JPS6034200A - τ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＥＣ
２，８，２，２：以下「γ−ＧＴＰＪと略称する。）活
性の測定法に関する。具体的にはＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ（以下ｒＧＬＸＤＪと略称することもある。）
を利用するγ−ＧＴＰ活性の測定法に関する。

ｆ−ＧＴＰは生体内でγ−グルタミルペプチドの代謝に
関与する酵素で、グルタチオンなとのｒ−グルタミルベ
ブチドを加水分解し、同時にｒ−グルタミル基を他のペ
プチドあるいはアミノ酸に転移させる作用を有する酵素
である。γ−ＧＴＰは生体内の各組織に広く分布する酵
素であるが、体液、特に血清中のｒ−ＧＴＰ活性の測定
は肝硬変、アルコール性肝炎、肝癌などの肝疾患の診断
および病態把握の手段として重要であり、広〈実施され
ている。

従来技術 ｒ−ＧＴＰ活性の測定法としてはグルタチオンなどのペ
プチドを基質として用い、クロマトグラフィー、ガス分
析などの繁雑な方法で活性測定を行う方法も知られてい
るが、臨床検査においては合成基質であるγ−グルタミ
ルアミドを基質として用い、γ−ＧＴＰの作用によって
遊離するアミン類を定量する方法が一般に用いられてい
る。代表的な方法としては、（１）γ−グルタミルーｐ
°−ニトロアニリドを基質とする方法、および（２）γ
−グルタミルーα−ナフチルアミドもしくはｒ−グルタ
ミル−β−ナフチルアミドを基質とする方法が知られて
いる。

（１）の方法においてγ−ＧＴＰの作用によって基質か
ら遊離するｐ−二トロアニリンを定量する方法としては
、（１−１）黄色のｐ−ニトロアニリンを直接比色定量
するか、（１−２）　Ｉ）−ニトロアニリンをアルデヒ
ド系化合物によって赤色系色調に発色させた後、比色す
る方法が採用されている。これらの方法は、試薬の調製
に際して基質であるγ−グルタミルーｐ−ニトロアニリ
ドが水に難溶性て、溶・解安定性も悪いため、基質濃度
が制限される欠点を有する。さらに、遊離するｐ−ニト
ロアニリンの定量においても（１−１）の方法では、こ
の物質が黄色であるために比色定量において血清成分の
影響を受けやすく、（１−２）の方法では、発色反応に
際して温度を厳密に調節する必要があるなど、煩雑な操
作を要求されるため日常の検査法としての実用性ζこ欠
ける。

（２）の方法においてγ−ＧＴＰの作用によって基質か
ら遊離するａ−も【７くはβ−ナフチルアミンを定量す
る方法としては、これらのアミン類を（２−１）ジアゾ
ニウム塩として比色定置する方法、または（２−２）８
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンと酸化剤
とで発色させて定量する方法などが採用されている。こ
れらの方法は、操作が煩雑であるだりでなく、基質化合
物の原料であり、標準物質でもある前記アミン類がす癌
性を有することから検査法として好ましくない。

以上の方法の他にγ−ＧＴＰ活性の測定法として（８）
アミンオキシダーゼを利用する方法も知られている（特
開昭５８−９６９８号）。すなわち、この方法は基質と
してγ−グルタミルー置換メチルアミド化合物を用い、
γ−ＧＴＰの作用によって遊離する置換メチルアミン化
合物に対応するアミンオキシダーゼを作用させ、酵素反
応に伴う酸素の消費量または過酸化水素もしくはアンモ
ニアの生成量を定量する方法である。この方法は、基質
の入手が困難であり、使用するアミンオキシダーゼの基
質特異性および安定性が必ずしも高くな（、実用的とは
いいがたい。

なお、従来ｆ−ＧＴＰ活性の測定法として、ジペプチド
を基質（ｒ−グルタミル基供与体）として使用する方法
は知られておらず、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを利用す
る方法も知られていない。

発明の概要 要旨 本発明者は、天然に存在するペプチドを基質とするｆ−
ＧＴＰ活性の測定法について鋭意検討した結果、γ−Ｌ
−グルタミル−し一グルタミン酸とｒ−グルタミル基受
容体とを基質として使用し、この基質にγ−ＧＴＰが作
用して遊離するＬ−グルタミン酸に対し、特異性の極め
て高いし一アミノ酸オキシダーゼを作用させ、この反応
に伴う物質の収支を検出することによってγ−ＧＴＰ活
性の測定が可能であることを見出し、本発明を完成した
。

