JPS60259179A - 細胞培養槽及び細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ）　産業上の利用分野 本発明は細胞を培養増殖させるための方法及び培養槽に
関するものである。さらに詳しくは、大規模にかつ高密
度に細胞培養を行なう目的で作られたサスベンジｌン方
細胞培養方法及びそのための培養槽に関するものである
。

ｂン　従来技術 細胞大量培養は例えばウィルス、ワクチン、イクターフ
エロンなどの抗ウィルス剤、あるいはホルモンなどの生
物薬品の工業的製造に重要な技術である。殊に近年特定
タンパク質などを標的とするモノクロ−スル抗体の生産
は抗体生産細胞とミエローマ細胞の配合によるハイブリ
ドーマ細胞の犬ｍ＠養によるものであり、その技術の解
決は工業的に不可欠な問題である。

また、大規模であり、かつ高密度に細胞を培養すること
は上記有用物質を停コストで生産するために必須の技術
であり、その技術の急速な解決がのぞまれている。

従来、サスペンション方の細胞培養は一般に培養びんや
スピンナーフラスコを用いて実験室的規模で行なわれて
いる。

しかしながら、上記の方法では一定四の栄養分の中で培
養されるため細胞の成長増殖は比較的低い濃度で停止す
る。

Ｃ）　発明の構成 そこで本発明者らは前記のような従来法における欠点を
克服し、サスペンション型の細胞培養法によって大規模
かつ高密度の培養が可能な培養方法及び培養槽について
研究を進めた結果、本発明に到達した。

すなわち、本発明の第１の発明は培養槽の底部近傍に培
養液は透過するが細胞は透過しないフィルターが設けら
れ、培養槽には新しい培養液の供給口、フィルター上部
近辺に撹拌翼を有する撹拌手段を有するサスペンション
型細胞培養槽であり、第２の発明は前記培養槽を使用し
、その供給口から新しい培養液を連続又は間歇的に槽中
へ供給し、一方眼排出口から連続又は間歇的に槽外へ排
出することによる細胞培養方法である。

本発明はサスペンション方の細胞培養に適用されるが、
サスペンション型とは、水性媒体中で細胞それ自体が浮
遊しながら或いは細胞を微小担体（マイクロキャリヤー
）に担持して浮遊しながら、またマイクロカプセル中で
細胞が生育されるような種々の浮遊培養をいう。殊に本
発明は１＠胞自体が浮させる培養に有りに用いられる。

本発明において培養される細胞は、植物細胞、動物細胞
、微生物細胞などであっても良く、また人為的或いは遺
伝子操作により変性された細胞であっても良い。殊に本
発明は動物細胞の培養に適している。

本発明におけるサスペンション型の細胞培養槽中におい
ては、培養しようとする細胞が培養液中に浮遊した状態
で培養される。培養液は実質的に水よりなる水性媒体に
、種々の無機塩、ビタミン類、補酵素、ブドウ等、アミ
ノ酸、抗生物質などの通常細胞培養に使用される添加成
分が加えられている。また、培養液には血清を加えるこ
ともできるし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液
として使用す−ることも出来る。

本発明の培養槽には種々の種型のものが使用可能である
が、殊に同筒縦型のものが望ましい。その場合槽内の液
面の高さくｈ「）と槽内径（Ｄ＞の割合は旧／Ｄの比と
して表わして小さい方が望ましく、好ましくは０．３〜
３の範囲、特に０．５〜１．５の範囲が有利である。

本発明におけるフィルター領域には、培養沖は透過する
が、細胞あるいはそれがイ」着した微小担体又はそれが
中に入ったマイクロカプセルは透過しない大きさの細孔
が多数設けられている。細胞自体を浮遊させて培養する
場合、細孔の大きさは細胞の大きさによって左右される
が一般に平均孔径が１０μ以下、好ましくは８μ以下が
適当である。

一方微小担体（マイクロキャリアー）の表面に細胞を付
着させて培養する場合又はマイクロカプセルを使用して
培養する場合にはそれらが透過しない大きさの細孔であ
る必要がある。

