JPS60256059A - ポリヌクレオチドの測定法 - Google Patents
ポリヌクレオチドの測定法Info
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- JPS60256059A JPS60256059A JP59112519A JP11251984A JPS60256059A JP S60256059 A JPS60256059 A JP S60256059A JP 59112519 A JP59112519 A JP 59112519A JP 11251984 A JP11251984 A JP 11251984A JP S60256059 A JPS60256059 A JP S60256059A
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- dna
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
特定の構造を有するデオキシリｇ核酸（ＤＮＡ）あるい
はり？核酸（ＲＮＡ）の測定は生化学分野において重要
でアシ、例えば人血清中のＤＮＡを測定することＫよっ
てウィルス感染の検査あるいは遺伝性疾患の発見などを
行なうことができる。本発明はこの上うなりＮＡ及びＲ
ＮＡの特定のものを簡便かつ正確に測定しうる方法を提
供するものである。
はり？核酸（ＲＮＡ）の測定は生化学分野において重要
でアシ、例えば人血清中のＤＮＡを測定することＫよっ
てウィルス感染の検査あるいは遺伝性疾患の発見などを
行なうことができる。本発明はこの上うなりＮＡ及びＲ
ＮＡの特定のものを簡便かつ正確に測定しうる方法を提
供するものである。
（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）従来
、このＤＮＡ及びＲＮＡの測定方法としては、試料を変
性処理゛して得た一本鎖ＤＮＡ （Ｓ −ＤＮＡ ）又
は一本鎖ＲＮＡ （Ｓ −ＲＮＡ ）を固相に結合させ
、この固相にラジオアイソトープを標識したＳ −ＤＮ
Ａ又はＳ −ＲＮＡを作用させて固相の５−ＤＮＡ又は
Ｓ −ＲＮＡと・・イブリッドを形成させてから未反応
の標識Ｓ −ＤＮＡ又けＳ −ＲＮＡを除去し、固相の
放射線を測定する方法が行なわれていた。この方法は測
定の際に固定化、洗浄等数多くの工程を必要とし、特に
試料の固定化に長時間を要するところから操作の労力及
び時間の両方に問題があったＯ また、測定対象である一本鎖ポリヌクレオチドと・・イ
ブリッドする一本鎖Ｉリヌクレオチドの２０塩基から１
５０塩基ごとに酵素、ビオチン、ハプテン等の標識物を
結合させ、この標識物を利用して測定する方法も知られ
ている。しかしながら、これらの方法は標識物の量を増
すと・・イブリッドするＤＮＡへの特異性が低下し、一
方、標識物の量を減少させると測定感度が低下するとい
う問題点があった。
、このＤＮＡ及びＲＮＡの測定方法としては、試料を変
性処理゛して得た一本鎖ＤＮＡ （Ｓ −ＤＮＡ ）又
は一本鎖ＲＮＡ （Ｓ −ＲＮＡ ）を固相に結合させ
、この固相にラジオアイソトープを標識したＳ −ＤＮ
Ａ又はＳ −ＲＮＡを作用させて固相の５−ＤＮＡ又は
Ｓ −ＲＮＡと・・イブリッドを形成させてから未反応
の標識Ｓ −ＤＮＡ又けＳ −ＲＮＡを除去し、固相の
放射線を測定する方法が行なわれていた。この方法は測
定の際に固定化、洗浄等数多くの工程を必要とし、特に
試料の固定化に長時間を要するところから操作の労力及
び時間の両方に問題があったＯ また、測定対象である一本鎖ポリヌクレオチドと・・イ
ブリッドする一本鎖Ｉリヌクレオチドの２０塩基から１
５０塩基ごとに酵素、ビオチン、ハプテン等の標識物を
結合させ、この標識物を利用して測定する方法も知られ
ている。しかしながら、これらの方法は標識物の量を増
すと・・イブリッドするＤＮＡへの特異性が低下し、一
方、標識物の量を減少させると測定感度が低下するとい
う問題点があった。
そのほか、最近ＤＮＡ ｆ ロープを短かく切断してそ
の５′端及び３′端に標識物を結合させる技術が開発さ
れたが（特開昭５８−４００９９号公報）、この方法も
ＤＮＡ７０ローブが短かいだめ特異性が低く、また、標
識物の量が少ないため感度が充分でないという問題があ
った。
の５′端及び３′端に標識物を結合させる技術が開発さ
れたが（特開昭５８−４００９９号公報）、この方法も
ＤＮＡ７０ローブが短かいだめ特異性が低く、また、標
識物の量が少ないため感度が充分でないという問題があ
った。
（問題点を解決するだめの手段）
本発明は、これらの問題点を解決したポリヌクレオチド
の測定方法を提供するものでラシ、測定対象の一重鎖Ｉ
リヌクレオチドとハイブリッドを形成する一本鎖ポリヌ
クレオチドの５′端あるいは３′端に高分子化合物を結
合させてもハイブリッドを形成する特異性が損なわれず
、まだこの高分子化合物に多数の標識物を結合させるこ
とによりこの・・イブリッドを高感度で測定できること
を見出してなされたものである。
の測定方法を提供するものでラシ、測定対象の一重鎖Ｉ
リヌクレオチドとハイブリッドを形成する一本鎖ポリヌ
クレオチドの５′端あるいは３′端に高分子化合物を結
合させてもハイブリッドを形成する特異性が損なわれず
、まだこの高分子化合物に多数の標識物を結合させるこ