本発明は、ｒ−グルタミル基を供与する基質としてγ−
Ｌ−グルタミル−し一グルタミン酸を使用し、これにｒ
−グルタミルトランスペプチダーゼを作用させ、次いで
遊離するし一グルタミン酸ｌこ対し、Ｌ−グルタミン酸
オキシダーゼを作用させ、反応に伴う酸素の消費量また
は過酸化水素、アンモニアもしくはα−ケトグルタル酸
の生成量を検出することを特徴とするｒ−グルタミルト
ランスペプチダーゼ活性の測定法を提供するものである
。

本発明方法における酵素反応を概略的に示すと以下のと
おりである。

ｒ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−グルタミン酸＋受容体酵素反
応の検出 処遇 ■本発明において使用するγ−ＧＴＰの基質は基本的に
は天然界に存在するものであり、測定されたγ−ＧＴＰ
活性には真の意味でのγ−ＧＴＰ活性が反映される。

■基質は安全な物質であり、かつ入手が容易である。

■本発明のＧＬＸＤによる反応は、臨−床検査等におい
て最も広く実用化されているオキシダーゼ反応であり、
酵素反応の測定も汎用されている方法をそのまま適用で
きる。

■上記ＧＬＸＤはＬ−グルタミン酸に対する基質特異性
が極めて高いので他のアミノ酸が共存する系であ？ても
γ−ＧＴＰの作用で生成したし一グルタミン酸のみを特
異的に測定することができる。

■上記ＧＬＸＤは熱安定性、ｐＨ安定性および保°存安
定性が高く、γ−ＧＴＰ活性測定用の試薬として使用す
る際にも好都合である。

■上記ＧＬＸＤは作用ｐＨ範囲が広く、至適ｐＨが７〜
・８．５であり、中性付近で効率良く作用することから
、至適ｐＨが同様の範囲であるγ−ＧＴＰの反応系との
カップリングが容易である。

また、この酵素反応の生成物である過酸化水素の発色反
応などによる検出も通常中性付近で行われることからも
、上記Ｇ　Ｌ　Ｘ　Ｄは都合が良い。したがって、γ−
ＧＴＰによる酵素反応と上記Ｇ　Ｌ　ＸＤによる酵素反
応と過酸化水素を検出するための反応のうち連続する二
反応あるいは全ての反応を同時に行うことも可能である
。

基質 γ−ＧＴＰのγ−グルタミル基転移反応における基質は
ｒ−グルタミル基供与体とγ−グルタミル基受容体であ
る。

本発明方法はγ−１．−グルタミルーＬ−グルタミン酸
をｒ−グルタミル基を供与する基質（γ−グルタミル基
供与体）として使用することにひとつの特徴を有するも
のである。

γ−グルタミル基受容体としては各種のペプチドまたは
アミノ酸を使用することができる。通常はグリシルアラ
ンンが使用されるが、場合によってはグリシルアラニン
などのその他のジペプチド、グリシルグリシルグリシン
などのトリペプチド、グリシン、アラニン、バリン、ロ
イシン、フェニルアラ÷ンなどのアミノ酸を使用するこ
ともできる。

本発明方法はｆ　−ＧＴＰの作用によって遊離するし一
グルタミン酸を定量するために基質特異性の高いし一ア
ミノ酸オキシダーゼであるし一グルタミン酸オキシダー
ゼを使用することにもうひとつの特徴を有するものであ
る。

本発明において使用されるし一グルタミン酸オキシダー
ゼは基本的には下記反応式で示される作用を示し、Ｌ−
グルタミン酸に対する基質特異性が高（、他のアミノ酸
にはほとんど作用しない酵素であればよい。

Ｌ−グルタミン酸＋０２　＋　Ｈ２０□α−ケトグルタ
ル酸＋ＮＨＢ　−１−Ｈ２Ｏ２Ｌ−グルタミン酸オキシ
ダーゼの具体例としては、本発明者ＩＣよって見出され
た酵素であり、ストレプトマイセス・エスピー　Ｘ−１
１９Ｘ−１１９−６（Ｓｔｒｅｐｔｏ　ＳＰ　、　Ｘ　
−１１９−６；微工研菌奇策６５６０号、ＡＴＣＣ８９
８４８）の培養１３２３〜１８２８　（１９８８）、特
願昭５７−１１２２７１号など参照；この酵素を以下「
本酵素」ということもある。）を例示することができる
。

