JPS61114163A - 液体クロマトグラフイ−分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は展開液を切換えてもクロマトグラムのベースラ
インが変化しないようにした液体クロマトグラフィー分
析方法に関する。

［従来の技術］ 液体クロマトグラフィー分析方法では、一般に、展開液
を分離カラムに流し乍ら、同時に該展開液によりザンブ
ラーでサンプリングされたサンプルを分離カラムに流し
、該分離カラムから溶出して来たサンプルの成分に反応
試薬を反応させて、その反応液の吸光度又は螢光強度等
を検出し、該検出した強度、即ちクロマトグラムを記録
計に記録させている。

さて、前記展開液としては通常緩衝液を用いるが、サン
プルの各種成分を効率良く分離させる為に、組成の異る
緩衝液を複数種類用意し、分離の進行に応じて予め決め
られた順序で緩衝液を切換るようにしている。

［発明が解決しようとする問題点］ しかし乍ら、記録針に記録されるりＯマドグラムを見る
と、第２図に示すように、緩衝液の切換に対応した時点
ｔ１でベースラインが８１からＢ２へと大ぎくシフトし
てしまう。このシフトと同時に目的成分の溶離があると
、Ｐ＋に示す如きりロマトグラムとなり、該成分の定量
（ビークＰ１の面積測定）が正確に出来ない。

本発明はこのような問題を解決する事を目的としたもの
である。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は、分離カラムでのサンプルの分離に応じて異っ
た緩衝液を順次切換えてサンプルと共に分離カラムに導
入し、該カラムから溶出して来るサンプル成分と！１１
液に試薬を加えて反応させ、該反応液の検出信号に基づ
いてクロマトグラムを記録するようにした液体クロマト
グラフィー分析方法において、前記緩衝液の切換えに拘
わらず、反応液のＰｌ−１が一定になるように、該反応
液に酸又はアルカリを添加すると共に、前記各緩衝液の
弱酸と強酸の比率を選択する事を特徴とする液体クロマ
トグラフィー分析方法を提供するものである。

さて、クロマトグラフのベースラインが緩衝液切換時点
でシフトする原因を追及した所、分離カラムを通過した
各緩衝液には夫々反応試薬が混ぜられるが、緩ｖｊＪ液
の切換えににり反応液のＰｌ−１値が変化し、その結果
、該反応液の色又は反応液中の螢光物質の螢光強度が変
化Ｊる為である事が分かった。

そこで、これらの緩衝液を順次流す事により該各緩衝液
が反応液と混合しても一定のＰＩ（値になるように、該
反応液に酸又はアルカリ液を添加すると同時に、前記各
緩衝液の弱酸と強酸の比率を選択するようにしてお【プ
ば、組成の異なるｌ衝液を切換で分離カラムに流しても
、クロマ１〜グラムのベースラインは常に一定である筈
である。

では、次に、どのような酸又はアルカリを添加し且つ各
緩衝液の弱酸と強酸の比率をどのように定めればよいか
について、詳細に説明する。

例えば、弱酸と強塩基から成るａｍ＊を一般化してｎ塩
基酸とし、その構造式を １−（ｎＸ とするど、この緩衝液（又はこの！１衝液の弱酸の）の
ＰＨ値は ＰＨ＝ＰＫ＋　＋ＡＯ（ｌ（［ＭＨｎ−Ｘ］／　［ｌＩ
ｎ　Ｘ］　）−ＰＫｚ　＋Ｑ、０（１（［Ｍ２　Ｈｎ−
ＪＸ］／　［ＭＨｎ−＋Ｘ］　）＝ＰＫｎ　十免Ｑ（＋
（［Ｍｎ　Ｘ’ｌ／［Ｍｎ−，１−ＩＸ］）・・・　（
１） となる。但し、ＰＫ＋　、ＰＫ２　、・・・・・・、Ｐ
Ｋｎは緩衝液に特有の解離定数、Ｍは強アルカリ性の１
価の陽イオン、［］はモル濃度を示す。

さて、緩衝液を調整する際に用いるｎ塩ＭＭＨｎＸのモ
ル数を×９強アルカリＭＯＨのモル数をｙ、１価の強酸
１−Ｉ　Ｙのモル数を２とし、［Ｍｉ　　Ｈｈ−ａＸ］
　　＝ｌｌｌ　　ａ　　　（ａ　　＝０．１，２．　・
　ｎ　　）　　−（２＞とすれば、前記（１）式は、 ＰＩ−１−ＰＫｂ　＋ＱＯｉｌ（Ｉｌｌ　ｂ　／ｉｎ＋
−＋）　　（ｂ　＝Ｌ２．−＋ｎ）　　　　　　　　　
　　　　　　　　　・・・（３）従って、該〈３）式を
変形すると、 （ｍ　ｂ　／　１１ｂ−１）　＝　１０　　　　　　　
　　　・・・（４）ここで、 １０ＰＨ−ＰＫｂ−Ｑｂ　　　　　　　　　　　　　　
　　・・・（５）とおけば、前記（４）式は次のように
なる。