とによりこの・・イブリッドを高感度で測定できること
を見出してなされたものである。
すなわち、本発明は、測定対象である一本鎖ポリヌクレ
オチドを、標識物を有する高分子化合物が５′端又は３
′端に結合されかつ該測定対象一本鎖ポリヌクレオチド
と二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうる一本鎖ポリヌク
レオチドと接触させることを特徴とするポリヌクレオチ
ドの測定方法に関するものである。
オチドを、標識物を有する高分子化合物が５′端又は３
′端に結合されかつ該測定対象一本鎖ポリヌクレオチド
と二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうる一本鎖ポリヌク
レオチドと接触させることを特徴とするポリヌクレオチ
ドの測定方法に関するものである。
測定対象は一本鎖ポリヌクレオチド（以下、測定対象ポ
リヌクレオチドという。）である。測定対象ポリヌクレ
オチドにはＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
リヌクレオチドという。）である。測定対象ポリヌクレ
オチドにはＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
試料中に含まれるポリヌクレオチドが二本鎖である場合
には水酸化ナトリウム溶液の添加などのアルカリ処理あ
るいは熱処理などによシ一本鎖にしておく必要がある。
には水酸化ナトリウム溶液の添加などのアルカリ処理あ
るいは熱処理などによシ一本鎖にしておく必要がある。
試料の種類は問わないが、例えば人血清、尿１組織抽出
物などである。人血清などのようにポリヌクレオチドが
蛋白と結合しているおそれがある場合には試料をズロテ
アーゼ等で処理して蛋白を分離しておくのがよい。
物などである。人血清などのようにポリヌクレオチドが
蛋白と結合しているおそれがある場合には試料をズロテ
アーゼ等で処理して蛋白を分離しておくのがよい。
この測定対象ポリヌクレオチドと接触させる一本鎖ポリ
ヌクレオチド（以下、標識ポリヌクレオチドという。）
は標識物を有する高分子化合物が５′端又は３′端に結
合されかつ該測定対象一本Ｓポリヌクレオチドと二本鎖
ポリヌクレオチドを形成しうるものである。
ヌクレオチド（以下、標識ポリヌクレオチドという。）
は標識物を有する高分子化合物が５′端又は３′端に結
合されかつ該測定対象一本Ｓポリヌクレオチドと二本鎖
ポリヌクレオチドを形成しうるものである。
この一本鎖ポリヌクレオチドは現在知られている固相ポ
リヌクレオチド合成法あるいはプラスミツドを用いる遺
伝子工学によるγ−ＤＮＡ法などによシ合成することが
できる。また、一般の生化学的手法によ、５ ＤＮＡを
抽出し、これをアルカリで変性させてて一本鎖にするこ
ともできる。そのほか、既に市販されているものを利用
することもできる。
リヌクレオチド合成法あるいはプラスミツドを用いる遺
伝子工学によるγ−ＤＮＡ法などによシ合成することが
できる。また、一般の生化学的手法によ、５ ＤＮＡを
抽出し、これをアルカリで変性させてて一本鎖にするこ
ともできる。そのほか、既に市販されているものを利用
することもできる。
容易に多量に一本鎖のポリヌクレオチドを入手できる点
で遺伝子工学的手法を利用することは好ましい。例えば
、ｍｐ７フアージに目的のＤＮＡを導入し、これをφ×
１７４に導入して培讐すると容易に鎖状の一本鎖ＤＮＡ
を得ることができる。得られた一本鎖ＤＮＡはそれ自身
で二本鎖になることがないので通常の中性かつ常温下で
保在できる。このため、ポリヌクレオチド合成後に一本
鎖に変える処理が不要になシ、余分な手間を省略できる
。
で遺伝子工学的手法を利用することは好ましい。例えば
、ｍｐ７フアージに目的のＤＮＡを導入し、これをφ×
１７４に導入して培讐すると容易に鎖状の一本鎖ＤＮＡ
を得ることができる。得られた一本鎖ＤＮＡはそれ自身
で二本鎖になることがないので通常の中性かつ常温下で
保在できる。このため、ポリヌクレオチド合成後に一本
鎖に変える処理が不要になシ、余分な手間を省略できる
。
高分子化合物は、水溶性で６Ｄかつ測定対象ポリヌクレ
オチドと非特異反応しないものであればよい。分子量は
１０００以上のものが好ましい。
オチドと非特異反応しないものであればよい。分子量は
１０００以上のものが好ましい。
高分子化合物の例としては、ゼラチン、ヘモシアニン、
フェリチン等のぼりぜプチド、可溶性デキストラン、カ
ル？キンメチル化デキストラン、アミン化デキストラン
、アミロース等のポリサッカライド、ぼりリン酸、ポリ
エチレングリコール、ポリビニルアルコール、あるいは
ポリヌクレオチドなどを挙げることができる。これらは
、例えば標識物の導入を容易にするためにアミン基、カ
ルダキシル基、チオール基、水酸基、反応性りｐル基な
どを予め導入しておいてもよい。
フェリチン等のぼりぜプチド、可溶性デキストラン、カ
ル？キンメチル化デキストラン、アミン化デキストラン
、アミロース等のポリサッカライド、ぼりリン酸、ポリ
エチレングリコール、ポリビニルアルコール、あるいは
ポリヌクレオチドなどを挙げることができる。これらは
、例えば標識物の導入を容易にするためにアミン基、カ
ルダキシル基、チオール基、水酸基、反応性りｐル基な
どを予め導入しておいてもよい。
