JPS6038111B2 - 固定依存性細胞の培養法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定（ａｎｃｈｏｒａ鞍）依存性細胞、すなわ
ち基質上で１又は２以上の層として通常生育され、そし
て懸濁液中では生育され得ない種類の細胞の培養法に関
する。

ここで固定依存性細胞とはデキストラン、ＤＥＡＥセル
ロースまたはポリスチレンのような基質に付着後にのみ
ィンビトロで増殖するであろう細胞を意味する。固定依
存性細胞は懸濁培養では生き残るとしても増殖はしない
。たとえば線維芽細胞、上皮細胞または賢細胞が固定依
存性細胞である。細胞生物学の発展により、種々の高等
生物の固定依存性細胞が病気治療に顕著な潜在的又は現
実的効用を有する少量の物質、例えばインターフェロン
を産生することが示されて来た。

このような細胞は研究の目的にも有用である。このよう
な細胞培養では既存の微生物による汚染又はその他の汚
染の危険性がある。

また、多くの場合、細胞培養により産生される興味ある
物質の量は極めて少ない。固定依存性細胞は懸濁培養と
異なり大量には培養できないので、このような細胞によ
って産生される著量の興味ある物質の生産に必要な大量
の細胞の実際的生育法は現存しないと認められる。現在
、正常な線維芽細胞及びある種の腎ならびに上皮細胞の
ような固定依存性細胞は基質上で培養せざるを得ない。

基質として用いるプラスチックシートは商業的に入手可
能である。ある種の固定依存性細胞はこのシートが単層
で覆われるまで繁殖し、やがて増殖しなくなる。その他
の細胞は増殖を続けて、最初の層の上にさらに１又は２
以上の層を形成する。本発明は懸濁液中で固定依存性細
胞を培養して、単層培養に比較して単位塔地容量あたり
大量の細胞を生育し得る方法を提供するものである。

本発明によれば、固定依存性細胞の供給源となる培養物
が半透膜からなる複数のマイクロカプセル内に充填され
てカプセル化される。膜が選ばれた上限透過率を有する
ように膜の合成を調節する。すなわち、膜が、例えば２
×１びダルトルまでの分子量を有する分子を通過させる
が、より高分子の物質の通過を阻止するに足る大きさの
マイクロ細孔を規定するように膜の合成を調節する。カ
プセル膜は、細胞を高分子量の血清成分と共に閉込める
マイクロ環境を規定する。しかし、このマイクロ環境は
、アミノ酸のような低分子量の細胞栄養への細胞の接近
を可能にし、そして低分子量の細胞代謝産物の環境外へ
の流出を可能にするものである。次いで、細胞を含むマ
イクロカプセルを慣用の培地に分散させる。

カプセル膜の内側表面及び／又はマイクロカプセル内に
含まれるある種の高分子量の水分敬性物質は、細胞が付
着する基質として働く。カプセルの外側の培地の容量に
対するカプセルの表面積の割合が極めて大きいので、各
細胞は必要な栄養に十分接近でき、そして細胞が生育し
得る面積は慣用の単層培養に比べて増大する。一般に、
マイクロカプセルの平均直径は数ム〜１肋又はそれ以上
の間で変化し得る。好ましい平均的大きさは直径が１０
０〜５００仏台である。コラーゲン等のような固定基質
がカプセル内に含まれていると、線維芽細胞もカプセル
膜の内側に生成し、そして正常な線維芽細胞の形態を呈
する。本発明の目的は固定依存性細胞の改良培養法を提
供することである。

その他の目的は、試験管内で生育した固定依存性又は接
触抑制細胞の収量を改良することである。その他の目的
は、細胞生育培地の容量全体にわたって固定依存性細胞
のための基質として適する大きな表面積を与えることで
ある。その他の目的は、インターフェロンを産生し得る
細胞の生育法を提供することである。これらの目的及び
他の目的ならびに本発明の特徴を以下の説明及び唯一の
図が写真（２００倍）である図面から明示する。この写
真は本発明によってマイクロカプセル中で生育した固定
依存性細胞を示し、そして伝統的な線維芽細胞の形態を
設明するものである。本発明の広い概念は、個々の細胞
又は一群の細胞の囲りに複数の半透膜を設けて、細胞が
固着し得る広い表面積の基質として作用させ、及び高分
子量の物質をマイクロカプセル内に閉込めて固定基質と
して作用させることである。