以下に本酵素の特徴的性質を示す。

本酵素はＬ−グルタミン酸に対する基質特異性が極めて
高く、他のアミノ酸に対しては実質的な作用は示さない
。すなわち、ｐＨ７，４においてはＬ−アスパラギン酸
とＬ−アスパラギンにわずかな活性（Ｌ＝グルタミン酸
に対する活性の０．６〜０．７％）を示すが、Ｌ−グル
タミンを含む他のし一アミノ酸およびＤ−アミノ酸には
全く作用しない。また、ｐＨ６，０においてはＬ−アス
パラギン酸およびＬ−アスパラギンに対しても実質的に
活性を示さない。

本酵素の作用１）Ｈ範囲は広＜（ｐＨ５〜１０）、至適
１）ＨはｐＨ７〜８．５である。すなわち、中性付近で
効率よく作用する酵素である。

本酵素は広いｐＨ範囲において安定である。すなわち、
３７°Ｃ１６０分間保持の条件下ではｐＨ５，５〜１０
．５の範囲において、４５°ｃ、１５分間保持の条件下
ではＩ）Ｈ５，５〜９．５の範囲において、６０°Ｃ１
１５分間保持の条件下ではｐＨ５，５〜７．５の範囲に
おいてそれぞれ安定であった。

本酵素の作用適温の範囲は３０〜６０’Ｃと広く。

作用至適温度は５０°Ｃ付近である。

本酵素の熱安定性は非常に高い。すなゎぢ、ｐＨ５，５
においては６５°Ｃまで安定であり、８５°Ｃても約５
０％の残存活性を示す。Ｉ）Ｈ７，５においては５０°
Ｃまで安定てあり、７５°Ｃても約６０％の残存活性を
示す。ｐＨ９，５においては４５°Ｃまて安定であり、
７０℃で約５０％の残存活性を示す。

本酵素の活性はパラクロロマーキュリベンゾエイトによ
って約４５％阻害されるが、他の通常の阻害剤によって
は阻害されない。

本酵素の製造法の一例は参考例に詳述する。

■ 本発明の測定法は基本約１こは前記のとおりの二段階の
酵素反応から成る。すなわち、（１）γ−Ｌ−グルタミ
ル−し一グルタミン酸およびｒ−グルタミル基受容体を
含有する溶液に測定対象のｒ−ＧＴＰを作用さぜ、γ−
グルタミル基を上記受容体に転移させるとともにＬ−グ
ルタミン酸を遊離させる反応および（２１Ｊ二記反応て
生成したし一グルタミン酸に酸素と水の存在下でＧＬＸ
Ｄを作用させ、過酸化水素、アンモニアおよびα−ケト
グルタル酸を生成させる反応である。

各反応の条件は各酵素が好適に反応するように調節すれ
ばよいが、（１）と（２）の反応条件が同様の範囲であ
れば反応条件を変更せずに同一反応系で連続して反応を
行うことができるので都合が好い。

ｒ−ＧＴＰは至適１）Ｈが７．５−９．０であることが
らＧ　Ｌ　Ｘ　Ｄの反応条件と適合し、（１）と（２）
の反応を同一反応系中で連続して行うことができる。

具体的には、（１）の反応液はγ−Ｌ−グルタミル−し
一グルタミン酸およびグルシルグリシンなどの受容体を
含有し、さらに必要に応じて緩衝剤および塩化マグネシ
ウムを添加してもよい。緩衝剤としてはトリスヒドロキ
シメチルアミノメタン、バルビツール、トリエタノール
アミン、グリシン、りん酸塩、はう酸塩、炭酸塩を使用
することができる。反応液中の各基質の濃度は限定され
ないが、通常、γ−Ｌ−グルタミル−し一グルタミン酸
２〜５０　ｍＭ、γ−グルタミル基受容体５０〜２５０
ｍＭの濃度で使用される。反応はγ−ＧＴＰ反応に好適
な条件、すなわち、通常はｐＨ７，５〜９．０．１５〜
４０°Ｃの範囲の条件で行われる。

（２）の反応は（１）の反応液とＧＬＸＤとを接触させ
ることによって行われる。反応条件は（１）の条件を特
に変更する必要はないが、必要に応じて反応ｐＨ１反応
温度などを変更してもよい。反応は通常、ｐＨ５〜９．
１５〜６０°Ｃの範囲の任意の条件で行われる。

