JPS6066979A

JPS6066979A - hybridoma

Info

Publication number: JPS6066979A
Application number: JP58176772A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Nagaike; 一博長池; Minoru Muramatsu; 村松　実; Seiko Hosokawa; 斉子細川
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1983-09-24
Filing date: 1983-09-24
Publication date: 1985-04-17
Also published as: JPH0469995B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】本発明はハイブリドーマに関する。[Detailed description of the invention] The present invention relates to hybridomas.

ガンのマーカーとして、（χ−フェトプロティン（ＡＦ
Ｐ）及び胎児性抗原（０１ｔｉＡ）が、よ（知られてい
る。ＣＥＡは、硝化器系のガン細胞の膜表面に存在する
とされている。他方、ＡＦＰは、多くの肝ガン及びセル
ラインで産生することか認められ毛いるが、細胞質に存
在−［ることか確かめられているにすぎず、膜表面に存
在するか否かは必ずしも明らかではない。As a cancer marker, (χ-fetoprotein (AF)
P) and fetal antigen (01tiA) are known to be present in cancer cells of the nitrifying system.CEA is known to exist on the membrane surface of cancer cells of the nitrifying system. Although it has been confirmed that it is produced in the cytoplasm, it has only been confirmed that it exists in the cytoplasm, and it is not necessarily clear whether it exists on the membrane surface or not.

本発明者らは、モノクローナル抗体に制ガン剤や毒索乞
結合させる、いわゆる６ミサイル療法”に過したＡＦＰ
に対するモノクローナル抗体を見出すべく、種々検討を
行ない、膜多面に存在する。ＡＦ’Ｐ及びそれｔ認識す
るモノクローナル抗体を見出し、本発明に同情した。The present inventors have demonstrated that AFP was used in the so-called 6-missile therapy, in which a monoclonal antibody is combined with an anticancer drug or a toxin.
Various studies were conducted in order to find monoclonal antibodies against the mitogen, which exists on multiple membrane surfaces. The inventors discovered AF'P and a monoclonal antibody that recognizes it, and contributed to the present invention.

すなわち１本発明の要旨は、細胞膜表面に存在するＡ　
Ｉ？　Ｐ　）５ｊ認職するモノクローナル抗体ケ産生ず
るハイブリドーマＫｈろ。That is, 1 the gist of the present invention is that A present on the cell membrane surface
I? P) Hybridoma Kh that produces a monoclonal antibody that has been approved for 5j.

以下５本発明の詳細な説明する。Hereinafter, five aspects of the present invention will be explained in detail.

本発明に保ろハイブリドーマは次のような方法で得られ
る。Hybridomas according to the present invention can be obtained by the following method.

すなわち、まず、ヒト胎盤由来のＡＦＰ％−５たとえは
ＢＡＬＢ／Ｃマウス等に免疫し７た後、肝臓Ｚ摘出し、
ポリエチレングリコールを用い、Ｐ３−ＤＩ等のマウス
ミニ１コーマ細胞と融合し。That is, first, after immunizing BALB/C mice with AFP%-5 derived from human placenta, the liver Z was removed,
Using polyethylene glycol, it is fused with mouse mini 1 coma cells such as P3-DI.

常法によりハイブリドーマをイむる。そしてハイブリド
ーマ上清よりモノクローナル抗体ケ得る。Inject hybridomas using conventional methods. Monoclonal antibodies are then obtained from the hybridoma supernatant.

つぎに、常法により得られたこれらの抗体ン・用いて、
肝ガ／セルライン（たとえば、Ｐ　Ｔ）Ｃ１ＫＮ、Ｎｕ
Ｅ）を免疫組織化学的に染色し、陽性を示す抗体を選択
する。この検出は、アビオシン：ビオチン化ワサビペル
オキシダーゼコンブレックス（ＡＢＯＪキットを用い、
ホースラデイシュ・ベルオギシダーゼの酵素活性により
、ジアミノベンジジンを基質として用いて行なわれろ。Next, using these antibodies obtained by conventional methods,
Liver moth/cell lines (e.g. PT) C1KN, Nu
E) is immunohistochemically stained and antibodies showing positive are selected. This detection was performed using an abiotin:biotinylated horseradish peroxidase complex (ABOJ kit).
Due to the enzymatic activity of horseradish beluogysidase, it is carried out using diaminobenzidine as a substrate.

