JPS60246751A - 胚移植法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １８９０年代の終わり頃、イギリス、ケンブリッジのウ
オルター・ヒープ（Ｗａｌｔｅｒ　Ｈｅａｐｅ）が動物
の卵子移植に関する実験を行なった。この研究はそめ後
多（の実験によって続けられている。

イギリス、ケンブリッジの動物研究所、生殖生理学・生
化学部門、Ａ、Ｒ，Ｃ，ユニットのｌ−。

Ｅ、Ａ、’０ウソン（Ｒｏｗｓｏｎ　）らは、最近、哺
乳動物、特に飼養動物における卵子移植技術を開発した
。ブリストル、ジョン・ライト・アンド・サンズ社発行
の［獣医年間（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ａｎｎｕａｌ　
）１９６９年版」の第２００ページ以後に、［生殖およ
び生１ｊｒ４陣害」と題して、彼等の開発内容を記した
り、Ｅ、Ａ、ロウソンの論文がある。これらの開発に関
係した技術は、ケンブリッジ、ユニバーシティ・プレス
１９７２年発行の哺乳動物の生殖シリーズ第５＠、Ｃ，
Ｒ，オースチン（Ａｕｓ’ｔｉｎ）およびＲ，Ｖ、ショ
ート（Ｓ　ｈｏｒｔ）著［生殖の人工制御（Ａｒｔｉｆ
ｉｃｉａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃ
ｏｏｎ　）ｊの第１章および第４章にも記載されている
。また、アメリカン・ソサイアテイ・オブ・アニマル・
サイエンスの動物の生殖に関する第１０回隔年シンポジ
ウムならびにアメリカン・ソサイアティ・オブ・アニマ
ル・サイエンスが１９７１年に発行した論文集「制御の
ための出産見込み時の性別比＜Ｓｅｘ　Ｒａｔｉｏ　Ａ
ｔ　８ｉｒｔｈ−Ｐｒ。

５ｐｅｃｔｓ　ｆｏｒ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）　Ｊをも参照
されたい。より広く見れば、この領域の進歩は、雑誌４
ノ−イエンス（アメリカ）、ネイチャー（イギ、リス）
、ジャ−ナル・オブ・アニマル・サイエンス、ジャーナ
ル・オプ・リスロダクション・アンド・フ１−ティリテ
ィおよびザ・バイオロジー−オブ・リプロダクションに
報告されている。

上記引用文献に記載されているこれら開発された技術は
、外来性ゴナドトロピンを用いて、供給体に過度排卵を
、ときにはそれに代えて供給体上、養い親として有望な
受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　）との発情同期化を、惹
起させ、供給体に人工授精を施し、受精後に卵母細胞を
外科的に採集し、商業的に入手し得る組織培養培地中で
短期間の胚（ｃ＋＋＋ｂｒｙｏ）培養を行ない、最後に
、１つ以上の胚を同期化受容体の子宮へ移植して、胎児
（ｒｅｔｕｓ　）を成熟させるものである。現在のとこ
ろ外科的に行なうのが好ましいどされている受容体への
移植に先立つ　。

胚の一時的「給塵」としてウサギが適当なことが示され
ており、これらの給塵がヒツジの胚をイギリスから南ア
フリカへ運び、次いでそれらの養母から誕生させ・るの
に使用されてきた。

オースチンとショートの著書第３０ページ以下によれば
、ラットの卵巣の薄片がグリセンリン処理され、−７９
℃まで冷凍され、融解され、受容体へ移植されている。

マウスの胚も、−１９６℃の凍結に耐え、融解され、受
容体へ移植され、その受容体は正常な満期生存胎児すな
わち新生マウスを誕生させたと、報告されている。す”
イエンス誌（アメリカ）１７８巻４１１ページ以降（１
９７２年１０月２７日号）参照。これらの進歩は、本明
細書記載の成東を達成するのに採用して役立つかもしれ
ない技術ならびにその他の別個に知られている技術に関
係するものである。たとえば、発情検知法としてふざけ
雄（ｔｅａｓｅｒ　ｍａｌｅ　）　ヲ作るため精管切断
を実施してもよいことがよく知られている。Ｘランティ
ング（ｍ０ｕｎＨｒｌｃ＋、　ｇｔが師に乗ること、）
は信頼し得る指標であって、１９６３年２月５日付アメ
リカ特許第３．０７６’、４３１号に記載されたマーク
付は法によって確認できるからである。

本明細書記載の技術は、記載した方法、装置および組成
物を指示通りに採用するとき、遺伝学的に優れた畜生な
らびにその他の牧場動物の生殖力を増大させるための改
良技術となるものと信じられる。

