JPS6041616A - 腎疾患に対する治療薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は腎疾患に対する治療薬に関するものである。

腎疾患については多数の症例において、その発症には免
疫的機序が関与してし・ると考えられている。その主な
ものは、生体内で腎組織に対する自己抗体が産生されて
、これが腎組織と結合することにより病変を起す場合と
、腎組織とは関係のない抗原、例えば細菌やウィルス等
の外来抗原に対する抗体が産生されてこれが循環血液中
で抗原成分と結合して抗原抗体複合体（ＩＣ）を生じ、
これが循環しているうちに腎に沈着して病変を起す場合
で、糸球体腎炎の多くがこれに属すると考えられている
。

これらいずれの場合においても、抗原−抗体反応が起る
と、補体が活性化されて種々の好ましくない現象を惹起
する。例えば、糸球体腎炎では、腎糸球体基底膜に沈着
した免疫複合体が補体を活性化して凝固系の活性化と、
これに伴う局所循環障害などを生じるとされている。す
なわち、補体の活性化によって血小板粘着と、さらに引
き続いて血栓形成を惹起し、以て腎機能低下、蛋白尿を
もたらすと考えられている。

このように、腎疾患の発症、病変の進展に対して、多く
の症例で免疫的機序が関与しているところから、その治
療共に関しても免疫的な立場からいろいろ検ｉｉ４がな
されている。抗体の産生を抑えて免疫反応そのものを抑
制しようとする免疫抑制剤、抗原−抗体反応の結果中す
る組織障害を減温させるだめの抗凝固剤等はその代表的
なものである。

これら免疫抑制剤および抗凝固剤等は、夫々腎疾患に対
して優れた効果をあげているが、父面において欠点もも
っている。すなわち、免疫抑制剤については、抗体産生
細胞のみならず全身の細胞に対しても抑制的に働くため
に、生体の防御１ｊｌｌＪ　ｌ’ｆ’ｊとして［Ｒ愕な
正常免疫反応をも抑制して、惑東症に対する易罹、偉性
等の副作用を生ずるおそれがあり、また抗凝固剤等につ
いても、同じく病変部のみならず全身に作用し、薬剤を
多量に用いれば副作用として出血をもたらずなどの問題
を含んでいる。

本発明は、このような事・Ｉｆ／を背景として４「され
たものであり、その目的とするところは、疾患部にのみ
集中的に作用してその薬効を効果的にあらオつず、腎疾
患に対する治療共を提（、ｌ（することを目的とするも
のである。この目的のた♂、５に′−ｉ己＋ｆｆｌされ
た本発明に係る７ｔ３療薬は、腎糸球（・）：基ＩＦ（
膜）２び／又は腎糸球体内皮細胞膜に対して選択ＩＦ、
〒２７へ的（てや、′９合するモノクローナル抗体から
、補イ本糸吉合ｆ１ニイキ″７．　ｆ除いブこ部分に、
血小板Ｍε隼抑制剤、１１ｉ′Ｃ凝［１斉［］若しくは
血栓溶解剤を結合させたものを、Ａ芝Σ貌Ｉγと１゜て
有することを要旨とするものであり、以てｑＬ来の抗凝
固剤等蓄剤の有する副作用の解消な’ｖ　）シ’ＦＶ減
とともに、それらの薬理作用が」ニリ多プＪ果ｒ１勺に
弓１き出されることとなったのである。

上述したように、かかる抗凝固剤、そのイ也血４１＼板
凝集抑制剤、血栓溶解剤等は、本来疾患ｒ＊ｓ　ｈｃの
み作用させたいものであり、その他の正？ｉりなｒ′Ｘ
Ｂ　（＜Ｌに対しては、むしろこれらの薬剤１作用さセ
′１．ＣｕＡ方が望ましいのである。この意力）らすノ
Ｌば、イ１ミイ本に薬剤を投与したとき、その蓄剤が疾
患ｒ’ＢＩ　ＩＪ’５所に集中して、そこで薬理作用を
あらＪ）　１−と１−　ＩＬ　（４その作用は搾めて効
果的であり、力）つ上言己有ｆ与な６１１１作用を大い
に軽減し得るか、また（ま（ゴとんどなくなることが期
待される。