この選択された抗ト４にン圧生ずるハイブリドーマを選
択し、本発明に係るハイブリドーマケ待る。Hybridomas generated in the selected column 4 are selected and hybridomas according to the present invention are prepared.

本発明＆Ｃ・ｌ；ｉろハイブリドーマより、細胞膜表面
に存在するＡＦＰ４認ａ：１−４−るモノクローナル抗
体７大辰に得るには５本ハイブリドーマ？Ｔ３ＡＬＢ／
Ｃマウスの腹腔内に注射し、増殖させ。In the present invention, five hybridomas can be used to obtain seven major monoclonal antibodies that recognize AFP4 a:1-4- present on the cell membrane surface. T3ALB/
C Injected intraperitoneally into mice and allowed to grow.

腹水ケ採取することにより行なうことができる。This can be done by collecting ascitic fluid.

また、上記ハイプリドーマ？培養タンクで犬惜培養する
方法によることもできる。Also, the above hyperidoma? It is also possible to use a method of culturing the cells in a culture tank.

不発明に保るハ・ｆプリドーマが産生するモノクローナ
ル抗体は、次のような性質を有１−る。The monoclonal antibody produced by the Ha.f. plaidoma has the following properties.

ｉ　）　＋４Ｑラベル化した本抗体を用いて、胎盤由来
ＡＦＰかＰＬＯ肝ガンセルラインの膜に対する結合を阻
害１−るか否か？みると、ＡＦＰが抗体とセルライン）
夙との結合を競合的１ｃ阻害することがわかる。i) Does the +4Q-labeled antibody inhibit the binding of placenta-derived AFP to the membrane of the PLO liver cancer cell line? If you look, AFP is an antibody and a cell line)
It can be seen that 1c competitively inhibits the binding to 1c.

１ｉ）ＰＬＯセルラインｗ　”＋ｃ−ロイシンでラベル
し、その膜成分ケ”トリトンＸ”で可溶化し、本抗体と
の結合Ｚみると、明らかな結合性が認められる。また、
培丘」＝清中の分泌告白にも結合性が確認される７、ＢＨ）ｐｒ、ａセルラインの可溶化１１Ｊｊ成分ならび
に培養土清中の抗体反応物乞、オファレル（０’　Ｆａ
ｒｒｅｌ　）もの方法に準じて二次元電気泳動ン行なう
と、膜由来、培養土苗由米のいずれの結合物もＡ　Ｆ　
Ｐ　０）ゼＩ　’ｒｉ’　（等重点、分イ鵬°）７有す
ることかわかる。1i) When PLO cell line w is labeled with +c-leucine, its membrane component is solubilized with Triton X, and the binding Z with this antibody is examined, clear binding is observed.
7, BH) pr, a cell line solubilized 11Jj component and antibody reaction in the culture medium, O'Farrell (0' Fa
When two-dimensional electrophoresis was carried out according to the method described in
P 0) zeI 'ri' (equal point, minute i peng °) It can be seen that it has 7.

ＩＶ）Ｐｒ、ａセルラインの１１＜！分ｊ！’ｉ　”’
・］−リブシン、プロテアーゼ、チモトリプンン等の蛋
白Ｉ９分解酵素で７肖化すると、本抗体とのｉＦｉ合性
は低下又は低下ｆ頃回乞示す。IV) Pr, a cell line 11<! Minj! 'i '''
・]-When enriched with protein I9-degrading enzymes such as ribsin, protease, and thymotryphin, the iFi compatibility with the present antibody decreases or decreases.

また、゛トリトンＸ″／ｉｔ１狸で低下傾向？示し、リ
パーゼ処理に、［す、その結イヤゼ１け増力１１する。In addition, ``Triton

本発明に係るハイブリドーマは、細胞膜表面に存在する
ＡＦＰｉ認識するモノクローナル抗体を産生ずる。The hybridoma according to the present invention produces a monoclonal antibody that recognizes AFPi present on the cell membrane surface.