ここに記載づる技術を採用することにより、卵子技術が
ありふれたものとなるであろうと信じることができる。

また、前記「生殖の人工制御」中のＣ，ボルダ（Ｐｏｌ
ｏｅ）の記述とは逆に、ここに記載する技術が、雌なら
びに雄の遺伝学的ポテンシャルを開発するべく、人工授
精と同様に利用されるのも遠くはないであろうと信じる
ことができる。これらの技術はまた、羊、畜生、さらに
は人間といった雌の真の子宮容量を開発することができ
る。それらは、「外来性ゴナドトロピンによる処置から
生じる（大ぎい一腹の子）の発現頻度は全（の自然現象
的子宮容量を示すはずであるという点で、むしろ例外的
であると思われる」　（Ｃ。

ボルダ、第２５ページ）のである。

従前の技術は実験的技術として用いられており、多数の
場合に容易に再現できるものではないような手法を採用
しており、その他の難点もあったが、本発明開示の種々
の改良はそれらを克服するものである。

現在、また将来において、本明細書添付の特許請求の範
囲の精神から外れることなく、種々の改良、組合せ、再
編成を当業者ならば思いつくであろうから、本明細書開
示の改良は、入手し得る材料またはここに記載の材料を
掲げて説明していることを了解されたい。

かくして、本開示の対象としでは、所望の遺伝材料の入
手可能性を有利かつ大きくする方法が包含される。

したがって、ここには、改良された肝組織培養法は、卵
母細胞冷凍技術、移植すべき胚の性の予知法、同じ供給
体から同様の遺伝材料の胚をいくつか得るためのクロン
（ｃｌｏｎａｌ　ｂｏｄｉｅｓ　、栄養系または分校系
）の利用法を開示する。

供給体と受容体との同期化は従前よりも臨界的でなくな
り、移植時期のより大きい遅れを豹容づるものとなる。

１　以下に記載する多くの改良点は・以下に詳細に記載
するから、前記は、これから記載する技術を限定するも
のではなく、以下に続く改良点の記述をづべて包含して
いるものでもない。

これらの改良の目的のうちに、特定の動物の栄養繁殖（
ｃｌｏｎａｌ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　）のための
改良された方法がある。卵母細胞にお番ブる反応を誘導
するために滅菌精子および偽（ｐｓｅｕｄｏ　）滅菌溶
液を使用し、もともと汚染されていた補体の移植により
、または核移植により、卵母細胞を２倍体になされる。

細胞分離によって、さらに追加の栄養系の胚が得られる
。

精子は開示された種々の方法によって予め性を決定づる
ことができ、この方法の改良が本願の重要な一部である
。

それゆえ、その好ましい具体化例を以下に記述する。

発情はマウンティングを観察しｔ　＊　ｇ　することが
でき、それは、好ましくは、そして極めて信頼できる程
度に、精管切断（またはｇｏｍｅｒｉｚｅｄ　）雄性動
物を用いてなされる。かかるふざけ雄牛は発情が早まる
と雌牛に乗るであろう。輸精管の一部を切除された、ま
たは副精巣尾を除去された精管切断雄性動物は交尾を行
える。陰茎および包皮を偏らせることにより、交尾とそ
の後の疾病の伝搬を防止することができる。経済的には
、ふざけ雄牛を毎月２０〜３０頭の雌牛の組を回転させ
て、信頼性が保たれている間に最大の利用をすることが
要求される。

マウンティングは、熟練したカウボーイによりζ厳密な
監禁の下で、または放牧地で、観察することができる。

しかし、雌牛にマウンティング雄牛でマークを付けると
き、より信頼できる証拠が得られる。カマル（＋＜ａｌ
ｌｌａｒ）社が前記アメリカ特許第３，０７６．４３１
号記載の装置を売っている。

また、その目的でデザインされた、ウィスコンシン州デ
フＡレストのアメリカン・ブリーダーズ・サービス社の
販売に係る、マーク付は用端網を雄牛に取（＝ｌけても
よい。

マーク付けのための好ましい手段は、マウンティングが
試みられる間に雌の外から見える臀部と接触するところ
の雄の部分に顔料入りのグリースまたは油を局所的に塗
ることである。これは、雄牛の胸部および下腹部に適用
してもよい。

マウンティングを受けた雌に付いたマークは容易に観察
でき、未熟練者でも発情を検知できる。

グリースの処方は局所適用しても無害であり、雨で洗い
落されないが、石鹸水まｌζは洗剤によって除去し得る
ものであることが、望ましい。望ましい担体（ベヒクル
）は油であり、その中へ顔料が混入される。毎日マーク
付けの色を変え得るという点から、異なる色を採用する
のが望ましい。