ｍ　ｂ　＝Ｑｂ　ｌ１ｌｂ−１（ｂ　＝１．２ｓ”ｎ　
）　　　　　・・・（６）前記緩衝液１−１ｎＸのモル
数Ｘは弱酸Ｘのモル数に等しいので、前記（２）式から ×＝ｉＩＩ１．　　　−・・（７） ａ＋Ｏ Ｍ　ＯＨのモル数ｙはＭのモル数に等しいから、（２）
より強アルカリのモル数ｙは Ｖ−Σａｍａ＋ｚ・・・（８） 改；Ｏ （但し、この時、前記１１ｉ１１ｉの強１！ｌ　ｌ−Ｉ
　Ｙは完全解離してＭＹとなる。） 前記（６）、（７）及び（８）式から １・９．２・−−Ｑ−ｂ　）　）　＋Ｚ　　　　　　　
−（９）（５）式から明らかなように、ＰＨ値丈に関し
たものなので、これをＰと置く。即ち、 込２　・・・・・・・Ｑｂ））＝Ｐ　　　　　　　　・
・・（１０）すると、前記（９）式は ｙ＝ｐｘ十ｚ　　　　−（１１） となる。

この式は、緩衝液を調整する際に用いる強アルカリＭ　
Ｏ＋−１のモル数ｙは、ｍｉ液のＰ　ｌ−１（ｆｉ　Ｐ
と元の緩衝液ＨｎＸのモル数Ｘの積と、１１１ｉの強酸
）（Ｙのモル数２との和によって表わされる事を示して
いる。

ここで、先ず、分析に用いる複数種類の緩衝液の組成を
次のように決定する。即ち、分析すべき成分の分離に最
も最適なＰ　Ｈ値とＭイオン強度を実験により求める。

例えば、３種類の組成の緩衝液を使用するとすれば、第
１緩衝液、第２緩衝液、第３緩衝液夫々の強アルカリ１
−ＩＹのモル数７１元の緩衝液１１ｎＸのモル数ｘ、１
ｌｉｉｉの強酸トＩＹのモル数Ｚ、ＰＩ−１値Ｐを夫々
、（Ｖｌ、Ｘ＋、Ｚ＋、ｐ＋）、（Ｖｌ。

Ｘ２１Ｚ２１ρ２）、（Ｖ３．Ｘ３．Ｚａ、１１３）と
すれば、強アルカリのモル数Ｖ１．Ｖ２．Ｖ３は分析す
べきサンプル成分を最も良く分離するＭイオン強度を実
験により求める事により決定出来、又、各Ｐ　ｌ−１値
Ｐ＋　、Ｐ２　、Ｐ３も同様に、最適な分離をするＰｌ
−１値を実験により求める事により決定出来る。従って
、これらＶｌ、Ｖｌ、Ｖ３及びＰ＋　、Ｐ２　、Ｐ３は
定数となり、前記（１１）式から、次の３つの式が成立
する。

Ｖ　ｌ＝Ｐ＋　Ｘ　＋　十Ｚ　＋　−−−（１２ａ　）
Ｖｚ＝Ｐ２Ｘ２＋１２・・・・・・・・・（１２ｂ）Ｖ
　３＝Ｐ３　Ｘ　ｓ　＋Ｚ　３−　（１２０）次に、こ
れらの緩衝液が順次分離カラムを通過し、反応試薬液と
混合した時、これらの緩衝液と反応試薬液が最も良く反
応した場合の反応液のＰｌ」値があり、このＰＨ値をＰ
ｏとする。そして、何れの緩衝液と反応試薬を混合させ
ても、反応した反応液のＰＨ値がＰｏになるように調整
する為に、反応試薬液中に一定苗の酸又はアルカリを添
加する。この一定量の酸又はアルカリのモル数をＣとす
れば、前記（１１）式は、緩衝液と反応試薬が混合した
後、次の式に成る。