本明細書中に教示されているように、懸濁液中で生育す
る細胞もカプセル化することができる。マイクロカプセ
ルは、少なくとも培地の高分子量成分と共に細胞のため
のマイクロ環境として働き、そして細胞をカプセル外の
水性培地と分離する。微生物及びその他の比較的大きい
汚染物はこの膜を透過できない。線総芽細胞、上皮又は
賢細胞のような０南乳類起原の固定依存性細胞は、成長
を続けるために血清成分の存在を要求する。

この成分の一部は膜の上限透過度を超える分子量を有す
る。このような成分はカプセル化された細胞と共に含ま
れ得るが、カプセル外の培地中に存在させる必要はない
。また、マイクロカプセル内で固定基質として働く高分
子量の物質には、結合組織の主成分である天然タンパク
質のコラーゲンが首尾よく用いられて来た。その他の適
合する高分子量の水分数性タンパク質、例えばポリリジ
ンも使用し得る。タンパク質が遊離のアミ／基を有する
なら、後述のように膜形成中に水溶性ゴム質と反応させ
てタンパク質を水落性にすることができる。このような
物質の使用はカプセル内部にマトリックスを生じるもの
と考えられる。このような物質を含めることにより、カ
プセル膜の内側周辺での生育に代って、又はこの生育に
加えて細胞がカプセル内部で生育する際にカプセル内の
細胞濃度を向上させることが可能である。次いで、カプ
セル化した供給源となる培養物を慣用の培養物の生育に
用いられる種類の適当な生育培地中に懸濁させる。

細胞によって摂取されない血清タンパク質はカプセル外
培地から除かれてよい。しかし、ｐＨ、温度、イオン濃
度等は慣用の培地と同じであるべきである。酸素及びＣ
０２、移動は、これらの溶解した気体が膜を自由に透過
するので、慣用の培養と同じ方法で促進させ得る。カプ
セル化した細胞培養物のインキュベーション（溢鷹）に
より細胞の有糸分裂が生じる。線縦芽細胞の成長は伝統
的な線維芽細胞の形態を呈し、膜の内側又はカプセルに
含まれる固着基質上に細胞列を形成する。必要に応じて
連続的又は断続的に、カプセル外の培地を変えることに
よって新鮮な生育培地を供給する。培養の目的が興味あ
る細胞代謝産物の生産にあるときは、分子量又は膜の上
限透過度に応じて、カプセル内容物又はカプセル外塔地
のいずれかから代謝産物を取得する。本方法の好ましい
具体例では、膜は細胞に害を与えずに選択的に破壊され
得る種類のものである。この膜は所望時にカプセルから
細胞を放出させる。成長期の後に細胞を放出する理由の
一つは、細胞による興味ある物質の産生を刺激するため
である。

一例として、ヒトの線維芽細胞、白血球、又はリンパ芽
球細胞からのインターフェロンの生産がある。これらの
細胞はある種のウイルス又は高分子量の核酸による処理
でインターフェロンの排出が誘発される。このような状
況では、膜の上限透過度が誘発因子の高分子量以下であ
れば、カプセル化前に細胞をインターフェロン譲発処理
に付すできであり、或は細胞の培養後にカプセル膜を選
択的に破って、このような高分子量の物質が細胞と接触
するようにしなければならない。本発明の方法は、進行
中の成長力に同時に逆効果を与えることなく細胞周辺に
半透膜を形成する能力に依存している。

適当なカプセル化の一方法を以下詳述する。細胞のカプ
セル化 カプセル化すべき組織又は細胞を、含まれる細胞の種類
に生育に好ましくは水性塔地中に懸濁させる。

この目的にかなう培地は商業的に入手可能である。カプ
セル化すべき物質の平均直径は数ｒ〜約１肋の間で広く
変化し得る。しかし、１００〜５００仏の範囲にある大
きさのカプセルで最もよい結果が得られる。ヒト又は動
物起原の線雛芽細胞、啓細胞及び上皮細胞のような個々
の固定依存性細胞を所望によりカプセル化してよい。ま
た、白血球、リンパ芽球、総べータ細胞、アルファ一細
胞、デルタ細胞のような細胞、これらの種々の割合の混
合物、又は他の組織単位をカプセル化してもよい。この
ような生体の進行中の成長力は、特に、要求される栄養
の取り易さ、酸素移動、培地中における毒性物質の不在
、及び培地のｐＨに依存する。