−重鎖４ リヌクレオチドの端部のうち、一般的には３
′端の高分子化合物を結合させるほうが一般的に容易で
あシ、また、このポリヌクレオチドへの影響も少ない。
′端の高分子化合物を結合させるほうが一般的に容易で
あシ、また、このポリヌクレオチドへの影響も少ない。
３′端へ結合させる方法としては、例えばＳ−アセチル
ヘキソルアミノアデノシンジホスフェートに一本鎖ポリ
ヌクレオチドを加え、これにＲＮＡ Ｔ４リガーゼを作
用させると３′端にＳ〜ルアセチルが導入される。これ
に水酸化ナトリウム水溶液を作用させるとアセチル基が
除去されてＳＨ基になる。
ヘキソルアミノアデノシンジホスフェートに一本鎖ポリ
ヌクレオチドを加え、これにＲＮＡ Ｔ４リガーゼを作
用させると３′端にＳ〜ルアセチルが導入される。これ
に水酸化ナトリウム水溶液を作用させるとアセチル基が
除去されてＳＨ基になる。
これにマレイミド基を導入した水溶性ゼラチンを作用さ
せれば、一本領？リヌクレオチドの３′端にゼラチンを
導入することができる。ＲＮＡ Ｔ４リガーゼを利用す
ることによシ、３′端にアミノ基あるいはカルボキシル
基なども容易に導入できるので、これらを利用して高分
子化合物を結合させることもできる。これらの官能基を
利用して高分子化合物を結合させる方法は、例えば°’
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ” （Ｃ，Ａ。
せれば、一本領？リヌクレオチドの３′端にゼラチンを
導入することができる。ＲＮＡ Ｔ４リガーゼを利用す
ることによシ、３′端にアミノ基あるいはカルボキシル
基なども容易に導入できるので、これらを利用して高分
子化合物を結合させることもできる。これらの官能基を
利用して高分子化合物を結合させる方法は、例えば°’
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ” （Ｃ，Ａ。
Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ、 ＋ １９７６ ｒ
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎ、Ｙ、 ）とか「酵
素免疫測定法」（石川ら、医学書院、１９７８年）など
の底置に記載されている方法のなかから適宜選択して利
用することができる。例えばアミノ基相互間を結合させ
る場合には、ソイフシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等を利用す
ることができ、また、アミン基とカルボキシル基との間
を結合させる場合には、カルボキシル基をサクシンイミ
グエステル化する方法のほかカルピノイミド法、ウッド
ワード試薬法等を利用することができる。アミン基と糖
鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）もあ
る。チオール基を利用する場合には、例えばもう一方の
側のカルボキシル基をサクシンイミドエステル化してこ
れにシスティンを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合すること
ができる。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化
法、アルキル化法などがある。
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎ、Ｙ、 ）とか「酵
素免疫測定法」（石川ら、医学書院、１９７８年）など
の底置に記載されている方法のなかから適宜選択して利
用することができる。例えばアミノ基相互間を結合させ
る場合には、ソイフシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等を利用す
ることができ、また、アミン基とカルボキシル基との間
を結合させる場合には、カルボキシル基をサクシンイミ
グエステル化する方法のほかカルピノイミド法、ウッド
ワード試薬法等を利用することができる。アミン基と糖
鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）もあ
る。チオール基を利用する場合には、例えばもう一方の
側のカルボキシル基をサクシンイミドエステル化してこ
れにシスティンを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合すること
ができる。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化
法、アルキル化法などがある。
３′端に結合させる方法としては、上記の方法以外にも
例えば予め３′端に上ｉ己の方法で高分子化合物を結合
させておいたヌクレオチドを用いて一重鎖ポリヌクレオ
チドを固相合成し、最後に固相部分より高分子化合物を
切シ離す方法もある。
例えば予め３′端に上ｉ己の方法で高分子化合物を結合
させておいたヌクレオチドを用いて一重鎖ポリヌクレオ
チドを固相合成し、最後に固相部分より高分子化合物を
切シ離す方法もある。
一方、５′端に結合させる場合には、例えば二本鎖ＤＮ
Ａ状態においてＤＮＡ Ｔ４ ！Ｊガーゼを作用させて
予めアミン基やカルボキシル基等を結合させておいだ修