望ましい担体の例は次のとおりであｉ：処方　重量割合 オレイン酸またはオリーブ油 または落花生油　５０％ レシヂン（大豆の）　１％ ひまし油　２４％ 顔料、次のようなもの゛　２５％ 青：塩化第一コバルト 黒二カーボンブラック 黄ニクロム酸カルシウム 白：沈降炭酸カルシウム 赤味：硫酸コバルト（赤色へマタイト）赤：ノルマン・
レッド−（Ｎ　ｏｒｍａｎ　Ｒｅｄ　）、上記処方は要
求に適っており、局所適用のためにも、所望の色変更の
ためにも、全く満足すべきものであることが実証される
であろう。

ふざけ雄牛はいくつかの方法で準備できる。外科手術の
熟練者を必要とするという事実による最大の困難に相当
するのが、獣医学／小動物臨床医（■ｅｔｅｒｉｎａｒ
ｙｌｙｌｅｄｉｃｉｎｅ／Ｓｍａｌｌ　Ａｎｉｍａｌ。

Ｃ１１ｎｉｃｉａｎ）　１９７３年４月号３９５ページ
に記載されている陰茎と包皮を片寄せる外科的雄準備法
である。この方法を用いると、交尾が阻止される。

しかし、本説明の重要な一面は再現性の良い方法を提供
することであるから、副精巣切除法１．特にウシ科のそ
れを優先させる。この手術は、青春期直前の雄牛に行な
う。、記述する予゛定のこの手術は、同じ技法を潜在的
に市場性のある動物に利用できる点で、結果的に利益と
なる。雄牛は去勢牛よりもずっと速やかに成長し、去勢
牛で得られるよりも８％多い体重を期待でき、脂肪分は
より少ないのである。

手術は立った姿勢で実施する。副精巣尾を腹側の小さい
陰嚢切開部から除去する。局所麻酔または深い硬膜外麻
酔を利用する。皐丸を陰嚢の底へ押しやる。副精巣の尾
、部の真上の皮膚および被膜を通して３〜５ｃＩＩｌの
切開部を作る。切開部を通して副精巣尾を押しやるのに
、皐丸への背圧を利用する。副精巣を皐丸にくっ付【プ
ている副精巣の靭帯をはさみで切断し、副精巣尾を輸精
管と副精巣本体とによってその位置に保つ。輸精管と副
精巣本体は皐丸の側部を背面へ登っているものである。

副精巣本体を皐丸に密接させ て一緒に結紮する。副精巣尾をはすみで切り、取り除（
。反対側の皐丸についてこの手術を繰返す。

抗生物質の粉末を縫合または鉗子で閉じた傷口に適用す
る。雄牛を使用するまで２０８間持つ。

検体鼾における発情発現の限られた回数を同期化により
持つことがｔきる。これは同期化によりてなし得る。こ
れに関しては、ゴトナドトロピン、特にプロゲストロゲ
ンによる発情抑制が役立つ。

メトロキシプロゲスプロンアセテート、６−メチル−１
７７セトキシブログステロン（ＭＡＰ。

アップジョン社）は、発情抑制のためエタノール溶液と
して使用されてきた合成プロゲスプロンである。メレン
ゲステロールアセテート（ＭＧＡ）は、ミシガン州力う
マズーのジ・アップジョン・カンパニーのツコ部門が、
薬剤官−有食物適用認可の保有者に食品添加物として販
売しており、米産飼料飼育（ｆｅｅｄｌｏｔ　）雌牛の
体重増加率および飼料転化率を向上させるため発情を抑
制するのに用いられる合成プロゲストロゲンである。こ
れは同期化用には使用を認可されていない。これは多分
１、、Ｍ　Ｇ　Ａが流産を起こさせ（ジャーナル・オブ
・アニマル・サイエンス第３０巻第４３３頁以下）、ま
たは卵子の受精率が低い一方、卵子の奇形が多い（ジャ
ーナル・オブ・アニマル・サイエンス第３５巻抄録１５
５）ためと推測される。ＭＧＡは、米産雌牛の隆起した
耳の静脈内または耳の皮下に配置したポリウレタン挿入
物中へ、移植されてきた。１日当り０．４ｍｏの放出速
度が得られている。

ＭＧＡは経口的に毎日摂取させてもよく、穀物飼料に配
合（１日当り１．８２Ｋ（］の穀物中に４゜０ミリグラ
ムまで）してもよい。本発明者は１日当り１．８Ｋｏ中
に０．４〜１．０Ｉｌｉｏを用いるのがよいと考える。

最適用量は１日当り経口投与間約０．５ｍａであろう。

１日当ＩＪ０．５’ｎ＋　ａ　（Ｄ経口投与は発情を抑
制し、投薬中止後２〜９日後に発情を許すことが示され
ている（獣医学／小動物臨床医第６５巻４９１頁以下（
１９７０年５月））好ましい経口投与量を穀物中に入れ
て用いると、投薬中止後２〜１１日、平均で投薬中止後
４．５（±０．５）日して、発情が起こるであろう。未
産亀牛および経産成熟雌は投薬開始前に正常な発情リイ
クルを持ついたものであるべきである。