従来、同時にカプセル化しつつ、このような生体を生理
学的に適合する環境に保つことは可能ではなかった。問
題は、膜形成に要求される条件が組織に対して致命的又
は有害であり、そしてアメリカの特許出願第９５３，４
１３号及び第２４，６０び号の発明がなされる以前には
、組織を健全な状態で生存させておく膿形成法がなかっ
た点である。しかし、生きた組織と生理学的に適合し、
かつ水不落・性にして形状を保つた凝集体を形成し得る
ある種の水瀞怪物質を用いて、個々の細胞又は一群の細
胞の囲りに「一時的カプセル」又は保護障壁層を形成で
きること、及びこの一時的カプセルを処理して、細胞に
損傷を与えずにより恒久的な半透腰を細胞周辺に設ける
ことを見いだした。

このような物質は、典型的には１．の重量％台以下の濃
度で組織培地に加えられる。この培地は、さらに供給源
となる培養物、（必要に応じて）血清成分、及び任意に
は固定基質として作用するコラ−ゲン又はその他の高分
子量の水溶性物質を含んでいる。基質として用いられる
物質の濃度は約１０〃ｇ／机【〜１の９／の‘の範囲に
あるべきであるが、好ましくは１００〜５００ムｇ／の
【台である。次いで、この溶液は組織とその培地とを含
む液滴に形成され、そして直ちに少なくとも表面層が水
に不溶化及びゲル化される。その後、形状を保持した一
時的カプセルには、より恒久的膜が形成されるが、この
膜は、損傷ないこ組織の解放が望ましいときは、続いて
選択的に破ること−ができる。一時的カプセルを形成す
るのに用いる物質が透過性である場合は、恒久的膜の形
成後にカプセル内部を再び液化してもよい。この再液化
は、堵地内で再び物質が可溶となる条件にすることによ
って行なう。一時的カプセルを形成するのに用いる物質
は、イオン性環境又は濃度の変化により、形状を保持し
た物体に変え得るいかなる無毒の水溶性物質であっても
よい。

この物質は、さらに、複数の腸イオン性の基を有する重
合体と塩を生成することによって反応し得る複数のイオ
ン化し易い陰イオン残基、例えばカルボキシル基を含む
べきである。後述の通り、この種の物質の使用につに、
一時カプセルの表面層に問題を生ずることないこ、選ば
れた上限透過度（一般に１００，０００〜１５０，００
０ダルトン以上でない）を有する恒久的膜を設けるこが
できる。本発明で一般的カプセルを形成するのに好まし
い物質は、酸性で水溶‘性の天然又は合成の多糖類ゴム
質である。

このような物質は商業的に入手可能である。これらの物
質は、典型的には植物質から抽出され、そしていよいよ
各種食品の添加剤として用いられる。アルギン酸ナトリ
ウムは本発明で好ましい水溶性ゴム質である。１５０，
０００十ダルトンの範囲の分子量を有するアルギン酸塩
も用いることができるが、分子的大きさ及び粘度のため
に、通常、細かに形成されたカプセル膜を透過すること
が不可能である。

より低分子量のアルギン酸塩、例えば、５０，０００〜
８０，０００ダルトンのものは、十分な紬孔率を有する
膜を通して拡散することによりカプセル内部から容易に
除去されるので好ましい。その他の使用可能なゴム質に
は、グアーゴム、カラゲナン、ペクチン、トラガカント
ゴム、又はキサンタンゴムの酸性画分が含まれる。これ
らの物質はグリコシド結合した糖類を含む。これらの遊
離の酸基は、いまいまナトリウム型のようなアルカリ金
属イオン型で存在する。アルカリ金属イオンをカルシウ
ム又はストロンチゥムのような多価イオンと交換すると
、水落性の多糖類分子が「橋かけ」されて水に不溶の形
状を保持したゲルを形成する。このゲルは、イオン交換
によるが、又は金属イオン封鎖剤を用いて、イオンの除
去時に再び可溶化できる。本質的には酸性ゴム質と塩を
生じ得るいかなる多価イオンも使用可能であるが、生理
学的に適合するイオン、例えばカルシウムを用いること
が好ましい。このようなイオンの使用は組織を生きた状
態で保存するのに役立つ。その他の多価イオンも使用可
能である。マグネシウムイオンはアルギン酸ナトリウム
のゲル化に有効ではない。典型的な溶液組成は、堵地中
の細胞培養物（固定基質を含むもの又は含まないもの）
と生理的食塩水中１〜２％のゴム溶液とを等量含む。