飾ＤＪ’ＪＡを５／端に結合させ、その後一本領ＤＮＡ
に分離すれば５′端にアミン基やカルボキシル基等を導
入することができる。そこで、この官能基を利用して上
記の方法によシ高分子化合物を結合させればよい。
Ａ状態においてＤＮＡ Ｔ４ ！Ｊガーゼを作用させて
予めアミン基やカルボキシル基等を結合させておいだ修
飾ＤＪ’ＪＡを５／端に結合させ、その後一本領ＤＮＡ
に分離すれば５′端にアミン基やカルボキシル基等を導
入することができる。そこで、この官能基を利用して上
記の方法によシ高分子化合物を結合させればよい。
高分子化合物は３′端及び５′端の両方に導入してもよ
いことはいうまでもない。
いことはいうまでもない。
標識物の種類は特に限定されるものではなく、酵素、グ
ロスティックグルーグビオチン、アビジン、ハゲテン、
螢光物質、化学発光物質、放射性同位元素などを広く利
用できる。これらは測定方法が簡単でかつ高分子化合物
への結合が容易なものが望ましい。
ロスティックグルーグビオチン、アビジン、ハゲテン、
螢光物質、化学発光物質、放射性同位元素などを広く利
用できる。これらは測定方法が簡単でかつ高分子化合物
への結合が容易なものが望ましい。
酵素の例としては、グルコース−６−リン酸脱水素酵素
、ヘキソキナーゼ、α−アミラーゼ、マレートデヒドロ
ゲナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、被ルオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、クレアチンキナーゼ１．す
〆ヌクレアーゼ、被ニシリナーゼなどを挙げることがで
きる。酵素は特異性を高める点で耐熱性のものが好まし
い。
、ヘキソキナーゼ、α−アミラーゼ、マレートデヒドロ
ゲナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、被ルオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、クレアチンキナーゼ１．す
〆ヌクレアーゼ、被ニシリナーゼなどを挙げることがで
きる。酵素は特異性を高める点で耐熱性のものが好まし
い。
グロスティックグルーグの例としては、ＦＡＤｌＮＡＤ
Ｈ、ＮＡＤＰＨ２、アミノピロリン酸、ピリドキサール
リン酸、ＡＤＰ 、 ＡＴＰなどを挙げることができる
。
Ｈ、ＮＡＤＰＨ２、アミノピロリン酸、ピリドキサール
リン酸、ＡＤＰ 、 ＡＴＰなどを挙げることができる
。
ビオチンはアビジンを結合しうる誘導体であってもよい
。
。
アゼツノはビオチンと結合しうるものでｌ）、ストレプ
トアビジンあるいはこれらの誘導体でちってもよい。
トアビジンあるいはこれらの誘導体でちってもよい。
ハゲテンは例えばジニトロフェノール、ジニトロアニリ
ンなどである。
ンなどである。
螢光物質は、フルオレセイン、ローダミン、ダンジルク
ロライド、フルオレスフアミン、クマリン、アクリゾン
、ベンゾオキサノアゾール、トリアリールメタン、ピレ
ン類などである。
ロライド、フルオレスフアミン、クマリン、アクリゾン
、ベンゾオキサノアゾール、トリアリールメタン、ピレ
ン類などである。
化学発光物質は、ルミノール、インルミノール、アクリ
ジニウム、ヒドロ被ルオキシド、ポルフィリン、イント
レン−３−イルヒドロベルオキシド、２．４．５−トリ
フェニルイミダゾール、ルシフェリン−ルシフェラーゼ
などである。
ジニウム、ヒドロ被ルオキシド、ポルフィリン、イント
レン−３−イルヒドロベルオキシド、２．４．５−トリ
フェニルイミダゾール、ルシフェリン−ルシフェラーゼ
などである。
放射性同位元素には３２Ｐ１３Ｈ１３５Ｓ、′４Ｃ１１
２５Ｉなどを利用すればよい。
２５Ｉなどを利用すればよい。
これらのなかで特に酵素、グロスティックグル−グ、ビ
オチン及びその誘導体並びにアビノン、ストレグトアビ
ソ／及びこれらの誘導体が使用の簡便さ、感度等の点で
好ましい。
オチン及びその誘導体並びにアビノン、ストレグトアビ
ソ／及びこれらの誘導体が使用の簡便さ、感度等の点で
好ましい。
標識物の高分子化合物への結合方法は前述の高分子化合
物を一本領ポリヌクレオチドに結合させる方法のなかか
ら適宜選択すればよい。
物を一本領ポリヌクレオチドに結合させる方法のなかか
ら適宜選択すればよい。
標識物の高分子化合物への結合量は多いほうが望ましい
。
。
このような標識Ｉリヌクレオチドを測定対象ポリヌクレ
オチドと接触させて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ
る。接触させる方法としては、まず測定対象？リヌクレ
オチドを含有する溶液にニトロセルロースフィルターを
浸して測定対象Ｉリヌクレオチドを吸着させ、これを充
分に洗浄する。
オチドと接触させて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ
る。接触させる方法としては、まず測定対象？リヌクレ
オチドを含有する溶液にニトロセルロースフィルターを
浸して測定対象Ｉリヌクレオチドを吸着させ、これを充
分に洗浄する。
次ニ、このニトロセルロースフィルターを標識ポリヌク
レオチドを含む溶液に浸漬して反応させる。
レオチドを含む溶液に浸漬して反応させる。
反応条件はニトロセルロースフィルターに吸着されてい
る測定対象ボ°リヌクレオチドが標識Ｉリヌクレオチド