この抗体はたとえば肝ガン治療、特にミサイル療法用の
抗体として有用であり、さらに細胞診筈の診断・検査５
Ｈとして有Ｊηでキ・る。This antibody is useful, for example, as an antibody for liver cancer treatment, especially for missile therapy, and is also useful for diagnosis and testing such as cytology.
As H, there is Jη and Ki Ru.

以下、実施例により本発明Ｚさらに詳、ＩＴｌに説明す
る。Hereinafter, the present invention Z will be explained in more detail with reference to Examples.

実施例／（１）　マウスモノクローナル抗体（Ｄ　作ｆｌＪ、　
：ヒ）ＡＦＰとして、胎盤より精製された純度９９％以
上で、免疫化学的Ｖこヒトアルブミン（）（ＳＡ）と反
応しないもの（ＱＱＪ５Ｆ、４水生利研製）′ｆＸ′用
いた。Example/ (1) Mouse monoclonal antibody (D made flJ,
:H) As AFP, 'fX' was used which was purified from placenta, has a purity of 99% or more, and does not react with immunochemical human albumin (SA) (QQJ5F, manufactured by Mizuho Uken).

トとともに感作し、最ｉｔ、≦免疫（１静ｊ派より江身
１し２．３日後にＩ＋’早ル亀？摘出し、月４１Ｊエチ
レングリコール≠ダθＯ！用いＰ３−１］／マウスミエ
ローマと融合し、常法によりノ・イブ１ノド−マ？作製
した。クローニング（ｉ限界希ｉｔ＜法ン用い、同法ｔ
ｔ／、回以」１行なった。なお−太艶の抗体は、Ｂ　Ａ
　Ｌ　Ｂ　／　ＯマウスｒＩ水系により採取した。sensitized with the mouse, and then immunized (1+' 2.3 days later, the 41J ethylene glycol ≠ θO! used P3-1)/mouse. It was fused with myeloma, and a nove1 nodoma was created by a conventional method. Cloning (using the method
t/, after 1 line. Furthermore, the thick antibody is B A
LB/O mice were collected by rI water system.

抗Ａ　Ｆ　Ｐ抗体を産生する・・イブリドーマは、６回
の融合により、約／Ｉｏｏクローンが選別された。その
うち、ｌ／クローンの培養を清の抗体画工ｇＧ惜ケ表／
Ｖこ示才（旧情７１０倍濃縮した後、測定３．）。About /Ioo clones of hybridomas producing anti-AFP antibodies were selected by 6 rounds of fusion. Among them, the culture of l/clone was carried out by the antibody artist gG.
V (measured 3. after being concentrated 710 times).

表　７ナル抗体（２）抗体の選択ａ）セルラインは、−週間以上、イーグルＭＥＭを基本
とした培地に代えて培養後、リン酸緩衝液でり回洗浄し
、１）直ちにノ・イブリドーマ培養土清と反応させる方
法、及び、ｉｉ＋１１．％バラホルムアルデヒド固定後
、メタノール、Ｈ２０□溶液で、内因性酵素乞不活化し
、抗体と反応させる方法、を用いた。Table 7 Null antibodies (2) Selection of antibodies a) Cell lines were cultured in Eagle's MEM-based medium for over - weeks, washed several times with phosphate buffer, and 1) immediately cultured with no. A method of reacting with soil sei, and ii+11. After fixation with formaldehyde, endogenous enzymes were inactivated with methanol and H20□ solution, and reacted with antibodies.

抗イ木のイ尖出はベクタスタイン（ＶｅＣｔａＳｔａｉ
ｎ　）社のＡＢＣキットヶ用い、ホースラディツシュ・
ペルオキシダーゼの酎：累活性により。VeCtaStai (VeCtaStai)
Using the ABC kit from N), horseradish.
Peroxidase chu: Due to cumulative activity.