アルギン酸ナトリウムを用いる場合、１．０〜１．５％
溶液が使用上好都合である。コラーゲン又はポリベプチ
ドは天然又は合成のいずれも細胞培養物に含むことがで
き、そして最終的に形成するカプセル内部に閉込められ
る。複数の陰イオン性の基を有する重合体、例えばポリ
リジンを用いると、陽イオン性の基は水溶性ゴム質の陰
イオン性部位と反応して、ゴム質とからみ合った実質的
に水に不溶のマトリックスを形成する。このような物質
の好ましい濃度は懸濁液（ゴム質溶液を含む）１叫あた
り１００〜５００ｒｇ台である。カプセル化法の次の工
程で、組織を含むゴム質溶液は所望の大きさの液滴に成
形され、そして直ちにゲル化されて形状を保持した球状
又は長球状物体を生じる。

液滴の形成は次のように行なう。多価陽イオンの水溶液
、例えば１．５％のＣａＣ１２溶液を含む管に、液滴形
成装置を支えるストッパーを取付ける。この装置は上部
吸気ノズルを有する外被とストッパー上に固定した細長
い中空体の摩擦要素とからなる。ステップ・ポンプきの
１０ｃｃ注入器を、例えば、外被の長手方向に貫通する
内径０．２５４肌（０．０１インチ）のテフロン被覆針
によって外被に取付ける。外被の内部は、針の先端がェ
アナィフとして働く一定の空気層流に触れるように設計
されている。使用時には、カプセル化すべき物質を含む
溶液を注入器に満たし、スチップ・ポンプを作動させて
溶液の液滴を針の先端から漸増的に送り出す。各液滴は
気流により「切断」され、そして約２．＆枕落下してＣ
ａＣ１２溶液中に入る。この溶液中で、液滴はカルシウ
ムイオンの吸収により直ちにゲル化する。針の先端とＣ
ａＣ１２溶液の表面との間の距離は、この場合、アルギ
ン酸ナトリウム／細胞懸濁液を物理的に最も好ましい形
状、すなわち球状（最小表面積での最大容積）にするに
十分な大きさである。管内の空気はストッパー内の閉口
部を流れる。これによってゲルの「橋かけ」が生じ、そ
して懸濁した組織と培地を含む高粘度の形状を保持した
一時的カプセルが形成する。カプセルは溶液中で分離層
として集まり、そして吸引分離される。本方法の次の工
程では、一時的カプセルの表面周辺に「橋かけ」表面層
によって半透膜が設けられる。

この工程はゲル化した一時的カプセルをゲル分子内で陰
イオン性官能基と反応する腸イオン性の基を含む重合体
の水溶液で処理することによって行なう。遊離のィミン
又はアミ／基のような酸反応基を含む重合体が好ましい
。この場合、多糖類ゴム質はカルボキシル基とアミン又
はィミン基の間の相互作用（塩結合の形成）によって橋
かけされる。用いる橋かけ重合体の分子量を選ぶこと、
及び重合体溶液の濃度と処理時間及び温度を調節するこ
とによって透過度を制御できる。低分子量を有する重合
体溶液は、与えられた時間内で、高分子量の重合体より
も一時的カプセル内に多く透過する。橋かけ剤の浸透度
は得られる透過度と相関関係がある。一般に、高分子量
になるほど透過度は小さくなり、細孔度は大きくなる。
反応の時間、重合体溶液の濃度、及び所望の透過度に応
じて、３，０００〜１００，０００ダルトンの分子量範
囲にある重合体を広く用いることができる。約３５，０
００ダルトンの平均分子量、ポリリジンを使用する有効
な反応条件の一つの組合せとして、０．０１６７％のポ
リリジンを含む生理学的食塩水を婿拝しながら２分間反
応させる。この反応により、約１００，０００ダルトン
の上限透過度を有する膜が生じる。与えられた系内で透
過度を調節するのに通した最適反応条件は、上記の目安
から経験的に容易に決定できる。この方法を用いると、
膜の上限透過度を一般に約１５０，０００ダルトン以下
の選ばれた水準に定めることが可能である。適当な橋か
け重合体の例には、天然又は合成のいずれかのタンパク
質及びポリベプチドであって、遊離のアミノ基又はィミ
ノ基を有するもの、ポリエチレンァミン、ポリエチレン
イミン、及びポリビニルアミンが含まれる。

Ｄ及びＬ型の両ポリリジンは有用である。ポリアルギニ
ン、ポリシトルリン、又はポリオルニチンのようなタン
パク質も使用し得る。正の高い電荷密度範囲にある重合
体、例えばポリビニルアミンは、ゲル分子の陰イオン性
の基に急激に密着して安定な膜を形成するが、この膜は
若千破れにくい。ゴム質又は両性イオン緩衝剤の希薄溶
液を用いた処理は、カプセルに凝集化の傾向を与える恐
れのある遊離のアミノ基をカプセル表面に固定する。