卵子の受精率および予期される発情を向上させるべく、
投薬中止日に、１０〜２ｏＩＩ１ｇ、好ましくは１５〜
１７ｍ−ｏのステロイド、エストラジオールベンゾエー
ト（コロラド州ボウルダーのアラパホウ（Ａ　ｒａｐａ
ｈｏｅ　）ケミカルズ社）を筋肉内注射する。５日目に
同様量を投与する。５日目の投与■を１５〜１７ｍｇと
するとき、最初の投与量を減じてよく、はとんどの場合
に満足すべき結果が得られる。このステロイドはエタノ
ール溶液に混ぜ、塩類含有カプセルの形で、または穀物
飼料に添加して、経口的に投与してもよい。

上記の技法を用いるとき、最初の発情の間に受精が起こ
るようにしてもよいが、受胎率が向上され得る第二用ま
で待つのが畜生の場合好まし０で−あろう。

ここに破砕した発情・排卵検知の正確な管理を採用しな
いときは、２６または２７日目に、ａ３よび２８日目に
再び、動物に授精するのが好ましい。

同期化の後には、ふざけ雄牛を用いて発情を容易（に検
知することができる。上述のように、こ′れが雌に発情
が始まったときマークが付くようにする理由なのである
。

先に述べたように、多くの哺乳動物が、その、梗におい
て正常なよりも多数の胎児を成熟させることのできる子
宮容量を持つ。これが多産またＧ、を双生子の出産を特
に望ましいものとする。しかし、双生子出産は望ましい
が、多すぎる胚（ま望ましくないことを我々は認識して
いる。畜生の場合、双生子を招来する好ましい方法は、
発情サイクルの１４〜１６日目から始めて１日２回、５
日間にわたって、１％カルボキシメチルセルロースプ」
Ｊノウム（イリノイ州シカゴ、アボット・ラボラトリー
ズ）溶液３．６Ｉｌｌｉ中に５〜１５ＩＩ１ｇ、好まし
くは７．５〜１０Ｉｌｌ！ｌＩのＦ　Ｓ　Ｉ−１（ろ胞
刺激ホルモン）を含有させて筋肉的投与する方法である
。この期間中の発情抑制が望ましく、これは先に論じた
ようにアップジョン社から人手し得る合成プロゲストロ
ゲン（ＭＡＧ）を用いて行なうことができる。ＦＳＨ単
位約５０１１１０の１０ｃｃバイアル入りで入手できる
Ｆ　’Ｓ　Ｈ−Ｐは、ネブラス力州オマ／”１のアーマ
−ボールドウィン・ラボラトリーズｈＸら購入できる。

バイアルの５分の１が適当な投与ｍである。

ＦＳＨは、成熟のためには多プぎる卵母細胞を産生させ
得るところの望ましくない排卵過度を引き起こすＰ　Ｍ
　Ｓ”、（妊娠雌鳥血清ホルモン）の傾向を克服する傾
向がある。

畜生にお１プる双生子は、異なる性を持っていれば、量
産群の中の雄１党でも通常量産群中のすべての雌が７リ
ーマーヂンとなるから、失望的な副次効果をもたらす。

しかし、双生子は動物生産を増す結果を生じ、不幸な副
作用は、後に論じる性別制御法を用いて克服することも
できるのである。

排卵過度は、排卵時におけるより多くの卵子が産生され
るのが通常であるという点で、上記双生子招来法と区別
できる。

選択された個体の繁殖を行なって、望ましい癲みである
。以下、これらの技術におけるいくつかの改良および好
ましいステップを詳述しよう。

受容体哺乳動物において発情抑制が望ましい。

先の記載を再び引用できる。排卵過度を起こさせるべき
雌牛または米産若齢雌牛は受容体と同期化されたサイク
ルを持つべきであるが、受精率の問題のため、卵子を２
回目の発情まで回収すべきではない。

多排卵または排卵過度は、１５００〜３０００ｒＬＪ（
国際単位）のＰＭＳ　（妊娠１馬血清）の注射により引
き起こすことができる。畜牛には２０００ＩＵが好まし
いが、豚および羊に対しては大きい動物に用いる量の半
分が適当である。ＰＭＳ（エイアースト・ラボラトリー
ズ）血清は発情サイクルの１６日目または１５〜１８日
目の間に注射すればよい。１回のＰＭＳの注射で、齢４
−１１４３１１の子牛においても、過度の７胞の生長を
きたす。ＰＭＳ注射５日後に５〜ｉｏｌＩ１ｇのＮｒＨ
−＝１−ト１（黄体化ホルモン）を静脈内注射Ｊべさで
ある。ｍＨｌまアイオワ州デモワーヌのダイヤモンド・
ラボラトリーズから入手でき（ｖｅｔｒｏｐｈｉｎ　）
、１バイアル中１．：ＮＩＨ−１−８Ｈ−８４およ（Ｆ
Ｎｌｌ−１−Ｌ　＋−１−８ｉ活性成分５ｍｇが入って
いる。供給体動物中で授精を行なうべきときには、１２
〜２４時後に産生卵子を精液にさらずべきである。