ｃ　＋ｙ　＝Ｐｏ　Ｘ　−１−Ｚ　　　　　−（１３）
この式で、Ｃは一定なので、該（１３）式は次のように
変形される。

ｃ　＝Ｐｏ　ｘ　＋ｚ　−ｙ　＝ｃｏｎｓｔ−（１４）
〜７− ｉ（１４）式は全ての！１Ｉｊ）Ｉｉを分離カラムに流
通させても成立するので、次の式が得られる。

Ｃ＝ＰＯＸ　Ｉ＋Ｚ　Ｉ−Ｖ　１ ＝Ｐｏ　Ｘ　２　＋Ｚ　２−Ｖ　２ ＝Ｐｏｘ　３　＋Ｚ　３　　ｙ　３　　　・・＝・・（
１５）以上、前記（１２ａ）、（１２ｂ）、（１２ｃ）
式と該（１５）式から、 ｙ、＝ｐ、ｘ、＋ｚ、　　　　　　−＜１６ａ）Ｖｌ　
＝Ｐ２Ｘ２　＋Ｚ２　　　　　　・−・（１６ｂ　）Ｖ
３＝Ｐ３Ｘ３＋Ｚ３　　　　　　＝（１６（ｉ）０　＝
ＰＯＸ　Ｈ＋Ｚ　１−Ｖ　１ ＝ＰｏＸｚ＋Ｚ２−Ｖｌ ＝ＰｏＸ３＋２３−４３　　−（１６ｄ）（但し、Ｖｌ
、Ｖｚ、Ｖ３．ｌ）＋、ｌ）ｚ、Ｆｌｓ及びＰｏは定数
である） の７元６連１次方程式が得られる。

該方程式から、未知数ＸＩ、Ｘ２１Ｘ３１ＺｌｌＺ２．
Ｚａ、Ｏの何れか２つずつの比率が求まる。

従って、求められた各比率により、各緩衝液の組成（Ｘ
　、　Ｖ　、　Ｚ　）及び反応試薬中の酸又はアルカリ
のモル数Ｃを決定し、このような組成の！ｌ！ｌｉ液を
順次分離カラムに流通してやれば、反応液のＰ　ｌ−１
は緩衝液の切換えに拘わらず一定となり、緩衝液の切換
時にベースラインのシフトは無く、常に、一定のベース
ラインが維持される事になる。

［実施例］ 第１図は、本発明を実施する為の液体クロマトグラフ装
置の流系図の一例である。

図中１ａ、１ｂ、１ｃは前記７元６連１次方程式により
組成が決定された第１緩衝液、第２緩衝液、第３緩衝液
が収容された第１容器、第２＠器。

第３容器である。２は緩衝液切換器で、制御装置３から
の指令に従って、順次内部に設けられた流路を切換え、
該流路を前記第１．第２．第３容器に繋がった流路の何
れかに接続するものである。

該切換器２の流路の他方にはポンプ４が繋がっており、
該ポンプにより、切換られた緩衝液がサンプラーＳでサ
ンプリングされたサンプルと共に分離カラム５に送り込
まれる。６は混合器で、該分離カラムから溶出して来る
液と、ポンプ７により供給されて来る試薬容器８の反応
試薬を混合するものである。該試薬容器中には前記（１
６ｄ）式に基づいてモル数が決定された酸又はアルカリ
液が添加された試薬が収容されている。該混合器におい
て混合された液は反応コイル９中で反応し、検出系１０
に送られる。該検出系は、反応液の濃度に対応した信号
を検出するもので、例えば反応液を収容するセルと、光
源及び吸光度検出器が設けられている。１１は該検出系
で検出されたサンプル成分のクロマトグラムを描く記録
計である。

斯くの如き装置において、制御装置３の指令により、緩
衝液切換器２により第１容器１ａを選択し、ポンプ４に
より第１緩衝液をサンプルと共にカラム５へ送る。以後
、該１ｉ１１１Ｉｌ装＠３の指令により、適宜な時間間
隔で緩衝液切換器２の流路を切換え、第２．第３緩衝液
を該カラム５へ流す。この時、順次カラム５から出て来
る緩衝液と反応試薬が混合器６で混合され、反応コイル
９で反応しても、該各反応液のＰＨは一定の値Ｐｏに維
持される。従って、検出器で検出されたサンプル成分の
クロマトグラムのベースラインはＭＶ液が切換られるに
も拘わらず一定である。

［発明の効果］ 本発明によれば、組成の異なる緩衝液を切換えても、ク
ロマトグラムのベースラインがシフ１〜する事は無い。

従って、該緩衝液切換え時点に対応した時点に、目的成
分の溶離があっても、ピーク部分の面積測定による該成
分の定量が正確に出来る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を実施する為の液体り０７トグラフイ装
置の流系を例示する図、第２図は従来の方法の欠点を説
明する為のクロマトグラムを示したものである。 １ａ、Ｉｂ、１ｃ　：第１．第２．第３容器２：緩衝液
切換器 ３：制御装置 ４．７：ポンプ ５：分離カラム ６：混合器 ８：試薬容器 ９：反応コイル １０：検出系 １１：記録計

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 分離カラムでのサンプルの分離に応じて異った緩衝液を
   順次切換えてサンプルと共に分離カラムに導入し、該カ
   ラムから溶出して来るサンプル成分と緩衝液に試薬を加
   えて反応させ、該反応液の検出信号に基づいてクロマト
   グラムを記録するようにした液体クロマトグラフィー分
   析方法において、前記緩衝液の切換えに拘わらず、反応
   液のＰＨが一定になるように、該反応液に酸又はアルカ
   リを添加すると共に、前記各緩衝液の弱酸と強酸の比率
   を選択する事を特徴とする液体クロマトグラフィー分析
   方法。