カプセル化のこの時点で、ゴム質のゲル化溶液を取囲む
半透膜、細胞型に適合する培地、細胞、及び任意にコラ
ーゲン又はその他の固定基質の内部マトリックスを含む
カプセルを回収することができる。

物質移動はカプセル内及び膿を通じて行なわれるはずな
ので、ゲルを再び液化して水溶性型にすることが好まし
い。この操作は、ゴム質が液体となる条件、例えば、内
部のゲルからカルシウム又はその他の多価陽イオンを除
去する条件を再び確立することによって行なう。カプセ
ル内の培地は、アルカリ金属イオン及び水素イオンを含
むリン酸塩緩衝食塩水に単にカプセルを浸債することに
よって再可溶化できる。燈拝しつつカプセルを溶液中に
浸債すると、１価のイオンはカルシウム又はその他の多
価イオンとイオン交換する。クエン酸ナトリウム溶液を
同じ目的で用いることができ、そしてこの溶液は２価イ
オンを隠ぺいするように作用する。上記のようにカプセ
ル化した細胞培養物は、含まれる特定の細胞型のあらゆ
る要求を満たすように特別に調製した生育塔地に懸濁さ
せ、そして正常な試験管内代謝及び有糸分裂の進行を続
けさせる。

培地が血清成分のような高分子量成分の環境を要求する
なら、これらの成分をカプセル外の培地から除去する。
典型的には、細胞が通常摂取する成分は比較的低分子量
のものであり、そして容易にカプセル膜を通って成分が
細胞膜を透過する細胞のマイクロ環境内に拡散する。カ
プセル内の培地に排出される細胞の代謝産物は、もしこ
れらの産物がカプセル膜の上限透過度以下の分子量を有
するならば、同機に膜を通って拡散し、そしてカプセル
外の培地内で凝集する。カプセル化した細胞は、例えば
、慣用の培地と同じ温度、舟及びイオン的環境の条件下
に成長させる。細胞の代謝産物は、慣用の方法によりカ
プセル外の培地又はカプセル内部から取得する。しかし
、本明細書記載の培養法は下記の利点を有する。１ 培
養物の細胞は、膜の上限透過度を超える大きさの因子に
よる汚染から保護される。

このことは、他の微生物はカプセル内に閉じ込められた
細胞内に到達し得ないので、通常、培養法に特有の殺菌
の必要性が若千緩和されることを意味する。２ カプセ
ルは、事実上、次のような環境内に細胞を固定化する。

すなわち、この環境は包含された高分子量の物質を閉込
め、しかも低分子量の細胞栄養及び産物が容易に除去及
び導入されるものである。この環境は、所望により、細
胞に被害を与えることなく、栄養塔地の断続的又は連続
的な回収及び補給を可能にする。３ 細胞が産生した興
味ある物質がより容易に回収される。

カプセル膜を透過するに足る小ささの分子量を有する細
胞産物がカプセル外の堵地内で栄養分との混合物として
集まる。しかし、高分子量の血清成分等はカプセル外の
培地に放出されず、従って興味ある細胞産物の回収が簡
単になる。膜の上限透過度を超える分子量の細胞産物は
カプセル内に集まる。このような産物は、例えば、後述
の方法を用いて、カプセルを単離し、続いて膜を選択的
に破ることにより、比較的濃縮された状態で回収される
。４ カプセル内部は細胞分裂に十分適した環境を与え
る。

懸濁培養物がカプセル内で有糸分裂を続けることが観察
される。通常の培養物中で２次元的な単層として成長す
る固定依存性細胞は、増殖してカプセル内に列を形成す
る。このような細胞は内側表面を基質として利用し、及
びカプセル内に設けられた上記の高分子量物質に付着す
る。そのため、慣用の培養に比べて細胞密度が著しく高
くなる。このような細胞集落の継続する成長力は、カプ
セルの容積に対する表面積の比が極めて大きく、従って
すべての細胞が必要な栄養、酸素等に到達できる事実に
よって裏付けられる。ある場合には、カプセル膜を選択
的に破つて、損傷を与えずに細胞を放出するとが有利で
ある。

