JPS6047694A - キサントモナスヘテロ多糖類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、成るキサントモナス種を発酵させることによ
シ、キサントモナスへテロ多糖類を製造する方法に関す
る。

炭水化物源を有機体キサントモナス・カムベスト　リ　
ス　（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
　）ＮＲＲＬ　Ｂ−／’ｉ’ｊ９による発酵に付すとと
にょシ、ヘテロ多糖類が製造され得る、ということは米
国特許第３．≠１！；、７／り号から知られる。この特
許明細書には、キサントモナス・カムペストリスＮＲＲ
ＬＢ−／≠ｊ５’から生産されたヘテロ多糖類が、副生
油の回収操作に用いられる場合の格別効果的な剤である
こと、並びに、食品、化粧品等の増粘剤として、食用フ
ィルム形成剤として、乳化剤（例えば、印刷インキ用）
として、及び捺染に〜ストの増粘剤としての利用性があ
ること、がゎかったと述べられている。

今般、キサントモナス・カムペストリス種の新規な継代
菌株（ｓｕｂｓｔｒａｉｎ）を単離し、アバディーンＫ
ｌるナショナル・コレクション嚇オプｅインダストリア
ル・バクテリア、トリー・リサーチ・ステージ、　ン（
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌＢａｃｔｅｒｉａ　、　Ｔｏｒｒｙ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ　）に、受は入れ番
号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　）　／　／　
Ｉ　５４’で寄託した。

微生物キサントモナス命カムペス）　’）　、１．　Ｎ
ＲＲＬ　Ｂ−／１Ａｊ９と比べて、本機生物ＮＣＩＢ／
／ンヶμは、規定培地においてはるかに高い比生育速度
、顕著に高い比ポリマー生成速度を示すと認められ、ま
た、ポリマー生成能の低下を伴なうととなくがなり長期
間、連続培養又は反復される充填−取出し培養（ｆｉｌ
ｌ　−ａｎｄ　−ｄｒａｗ　ｃｕｌｔｕｒｅ　）におい
て維持され得る。

さらに、油の高回収操作に対して、、　ＮＣＩＢ／／ｇ
弥の微生物により生産されたヘテロ多糖類の潜在的注入
性（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　１ｎｊｅｃｔｉｖｉｔｙ　）
　（潜在的注入性は、沖過試験により測定される。）は
、キサントモナス・カムペストリスＮＲＲＬｓ−／ｌｌ
！；９にょシ生産されたヘテロ多糖類の潜在的注入性２
同じぐらいかあるいはそれより良好で、ちシ、特に、高
塩分プライン中に溶かした場合そうである。

本発明は、有機体キサントモナス・カムペストリスＮＣ
ＩＢ／／１３；ＩＡを水性栄養培地において、同化可能
な炭水化物及び窒素源の好気性発酵にょシ生育し、そし
てヘテロ多糖類を回収する、ことを特徴とするキサント
モナスヘテロ多糖類の製造法を提供する。本製造法は、
適当には、連続法として、充填及び取出しを伴なう又は
伴なわない供給回分法又は回分法として行なわれ得る。

生産性の観点から、連続法又は充填−取出し法が好まし
い。普通に入手できる多くのキサントモナス株と異１ム
キサントモナス・カムペストリスＮ（ＪＢ／／どｊ弘有
機体は、液体培養において満足な生育速度及びポリマー
生成速度を達成するために、複雑々生育因子又はビタミ
ンを必要とするとは認められない。単純な窒素源例えば
グルタミン酸ナトリウム、あるいはアンモニウム塩又は
硝酸塩を含有するところの、単純な化学的に規定される
培地において該有機体を生育する場合、非常に良好な結
果が得られ得る。それ故、かかる生育培地を用いること
が好ましい。グルタミン酸ナトリウムが好ましい窒素源
である。

さらに、化学的に規定される生育培地を用いることによ
り、微生物生育条件の一層良好な制御が可能になり、制
御されたポリマー合成並びに品質にばらつきのない生成
物を生じる再現性のある製造法がもたらされる。ヘテロ
多糖類の生成及び品質についてのとのタイグの制御は、
例えば、キサントモナス゛カム被ストリスＮＲＲＬＢ−
／４’、ｔ５；’を用い、一層可変性で複雑な窒素源例
えば酵母のエキス又は蒸留乾燥可溶物を含有する生育培
地において生育する場合、一般に可能でない。本発明は
さらに、上述した方法によって製造されたヘテロ多糖類
、並びに水性溶液中での粘度改質剤としての該へテロ多
糖類の使用に関する。