また、（１）および（２）の反応は多層分析フィルムな
どを使用するドライ・システム（化学の領域、３５ｆ４
１．２７８〜２８０　（１９８１））で行ってもよい。

反応に際し、ＧＬＸＤは可溶性酵素または固定化酵素と
して使用される。

固定化酵素は包括法（格子型、マイクロカプセル型など
）、担体結合法（共有結合法、イオン結合法、物理的吸
着など）、架橋法などの一般的方法（「固定化酵素」、
千畑一部編集、昭和５０年３月２０日、■講談社発行）
によって製造することができる。

たとえば、固定化用の担体としてはセルロース（セロフ
ァン、濾紙など）、アセチルセルロース誘導体、各種イ
オン交換セルロース、カラギーナンなとの多糖類；コラ
ーゲン、ゼラチンなどの蛋白質；ポリスチレン、ポリア
ミノスチレン、光硬化樹脂（エチレン性不飽和基を有す
る親水性光硬化樹脂（特公昭５５−４０号、特公昭５５
−２０６７６号）など）、イオン交換樹脂などの合成有
機高分子物質、ガラス（多孔性ガラスピーズなと）、シ
リカなどの無機物質を使用することができる。酵素の固
定化に際し、これらの担体はそのまま使用するか、ある
いは適当な官能基の導入、スペーサーの導入、官能基の
活性化などの前処理を施して使用される。担体と酵素の
結合は、ジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋試
薬（グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアナ
ートなど）を使用する方法によって行うことができる。

また上記のような架橋試薬によって酵素間を架橋するこ
とによっても固定化することかできる。

固定化酵素は膜状、ゲル状、粒状、チップ状、粉末状、
マイクロカプセル状、チューブ状、容器状、繊維状、ホ
ロファイバー状など使用の態様１こ応じた形態に調製さ
れる。たとえば、膜状に調製して酵素電極として、粒状
に調製し、カラム１と充填してリアクター型バイオセン
サーとして、あるいは発色試薬、ゼラチンなどのバイン
ダーなどとともに多層分析フィルムの酵素試薬層として
調製して使用することができる。

検出 本発明によるγ−ＧＴＰ活性の測定は、前記二段階の反
応にともなう酸素の消費量、または過酸化水素、アンモ
ニアもしくはα−ケトグルタル酸の生成量を検出するこ
とによって行われる。なお、検出法はレート法でもエン
ドポイント法でもよい。

（］）　酸素消費伍 酸素の消費量の検出は、通常ワールブルク検圧法（生化
学実験講座５．酵素研究法山、第３５〜４１頁、■東京
化学同人、１９７５年８月２０日発行）または酸素電極
法（電極法による酸素測定。

萩原文二編、■講談社、１９７７年１１月２０日発行）
によって行われる。

酸素電極としては、たとえば、カソードとして白金電極
、アノードとして鉛電極を具備し、水酸化カリウム溶液
を内部液とし、白金カソード表面に酸素透過性のテフロ
ン膜が装着されたクラーク型酸素電極を使用することが
できる。

酸素電極は酵素電極としても使用することができる。ｔ
；とえば、ＧＬＸＤの固定化酵素もしくは半透性膜で覆
われた可溶性酵素をクラーク型電極の電極膜に密着して
装着した電極装着型酵素電極として使用することができ
、固定化酵素を充填したカラムなど１こよるリアクター
と分離して装着された酸素電極とから成るリアクター型
酵素電極としても使用することもてきる（［化学の領域
、増刊ｔａ４号、バイオマテリアルサイエンスｍ　１　
ｆｉｌ＋）Ｉ）、６９〜７９．１９８２年４月２０日、
■南江堂発行；［化学工業Ｊ　１９８２年６月号、ｐｌ
）、４９１〜４９６　；　「イオン電極と酵素電極」、
鈴木周−編。

ｐｐ、６５〜１０６．１９８１年１１月１日、＠講談社
発行；「化学の領域」第３６巻、第５号、ｐｐ。

３４３〜８４９．（１９８２））。

（２）過酸化水素生成量 過酸化水素の生成量の検出は、電気化学的方法、分光学
的方法、化学発光法、けい先決など公知の方法（特公昭
５６−８２９１９号など）１こよって行うことができる
。