特記すべき一例を示せば、インターフェロン（ＩＮＦ）
の製造の場合である。ＷＦを産生し得る細胞は、ｍＦ産
生段階の準備としてある種のウイルス又は核酸で処理し
なければならない。また、数種の川Ｆ議導法では、培養
物に試剤を加えてタンパク質合成を阻害する。従って、
培養工程の生育段階はＩＮＦ譲導段階とは極めて異なる
条件下で行なわねばならない。…Ｆ誘導に用いた物質が
（ウイルス誘導の場合のように）カプセル膜の上限透過
度を超える分子量のものであると、誘導工程をカプセル
化細胞培養物の中で行なうことはできない。従って、ｍ
Ｆ産生細胞がカプセル内で成長したなら、膜を破ること
により細胞を放出して誘導工程に付すべきであろう。膜
の破壊 上記の種類の膜内に閉込めた細胞は、カプセル化細胞に
著しい逆効果を与えない性質を有する商業的に入手可能
な試剤を包含した方法につて放出させることができる。

まず、カプセルを懸濁培地から分離し、十分に洗ってマ
イクロカプセルの外側に存在する汚染物を除去し、次い
で、磯拝しつつ、カルシウムイオンのような１原子性の
多価陽イオンとポリスルホン酸又はポリリン酸の塩のよ
うな複数の陰イオン性残基を有する重合体との混合溶液
中に分散させる。この工程には、天然のスルホン化多糖
類であるへパリンが好ましい。使用する重合体の陰イオ
ン性電荷密度は、膜を形成するのに最初に用いた酸性ゴ
ム質の電荷密度と同等か、又は好ましくはこの密度以上
であるべきである。重合体の分子量は、少なくとも膜形
成に用いた複数の腸イオン性基を有する重合体の分子量
に匹敵し、そして好ましくはこの分子量以上であるべき
である。混合液中のカプセル懸濁液の内部では、水港性
ゴム費上の陰イオン性部位について、カルシウムイオン
と膿形成に用いた腸イオン性の重合体鎖とが競合する。
同時に、重合鎖上の陽イオン性部位について、溶液中に
溶けた複数の陰イオン性残基を有するへパリン又はその
他の重合体と膜の陰イオン性ゴム質とが競合する。この
結果、例えば、ポリリジン及びへパリンの水分散性又は
好ましくは水瀞性の錯体、及び１原子価陽イオンとゲル
の分子との会合が生じる。この工程は、次の金属イオン
封鎖剤に暴露させる際に膜を溶解可能にする。

この封鎖剤はゲルから１原子価イオンを取上げることに
よって破壊工程を完了させるものである。培地中に残存
するカプセル膜の破片があれば、細胞から容易に分離で
きる。選択的破壊工程の第一段階に用いる一般的に好ま
しい溶液は、塩化カルシウム１．１％（Ｗ／Ｖ）及び溶
液１のＺあたり５００〜１，５０■単位の間のへパリン
を含有する。

マイクロカプセルの内容物をこの溶液に加えて「懸濁液
の全容量の約２０％〜３０％の間を占めるに足るように
する。塩化カルシウム及びへパリンは、両試剤とも多く
の細胞と生理学的に適合し、そのため細胞を損傷する危
険性が少ないので、好ましい。ストロンチウム塩又はそ
の他の多価陽イオン（ただしＭｇ十十イオンを除く）を
上記の種類のポリスルホン酸塩又はポリリン酸塩と共に
用いてもよい。一般に、この工程で用いる１原子価イオ
ン及び陰イオン性重合体の濃度は広い範囲で変化し得る
。

最適濃度は経験的に及び暴露時間ならびに膜形成に用い
た特定の重合体に応じて容易に決定できる。選択的破壊
を行なうための一般的に好ましい金属イオン封鎖剤はク
エン酸ナトリウムであるが、クエン酸のその他のアルカ
リ金属塩及びＥＤＴＡアルカリ金属塩を用いてもよい。

クエン酸ナトリウムを用いる場合、最適濃度は５０〜６
０ｍＭ台である。細胞の損傷を少なくするために、クエ
ン酸塩又はその他の金属イオン封鎖剤を等張食塩水に溶
かすことが好ましい。下記実施例により本発明を詳述す
るが、これにより本発明を限定するものではない。

例１ ヒト線総芽細砲 慣用の単分子膜培養物をトリプトフアン及びＥＤＴＡを
用いて３７０で５分間、公知の方法で処理して得たヒト
線織芽細胞を、４０％（Ｖ／Ｖ）の精製した胎児ウシ血
清、０．８％のアルギン酸ナトリウム（シグマ）及び２
００山ｇ／の‘の精製子牛皮コラーゲンを加えた完全生
育塔地〔ＣＭＬＲＩ９６９，コンノート・ラボラトリー
ズ（ＣｏｎＭｕ鱗【いｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）〕に懸濁
される。

細胞懸濁液の密度は約１．５×１０７細胞／叫である。
次いで、前記のように液滴形成装置を使用することによ
り、塩化カルシウムの１．５％溶液を用いて液瓶を形成
させる。