基ａとしてジアミノベンジジンＺ用いて行なった。This was carried out using diaminobenzidine Z as group a.

ｂ）セルラインと維持ヒト肝ガンのセルラインとしては、Ｋｌｌ。b) Cell line and maintenance Kll is a cell line for human liver cancer.

ＰＬＯ，また、胎児性肝細胞由来のガン細胞株ＮｕＥｙ
、その他コントロールとして。PLO, also the fetal liver cell-derived cancer cell line NuEy
, and other controls.

ヒト胃ガン培養株ＫＡＴＯＩＩＩ、ＭＫＮ４５゜太）１
９ガンＣＩの各細胞株を用いた。なお、培う９細胞は、
ノＯ子牛胎児血清含頁ＲＰＭＩ１６ダＯの培養液で３７
．０℃、５％Ｃ０２，９３％Ａｉｒの条件で維持−増殖
さぜた。Human gastric cancer culture strain KATOIII, MKN45゜th) 1
Each cell line with 9 cancer CI was used. In addition, the 9 cells to be cultured are
37 in culture medium containing RPMI 16 days containing fetal calf serum.
．． The cells were maintained and grown under conditions of 0°C, 5% CO2, and 93% air.

リ　上記（１）の抗Ａ　Ｆ　Ｐモノクローナル抗体を含
む培養上清及びその希釈物（，２８倍まで）を肝ガンセ
ルラインＰＬＣ；ＫＮならびに胎児肝細胞ＮｕＪＣと免
疫組織化学的に反応させたところ、ｉｑｐ’ｉコに強い
反応を認めた。この反応は無同５ｇ４・￥゛木て・も、
固定、メタノール、Ｈ２Ｏ２処理法のいずれでも同様で
あった。The culture supernatant containing the anti-AFP monoclonal antibody in (1) above and its dilutions (up to 28 times) were immunohistochemically reacted with the liver cancer cell line PLC;KN and fetal liver cells NuJC. , a strong reaction was observed in iqp'i. This reaction is similar to 5g4・¥゛Kite・
The results were similar for all of the fixed, methanol, and H2O2 treatment methods.

ｆ　ターコントロールとして市販の抗Ａ　Ｆ　Ｐモノク
ローナル抗体（ハイブリチック社製）ン、抗体価として
／θ３１７１’あわせて反応させたが、他のハイブリド
ーマクローンと同様に陽性反応は認められなかった。As a control, a commercially available anti-AFP monoclonal antibody (Hybritic Co., Ltd.) was reacted with the antibody titer /θ3171', but as with other hybridoma clones, no positive reaction was observed.

／ｑＰ／２は表１に示すように抗体価が！而に強いもの
でもなく、また工ｇＧ量が多いというものでもないが、
−１＝　ＭＩ−：のよ５にｍ個と異なり陽性を示した。/qP/2 has an antibody titer as shown in Table 1! However, it is not strong, nor does it have a large amount of G-G.
-1=MI-: No. 5 showed positive unlike m number.

一万、ＡＦＰの産生が認められないセルラインＭＫＮり
ｊ、−ＫＡＴＯＩＩＪ、Ｏ／にはこの１ｑＦ１２は反応
しなかった。This 1qF12 did not react with the cell lines MKNRIJ, -KATOIIJ, and O/, in which production of AFP was not observed.

（３）ハイブリドーマの選択上記のように選択されたモノクローナル抗体？ガｉ生ず
るノ・イブリドーマケ選び（この場舒、１９Ｆ／、２）
一本発明に係ろノ・イブリドーマケ得る。(3) Selection of hybridoma Monoclonal antibody selected as above? Gai arises, Iburidomake selection (Konba Shu, 19F/, 2)
According to one aspect of the present invention, the present invention can be obtained.

参考例１不発明に係ろノ・イブリドーマが産生ずるモノクローナ
ル抗体について、さらにつぎのような検討を行なった。Reference Example 1 The following study was further conducted regarding the monoclonal antibody produced by the uninvented A. hybridoma.