電気化学的方法としては過酸化水素電極を用いる方法が
一般的であるが、過酸化水素とヨウ素イオンを反応させ
、ヨウ素イオンの活量減少をヨウ素イオン電極で測定す
る方法によっても過酸化水素を検出することができる。

過酸化水素電極としては、たとえば白金電極を使用した
クラーク型過酸化水素電極を使用することができる。ま
た、酸素電極と同様の酵素電極として使用することもで
きる。

分光学的方法としては■パーオキシダーゼ法、■カタラ
ーゼ法、■Ｔｉ（１％ｌｌ／　４−　（２−ピリジルア
ゾ）レゾルシノール系、Ｖ（Ｖｌ／キシレノール・オレ
ンジ系などを使用する化学的方法（以上、有機合成化学
−色９Ｆ７１．　６５９〜６６６（１９８１）参照）、
■グルタチオン／グルタチオンパーオキシダーゼ系を利
用する方法（Ａｎａｌ、　１３ｉｏｃｈｅｍ　７６　。

１８４〜１９１（１９７６））などを使用することがで
きる。

■のパーオキシダーゼ法は、被酸化性発色剤をパーオキ
シダーゼもしくは同様の活性を示す物質の存在下に過酸
化水素と反応させ、反応生成物である色素を吸光度測定
によって定量する方法である。パーオキシダーゼとして
は通常、西洋わさび（ホースラディシュ）由来の酵素が
使用される。

発色剤としては、たとえば０−ジアニシジン、４−メト
キシ−１−ナフトールもしくは２．２′−アジノービス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）など
の単独；４−アミノアンチピリンとフェノール、ｐ−ク
ロロフェノール、２，４゜６−ドリブロモフエノールな
とのフェノール系化合物との組合せ；４−アミノアンチ
ピリンとＮ。

Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリンなど
のアニリン系化合物との組合ぜ；４−アミノアンチピリ
ンとＮ、Ｎ−ジエチル−ｍ−）ルイジンなどのトルイジ
ン系化合物との組合せ；または３−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾンとＮ、Ｎ−ジメチルアニリンと
の組合せなどを使用することができる。

なお、パーオキシダーゼ法による発色反応は中性付近の
ｐＨて行われる場合が多い。たとえば、４−アミノアン
チピリン／フェノール系の場合、発色反応はＩ）Ｈ７，
５で行われる。したがって、ＧＬＸＤによる反応は通常
中性付近で行われることから、発色反応に際してｐＨを
変更することなく、同一反応系中で連続して反応を行う
こともできる。さらｌこ、γ−ＧＴＰによる酵素反応も
同じｐＨ範囲で行うことが可能である。すなわち、ｒ−
ＧＴＰによる酵素反応、ＧＬＸＤによる酵素反応および
発色反応の三反応を同一反応系中で連続して行うことが
できる。

■のカタラーゼ法としては過酸化水素をカタラーゼの存
在下にアルコール（メタノールなど）と反応させ、生成
するアルデヒド（ホルムアルデヒドなと）を発色系に導
き、生成色素を吸光度測定するか、あるいはアルデヒド
をアルデヒドデヒドロゲナーゼを利用して定量する方法
などを採用することができる。ホルムアルデヒドを発色
させる方法としては、アンモニアと反応させる方法また
は酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム、赤血塩（フェリシア
ン化カリウム）など）の存在下てヒドラゾン（４−アミ
ノ−８−ヒドラジノ−５−メルカプト−１，、２、４−
トリアゾールなど）と反応させる方法を用いることがで
きる（特公昭５６−１９２８８号）。

化学発光法としては、過酸化水素を赤血塩の存在下でル
ミノールと反応させ、化学発光量をフォトンカウンター
によって測定する方法（特開昭５８−４７４８４号）が
好適である。同様の方法で赤血塩の代りにパーオキシダ
ーゼを使用してもよく（特開昭５７−７１８９９号、特
開昭５７−７１４００号）、ルミノールの代りにイソル
ミノール、ピロガロールを使用してもよい。

けい先決としては、ホモバニリン酸をパーオキシダーゼ
の存在下、過酸化水素と反応させてけい光強度を測定す
る方法が挙げられる。発けい光試薬としてはｐ−ヒドロ
キシフェニル酢酸またはジアセチルフルオレスシン（特
開昭５５−４８６５６号）などを用いてもよい。