また、該フィルター領域は水を成る程度透過する能力を
有することがのぞましい。すなわち該フィルターは水の
透過係数（ｍｍ塁／ＴＩｔ−ｈｒ−１ｌｌＩｌｌＨｇ）
が１０以上、好ましくは１００以上であるのが有利であ
る。一方上限は特にないが、２０，０００以下、好まし
くはｉｏ、ｏｏｏ以下が望ましい。

さらに該フィルター領域は栄養分や細胞の老廃物、代謝
生産物などの如き分子量の小さい化合物は透過するが分
子量の大きい化合物（例えば分子量ｉ、ｏｏｏ以上、好
ましくは５，０００以上）は透過しない膜、例えば例え
ば限外濾過膜を使用することも可能である。

本発明でいうフィルターは培養槽の底部の近傍であるが
底部よりやや上部に設けられている。前述したようにフ
ィルターは槽の縦型の壁面に対しほぼ直角方向に面状で
設けられているのが好ましい。従って槽はフィルターに
よって上部と下部に区分されている。フィルター領域は
前記面状のほぼ全面に設けられても良く、一部であって
良い。

また、培養槽のフィルターより下部がさらに仕切り板に
より２つ以上の区域に仕切られても良い。

フィルターの材質としては前記特性を有する限り種々の
ものが使用されるが、例えばガラス、焼結金属、セラミ
ック、紙、プラスチックなどが可能である。

撹拌翼の翼数は通常用いられるものと同様のものが使用
可能である。翼の形状は、フィルター濾過面の液の乱れ
が均一に激しく、但し細胞に損傷を与えないようなもの
が適当である。殊にフィルター面とそれに最も近い撹拌
翼との間隔は３　ｍｍ以上３０＃１１１１以下が好まし
い。撹拌速度は３０〜３０Ｏｒｐｍが適当である。

培養槽の供給からの新しい培養液の供給方式はリスペン
ション液中あるいは滴下のどちらでも良く、連続あるい
は間歇のどちらも可能である。また、前述のようフィル
ターの上部を２つ以上の区域に仕切られた構造のものを
使用した場合、その一つの区域に新しい培養液を供給す
ることもできる。この場合、他の一つの区域から古い培
養液を槽外へ排出することが便利であり、殊に前記供給
と排出を適当に連続的又は間歇的に液の流れを操作して
培養することも可能である。

培養液の供給と排出は同時に行ないながら操作するのが
望ましいため、排出速度と供給速度はほぼ等しくづるこ
とか好ましい。培養槽内における単０位培養液当りの古
い培養液排出量は多々過ぎるとフィルターの目詰まりを
起こし、少な過ぎると細胞密度の低下をきたすため、容
積比率は１日当り　０．５以上５以下が好ましい。

以下添付図面により本発明の細胞培養方法及び培養槽を
更に詳細に説明する。

添付第１図は、本発明の細胞培養槽を用いて培養を行な
うための概略図の一例を示すものであり、第２図はこの
培養槽を２台組合せて使用した例を示すものである。第
３図はフィルター下部を２つの区域に区切った例を示す
ものである。

第１図は本培養槽を単独で用いて連続的に培養液交換を
行ないながら培養する場合を示したものであり、第１図
において１はサスペンション型培養槽における培養槽本
体であり、栄養物などを含む水性媒体はその供給槽２か
らポンプ３により供給導管４を通り、培養槽中へ送られ
る。一方、古い培養液は培養槽内壁に固着されたフィル
ター５を透過し、Ｕ［出力管４′を通ってポンプ３′に
よって古い培養液の貯槽６へ送られる。培養液は細胞が
サスペンション液中を効果的に浮遊するように撹拌手段
（例えばングネチックスターラー）で駆動される撹拌装
置８で撹拌される。ざらに培養槽にはｔｉｌｌ、溶存酸
素制御のため、炭酸ガスと空気の混合ガス（例えば炭酸
ガス濃度％）及び炭酸ガスとＭ素の混合ガス（例えば炭
酸ガス濃度５％）がそれぞれ導管７．７′を通って必要
に応じて通気される。

本発明の培養槽に供給される新しい培養液は、この中に
ブドウ等、タンパク質の如き栄養源、種々のアミノ酸、
無機塩、抗生物質などの細胞培養に必要な成分を水溶液
として含むものが使用されるが、さらに血清を含んでい
ても良く、また含んでいなくても良い。これらの成分は
必要はすべてを培養源どして供給しても良いが、一部の
成分は、他の供給手段によって培養液中へ導入すること
も可能である。