と充分に反応してノ・イブリッドを形成しうる程度がよ
い。この条件は標識ポリヌクレオチドの濃度等によるが
、通常は２０〜７５℃、ＰＨ５〜９程度で０５〜４８時
間程度である。
る測定対象ボ°リヌクレオチドが標識Ｉリヌクレオチド
と充分に反応してノ・イブリッドを形成しうる程度がよ
い。この条件は標識ポリヌクレオチドの濃度等によるが
、通常は２０〜７５℃、ＰＨ５〜９程度で０５〜４８時
間程度である。
反応終了後はこのフィルターを充分に洗浄し、フィルタ
ーに吸着された標識物を測定する。測定方法は標識物の
種類に応じて各々の公知の方法に従って行なえばよい。
ーに吸着された標識物を測定する。測定方法は標識物の
種類に応じて各々の公知の方法に従って行なえばよい。
（作用）
本発明の方法においては、標識ポリヌクレオチドが測定
対象Ｉリヌクレオチドに対し特異的にハイブリッドを形
成する。そこで、このハイブリッドを形成した標識ポリ
ヌクレオチドの標識物の量を測定することによシ測定対
象ｆ １）ヌクレオチドの量をめることができる。
対象Ｉリヌクレオチドに対し特異的にハイブリッドを形
成する。そこで、このハイブリッドを形成した標識ポリ
ヌクレオチドの標識物の量を測定することによシ測定対
象ｆ １）ヌクレオチドの量をめることができる。
（発明の効果）
本発明の方法においては、標識、Ｊ ＩＪスクレオチド
の端部以外には標識物が結合されていないところから測
定対象ポリヌクレオチドとノ・イブリッドを形成する特
異性が損なわれない。また、標識物を高分子化合物に結
合させているところから標識物の量を多くすることがで
き、その結果、測定感度を高めることができる。本発明
の方法は操作が簡単であるという利点も有する。
の端部以外には標識物が結合されていないところから測
定対象ポリヌクレオチドとノ・イブリッドを形成する特
異性が損なわれない。また、標識物を高分子化合物に結
合させているところから標識物の量を多くすることがで
き、その結果、測定感度を高めることができる。本発明
の方法は操作が簡単であるという利点も有する。
（実施例）
実施例１
（１） ＨＢＶ −ＤＮＡ ｆ ｏ−ブの調製５００ｍ
Ｊの慢性Ｂ型肝炎患者のプール血清を９００ Ｏｒｐｍ
で１５分間遠心し、得られだ上清を４℃１０００００Ｘ
５’で５時間超遠心してＨＢＶ粒子をベレットとして集
めた。このＲレットを０．１ＭＮａＣ１、１ｍＭ ＦＪ
ＤＴＡ 、０．１チ２−メルカプトエタノール及びＯ４
１チＢＳＡを含む０．ＯＩＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）Ｉｌｌｌに溶かし、このウィルス溶液のうち５
ｍｌを保存し、残５ ｍｌを１０００００Ｘ＆で再度
５時間超遠心して被レットを得た。
Ｊの慢性Ｂ型肝炎患者のプール血清を９００ Ｏｒｐｍ
で１５分間遠心し、得られだ上清を４℃１０００００Ｘ
５’で５時間超遠心してＨＢＶ粒子をベレットとして集
めた。このＲレットを０．１ＭＮａＣ１、１ｍＭ ＦＪ
ＤＴＡ 、０．１チ２−メルカプトエタノール及びＯ４
１チＢＳＡを含む０．ＯＩＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）Ｉｌｌｌに溶かし、このウィルス溶液のうち５
ｍｌを保存し、残５ ｍｌを１０００００Ｘ＆で再度
５時間超遠心して被レットを得た。
この被レットを０５チＮＰ−４０を含む］−０ｍＭ ）
リス−塩酸、０．１ Ｍ ＮａＣ１ｐ８７．５溶液２０
０μｔで処理し、ＤＮＡポリメラーゼを活性化した。こ
の溶液に１ ｍＭ ｄＡＴＰ ｚ １ ｍＭ ａ’ｒ’
ｒｐ ｚ ２．５μＭ ｄＧＴＰ 。
リス−塩酸、０．１ Ｍ ＮａＣ１ｐ８７．５溶液２０
０μｔで処理し、ＤＮＡポリメラーゼを活性化した。こ
の溶液に１ ｍＭ ｄＡＴＰ ｚ １ ｍＭ ａ’ｒ’
ｒｐ ｚ ２．５μＭ ｄＧＴＰ 。
２５μＭ ｄＣＴＰを含む０．０８ ＭＭｇＣ，ａ２０
．２ Ｍ ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）５０μｔを加え
て３時間加温した。
．２ Ｍ ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）５０μｔを加え
て３時間加温した。
この溶液を３０％ンユークロース溶液の入った遠心チュ
ーズに重層し、５ｗ６５０−ター（ベックマン社製）を
用い５００００ｒｐｍで３時間遠心して被レットを得た
。この被レットをゾロナーゼで処理し、得られた溶液を
フェノールで２回抽出処理した。抽出液を５〜２０％シ
ュークロースグラノエントで５００００ｒｐｍにて３時
間遠心して１５ＳＤＮＡ分画を集めこれをプールした。
ーズに重層し、５ｗ６５０−ター（ベックマン社製）を
用い５００００ｒｐｍで３時間遠心して被レットを得た
。この被レットをゾロナーゼで処理し、得られた溶液を
フェノールで２回抽出処理した。抽出液を５〜２０％シ
ュークロースグラノエントで５００００ｒｐｍにて３時
間遠心して１５ＳＤＮＡ分画を集めこれをプールした。
この分画から１５８ ＤＮＡ ヲエタノールを用いて沈
澱させ、乾燥して目的のＨＢＶ −ＤＮＡを得た。
澱させ、乾燥して目的のＨＢＶ −ＤＮＡを得た。
（２） ニックトランスレーンヨンＫ Ｊ： ルＤＮＡ