（３）　アンモニア生成量 アンモニアはミクロケルプール法、ネスラー法、インド
フェノール法、ニンヒドリン法、フェノサフラニン法な
どの方法によって分析できる。また、カチオン選択性電
極によってアンモニウムイオンを分析する方法または疎
水性のガス透過性膜を装着したガラス電極からなるアン
モニアガス電極によってアンモニアガスとして分析する
方法など、電気化学的分析法によって分析してもよｔｌ
。さらに、これらの電極とＣ，Ｌ　Ｘ　Ｄを組合せた酵
素電極によってアンモニアを検出してもよい。

（４）　α−ケトグルタル酸生成量。

ａ−ケトグルタル酸は、８−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）と反応させて生成物の吸
光度を測定する方法、２．４−ジニトロフェニルヒドラ
ジンと反応させ、生成物の吸光度を測定する方法、０−
フェニレンジアミンと反応させて生成物の吸光度を測定
する方法、その他公知の方法を使用することができる。

実　施　例 以下、本発明による測定法の一例を示す実施例およびＬ
−グルタミン酸オキシダーゼの製造法を示す参考例によ
って本発明をより具体的に説明する。本発明はこれらの
例示によって限定されるものてはない。実施例および参
考例におｐｓで酵素単位（［Ｊｎｉｔ）はｒＵＪと表記
するものとする。

実施例１ （１）試薬の調製 ■基質溶液 グリシルグリシン４２ＩＲｇ、γ−Ｌ−グルタミル−し
一グルタミン酸７　ｍｆｌおよび塩化マグネシウム六水
塩ｌＯＩＩＩｇを５譚ｔの０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ８，５）に溶解した。

■γ−ＧＴＰ標準溶液 γ−ＧＴＰ（シグマ社製、牛腎臓由来、６．２Ｕ／＃＋
ｇ）ｌＩｌｇを６．２　ｍｌの０．２　Ｍ　ｌ−リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に溶解し、同緩衝液で稀釈し
て５０〜１０００　ｍＵ／＊／の酵素液を調製した。

■発色試薬 フェノール４０Ｉｌ１ｇ、４−アミノアンチピーノン４
０ｍｇおよびパーオキシダーゼ（東洋紡績■製、西洋ワ
サび由来、１００　Ｕ７１１ｇ）６ａｙを０．２　Ｍり
ん酸カリウム緩衝液（ｐ）ｌ　７＞４　）　８０ｔｔｔ
ｌに溶解した。

■ＧＬＸＤ溶液 部分精製ＧＬＸＤ（１２Ｕ／ｚｙ）５ｑを５０　＊ｔの
０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐｌ（’７．４）に溶解した（
約１．２Ｕ／ｇｔ）。

（２）操作法 試験管に基質溶液０．１　ｍｌを取り、γ−ＧＴＰ標準
溶液０．２ａ＋ｔ（１０〜２００ｍＵ　）を加え、２５
’Ｃ，２０分間インキュベートした後、２５％トＩＪク
ロロ酢酸２０μｌ　を加えて反応を停止させた。

反応停止液にＩＭりん酸カリウム緩衝液（ｐ）１７．４
）０１層ｔ、ＧＬＸＤ溶液０．１　ｍｌおよび発色試薬
０，５ｗｔを加え、３７°Ｃｌ２Ｏ分間好気的に振盪し
な力（らインキュベートした。盲検を対照として５００
ｎｍ　の吸光度を測定し、第１図に示す検量線を作成し
た。

実施例２ ＧＬＸＤ２Ｕを添加した実施例１と同じ基質溶液１耐を
２５°Ｃの恒温水を循環してＬ）るポーラログラフ方式
の酸素電極のキュベツトへ密封し、２０μｌ　のγ−Ｇ
ＴＰ標準溶液（１２，５〜２００ｍｔＪ）を注入して酸
素消費速度を測定し、第２図１こ示す検量線を作成した
。

参考例 ５００ｇ／容三角フラスコにフスマ２０’／および水１
６ｗ１を入れ、１２０°０．３０分間加圧滅菌して調製
したフスマ培地にストレプトマイセス・エスピー　Ｘ−
１１９−６（微工研菌第６５６０号）を植菌し、２８°
Ｃ，７日間培養して種菌を調製した。

５１容三角フラスコ２５本にそれぞれフスマ２００ｑお
よび水１６０＊ｔを入れ、１２０’Ｃ，３０分間加圧滅
菌した後、前記の種菌を無菌的に接種し、２８℃で２日
間培養後、温度を２０８Ｃに下げてさらに２週間培養し
た。