直径５０〜５００〃台の液滴は針の先端を離れ、そして
カルシウム溶液中に入ると直ちにゲル化する。５分後、
上燈液を吸引除去する。次いで、１％のＣａＣ１２２礎
部で希釈した０．６％ＮａＣ１（等張液、ｐＨ＝８．２
）中に２％の２一（シクロヘキシルアミノ）ェタンスル
ホン酸緩衝溶液１部を含む溶液１５のＺ入りのビーカー
に、ゲル化したカプセルを移す。次いで、生理学的食塩
水中に０．００５％（Ｗ／Ｖ）のポリリジン（平均分子
量４３，０００ダルトン）を含む溶液３２の‘の中にカ
プセルを移す。

３分後、ポリリジン溶液を煩潟炉過する。

続いて、得られた「恒久的一半透膜を有するカプセルを
１％ＣａＣ１２で２回、及び生理学的食塩水で２回洗い
、そしてアルギン酸ナトリウムの０．０３％溶液１０叫
と混合する。カプセルは凝集を阻害し、そしてすべて線
総芽細胞を含むものと考えられる。カプセル内部のゲル
は、カプセル化を食塩水とクエン酸緩衝剤との混合物（
ｐＨ７．４）に５分間浸潰することによって再液化する
。上記の手順はすべて２２〜３７０で行なつｏ顕微鏡下
で、これらのカプセルは細胞を包む極めて薄い膜を含む
ことが観察される。

約１００，０００までの分子量を有する分子がこの膜を
透過可能である。得られたカプセルは１０％の胎児ゥシ
血清を加えたＣＭＬＲ−１９６９中に懸濁させる。

３７０で４〜５日間培養した後、カプセルを顕微鏡観察
すると、カプセルは有糸分裂を終えた線総芽細胞を含み
、そしてマイクロカプセル内で伝統的な線総芽細胞の形
態を呈することが判明する。

約５００〜１０００カプセル／泌を含むマイクロカプセ
ル懸濁液１０の【部分を沈降させることにより、細胞を
損傷せずにカプセル膜を破ることができる。

培地を吸引炉別した後、カプセルを食塩水で２回洗う。
次いで、洗ったカプセルを、１００■単位／叫のへパリ
ン及び１．１％（Ｗ／Ｖ）ＣａＣ１２を含むアリコート
３．０の‘と混合する。この懸濁液を３７ｏ０で３分間
縄拝し、その後、カプセルを沈降させ、上燈液を吸引炉
別し〜 そして０．１８ＭのＮａＣ１３．０の上を用い
てカプセルを２回洗う。２回目の洗液を吸引炉過した後
、１１伽Ｍのクエン酸ナトリウム及び０．１９ＭのＮａ
ＣＩを等容量含む混合溶液（ｐＨ＝７．４）２．０叫を
カプセルと混合する。

この混合物を手で渦動させて膜の破壊を促し、この後、
細胞を培地で２回洗う。線総芽細胞は、ビルセック（Ｖ
ｉｌｃｅｋ）法に従ってＩＮＦ−Ｂ超誘導処理に付す。

５％のＣ０２雰囲気（空気９５％）中、ウィスコンシン
州ミルウオーキーのピー・エル・バイオケミカルズ（Ｐ
ＬＢｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手し得る二重ラ
センＲＮＡ（公知のＩＮＦ誘導剤）であるＰｏｌｙｌ−
ＰｏｌｙＣＩＯＯ仏ｇ／泌及びシクロヘキシミド〔カリ
ホルニア州ラジョラの力ルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ）のタンパク質合成阻害剤〕５０仏ｇ／の‘の存
在下に３７ｏ０で１時間、上記の細胞懸濁液を培養する
。

１時間後、シクロヘキシミド５０ｒｇ／の‘を含む培地
（ＣＭＬＲ−１９６９）中で洗い、次いで、５％のＣ０
２雰囲気下に３７０で３時間、同じ溶液中に懸濁させる
。

この培養が完了した時点で洗浄工程を操返えし、そして
シクロヘキシミド５０レｇ／の【及びアクチノマイシン
Ｄ（カルバィオケミの公知ＲＮＡ合成阻害剤）５一ｇ／
の‘を含む培地に懸濁させ、そして５％のＣ０２雰囲気
下に３７℃で２時間培養する。次いで、細胞を培地中で
２回洗い、そして血清を含まない培地中３７ｏ０で１８
〜２蝿時間懸濁させるが、この間に線絡芽細胞はＩＮＦ
一８を分泌する。ＩＮＦ−８は２１，０００ダルトン台
の分子量を有し、そしてカプセル外の渚地から取得でき
る。沈降係数虫のＰｏｌｙｌ−ＰｏｃｌｙＣ（Ｐｏｌｙ
ｌ及びＰｏｌｙＣをアニール化して二重ラセンＲＮＡを
形成させたもの）を用いて実験を行なったところ、培養
物中の１び個の細胞あたり２，５０山単位のＩＮＦ−８
が生じた。