そこで本発明者は、自己免疫疾患に」５いて、生体内で
アＣ生される自己抗体が、生体の体成分に列して選択特
異的に結合することに着目し、抗糸球体基底膜自己抗体
の出現する腎炎患者において出現する抗体が、腎糸球体
基底膜を抗原として特異的に結合する性質を利用するこ
とを考えたのである。そしてこの抗体と同種の抗体を別
途Ｋ１４製しで、これらに所定の処理を施すとともに、
これに血小板凝集抑制剤、抗凝固剤、血栓溶解剤軸−を
結合させ、以て腎疾患に対する治療共のうｂ明を完成さ
ぜたのである。

かかる本発明において、上記モノクローナル抗体は、具
体的には、ヒトのミエローマ細胞と抗糸３’Ｊｅ体基底
膜自己抗体の出現する腎炎患者の８１７３球、若しくは
糸球体内及卸ＩＩＩ包で感作されたヒトのＩＦｚｌｉｔ
細胞の８１７３球とを細胞融合さセで所定の培養器中に
分注培養し、それらの中から上記の抗糸球体〕、（底膜
抗体若しくは抗糸球体内皮卸１胞ｎ′、“ｆ抗体と同種
の抗体を産生ずるクローンを選び出すことによって得る
ことができる。但し、これらモノクローナル抗体は、そ
のままでは補体結合性を有する部分を含んでいるから、
これを患者に投与すれば有害な免疫反応を引き起すおそ
れがある。

そこで本発明においては、かかるモノクローナル抗体か
ら補体結合性を有する部分を除いてＦａｂ。

１’（ａ＋〕’　）２．Ｆａｂ’　、または抗原結合部
位ヲ残してそれらを更にｆｆ４ｉ１　＜分解し、これに
、従来より腎疾患用の治療共として用いられているｌｌ
’ｌ［小板凝集抑制剤、抗ｌ″Ｘ１５固剤、血栓溶解剤
を結合させて治Ｉ！゛〔蘂となしたのである。

モノクローナル抗体から、補体結合性を有する部分を除
く手段としては、蛋白分解酵素を用いるものが好心であ
る。すなわち、蛋白分１１１Ｔ１尊素で子（ｊ１重結合
性をＦｒする部分を消化させるのである。このとき、パ
パインを用いれば１価のＦａｂが、またペプシンを用い
れば２価のＦ（ａｂ’）２　が夫々得られ、このＦ（ａ
ｂ’）２　を稈１ノじずλしば１１曲のＩＦ　ａ　ｂ’
が得られる。蛋白分解酵素としては、こ扛らの他に、ト
リプシン、プラスミン′−：γを用いることができる。

但し、上に述べたモノクローナル抗体の調製方法、Ｆａ
ｂ等の調製方法はあくまで１つの具体例であって、その
他の方法も可能であり、またこれらの調製方法は本発明
において要件とされるものではなく、遺伝子工学的手法
その他によって得られたものであっても本発明を適用す
ることは可能である。

次に、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’　）２．Ｆａｂ’等にこれら
血小板凝集抑制剤等を結合させる手段としては、過ヨウ
素酸酸化法、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド法
、ジアゾ法、臭化シアン法その他の方法を用いることが
できる。ここで、過ヨウ素酸酸化法とは、ジオールを有
する上記薬剤を、過ヨウ素酸で酸化してそのジオールを
ジアルデヒドとし、さらにＦａｂ等とともにＰＨ９〜９
．５で処理して、ジアルデヒド基とＦａｂ等の−ＮＨ２
基とを縮合させるというものである。この過ヨウ素酸酸
化法、および上記カルボジイミド法、グルタルアルデヒ
ド も公知の方法であるのでここでは詳しい説明は省略する
。

このようにして、Ｆａｂ，Ｆ（　ａｂ′）２，Ｆａｂま
たはこれらを更に分解したものであってなお抗原結合部
位を有するものに、上記血小板凝集抑制剤、抗凝固剤、
血栓溶解剤を結合させたものを、腎疾患の患者に投与す
れば、それらＦａｂ等が血小板凝集抑制剤等を伴って患
者の腎糸球体基底膜若しくは腎糸球体内皮細胞に選択特
異的に結合する。つまり、従来より腎疾患に対して用い
られているこれら薬剤が、Ｆａｂ等を媒介として疾患部
に結合するのであり、その疾患部においてそれら固有の
薬理作用をあられす。すなわち、抗凝固剤等のみを患者
に投与した場合には、それら薬剤の一部のみが疾患部に
作用するにすぎないのに対し、本発明に係る薬剤の場合
には、投与されたものがすべて疾，密部に集中してその
回復にあてられるのであり、したがってその投与量は少
なくても障害の軽減ないし回復に対して著効をあられす
のである。しかも、これら本発明に係る薬剤は、他の正
常な部位には作用せず、かつ投与量も少なくてすむこと
から、出血等の有害な副作用をもたらさないのである。