水及び０．　ＯＡ　−／、５重量％の上記へテロ多糖類
からなる掘削泥水（ｄｒｉｌｌｉｎｇ　ｆｌｕｉｄ　）
は、本発明の別の側面である。本発明はまた、水及び０
．０ｊ〜／、　、５−重量係の上記へテロ多糖類からな
る水性媒体を井戸中に導入することからなる井戸の処理
法、並びに、上記へテロ多糖類を含む水性溶液を井戸中
に注入することにより、井戸及び／又は井戸と連通して
いる浸透性の地下層を通じて流体を排出する方法を含む
。本発明はさらに、キサントモナス・カムペストリスＮ
ＣＩＢ　／　／ｇ！ＩＡの生物学的に純粋な培養物に関
する。

本発明を下記の例によシさらに説明する。

キサントモナス・カムペストリス種ＮＣＩＢ／／♂ｊ≠
の培養によるペテロ多糖類の製造、並びにキサントモナ
ス・カムペストリスＮＲＲＬＢ−／４Ｉりとの性能比較 キサントモナス・カムペストリスＮＣＩＢ　／／ｇ！’
１を、７リツトルの発酵槽（Ｃｈｅｍａｐ　ＧＦ　）中
で、３つの異なる化学的に規定される塩の培地（表／に
示す通シである。）にて、表２に要約した回分条件下で
生育した。

第１の実験では、微生物の生育のだめの唯一の窒素源は
アンモニウムイオン（，２４１ｍＭ　）であり、細胞の
指数的生育は最大濃度３９Ｂ−１であった。

第２及び第３の実験では、アンモニウムをそれぞれ硝酸
塩（２≠ｍＭ）及びグルタミン酸塩（ｊ！ｍＭ）で置き
換えた。結果を第１〜３図に示す。

これらの図の比較から明きらかなように、窒素源として
グルタミン酸塩が好ましく、何故なら、０、／２ｈ−１
のμｍａｘ即ち最大の細胞生育速度、０．３乙Ｌ（ｇ−
”）ｈ−１のｑｐ値即ち比ポリマー生成速度及び０、夕
９９−９　のｙｐ即ち最終的ポリマー収率を生じるから
である。この高いμｍａｘと高いｑｐとの組合わせによ
シ、０．≠り、ｐ、（、ｎ−”）ｈ−”の最終的ポリマ
ー生成率がもたらされ、しかしてこの最終的ポリマー生
成率は、キサントモナス・カムペストリスＮＲＲＬＢ−
／弘５りを用いるペテロ多糖類発酵の正常な生成率の２
倍よシ大である。表３には、上記に規定された塩の生育
培地におけるキサントモナス・カム被ストリスＮＣＩＢ
　／　／　１３；≠について、μｍａｘ　。

ｑｐ・ｑｇ即ち比グルコース資化速度、Ｙｐ即ちり゛ル
コースに関するポリマーの収率及びＰ即ちポリマー生成
物の値がＡにおいて、並びにキサントモナス・カムペス
トリスＮＲＲＬＢ−／４’ｊ７についてのそれぞれの値
がＢにおいて記載されている。

（以下余白） 表　／ キサントモナス・カムペストリスＮＣＩＢ／／ｌｓ’５
≠ｍＭ　−ミ　ルモル ９Ｆ’　＝グラム／リットル ｍＭＮ＝ミルモルの窒素 表　！ キサントモナス・カムペストリス この表は明きらかに、キサントモナス・カムベス）　Ｉ
Ｊ　スＮＣＩＢ　／　／１３；≠が、キサントモナス・
カムペストリスＮＲＲＬＢ−／ｌＡ、！；９よシも良好
な性能を有していることを示している。

表≠には、希釈して種々の塩分の溶液中における一定の
粘度にした場合の、キサントモナス・カムペストリスＮ
ＣＩＢ／／１３；’Ａの肉汁の濾過性とキサントモナス
・カム被ストリスＮＲＲＬＢ−／ｌ−５’の肉汁の濾過
性とが比較されている。

（以下余白） 実際に濾過するのに、’Ａ７ｒｎｘの直径を有する、ミ
リポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フ４　ｋター（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅは商標）を用いた。これらのフィルターの孔
の大きさは、ｊμ及び７．２μである。