ＰＭＳ血清の代わりに、脳下垂体ゴナドトロピン（ＦＳ
）ｌ）を置換えて双生子をもたらすようにできることが
述べられている。これは速やかに消失するので、発情サ
イクルの１２〜１８日目の間に、６〜１４ｍ１これより
少量では生長するデ胞の生じる数が少なくなる）を１日
２回、約５日間にわたり、先に述べた好ましいやり方で
、または生理食塩水に入れて筋肉内に、注射することが
必要である。ニレヴアール（Ｎ　ＮｅＶａｒ、ノルエタ
ンドロロン、サール社はもはや製造をやめている）が発
情期間中の発情の抑制に有用であることが示唆されてい
る（ジャーナル・オブ・アニマル・サイエンス第３４巻
７７頁以下、１９７２年）が、それは望ましくなく、そ
の目的を達成するのに低レベルのＭＧＡ　（０，３−０
，５ｍ　ｇ＞を用いることができ、これが枦胞の数を増
すようである。

ＦＳＩ−１−Ｐ（アーマ−＝ボルドウィン）が、先に述
べたように、適当な下垂体ゴナドトロピンである。豚か
ら調製されたＦＳＩ−１の１０１１１１１１を代…して
もよい。ＬＨ，たとえばＮ　Ｉ　Ｈ−Ｌ　Ｈ−８１をそ
の期間の終わりに釈放をもたらすべく、使用することが
できる。

畜生において発情が始まったのちは、発情の終わりが検
知されるまで、４時間ごとにチェックを行なうべきであ
り、卵巣を、排卵が検知されるまで４時間間隔で、直腸
から触診すべきである。供給体内で授精させるときには
、発情の後期に動物に精液で授精を行なうべきである。

ここで意図する炉胞の生長は、ブ胞成育の期間中に、最
後の発情伊７〜１４日目に、高エネルギ含量の飼料を与
えることにより、特にゴナドトロピンを利用するとき、
増進させることができる。

この食餌は、通常の穀物飼料の２倍の重量とすべきで、
その追加分にはグルコースおよびその他の高エネルギ源
、たとえば脂肪（ラード）、糖蜜が・当てられる。

この期間の初めには、エストラジオールベンゾエートを
、水明ａｍ中に記載した用用で与えることも、望ましい
。− 排卵後８〜９０１に７１１！ＩＩの排卵過度の雌から卵
子を得ることが極めて望ましい。卵子が内部的に授精さ
れているときは、最良の時期は５０・−８０時間の間、
好ましくは７０〜８０時間の間であり、その時期には、
卵子は主どして、膨大部−峡部連結部（子宮前方の挟小
部）の前法の輸卵管の下流域および子宮の角（ｈｏｒｎ
）の−り部にある。これは、この局所域での卵母ｍ胞の
集中に導く。

この時期は、授精を受けていない対象についても概して
受容れうるちのであるが、卵子は輸卵管のより高い所に
、采の近くにさえ、見出されるであろう。ここでの最良
の時期４０〜８０時間の間であり、その時期には、卵子
の大部分が膨大部−峡部連結部に近い点に達している。

他の動物、たとえば豚では、畜生で起る上記の状況より
も、輸送がずっと速い。

その期間内に脇腹の開腹を行なえばよい。対象動物は手
術前２４時間絶食させ、各々に約０．５ｍａの塩酸プＯ
ビオブＯマシン（たとえばアボット・ラボラトリーズの
トラウェット（Ｔ−ｒａｖｅｔ　、）、５０／ｕ、ｍＡ
　）を麻酔の２５分前に筋肉的注射する。麻酔は、塩酸
プロ力インを第１、第３および第５腰椎の背側および腹
側の両方に注射して行ない、用ｍは個体の寸法に応じて
１００〜１５０１１史とする。

切間域は毛を剃り、消毒液で洗う。切開は最後の肋骨と
、回腸の外角との間で長さ１５〜２０ｃｍにわたって行
なうことができる。これは、バード−パーカー（Ｂａｒ
ｄ　−ｐａｒｋｅｒ）　Ｎｏ、４の柄にバード−パーカ
ーＮ０．２２の刃をはめたものを用いて行なうことがで
きる。検線（ｅＯｒａｓｅｌｌｒ　）を用いて、両側の
卵巣切除および卵管切除を行なう。