なお、上記Ｆａｂ等に血小板凝集抑制剤、抗凝固剤、血
栓溶解剤を結合したものを患者に投与するにあたっては
これを単独で、あるいは２種以上を組合せて投与するこ
とも可能である。

次に、本発明のかかる優れた効果をより明らかにするた
めに、以下に、本発明に係る薬剤の患者への投年例を、
同共剤の調製例とともに具体的に説明する。

（Ａ）　薬剤の調製例 （イ）　抗糸球体基底膜抗体又は抗糸球体内皮細胞膜抗
体と同種のモノクローナル抗体の調製例 非分泌型のヒト骨髄腫細胞（８−アザグアニン（　ａｚ
ａｇｕａｎｉｎｅ　）耐性株ヒトンエローマ細胞と１抗
糸球体基底膜自己抗体の出現する腎炎，Ｕ者のＢリンパ
球とを混合してポークライードマイトゲｙ　（　Ｐｏｋ
ｅｗｅｅｄ　ｔｎｉｔｏｇｅｎ　）で刺激した後、これ
らをポリエチレングリコール中で細胞ｒｒｌＡ合させて
ハイプリドーマ（　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　）を作製した
。

このハイブリドーマ細胞を、組織ｉ′＠養プレ〜トに分
注いＩ（　Ａ　’Ｉ’培地にて培養した。これらのハイ
プリドーマは、極めて多くの抗体を産生し得る雑多（　
ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ　）な細胞群かう成るもの
であるため、これらの中から目的とする抗糸球体基底膜
抗体を産生ずる細胞群を選び出さなければならない。そ
こで、予め腎糸球体基底１漢抗原を非特異的に付着させ
たＥ　Ｉ　Ａ　（　ｅｎＺｙ＋ｎＱｉｍｍｕｎｏ　ａｓ
ｓａｙ　）プレートに、上記培養した上清を分注し、そ
して過酸化酵素（　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｃ　）を結合し
た抗イムノグロブリン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によっ
て、どのコロニーが目的とする抗体を産生ずるかを分析
した。抗イムノグロブリン抗体は、目的とする抗原−抗
体複合体があるとこれに結合するから、抗イムノグロブ
リン抗体処理後、これに結合された酵素の酵素活性を調
べれば、目的とする抗体を産生ずるハイプリドーマがど
のコロニーのものであるかが解るわけである。

上清分析で陽性と判定されたコロニー、ずなわぢ目的と
する抗体を産生ずるコロニーが見つかったら、これを別
の組織培養プレートに分注して培養する。再度上清の特
異抗体の分析と分注を繰り返して選択培養を行なえば、
最終的に目的とする抗腎糸球体基１１て膜自己抗体と同
種の抗体を産生するモノクローナルなｌ１１ＴＩ胞が得
られる。

一方、抗腎糸球体内皮細胞膜自己抗体と同種のモノクロ
ーナル抗体については、ヒトのＦ’　Ｉ！１細胞を試験
管内で、糸球体内皮細胞膜で感作しておき、そのＴ号す
ンパ球とヒトのミエローマ細胞とでハイプリドーマを作
興し、これに上記と同様の処理を施すことで得ることが
できる。

（ｏ）　Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２．Ｆａｂ’等の調製（
ｉ）　（Ｆａｂ’）２の調製 （イ）で得られたモノクローナル抗体に、１１５０重量
のペプシンを加え、ｐ　ＩＩ　４．　Ｑ〜５．０．３７
°Ｃで８〜１８時間処理して抗体のＦ　ｃ部分を消化し
た後、ｐＨを８．０としてペプシンを不活性化し、フラ
グメントをセフアゾ・ンク７、　（５ｅｐｈａｄｅｘ　
Ｏ−１００）　（商品名ニア１ンエーデン、ファルマシ
ア社ｆｌｉｕ　）　ｔ　ＪＴＢｚ　−ｃ　？　／ｌ／口
過して分離し、Ｆ（ａｂ’）２をイ））た。