７’ローブの調製 ５ ｍＭ ＭｇＣ４２，１０ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、５μＭｄＴＴＰ、５μＭｄＧＴＰ、５μＭｄＣ
ＴＰ及び５ μＨｄＡＴＰを含む５０ｒｒＬＭトリスー
ＨＣ４緩衝液（ＰＨ７，５）１００μｔに前項で得られ
た）（１３Ｖ −ＤＮＡ１ μ＆ 、 ＤＮａｓｅ 、
ｆ １００ ｐｌ／及びＤＮＡポリメラーゼ１１００ｐ
Ｆを加えて１５℃で９０分間インキュベートした。この
溶液をフェノールで抽出し、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −
５０カラムで精製してＨＢＶ−ＤＮＡを得だ。
７’ローブの調製 ５ ｍＭ ＭｇＣ４２，１０ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、５μＭｄＴＴＰ、５μＭｄＧＴＰ、５μＭｄＣ
ＴＰ及び５ μＨｄＡＴＰを含む５０ｒｒＬＭトリスー
ＨＣ４緩衝液（ＰＨ７，５）１００μｔに前項で得られ
た）（１３Ｖ −ＤＮＡ１ μ＆ 、 ＤＮａｓｅ 、
ｆ １００ ｐｌ／及びＤＮＡポリメラーゼ１１００ｐ
Ｆを加えて１５℃で９０分間インキュベートした。この
溶液をフェノールで抽出し、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −
５０カラムで精製してＨＢＶ−ＤＮＡを得だ。
（３）高分子化合物及び標識物の結合
このようにして得た二本鎖ＨＢＶ −ＤＮＡを０．５Ｎ
水酸化ナトリウム溶液で分離させて一本鎖ＤＮＡとし、
この溶液を中和した。これに直ちにアミンヘキシルアプ
ツシ／ジホスフェートを加え、次にＲＮＡりが−ゼＩＯ
Ｕを加えた。１時間反応後、反応液をグル濾過してアミ
ノ化Ｔ（ＢＶ−一本鎖ＤＮＡを得た。
水酸化ナトリウム溶液で分離させて一本鎖ＤＮＡとし、
この溶液を中和した。これに直ちにアミンヘキシルアプ
ツシ／ジホスフェートを加え、次にＲＮＡりが−ゼＩＯ
Ｕを加えた。１時間反応後、反応液をグル濾過してアミ
ノ化Ｔ（ＢＶ−一本鎖ＤＮＡを得た。
次に１これに分子量ｓ ｏ、ｏ ｏ ｏのＣＨＭ化ゼラ
チン１〜を加え、さらに水溶性力ルデノイミドｌ ｍｌ
を加えて３７℃で１時間、Ｈ５，０に保持した。この反
応液を七フアクリルＳ−３００カラムでグル濾過し、Ｃ
ＨＭ化ゼラチン結合ＨＢＶ−一本鎖ＤＮＡを得た。
チン１〜を加え、さらに水溶性力ルデノイミドｌ ｍｌ
を加えて３７℃で１時間、Ｈ５，０に保持した。この反
応液を七フアクリルＳ−３００カラムでグル濾過し、Ｃ
ＨＭ化ゼラチン結合ＨＢＶ−一本鎖ＤＮＡを得た。
このＣＨＭ化ゼラチン結合ＨＢＶ −一本鎖ＤＮＡに常
法によって得たＳＨ化被ルオキシダーゼ１０Ｉｎ９を加
え、ｐＨ７，０，４℃で一夜攪拌した。反応物をセファ
ロース４Ｂでダル濾過して未反応の被ルオキシダーゼを
除去し、目゛的の標識一本鎖ＤＮＡを得た。
法によって得たＳＨ化被ルオキシダーゼ１０Ｉｎ９を加
え、ｐＨ７，０，４℃で一夜攪拌した。反応物をセファ
ロース４Ｂでダル濾過して未反応の被ルオキシダーゼを
除去し、目゛的の標識一本鎖ＤＮＡを得た。
（４） ポリヌクレオチドの測定
ＨＢウィルス性肝炎患者血清１００μノに０．５ＮＮａ
Ｑ）ｌ １０ Ｑμｌを加えて室温で１０分間攪拌した
。
Ｑ）ｌ １０ Ｑμｌを加えて室温で１０分間攪拌した
。
次に、０．５ ＮＨＣｌ ］ ＯＯμｊを加え、さらに
２００μ９７ｍｅのグロテインキナーゼに溶液２００μ
ノを加えて７０℃で１時間反応させた。それから、飽和
フェノール−クロロホルム水溶液（１： ］ ） ２０
０μＥを加え、分層した水層２００μｌをニトロセルロ
ースを底に敷いた９６ウエルのマイクログレートに入れ
た。各ウェルの水層を吸引濾過後８５℃で１時間インキ
ュベートし、ＰＢＳで１回洗浄した。
２００μ９７ｍｅのグロテインキナーゼに溶液２００μ
ノを加えて７０℃で１時間反応させた。それから、飽和
フェノール−クロロホルム水溶液（１： ］ ） ２０
０μＥを加え、分層した水層２００μｌをニトロセルロ
ースを底に敷いた９６ウエルのマイクログレートに入れ
た。各ウェルの水層を吸引濾過後８５℃で１時間インキ
ュベートし、ＰＢＳで１回洗浄した。
これに前項で得られた標識一本鎖ＤＮＡ １μｙを含む
溶液２００μβを加え、４０℃で１８時間加温した。
溶液２００μβを加え、４０℃で１８時間加温した。
このフィルターを０．１Ｍ酢酸−１０μＭ ＥＤＴＡ
−１Ｍ ＮａＣＬ ｐＨ７，０で４回洗浄後、このフィ
ルターに０．５ｒｒＭ４−メトキシナフトール及び２
ｍＭ Ｈ２Ｏ２を含む基質溶液ＰＨ７，ｏ １００μｌ
を加えて３０分間反応させた。各フィルターに発色した
スポットをリフラクトメータ−で測定し、血清希釈率と
相対反応強度の関係をめた結果を第１図に示す。
−１Ｍ ＮａＣＬ ｐＨ７，０で４回洗浄後、このフィ
ルターに０．５ｒｒＭ４−メトキシナフトール及び２
ｍＭ Ｈ２Ｏ２を含む基質溶液ＰＨ７，ｏ １００μｌ
を加えて３０分間反応させた。各フィルターに発色した
スポットをリフラクトメータ−で測定し、血清希釈率と
相対反応強度の関係をめた結果を第１図に示す。
各種血清のＨＢＶ −ＤＮＡの量を上記の方法によって
測定し、従来法であるラジオアイソ） −ｆ標識固相法
による測定値と比較した結果を下表に示す。
測定し、従来法であるラジオアイソ） −ｆ標識固相法
による測定値と比較した結果を下表に示す。
Ａ ］ ＯＯｐｇ ９６ ｐ＆