得られた培養物を８７．５１の水に１時間浸漬した後、
濾過し、さらにけいそう土を通過させて粗酵素液的８４
１を得た。この粗酵素液に硫酸アンモニウムを５０９６
飽和まで加え、生成した沈澱を遠沈採取して０．０２　
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）３．９ｅに溶解し、５７°
Ｃで３０分間加熱した。この熱処理した酵素液を５６Ｃ
以下に冷却後、２倍ｆｉｌの予め冷却したエタノールを
加え、生成した沈澱を遠沈採取して０．０２Ｍりん酸緩
新液（ｐＨ７，４）２ｅに溶解し、同一緩衝液で一夜透
析した。透析中に生成した沈澱を遠沈除去し、上清液を
同−緩衝 新液て平衝化したＤＥＡＥ　（ジエチルアミノエチル）
−セルロースカラム（８，５ｘ５０α）に通し、吸着し
た酵素を食塩０３５Ｍを含む同一緩衝液を用いて溶出し
た。溶出された活性区分を集め、００５Ｍの食塩を含む
００５Ｍ酢酸緩衝液（ｐ）（５５）で−夜透析した。こ
の透析内液を同−緩衝衡 液で平手化したＤＥＡＥ−セフアローズＣＬ−６Ｂ（フ
ァルマノア・ファインケミカルズ７１製）カラム（２Ｘ
１０ｚ）に通し、吸着した酵素を食塩０．０５〜０７５
Ｍのリニアグラノエント法で溶出した。溶出された活性
区分を集め、透析濃縮後、セファデックスＧ−２００（
ファルマシア・ファインケミカルズ社製）カラム（２，
５ｘ　１２０ｚ）を用いてゲル濾過を行い、活性区分を
集めて濃縮後、００２Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
，４）で透析した。この透析内液を遠沈し、上清液を精
密濾過した後、凍結乾燥してＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼの精製標品（比活性５５．ＩＵ／Ｅｌｆ蛋白。

収率１８．４％）８０屑２を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるｆ−ＧＴＰ活性の検量線を示
す。 第２図は実施例２におけるγ−ＧＴＰ活性の検量線を示
す。 特許出願人 （６７７）　ヤマサ醤油株式会社 ≦架堺２ こ 手続補正書（自発） 昭和５９年７月う１日 特許庁長官　志　賀　学　殿　◆ ■　事件の表示 昭和５８年特許願第１４’８４８４号 ２　発明の名称 γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性の測定法３　
補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　（郵便番号　２８８） 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１電話　０４７９
（２２）００９５ 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 とＲ４７，１１ ２）明細書第１３頁第１５行目のｒＧＬＸＤ、Ｊの後１
こ「（本酵素）」を加入する。 ３）明細書第２１頁第１行目のｒＧＬ、ＸＤＪの後に「
（本酵素）」を加入する。 ４）明細書第２５頁第１行目に［（１２Ｕ　１ｍｇ月と
あるのを「（本酵素；ｔ２Ｕ、／ｙ）ｊと訂正する。 ５）明細書第２５頁第１６行目のｊ’−ＧＬＸＤＪの後
に１（本酵素）」を加入する。 ６）明細書第２８頁第１行目の「キンダーゼ」の後に１
Ｃ本酵素）」を加入する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）　γ−グルタミル基を供与する基質としてγ−■５
   −グルタミル−し一グルタミン酸を使用し、これにγ−
   グルタミルトランスペプチダーゼを作用させ、次いて遊
   離するし一グルタミン酸に対し、Ｌ−グルタミン酸オキ
   シダーゼを作用させ、反応に伴う酸素の消費量または過
   酸化水素、アンモニアもし、くはａ−ケトグルタル酸の
   生成量を検出することを特徴とするγ−グルタミルトラ
   ンスペプチダーゼ活性の測定法。 ２）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼが、Ｌ−グルタミン
   酸に対する基質特異性がきわめて高く、Ｌ−グルタミン
   酸以外のアミノ酸には実質的に作用せず、安定性の高い
   酵素である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ８）　Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼが、至適ｐＨ７〜
   ８．５付近の酵素である特許請求の範囲第１または２項
   記載の測定法。 ４）　Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼが、ｐＨ５，５゜
   １５分間の保持条件下において６５°Ｃまては活性が低
   下しないという安定性を有する酵素である特許請求の範
   囲第１〜８項のいずれかに記載の測定法。