（ｉｉ）　Ｆ　ａ　ｂ’の調製 ＜Ｉ）−ｃ得られたＦ（ａｌ）′）２を、０．０１Ｍの
２−メルカブトエクノールで、ｐ）１３．Ｏにおいて還
元し、遊郭したＳ　Ｉ−Ｉ基をモノヨー１′アセトアミ
ドによりアルキル化してＦａｂ’を得た。

（１目）Ｆａｂの調色ν 上記の（イ）で１１）られたモノクロ−リール抗体と、
１／１００重量のパパインをシヌテイン０．０１　Ｍ、
Ｅｌ）ＴＡ、０．００２Ｍを含むＮａ−リンｌπ緩衝ン
ｆ支（０，１Δ（、ｐＩ（７，０）に溶力）し、３７°
Ｃで１６時間処理して抗体のＦｃ部分を消化し、（１）
と同様の方法でＦａｂ部分を分離した。

（ハ）　上記Ｆ　ａ　ｌ）等に対する血小板凝制剤１ｉ
（１斉１１、抗凝固剤、血栓溶解剤の結合例 過ヨウ素酸酸化法（文献−Ｗｃａｋｌｃｙ　、　Ｆ−、
＋３゜ｃｔａｌ、Ｂｉｏもｅｃｂｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ
、第　１５　巻、１１８９ｊ７（１９７３年））に従っ
て上ｉｉ＋：、　ｌ　ａ　ｂ等にヘパリン（抗凝固剤）
を結合ざすた。すなわち、これを過ヨウ素酸で酸化して
シアｐデヒドを形成し、これを上記（ロ）で得られたＦ
ａｂ、Ｆ（ａｂ’　）２．Ｆａｂ’等とともにｐｕ９〜
９．５で反応させて、アルデヒド基とＦａｂ等の−ＮＨ
２基とを縮合させた。このとき形成されるシッフ塩へを
」３元して結合を安定化させた。

同シくワルファリン（Ｗａｒｆａｒｉｎ　）　（抗ｈｌ
固剤）、ウロキナーゼ（Ｕｒｏｌｃｉｎａｓｅ　）　（
血栓溶解剤）、プロスタグランジン（ｐｒｏｓ　ｔａｇ
ｌａｎｄ　１ｎ）Ｅ、１号２　＋　■２　＋　Ｄ２およ
びそれらの誘導体（例えばチクロピジン（ｔｉｃｌｏｐ
ｉｄｉｎｅ　）、イフエンプロジ／ｌ／　（１ｆｃｎｐ
ｒｏｄｉｌ　）、ジラゼッグ（ｄｉｌａｚｃｐ　）、ト
リメタシン（ｔｒｉ＋ｎｃＬａｚｉｎｃ）、ベンシクロ
レン（ｂｃｎｃｙｃｌａｎｅ　）、アスピリン（ａｓｐ
ｉｒｉｎ　）、フルｌレビプロフエン（ｆｌｕｒｂｉｐ
ｒｏｆｅｎ　）、トフピジ）ｖ（ｔ、ｒａｐｉｃｉｉｌ
）、ピリジ）　−）ｖ　（ｐｙｒｉ旧ｎｏｌ　）　、ジ
ビリダモー／Ｌ／（ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ　）、グ
リクラシト（ｇｌｉｃｌａｚｉｄｅ　）など）（以」−
血小に’Ｉｍ集抑制剤）などの血小板凝集抑制剤、抗凝
固剤、血栓溶解剤を、上記過ヨウ素酸酸化法、カルボジ
イミド法（文献−Ｃａｒｒａｗａｙ　、　ＫＬ、　Ｃｔ
　ａｌ　：Ｍｅｔ、ｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、第２５
巻、６１６頁（１９７２年））、グルグルアルデヒド法
（文献−Ａｖｒａｍｅａｓ　８　；　Ｉｍｍｕｎｏｃｌ
＋ｅｍｉｓｔｒｙ　、第６巻４３頁（１９６９年））、
ジアゾ法（文献−Ｌａｎｄｓｔ、ｅｉｎｃｒ　、Ｔ（、
：　Ｔｈｅ　ｓｐ　θｃｉｆｉｃｉ　もｙ　ｏｆｓｃｒ
ｏｌｏ傳ｃａｌ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、　Ｎｃｗ　Ｙｏ
ｒｋ　：　Ｄｏｒｅｒ　。