第２図は本発明における培養槽を２個並列に連結した例
を示したものである。一方の培養槽１においてそのフィ
ルター５が目詰りを起こし、培養の継続が不可能となっ
た際に培養液を導管９−を通してもう一方の培養総１′
に圧送し、培養を継続する。培養総１′で培養継続中に
貯槽１０よりポンプ３″により導管１１を通して滅菌水
または新しい培養液などを送り、フィルター５の逆洗浄
を行なうことが可能である。これら２つの培養槽を用い
て前記操作を交互に繰り返せばフィルターの目詰まりの
制約をうけずに長期間の培養が可能である。

第２図において、１，２．３，４，５，６，７゜３’　
、４’　、５’及び７′は第１図と同様のものを意味す
る。

栄養物などを含む水性媒体は供給総２からポンプ３によ
り供給導管４を通り、フィルター５の半面（図面の左側
の区域）を透過して培養槽中へ送られ、一方古い培養液
はポンプ３′によってフィルター５の他の半面（図面の
右側の区域）を透過して排出導管４′を通って古い培養
液の貯槽６へ送られる。この時点では弁９及び９′は開
いており、弁１０及び１０′　は度しているが、培養中
の適当な時期に弁９及び９′を閉じ、弁１０及び開ける
と供給口排出口が逆となり、培養液の供給フィルターの
逆洗浄を兼ねることが可能となる。この操作−を交互に
行なうことにより、長期間の培養が可能である。第３図
において、１，２．３．４．５゜６．７．８．３’　、
４’　、及び７′は第１図と同様のものを意味する。

以上説明した本発明の細胞培養方法及び細胞培養槽によ
れば、サスペンション型の細胞培養において連続的に培
養液を供給でき、かつ連続的に老廃物、代謝生産物、生
育阻害物質などを除去でき、またフィルターの目詰りも
起こらないため、高密度でしかも大量の細胞を長期間に
わたって培養することが可能となる。

実施例１ １）　培養槽の形状 添付第１図に示したよな構造をした内容積が約４００ｍ
のガラス容器を培養として使用した。

この培養槽には第１図に示したような構造をした内容積
が約４０ＯＮＩｎＵのガラス容器を培養槽として使用し
た。培養槽には第１図に示されているよう底部近傍に平
面状ガラスフィルターが設置されており、またマリン型
撹拌子が装着されている。閣内の液面の高さくｈｌ）槽
と内径（Ｄ）の割合旧／Ｄは０．６であり、フィルター
の水の透過係数（ｔｄ／Ｔｄ−ｈｒ−ＩｌｌＩＩＩＨｑ
）は約３０Ｑ（ｌｔ−ある。培養槽内には炭酸ガス５％
含有空気及び炭酸ガス５％含有炭素の供給導管が挿入さ
れているが、これは第１図の７，７′に該当する。

２）　新培養液の組成 市販の培地ＲＰＭ　１１６４０（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ社製）
に下記ものを添加したものを使用した。

牛胎児血清　１０％（ｖ／ｖ、） （ＡＲＭＯＵＲＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＣＯＭＰ
ＡＮＹ　ＬＯＴ　Ｎｏ、Ｗ　６０２０６）Ｑ　ｅｎｆａ
ｍｙｃｉｎ　５０ＩＩ１ｇ／　ｔｄＬ　−Ｇ　ｌｕｔａ
ｍｉｎ　２　ｍＭ Ｎａ　ＨＣＯ３２９／Ｊｊ ３）　培養方法 前記培養槽に液容積が２００威となるように当らしい培
養液を入れ、これにマウスミエローマ細胞Ｐ３ｔＪＩを
親株とするマウスハイブリドーマ４０１０日６細胞株を
２．３Ｘ　１０”個／ｄとなるように加えた。この細胞
は免疫グロブリン（ＩｏＧ）生産型の株である。

培養槽においては、炭酸ガス５％含有空気及び炭酸ガス
５％含有酸素がサスペンション液中へ供給れ、それらの
供給はそれぞれ系内のｐ　Ｈ６，５〜７、溶存酸素量が
３〜４　ｐｐｍの一定となるように制御された。