上記の表から明きらかなように、キサントモナス・カム
ペストリスＮＣＩＢ／／ｇａｌｌ−の肉汁の濾過性は、
キサントモナスｅカムベス）　ＩＪ　スＮＲＲＬ　Ｂ−
１≠βの肉汁の濾過性よシも、酵素処理の前及び後にお
いて顕著に良好である。

キサントモナス・カムペストリスＮ（ＪＢ　１１ｇ３１
１−及びキサントモナス・カムペスト１Ｊ　スＮＣＩＢ
　１１ｇ０３、＝ＮＲＲＬＢ−／りｉ（以下、それぞれ
ｒＮｃＩＢ／／ｇタグ」及０’　ｒＮｃｒＢ／／♂０３
Ｊと記載する。）のナショナノいコレクション・オプ・
インダストリアル・バクテリ　ア　（Ｎａｔｉｏｎａｌ
　Ｃｏ１１’ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌＢａｃｔｅｒｉａ　）による特徴決定。それらの結果
は、下記に述べることを除いて、ＮＣＩＢ／／どｏ３と
ＮＣＩＢ／／１３≠について同様であった。

細胞形態学 Ａ、栄養肉汁（０ｘｏｉｄ　ＣＭＩ　）に０．７３％寒
天（１）ｉｆｃｏ）を加えた寒天平板に、若い生育体（
ｙｏｕｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ）を接種し、そして２５℃で
７Ｌ時間培養した。生育！ 体の約０．２龍の塊（ｐａｔｃｈｅｓ　）の縁の細胞を
調べ、カバーグラス下にて、位相差によるその場での写
真撮影を行なった。運動性及び他の特徴は、生育体の別
の埋土にばらまかれた０、　／　ａｍのガラスピーズを
取シ囲む培養液（ｐｏｏｌ）中においてめられた。生育
体の縁において細胞は単一で及び対になって発生し、細
胞の大きさはＮＣＩＢ／／１０３については幅０．ｊ〜
０．５μｍ×長さ７．２〜２．５８ｍであシ、ＮＣＩＢ
　／／ｇ！；４１については０１．５〜０．乙ｔｔｍ　
Ｘ　／、　、２〜ｊ、３　ｔｔｍであった。培養液中の
生育体の縁においては、百ないし数千の細胞の集合体（
「ｓｙｍｐｌａｓｍａｔａＪ　。

Ｇｒａｈａｍ　＆　Ｈｏｄｇｋｉｓｓ　、　／　９乙７
参照）がＮＣＩＢｉｉｇｏ３について普通見られるが、
しばしばＮＣＩＢ／／ｇ！；≠についてははるかに少な
かった。運動性は陽性であった。

Ｂ、上記Ａに記載の条件を用い、しかし培地に０．５チ
グルコースを添加しかつ７＃間培養としたところ、細胞
が０．　／μｍ大きく、集合体がＮＣＩＢ／／ど評につ
いては見られなかった以外は、同様な結果であった。

コロニー形態学 Ａ、栄養寒天（Ｏｘｏ’ｉ　ｄ　ＣＮ３　）平板上、３
０℃における≠ｇ待時間生育後、生育体は良好であり、
単離されたコロニーは、黄色、環状、金縁（ｅｎｔｉｒ
ｅ　）、粘液様（ｍｕｃｏｉｄ）、平滑、糸状（ｓｔｒ
ｉｎｇ　）、凸状であった。コロニーの直径はＮＣＩＢ
　／／１０３については／〜／、　３　ｔｎｎであり　
、ＮＣＩＢ　／／１３１１についてはＡ夕ｍｍであった
Ｏ Ｂ、上記Ａに記載の培地上でしかし７％グルコースを添
加し、３０℃にて７２時間生育させた後、生育体は良好
であシ、単離されたコロニーは、薄いクリーム色、環状
、金縁、非常に粘液様、平滑、凸状であシ、全面生育体
は薄いクリーム色ないし黄色であった。コロニーの直径
はＮＣＩＢ　／／１０３については、２ｍｍであＪ、Ｎ
ＣＩＢ／／乙燵については２〜！、ｊ朋であった。