輸卵管を切開した場所で、子宮の角の頚部端を鉗子でつ
かみ、焼きごてで焼灼し、焼灼部は、滅菌ウシ血清（ミ
シガン州デトロイトのデフコ（Ｄｅｆｃｏ）社）または
好ましくは、輸卵管切除時、１０Ｍ１９９または、より
好ましくは、本明細書で胚培養用の例どして記述する培
地を入れた２０〜５０ｍ１注射器の鈍い針で穿刺する。

角は内情で洗い（２０〜４０ｍ１の血清を要するであろ
う）、輸卵管を通過した洗液を滅菌時計皿に集める。そ
れゆえ、輸卵管には、放出されてきた母印細胞を集める
ための室（ｓｕｒｇｅ　ｃｈａｍｂｅｒ　＞を持つデユ
ープを挿入する。その小管を吸引すれば、この過程の助
けどなるであろう。、 他の麻酔法として、最初にベンドパルビトンナトリウム
を注射し、１５分してからフルオセーンと酸素との閉回
路を適用する方法がある。切開は、骨盤のすぐ前方で正
中線（ｍｉｄｌｉｎｅ　）に沿って行なうことができ、
そこを通して子宮と卵巣を取出し、角を鉗子で挾んで遮
断する。卵巣中央の切開を行ない、そこを通して管を挿
入する。４０１１１Ａの注射器は鉗子の前方へ導入し、
輸卵管を前記のやり法で洗う。次に子宮を下腹部へ戻し
、Ｎ０１３の賜線を用いて傷口を縫合し、続いてテープ
で覆った皮膚を断続的に縫合する。

１　受精卵子は、±２日の変動幅で発情を同期化した養
い籾受容体に移植すればよい。

移植には前と同じ技法を用いるが、黄体を包含する卵巣
を直腸触診で確認し、卵子を、１　ｔｅｆＬの注射器に
接続したパスツールピペットを用いて隣接する子宮角へ
移植する点が異なる。−各卵巣に黄体があるときは、両
角に卵子を移植してもよい。

しかし、これが存在しなければ、双生子は見込めない。

卵子（割球）のｍｍ鑑別がされるηら♂、出産の見込み
を増すために２個の卵子を移植することが望ましい。し
かし、２個の卵母細胞に対し出産１頭の可能性が極めて
大きいから、フリーマーヂンをあまり心配せずに、これ
を行なうこともできる。

卵子は滅菌してあれば短時間（１０時間）は透析室中に
、または後述するようにより長（ふ卵ユニット中に、保
存することができ、また、卵子が子宮へ入り込まないよ
うに結紮したウサギの輸卵管の子宮−卵管連結部に移植
してもよい。この結紮は、卵子回収のため輸卵管を洗う
とき、その回収を容易にする。これらの条件の下で、卵
子は、ふ部器中でも可能なのと同じく、約７日間まで、
正常に分裂していくであろう。

受容体が±２日の精度で、好ましくは１確に、同期化さ
れるのを確実にするよう、注意を払うべきである。受精
後、卵子が子宮に入り、概説する予定の頚管入り込み法
によってそこがら採集できるようになるまで、通常４日
かがる。また、卵子を輸卵管および子宮から外科的に回
収するときに、はぼ同じ時期を採用することを想起すべ
きである。

受容体は、黄体退行前に、好ましくは６日目または７日
目に終わる期間内に、卵子を受入れるべきである。

ピペットおよび人工授精用と同様の方法を用いて、卵子
を畜生および馬（豚はだめ）に頚管を通して挿入するこ
とができるが、化膿性子宮内脱炎を防止するため無菌条
件を採用すべきである。炭酸ガスによる子宮拡張は、非
外科的移植のために望ましいことである。

受容体への卵子の非外科的導入は、６つの細胞期の２ま
たは・３期または桑実胚期の初期に、行ない、まず、づ
べて無菌条件の下で、一端の曲がった通常の授精とベッ
トへ卵子を培地または血清。。

５　ｎ＋ＪＬとともに吸い入れる。ピペットを、滅菌鏡
を通して、受容体の子宮頚管に導入し、直腸触診により
前もって黄体のあることを確認しである子宮角に沿って
前進させる。同じピペットを通してＧ　Ｏ２を導入し、
子宮が十分拡張するまでその導入を行なう。装−は２つ
のフラスコがらなり、１つは、エタノールで覆われたド
ライアイス片を含有し、第２のフラスコの水の線よりも
下のところへ接続されている（第２のフラスコには蒸留
水が半分入っている）。第２のフラスコの上部空間はＴ
字形の取付物に接続されている。Ｔ字形付属品の片側は
ピペットに、他の側はゴム気球を通じ、ゴム気球は子宮
内の圧力が増すとふくらむ。ガス導入後直ちにピペット
を抜き取り、４〜Ｑ時間子宮を拡張された状態のままに
しておくべきである。