培養中のサスペンション液は３７℃に保持され、またマ
リン型撹拌子は６０ｒｐｍの速度で回転させた。

培養開始後２日目から新しい培地の供給と古い培地の排
出を１５０１１１ｇ／日の速度で行なった。培養開始後
５日経過後は、この供給、排出の速度を３００ｍｅ　／
　ｄａｙに上げた。

４）　培養結果 かくして８日間培養を行った結果、最終細胞密度は８．
ＯＸ　１０”個／ｄに達した。

実施例２ １）　培養槽の形状 添付第２図に示したような構造をした内容積が２００ｄ
のガラス容器を２個並列につないだものを培養槽として
使用した。培養槽への装着物は実施例１と同様である。

旧／Ｄは０．８であり、フィルターの水の透過数は実施
例１と同様である。

２）　新培養液 実施例１と同様のものを使用した。

３）　培養方法 前記培養槽の一方に液容積が５０ｍ９となるように新し
い培養液を入れ、これにマウスミエローマ細胞Ｐ３ＵＩ
を親株とするマウスハイブリドーマ１Ｂ　１００４細胞
株を１．０×１０５個／彪となるように加えた。この細
胞は免疫グロブリン（１（ＩＧ）生産型の株である。

培養中のサスペンション液は３７℃に保持され、またマ
リン方撹拌子は６０ｒｐｍの速度で回転させた１培養開
始後、細胞密度が４×１０５個／ｄに達してから当らし
い培養液の供給と苦い培養液の排出を開始した。開始時
の供給、υ［比速度は５０ｄ　／日であったが、その後
１１［１胞密度が６×１０６個／ｄに達するまで徐々に
流速を上げ、これ以降は１５０ｄ／日で行なった。

細胞密度がｌＸ１０’に達した際には培養液を細胞と共
に半量取り出し、新しい培養液をそれと同量供給し、細
胞密度を半分に減少させ、培養を継続した。

初めに用いた培Ｎ槽のフィルターが目詰りを起こし、培
養不可能となった後は培養液をもう一方の１８養槽に移
し、培養を継続した。目詰りを起こしたフィルターはこ
の間に滅菌水ににって逆洗浄を行なった。このように培
養槽を交互に切換えて培養を継続した。

４）　培養結果 かくして培養を行なった結果、培養開始１８日目に細胞
密度は１，２ｘ　１０’個／ｄに達し、その後生なくと
も培養４３日目まで細胞密度をほぼ５　Ｘ　１０Ｇ個／
威〜１．４Ｘ　１０’個／ｄの範囲の濃度に保って培養
を継続することができた。

なお上記実施例２において１の培養槽のみを使用し、培
養液の供給、排出を行なわずに他は同じ条件で培養を行
なった結果、最終の細胞密疾は５×１０５個／ｒｄｌで
あった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の細胞培養槽の全体を示す概略図の一例
を示・すものである。第２図はこの培養槽を２個並列に
組合せて相互の培養液の交換を可能としたシステムの一
例の概略図を示すものである。 図３は本発明の培養槽のフィルターより下部を２つに仕
切り、仕切られたそれぞれの部分に培養液の供給口兼排
出口を取り付けた培養槽の一例の概略図を示すものであ
る。 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）　サスペンション型細胞培養槽であって、培養液は
   透過づるが細胞は透過しないフィルターが底部近傍に設
   けられ、培養槽には新しい培養液の供給口、フィルター
   より下部に古い培地の排出口を有し、フィルターの上部
   の近辺に撹４１’翼を有づる撹拌手段が設置させた細胞
   培養槽。 ２）　サスペンション方細胞培養槽であって、培養液は
   透過するが１ｌＩＩ胞は透過しないフィルターが底部近
   傍に段（プられ、培ａｎｙには新しい培養液の供給口、
   フィルターより下部に古い培地の排出口を有し、フィル
   ターの上部近辺に撹拌翼を有する撹拌手段が設置された
   細胞培養槽を使用し、該供給口から連続又は間歇的に新
   ゛しい培養液を槽中に供給し、一方該排出口から連続又
   は間歇的に培養液を槽外へ排出して、培養細胞を高密度
   に培養する方法。