1 (en) | 1985-12-18 |
| DE3581958D1 (de) | 1991-04-11 |
| JPH062061B2 (ja) | 1994-01-12 |
| EP0164754B1 (en) | 1991-03-06 |
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