選択された形態学 無機物基材　パレロニ乙ドウドロフ／り７．２改良品（
Ｐａ１ｌｅｒｏｎｉ　ｌ　［）ｏｕｄｏｒｏｆｆ　／り
７ｊＭｏｄｉｆｉｅｄ）（ＰＤ）　（Ａ、　Ｒｅｖ、　
Ｐｈｙｔｏｐｈｅｔｈｏｌ、　／　０　＋　７３　）Ｎ
ａｚＨＰＯ４、／２Ｈ２０乙、ｏ　ｇＫＨ２Ｐ０４　・
　２．１１−１１ ＮＨ４Ｃ１／、Ｏ９ ＭｇＳＯ４，７Ｈ２００３＆ ＦｅＣ１、乙ＨＯＯ，０／９ ２ Ｃａ　Ｃｌ　２　、乙Ｈ２００，ＯＨ／脱イオン水　／
リットル ｐｔｔは乙、どになろう。

ＰＤ無機物基材＋０．／係の濾過滅菌済グルコース（Ｐ
ＤＧ　） ゼラチン穿刺 栄養肉汁（Ｏｘｏ　ｉｄ　／に２　）　、２．！；チゼ
ラチン（Ｄｉｆｃｏ）　／２．０チ ゼラチン平板 栄養寒天（Ｏｘｏｉｄ　ＣＮ３）　、２．／？係ゼラチ
ン　７．０チ ミルク平板 個々に滅菌された、脱脂乳（Ｄｉｆｃｏ）　３　％にノ
トン（Ｄｉｆｃｏ）　０．１％ 牛肉エキス（Ｌａｂ−Ｌｅｍａｏ）　０．／　’ＩｙＮ
ａＣ１Ｏ，！；チ 寒天　／、Ｊ−チ オートクレープにかける前−７４Ｌ 生化学的特徴：指摘がなければ３０℃にてＣＭ３平板上
での生育 温度（℃）　３０３０°　３７゜ 生育（非定量的）＋＋− ＰＨ３夕　７２　ｇ　タ　１０ 生育　−３＋　３＋　３＋　３＋　３＋塩の存在下での
生育 ＮａＣ１を２，３．μ及びタチの濃度で含有する基礎培
地を、ヘイワード＆ホジキス（Ｈａｙｗａｒｄ　＆Ｈｏ
ｄｇｋｉｓｓ　）　（／り、４／）の方法に従い調製１
００培養は３日間行なった。下記に示すように、ＮＣ１
８７７ｇ１＋はＮＣＩＢ　／／♂０３よりも塩寛容性が
小さい。

ＮａＣ１％　２３１１３ ＮＣＩＢ　／／１０３の生育　３＋　３＋　３＋　−Ｎ
ＣＩＢ　／／どｊ≠の生育　３＋　３＋　十　−ゼラチ
ン及びカゼインの加水分解 培養は７日間行なった。ゼラチン穿刺は、２０℃にて行
なった。下記に示すように、ＮＣＩＢ　／／１３’Ａは
ＮＣＩＢ　ｌ／ｆ０３よシもタンｉＱり質加水分解活性
が小さい。

ゼラチン穿刺　ゼラチン平板　ミルク平板ＮＣＩＢ／／
ど０３　＋　＋　＋ ＮＣＩ　Ｂ　ｔ”’＃ｓグ　−　十　弱い＋生育因子要
求性試験 ガラス蒸留水を用いて作ったＰＤＧ培地において、まっ
すぐな針金を用い、３回継代培養した。約≠日で満足な
生育体が得られ、生育因子に絶対的要求性はないことが
示された。

メチオニン刺激試験 ガラス蒸留水を用いて作ったＰＤＧ培地においてかすか
に濁った若い生育培養物の各７滴を、／６朋管中で、１
０μ９／ｍｌのＬ−メチオニンを添加したＰＤＧ及び添
加しなかったＰＤＧ　／　Ｉｌｌ／に接種した。

Ｌ−メチオニンによる生育速度の刺激は起こらなかった
。

炭素源の資化 表／に示した、ｏ、ｉ’ｉｒＯ涙過滅菌済の唯一の炭素
源を添加したＰＤ培地に接種し、そして／≠日間培養し
た。外観上わずかな生育的差違が３点、菌株間で認めら
れた。

炭水化物からの酸の生成 ヘイワード＆ホジキス（／り乙／）の酸化発酵培地に、
表／に示した／チの沢過滅菌済の炭素源を添加した。そ
れらを入れた管゛に接種し、そして／μ日間培養した。