これら非外科的方法による移植は、好ましくはシラステ
ィック（Ｓ　１ｌａｓｔｉｃ　）　（ダウ・ケミカルの
商標）チューブからなる可撓性カニユーレをピペット中
に用いることを予想している。ピペットを子宮角に挿入
し、カニユーレを通しくピペットを通して）、移植組織
を子宮角中へ放出し、小さい移植組織の場合は子宮峡部
を通して輸卵管中へ放出する。

受精卵を受容体へ移植する前に、移植づる胚の性別鑑別
を行なうのが望ましいであろう。これは種々の方法で行
ない得る。明らかに、通常の精子細胞により卵母細胞を
受精させると、一方の性の計数値は５０％となるであろ
う。しかし、後述のように、胚を成る期間試験管内に維
持することができるから、胚の細胞中にＸ染色体が存在
するか、Ｙ染色体が存在するかを電子顕微鏡で判定する
ことも可能である。

桑実期の細胞または胚胞を胚から切採する。損傷のおそ
れが最も低い点でより好ましい胚胞の場合には、吸引下
のピペットで透明体を保持し、１または２個の細胞を切
採するのに十分な大きさの針で栄養芽層を突く。

１　細胞の染色体含量を調べるため、０．０７５ＫＯ史
（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）　Ｎｏ、Ｒ１：５−０５７５）
を全量が４１１１ｆｔとなるまで加え、冷却する。細胞
をウシ胎児の血清０．５ＩＩＩＱ、中に懸濁させ、低張
食塩水０．５　ｍｆＬを加え、遠心分離直前にさらに３
．５１！ＩＱ、を加える。７５０　ｒｐＩｌｌで６分間
遠心分離する。添加から終了までに１２分間を越えるべ
きではない。上澄液０．２５　ｍＱは棄て、残りの上澄
液中の細胞を再懸濁させる。無水アルコール３部、木酢
１！１部からなる固定液をまず０．５１１１見、次いで
３．５　ｍＱ、加えて、固定する。細胞はこの固定液中
に１５分間置くべぎである。固定液の上澄み０．２５　
ｍｆＬ残して他は棄て、固定操作を繰返す。

固定操作を反復した後、固定液０．５　ｍｆＬ以外は棄
て、細胞を再懸濁させる。清浄な冷却した湿潤ガラスス
ライド上に細胞を含有する２滴を置き、風乾させる。次
に、アセト−オルシン（ＡＣｅｔＯ−Ｑ　ｒｃｉｎ）染
料（ギブコＮｏ、５３７．５３’８．５３９）２滴で染
色する。ここで、電子顕微鏡下に―胞を調べ、染色体の
特性を記録する。　゛と殺動物を卵母細胞源とし、その
卵母細胞を生ぎている受容体に移植して成熟させること
ができる。と殺すべき動物は、と殺菌は、通常の外科６
的または非外科的処置法を採用する場合と同じように、
取扱う。と殺時期は、外科的方法について概説したもの
と対応すべきである。動物は、外科的回収法の場合と同
じく、受精後または受精前に、と殺する。

と殺は、−撃して気絶させ、出血させることにより実行
する。出血させている間に、腹側を切開し、卵巣、輸卵
管および予言角を無傷で回収する。

子宮角は直ちに鉗子ではさみ、焼灼する。その器官を移
送用ふ卵器に入れ、臓器を３０〜３８℃、好−ましくは
３１〜３３℃に保ち、卵子を回収すべき場所へ移す。

回収は、輸卵管を切断することによって行ない、子宮角
に注射器を挿入し、血清または好ましくは組織培養用培
地（７０Ｍ１９９またはハム（Ｈａｍ）のＦｌｏまたは
Ｆ１２、ギブコ社）２０〜４０℃庭を注入して、輸卵管
から卵子を洗い出す。

卵子を時計皿に載撃、パラフィン油で覆や。卵子は５０
倍の顕微鏡で検査し、集め、本明細記載の好ましσ）組
織培養用培地へ移し、次いで受容体へ移植する。

未受精卵母細胞も、と殺動物の黄体の吸引によって卵巣
から回収す鼻ことができる。これらは、本明細書中の記
載通りにして受精させることかできる。

回収と受容体への移植どの間は、７０Ｍ１９９またはハ
ムＦ１０、または好ましくは本明細書で例示する処方の
ごとき組織培養用培地中で胚を培ｆ＆するのが望ましい
。培養は、市販の組織培養用恒温器中で、３１〜３７℃
の温度で、ＣＯ２５％、空気または酸素９５％として、
維持する１、Ｆ記範囲内で低めの温Ｉｆ（３１〜３３℃
）が好ましい。