Ｂ ２５ ４１
Ｃ６８７１
Ｄ ３６５ ４１ １
ＦＪｎｄ ｎｄ
Ｆ ５ １ ０ ４． ９ ０
実施例２
実施例１で作製した二本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡ １ ｍｌ
（１ｍｌ ）とＨＢＶ−ＤＮＡを導した一本鎖Ｍ１３−
ファジＤＮＡ５ ■（２ｍｌ ） Ｋホルムアミド８ｍ
ｌを加え、５分間この混合液を沸とうさせた。次に、こ
れに２ｍｌの緩衝液（０，０７モル／ｌ ）リス−ＨＣ
１２モル／ｌ ＮａＣＡ 、 １５ ｍＭ ＥＤＴＡ
ｐＨ７，５）を加え、５０℃で４時間そしてさらに６０
℃、で１時間加温した。
（１ｍｌ ）とＨＢＶ−ＤＮＡを導した一本鎖Ｍ１３−
ファジＤＮＡ５ ■（２ｍｌ ） Ｋホルムアミド８ｍ
ｌを加え、５分間この混合液を沸とうさせた。次に、こ
れに２ｍｌの緩衝液（０，０７モル／ｌ ）リス−ＨＣ
１２モル／ｌ ＮａＣＡ 、 １５ ｍＭ ＥＤＴＡ
ｐＨ７，５）を加え、５０℃で４時間そしてさらに６０
℃、で１時間加温した。
この反応液をＢｌｏ−Ｇｅ１ Ａ３０ＦＦＩでグル濾過
し、ハイブリッドしたＤＮＡと未反応のＤＮＡを分離し
た。
し、ハイブリッドしたＤＮＡと未反応のＤＮＡを分離し
た。
？イド分画の近くに溶出される最初のピークを・分画し
、これにＮａＣ１が０．１−Ｍになるように粉末を加え
て溶かした。そして、さらに１００チエタノールを溶液
１ ｍｌに対し２倍の比率（２ｍｌ ）で加え、−７０
℃で２時間放置した。次に、］、７０００Ｘ、９で１０
分間遠心し、エタノール沈殿物を５０ｍ１の０、Ｉ Ｎ
ＮａＯＨ、０，２５ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．００１
％フェノールレッドで溶解した。ただちにこれをＢｌｏ
−Ｇｅ１Ａ５０でグル沖過し、目的の一本領ＨＢＶ−Ｄ
ＮＡを得たＯ この一本鎖ＤＮＡに６−Ｓアセチルメルカプトへキシル
アゾ、ノシンジホスフェー） （］ ＯｍＭ ）及びＲ
ＮＡリガーゼＩＯＵを加え、１０ ｍＭ トリス−ＨＣ
ｌ 。
、これにＮａＣ１が０．１−Ｍになるように粉末を加え
て溶かした。そして、さらに１００チエタノールを溶液
１ ｍｌに対し２倍の比率（２ｍｌ ）で加え、−７０
℃で２時間放置した。次に、］、７０００Ｘ、９で１０
分間遠心し、エタノール沈殿物を５０ｍ１の０、Ｉ Ｎ
ＮａＯＨ、０，２５ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．００１
％フェノールレッドで溶解した。ただちにこれをＢｌｏ
−Ｇｅ１Ａ５０でグル沖過し、目的の一本領ＨＢＶ−Ｄ
ＮＡを得たＯ この一本鎖ＤＮＡに６−Ｓアセチルメルカプトへキシル
アゾ、ノシンジホスフェー） （］ ＯｍＭ ）及びＲ
ＮＡリガーゼＩＯＵを加え、１０ ｍＭ トリス−ＨＣ
ｌ 。
１ ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．１ 、Ｍ ＮａＣ１ｐＨ
７，３で３７℃で２時間反応させた。これをＢｉｏダル
Ａ６０でグル濾過し、修飾一本鎖ＤＮＡ分画を分取した
。ＰＥＧ−１５０００で２ｒｎｌに濃縮後、０． Ｉ
Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１１，０に維持し完全にブセチル基
を除去した。５ＰＤ−化ルミノール結合デキストラン１
０■をｐＨ７，０で加え、４℃で一夜放置した。
７，３で３７℃で２時間反応させた。これをＢｉｏダル
Ａ６０でグル濾過し、修飾一本鎖ＤＮＡ分画を分取した
。ＰＥＧ−１５０００で２ｒｎｌに濃縮後、０． Ｉ
Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１１，０に維持し完全にブセチル基
を除去した。５ＰＤ−化ルミノール結合デキストラン１
０■をｐＨ７，０で加え、４℃で一夜放置した。
次に、これをバイオグルＡ６０でゲル濾過し、目的のル
ミノール結合標識Ｊ（ＢＶ−一本鎖ＤＮＡを得た。
ミノール結合標識Ｊ（ＢＶ−一本鎖ＤＮＡを得た。
ＨＢウィルス性肝炎患者血清１００μｌに０．５ＮＮｎ
ＯＨ１００μｌを加えて室温で１０分間攪拌した。
ＯＨ１００μｌを加えて室温で１０分間攪拌した。
次に、０．５ Ｎ ＨＣｌ １００１ｔｌを加え、さら
に２００μｇ／＃Ｉ６のプロティンキナーゼに溶液２０
０μ１ｌＦｒ加えて７０℃で１時間反応させた。それか
ら、飽和フェノール−クロロホルム水溶液（１：１）２
００μｌを加え、分層した水層２００μｌをニトロセル
ロースを底に敷いた９６ウエルのマイクロプレートに入
れた。各ウェルの水層を吸引テ過後８５℃で１時間イン
キュベートし、ＰＢＳで１回洗浄した。
に２００μｇ／＃Ｉ６のプロティンキナーゼに溶液２０
０μ１ｌＦｒ加えて７０℃で１時間反応させた。それか
ら、飽和フェノール−クロロホルム水溶液（１：１）２
００μｌを加え、分層した水層２００μｌをニトロセル
ロースを底に敷いた９６ウエルのマイクロプレートに入
れた。各ウェルの水層を吸引テ過後８５℃で１時間イン
キュベートし、ＰＢＳで１回洗浄した。
これに前項で得られた標識一本領ＤＮＡ １００ｎ９を
含む溶液２００μｌを加え、６５℃で１８時間加温した
。このフィルターを０．１Ｍ酢酸−１０μＭＥＤＴＡ
−Ｉ Ｍ ＮａＣＬｐＨ７，０で４回洗浄後、このフィ