Ａ　胎盤Ａ　ｈｐ　ｐとＰＬＯ膜との本抗体の競合反応
：ａＪ　１元体の＋４Ｑラベル：。イシン乞含まないＲＰＭＩｚＡグＯ培地Ｋ　５　ＩＩ
　Ｃｉ　／　ｍｌ　Ｏ）　濃度のｕ１４Ｃ（＋イシンｔ
）川え、５　Ｘ　／　０６セル／　ｍｅの濃度で６０時
間培養し、そのｆ＠養ｇＺ゛プロティンＡセファロース
°′によって精製し−＋４Ｑ　−）　ヘル化モノクロー
ナル抗体とした。A Competitive reaction of this antibody with placenta A h p and PLO membrane: aJ +4Q label of monomer: . RPMIzAguO medium K 5 II without Ishin
Ci / ml O) Concentration of u14C (+Isin t
) Kawae was cultured for 60 hours at a concentration of 5×/06 cells/me and purified with f@gZ'Protein A Sepharose to obtain a monoclonal antibody.

ｂ）肝ガンセルラインＰＬＯのラベルと１１す分画の可
溶化：上記ａ）と同様の条件で培養し、培地、細胞を回収して
用いｆこ。膜分画は、細胞ケ超音波処理後、ｉｏ万ｘｙ
、ｘθ分の沈査７−回洗浄して用いた。暎の百４溶１ヒ
は、７％１　ト　リ　ト　７　（１’ｒｉｔｏｎ　）　
Ｘ　／　０　０　”　、、２　９　ＩＩＩ　λイ）　’
）ス−ＨＣ１緩’ｆＩｒＩｉ’Ｍ（ｐＨｇ、θ〕で行な
い、抗体との反応には、リン酸−生理的食塩水舒衝蔽で
ｉｏ倍希駅して用いた。b) Labeling of the liver cancer cell line PLO and solubilization of the 11th fraction: Cultivate under the same conditions as in a) above, collect the medium and cells, and use. Membrane fractions were collected after cell sonication.
, xθ minutes and washed 7 times before use. 7% 1 tori 7 (1'riton)
X / 0 0'',, 2 9 III λa)'
)-HC1 (pHg, θ), and for the reaction with the antibody, it was diluted with phosphoric acid-physiological saline and diluted to io times.

Ｃ）ＰＤＩＱカラム（ファルマシア社製）Ｋよって脱塩
、リンｒ肢−生理的食塩水緩衝液で平衡化した＋４０ラ
ベル抗体ケ用い　ＰＬＯセルライン膜と胎盤由来ＡＦＰ
と競合実験ケ行なった。その結果ケ図／に示す。図／か
ら明らかなように、、ＡＦＰ９反応Ｃ１１中に加えた場
合、その濃度に依存してｐＬｃ膜に結合する抗体は少な
くなった。また、ＡＦＰと抗体の結合物とみらハ、る可
溶４’ｌ：の放射能もＡＦＰ濃Ｕ＆て依存して垢゛加し
た。C) PLO cell line membrane and placenta-derived AFP using +40 label antibody desalted with PDIQ column (manufactured by Pharmacia) and equilibrated with phosphate-physiological saline buffer.
A competitive experiment was conducted. The results are shown in Figure/. As is clear from the figure, when added to the AFP9 reaction C11, less antibody bound to the pLC membrane depending on its concentration. In addition, the radioactivity of soluble 4'L, which is a conjugate of AFP and antibody, increased depending on the concentration of AFP.

Ｂ　二次元電気泳動法によるモノク′ローナル抗体結合
物質の検出：肝ガンセルラインＰＬＯ′？１４（！−ａイシンでラベ
ルし、その培養土清中の高分子性物を集め、本抗体と反
応させプロティンＡ結合性の放射能の存否？みると、明
らかな抗体結合′１勿が認められた。B Detection of monoclonal antibody-bound substances by two-dimensional electrophoresis: Liver cancer cell line PLO'? 14 (!-A) Labeled with icine, collected the polymeric substances in the culture medium, and reacted with this antibody to determine the presence or absence of protein A-binding radioactivity. Obvious antibody binding was observed. It was done.