１あのＰｏＭ−Ｐｏｌ丈（取得時は二重ラセン）を用い
た第２回目の実験でも同じ収量を得た。

その他の具体例は特許請求の範囲に包含される。

【図面の簡単な説明】

第１図はマイクロカプセル中で生育した細胞の拡大写真
である。 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 固定依存性細胞の培養法において、該方法がＡ 固
   定基質材料と、高分子成分（Ａ）（この分子量は選ばれ
   た水準を超える）を含む培地に前記細胞を懸濁させ、Ｂ
   前記成分（Ａ）と固定基質材料の透過を阻止し、かつ
   前記の選ばれた水準以下の分子量を有する分子を膜透過
   させ得るに足る半透性の上限を有する複数の半透膜内に
   前記細胞を、前記固定基質材料を含む前記培地と共にカ
   プセル化し、Ｃ 細胞が同化できるアミノ酸、塩および
   ビタミンからなる成分（Ｂ）（但し該成分（Ｂ）の分子
   量は前記選ばれた水準以下である）を含む培地に工程Ｂ
   の生成物を懸濁させ、Ｄ 前記細胞を前記膜内で有糸分
   裂に付させる諸工程よりなる、培養法。 ２ 固定基質がタンパク質である、特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３ 固定基質がコラーゲンである、特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ４ 固定基質が子牛皮コラーゲンであり、そして懸濁液
   中に約１０μｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で
   含まれる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 固定依存性細胞の培養法において、該方法がＡ 固
   定基質材料と、高分子成分（Ａ）（この分子量は選ばれ
   た水準を超える）を含む培地に前記細胞を懸濁させ、Ｂ
   前記成分（Ａ）と固定基質材料の透過を阻止し、かつ
   前記の選ばれた水準以下の分子量を有する分子を膜透過
   させ得るに足る半透性の上限を有する複数の半透膜内に
   前記細胞を、前記固定基質材料を含む前記培地と共にカ
   プセル化し、Ｃ 細胞が同化できるアミノ酸、塩および
   ビタミンからなる成分（Ｂ）（但し該成分量は前記選ば
   れた水準以下である）を含む培地に工程Ｂの生成物を濁
   懸させ、Ｄ 前記細胞を前記膜内で有糸分裂に付させ、
   そしてＥ 膜を選択的に被つて細胞を解放する、諸工程
   よりなる培養法。 ６ 細胞が線維芽細胞よりなる、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ７ 成分（Ａ）が血清成分よりなる、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ８ 細胞がインターフエロンを分泌し得るヒト線維芽細
   胞よりなる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９ 固定依存性細胞の培養法において、該方法がＡ 固
   定基質材料と、高分子成分（Ａ）（この分子量は選ばれ
   た水準を超える）を含む培地に前記細胞を懸濁させ、Ｂ
   前記成分（Ａ）と固定基質材料の透過を阻止し、かつ
   前記の選ばれた水準以下の分子量を有する分子を膜透過
   させ得るに足る半透性の上限を有する複数の半透膜内に
   前記細胞を、前記固定基質材料を含む前記培地と共にカ
   プセル化し、Ｃ 細胞が同化できるアミノ酸、塩および
   ビタミンからなる成分（Ｂ）（但し該成分（Ｂ）の分子
   量は前記選ばれた水準以下である）を含む培地に工程Ｂ
   の生成物を懸濁させ、Ｄ 前記細胞を前記膜内で有糸分
   裂に付させ、Ｅ 膜を選択的に破つて細胞を解放し、Ｆ
   細胞をインターフエロン誘導処理に付し、Ｇ 工程Ｆ
   から生じる細胞を培地で培養し、そしてＨ 工程Ｇの培
   地からインターフエロンを収得する、諸工程よりなる培
   養法。 １０ カプセル化工程の間に１００〜５００μの範囲の
   平均直径を有する回転楕円膜が形成される、特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 １１ 固定基質が、複数の遊離陽イオン基を有するタン
   パク質よりなる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １２ 選ばれた水準が約２．０×１０＿５ダルトン以下
   である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３ 選ばれた水準が約１×１０＿５ダルトン以下であ
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。