ルタを切りとシ、ルミノボトメ−ター中でＨ２Ｏ２２ｍ
Ｍ、ＰＯＤ １０ Ｕ 、ＮａｚＣＯ３ｏ、 Ｉ Ｍ
ｐＨ９，５を２００μｌ含む発光管に移し、発光強度を
測定した。
含む溶液２００μｌを加え、６５℃で１８時間加温した
。このフィルターを０．１Ｍ酢酸−１０μＭＥＤＴＡ
−Ｉ Ｍ ＮａＣＬｐＨ７，０で４回洗浄後、このフィ
ルタを切りとシ、ルミノボトメ−ター中でＨ２Ｏ２２ｍ
Ｍ、ＰＯＤ １０ Ｕ 、ＮａｚＣＯ３ｏ、 Ｉ Ｍ
ｐＨ９，５を２００μｌ含む発光管に移し、発光強度を
測定した。
得られた結果を第２図に示す。
図面はいずれもＨＢウイ−ルス性肝炎患者血清について
本発明の方法で測定した結果を示すものでらシ、第１図
は一実施例における血清希釈率と発色スポットの反射強
度の関係を、そして第２図は他の実施例における血清希
釈率と化学発光強度の関係をそれぞれ示している。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人弁理士 １） 中 政 浩
本発明の方法で測定した結果を示すものでらシ、第１図
は一実施例における血清希釈率と発色スポットの反射強
度の関係を、そして第２図は他の実施例における血清希
釈率と化学発光強度の関係をそれぞれ示している。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人弁理士 １） 中 政 浩
Claims (1)
- 測定対象である一本鎖ポリヌクレオチドを、標識物を有
する高分子化合物が５′端又は３′端に結合されかつ該
測定対象一本鎖Ｉリヌクレオチドと二本鎖、ｊ？ ＩＪ
ヌクレオチドを形成しうる一本鎖ポリヌクレオチドと接
触させることを特徴とするポリヌクレオチｒの測定方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59112519A JPS60256059A (ja) | 1984-06-01 | 1984-06-01 | ポリヌクレオチドの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59112519A JPS60256059A (ja) | 1984-06-01 | 1984-06-01 | ポリヌクレオチドの測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60256059A true JPS60256059A (ja) | 1985-12-17 |
| JPH0551280B2 JPH0551280B2 (ja) | 1993-08-02 |
Family
ID=14588674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59112519A Granted JPS60256059A (ja) | 1984-06-01 | 1984-06-01 | ポリヌクレオチドの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60256059A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5082830A (en) * | 1988-02-26 | 1992-01-21 | Enzo Biochem, Inc. | End labeled nucleotide probe |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5861468A (ja) * | 1981-10-09 | 1983-04-12 | Hitachi Ltd | 免疫定量法及びそれに用いる免疫試薬 |
| JPS60144662A (ja) * | 1983-12-12 | 1985-07-31 | モレキユラー・ダイアグノステイツクス・インコーポレーテツド | 核酸プローブ、ポリヌクレオチド配列およびその抗体を検出するための試験方法および試薬系 |
-
1984
- 1984-06-01 JP JP59112519A patent/JPS60256059A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5861468A (ja) * | 1981-10-09 | 1983-04-12 | Hitachi Ltd | 免疫定量法及びそれに用いる免疫試薬 |
| JPS60144662A (ja) * | 1983-12-12 | 1985-07-31 | モレキユラー・ダイアグノステイツクス・インコーポレーテツド | 核酸プローブ、ポリヌクレオチド配列およびその抗体を検出するための試験方法および試薬系 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5082830A (en) * | 1988-02-26 | 1992-01-21 | Enzo Biochem, Inc. | End labeled nucleotide probe |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0551280B2 (ja) | 1993-08-02 |
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