Ｎ（ＪＢ　／／乙燵ではガラクトース及びメリビオース
から酸がつくられたが、ＮＣＩＢ／／１０３ではつくら
れ永かった。このことは有意である、とすることは疑問
であシ、何故なら、特に、ＮＣＩＢ　／／Ｉ！；グ及び
ＮＣＩＢ／／１１０３の両方とも、両化合化物を唯一の
炭素源として資化したからである。

これらの試験は限られた差異を示すものであシ、主な差
異は次のことである。即ち、Ｔ、１１１ｇは、規定培地
においてポリマー生産の反応速度が一層良好でアシ、無
機窒素特にＮＨ４＋で一層良好に生育し、規定培地中で
の連続培養において安定である。

参照文献 ／、　「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｊ−ｏｌｏｇｙ
　ｓ第ｇ片（／り７１１　）　（Ｒ，Ｅ、　Ｂｕｃｈａ
ｎａｎ及びＮａｇ＠　Ｇｉｂｂｏｎｓ共編）　、　Ｂａ
ｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ　
Ｊ ２、　「Ｃｏｗａｎ　、　Ｓ、Ｔ、及び５ｔｅｅｌｔ　
Ｋ−Ｊ、　（／り７≠）”　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　ｔ
ｈｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｄｉ
ｃａｌＢａｃｔｅｒｉａ　”　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ＰｒｅｓｓＪ

【図面の簡単な説明】

第１図は、窒素源がアンモニアである規定塩培地（培地
／）における、キサントモナス・カムペストリスＮＣＩ
Ｂ／／♂夕≠（実線）及びキサントモナス・カムペスト
リスＮＲＲＬ　Ｂ　−／≠ｊり（点線：上の点線はポリ
マー、下の点線は細胞）による生育及びポリマーの生成
を示し、第２図は、窒素源が硝酸塩である規定塩培地（
培地２）における、キサントモナス・カムペストリスＮ
ＣＩＢ　／／♂ｔｇによる生育及びポリマーの生成を示
し、第３図は、窒素源がグルタミン酸塩である規定塩培
地（培地３）における、キサントモナス・カムペストリ
スＮＣＩＢ／／Ｉ！；ｌｌ−（実線）及びキサントモナ
ス・カム被ストリスＮＲＲＬＢ−／≠タタ（点線二上の
点線はポリマー、下の点線は細胞）による生育及びポリ
マーの生成を示す。 代理人の氏名　川原１）−穂 手続補正書 昭和５９年　８月２２日 特許庁長官　志　賀　学　殿 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付　自　発 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象　図　面　く第全図）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）　キサントモナスへテロ多糖類の製造法において
   、有機体キサントモナス・カムペストリスＮＣＩＢ／／
   １３；ｌｌ−を水性栄養培地において、同化可能な炭水
   化物及び窒素源の好気性発酵により生育し、そしてヘテ
   ロ多糖類を回収する、ことを特徴とする上記製造法。
2. （２）連続法として又は充填−取出し法として行なう、
   特許請求の範囲第１項に記載の製造法。
3. （３）酵母エキスの不存在下、化学的に規定された培地
   において該有機体を特徴する特許請求の範囲第１項又は
   第２項に記載の製造法。
4. （４）　グルタミン酸塩を窒素源として用いる、特許請
   求の範囲第１〜３項のいずれか一項に記載の製造法。
5. （５）特許請求の範囲第１〜μ項のいずれか一項に記載
   の方法によシ製造されたへテロ多糖類。
6. （６）特許請求の範囲第５項に記載のへテロ多糖類の、
   水性溶液中の粘度改質剤としての使用。
7. （７）水及びｏ、ｏｔ〜乙ｊ重量％の特許請求の範囲第
   ５項に記載のへテロ多糖類からなる掘削泥水。
8. （８）水及びｏ、ｏｒ〜／、５重量％の特許請求の範囲
   第５項に記載のへテロ多糖類からなる水性媒体を井戸中
   に導入する、ことを特徴とする井戸の処理法。
9. （９）特許請求の範囲第５項に記載のへテロ多糖類を含
   む水性溶液を井戸中に注入することにより、井戸及び／
   又は井戸と連通している浸透性の地下層を通じて流体を
   排出する方法。 αＯキサントモナス・カムペストリスＮＣＩＢ／／Ｉ夕
   ４１の生物学的に純粋な培養物。