１９６２．３３０ＰＰ）、臭化シアン法（文献−Ａｘｅ
ｎ　、　Ｒ，ｅｔ、ａｌ、　：Ｎａｔｕｒｅ　２１４．
　Ｉ　８０２（１９６７年））等にしたがって結合さ氾
た。

なお、カルボキシル基を有しないが８剤であって水酸シ
ｊ（を有するものは、これを無水コノ１り酸と反応させ
ることによりカルボキシル基を形成することができ、ま
たカルボニル基を有するものは、これを（０−カルボキ
シメチルより（０−力ｐボキシメチル）オキシムとする
ことによりカルボキシル基を形成することができる。こ
れらはカルボジイミド法を用いてＦａｂ等に結合させる
ことができる。

（Ｂ）　患者への投与、治療例 （Ａ）で得られた薬剤を、腎疾患の患者に投与した。具
体的な内容は以下の如くである。

（その１） 患者：に、Ｎ．、女性，３８才，４８ｋｇ症状＝　３ケ
月前から蛋白尿、浮腫が出現し、急速に腎機能が低下し
た。

薬剤投与量：　抗糸球体基底膜抗体と同種のモノクロー
ナル抗体から得た上記Ｊｉ’　ａ　ｂにウロキナーゼを
結合したものを５００ｍｇ，２回投与した。

結果： （その２） 、Φ者：　Ｙ，　Ｋ．、男性，５８才，６８ｋｇ症状：
　急速進行性腎炎で、１ケ月前に始めて蛋白尿、高血圧
、腎機能低下をみた。

薬剤投与量：　抗糸球体基底膜抗体と同種のモノクロー
ナル抗体から得た上記Ｆ　ａ　１３にへｌ＜リンを結合
したものを５００ｍｇ，２回投与した。

（その３） 患者：　Ａ，Ｇ．、女性，２５才，５５ｋｇ症状：　急
速進行性腎炎で、２ケ月ｉｉｉＪがら蛋白尿、腎機能低
下、血尿を呈する。

薬剤投与量：　抗糸球体内皮細胞膜抗体と同種のモノク
ローナル抗体から得た上記Ｆ（ａｂ’）２にワルファリ
ンを結合したものを５００ｍｇ。

２回投与した。

結果： （その４） 患者：　Ｈ．Ｍ，、男性，３４才，４８ｋｇ症状＝　１
ケ月前に蛋白尿、血尿、腎機能低下を呈し、慢性腎炎と
診断された。

薬剤投与量：　抗糸球体基底膜抗体と同種のモノクロー
ナル抗体から得られた上記Ｆａｂにプロスタグランジン
Ｅ１を結合したものを５００ｍｇ，２回投与した。

結果： （その５） 患者：、Ｓ，Ｔ．、女性，２８才，５４ｋｇ症状：　２
年前から蛋白尿、腎機能低下を呈し、慢性腎炎と＃１祈
された。

薬剤投与量：腎糸球体基底膜抗体と同種のモノクローナ
ル抗体から得られたＦ　ａ　ｂ’に、ジピリダモールを
結合したものを５００ｍｇ２回投与した。

結果： 以Ｈの結果において、本発明に係る助剤が腎疾患に列し
て優れた効果をあられずことが示されている。

出願人　株式会社　メ　デ　り　ス 同　丹羽　利充

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）腎糸球体基底膜及び／又は腎糸球体内皮細胞膜に
   対して選択特異的に結合するモノクローナル抗体から、
   補体結合部位を除いた部分に、血小板凝集抑制剤、抗凝
   固剤若しくは血栓溶解剤を結合させたものを、主成分と
   して有することを特徴とする腎疾患に対する治療薬。
2. （２）前記補体結合部位を除いた部分が、Ｆａｂ。 Ｆ（ａｂ’　）２．Ｆａｂ’またはそれらを更に細く分
   解したものであって、なお抗原結合！９１１位を有する
   ものである特許請求の範囲第１項記載の治療薬。