また、培養液１０ｍ１、細胞！；　Ｘ　／　０６由来の
膜町溶画分？−μＪの本抗体と反応後゛プロティンＡ”
で梢火し、抗体結合吻質Ｚ魯だ。Also, 10ml of culture solution, cells! ; Membrane soluble fraction derived from X/06? - After reaction with μJ of this antibody “Protein A”
So it's Zulu, which has an antibody binding proboscis.

これＬつの結合物乞オファレルらの方法にしたがって、
二次元電気泳動法によって検出すると、本抗体由来の■
（鎖、Ｌ鎖の他に分子量Ａ　’７　Ｋ　、　’：；　’
ｉＷ：点ｆ、　７　（７）　Ａ　Ｆ　Ｐ　カｇメラｉＬ
り。This combination, following the method of O'Farrell et al.
When detected by two-dimensional electrophoresis, ■
(In addition to the chain and L chain, the molecular weight A '7 K, ':;'
iW: Point f, 7 (7) A F P Camera iL
the law of nature.

これらのスポットは、すべて、ＰＬＯ培養上清と自１溶
１Ｌ膜で同一であった。These spots were all identical in PLO culture supernatant and autolytic 1L membrane.

Ｃ肝ガンセルラインＰＬＯ膜の酵素、薬剤処ｊ里後の結
合性：ＰＬＯの；摸分画ｔトリグシン、グロテアーゼ、チモト
リブシン等の毎白分解醇素で消化した場合、本抗体の結
合性は低下上・るいは低下傾向７示したーまり”　Ｔｒ
ｉｔＯｌＩ　Ｘ　／　Ｑ　Ｑ処［テモ、低下傾向を示し
たが、リガーゼの処理によっては逆にその結合性が増加
した。Binding property of liver cancer cell line PLO membrane after treatment with enzymes and drugs: When a sample fraction of PLO is digested with white-digesting substances such as triglycin, grotease, and thymotrybcin, the binding property of this antibody decreases. The upper level shows a downward trend of 7.
Treatment with itOlI

[Brief explanation of drawings]

図／は、本発り１におけるモノクローナル抗体ケ用いて
、ＡＦＰがＰ’ＬＯセルライン膜と抗体との結合ン阻害
するか否かＺテストした結果？示す。出願人　三３！化成工朶（１式会社代理人　弁理士　長谷用　− （Ｑワか／名］：Ｊユ絖谷＄３　ｊｌｉ山（方式）昭和５９年２月１７日１ｙ１１イ′１の表示１１１イ和５（３年特＊ｔｌｉＳＩ第１７Ｃｉ７７２ｑ
２　発明の名称ハイブリドーマ３　補正をづる者ｉＪｓイ′１との関係　特Ｖ［出願人（５９６）三菱化成工業株式会社４代哩人　〒１００東京都千代ｌｌ　１ｇ丸の内二丁目５５番２号三菱化成
工業株式会社内５　禎１正命令の日イリ　昭和５９　’ｚｆ　１月３１
日（発送口）６ｈ１１止のえｊ象羅１ｆＵ、明細β：ａ３よび図面The figure shows the results of a Z test using the monoclonal antibody in Part 1 to determine whether AFP inhibits the binding of the antibody to the P'LO cell line membrane. show. Applicant 33! Chemical Industry Co., Ltd. (Type 1 Company Agent, Patent Attorney, Hase - (QWa/Name): Jyu Iya $3 Jli Mountain (Method) February 17, 1980 1y11i'1 Indication 111iwa 5 (3rd year special*tliSI No. 17Ci772q
2 Title of the invention Hybridoma 3 Relationship with the person who made the amendment Kogyo Co., Ltd. 5 Eiji 1st Order Day Iri 1982 'zf January 31
Day (shipping port) 6h11 end of the year, 1fU, details β: A3 and drawings

Claims

[Claims]

(1) α-fetoprotein (alpha-fetoprotein) present on the cell membrane surface
Production of monoclonal antibody that recognizes AFP'J7''f
−A hybridoma.