通常の組織培養範囲３７℃でも成る程度うまくいくであ
ろう。

培養室は、シリコーンゴム栓付ガラス製シンプル管（３
０ｘｌＯＯ＋＋ｕａまたは２５Ｘ７５＋ｎｍ）でよい。

管の内面は、ガラス壁への付着成長を防止するため、シ
リコーン被覆しておくべきである。管の半分に、ＨＥＰ
ＥＳ！ｌ！ｉｉ液を加えた培地およびコウジ血清２０％
を満たし、残りの半分は前記ガス混合物を満たす。ガス
混合物は８時間毎に入替える。管はローラー上に水平に
載せ、培養中３０〜４０　ｐｐｍで連続的に回転させる
べきである。

卵子を回収づ′る際、洗液は管に集める。各管の底の液
体的３　ｍ庭を、培養温度に２０分間装いた優、取出し
、時計回または窪み付スライドへ移し、解剖用顕微鏡の
下で、５０倍または１８７．５倍に拡大して卵子を捜し
、４５０倍または１８７５倍に拡大して調べる。

卵子は、記載の方法で受容体へ移植するか、または管ま
たはウサギの中へ移して長期培養することができる。

次の例に示したごとき好ましい培地は、ビタミンＢ１２
、リボ酸、ビルジン酸ナトリウムおよびＬ−グルタミン
を含有する。それはｌ−Ｉ　Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液およ
びＮａ　ｌ−１ｃｏ　ａ　ｔ”　ｐＨ７，３−７，４に
１　緩衝される。

好ましい培地の　１　１１１（］／見 Ｎａ（１１’　６８００ ＫＣ見　４００ Ｉｖ＋ｇ　ＳＯ４・　７Ｈ２０２０Ｏ Ｎａ　２　ｔ−ＩＰ、０４　・　２Ｈ２０’　６０ＫＨ
２ＰＯ，，６０ グルコース　１８００ フエノールレツド　１０ ＣａＣ麩（無水）　２０Ｏ Ｎａ　ＨＣＯａ　（ｐＨに応Ｌ；ｔ）　４００Ｌ−アル
ギニン１」Ｃ見　７０，０ １−−ヒスチジンＨＣ立　２０．０ １−一−リジン七ノ塩酸塩　７０．０ １）　Ｌ、　−１−ブトファン　２０．０Ｄ　Ｌ−フェ
ニールアラニン　５０．０ＤＬ−メチオニン　３０．Ｏ ［）Ｌ〜セリン　５０．Ｏ Ｄし一スレオニン　６０．０ ＤＬ−ｏイラン１２０．、０ １つシーイソロイシン　４０．Ｏ Ｄ　Ｌ−バリン　５０．０ ＤＬ−グルタミン酸モノ水和物　１５０．０ＤＬ−アス
パラギン酸　６０，０ ＤＬ−α−アラニン　５０．Ｏ Ｌ−プロリン　４０．Ｏ ［−−ヒドロキシプロリン　１０．０ グリシン　５０．Ｏ Ｌ−グルタミン　１００．０ 酢酸ナトリウム　５０．Ｏ Ｌ−シスチン　２０．Ｏ Ｌ−チロシン　４．０．Ｏ Ｌ−ジスチント＋Ｃ見　０．１ アデニン硫酸塩　１０．０ グアニン＋−＋Ｃ鈍　０．３ キサンチン　０．３ ヒボキザンチン　０．３ ウラシール′０．３ チミン　０．３ α−トコフェロールリンＭ２ナトリウム０．０１チアミ
ンＨＣ見　０．０１ ピリドキシン）−ＩＣ史　０．０２５ リボフラビン　０．０１０ ピリドキサールＩ−ＩＣＩＬ　Ｏ，０２５ナイアミン　
０．０２５ パントテン酸ｃａ　’　ｏ、ｏｌ。

ｉ−イノシトール　０．０５’０ アスコルビン酸　０．０５０ 葉酸　０．０１０ バラアミノ安息香酸　０’、　０５−０硝酸第二鉄Ｆｅ
　（Ｎｏ、＞’ａ　ｏ、１００ｄ−ビオチン　ｏ、ｏｉ
。

メナジオン　０．０１０ クルタチオン　０．０５０ ビタミンＡ　０．１００ カルシノエロール　０．２００ トウエーン（王Ｗｅｅｎ）　８．０ （アトラス・パウダー社商品名＞２０．０アデニル酸　
０．２００ アデノシン三リン酸　１．０ デスオキシリボース　０．５ リボース　０．５ コリンＧＡ　０．５ ビタミン８１２　１．３ リボ酸　０・　２ ピルビン酸ナトリウム　１１０．Ｏ Ｌ−グルタミン　２００．０ 上例の１徒当り、熱で不活′性化したウシ胎児血清２０
％を足す。

Ｌ 上側と同様であるが、塩類の代わりにアール（［：　ａ
ｒｌｅ）の塩類（ギブコ社）を用い、グルコースは１８
００１１１（］／立のままとする。

１也 例２と同様であるが、ビタミン類およびアミノ酸類の重
量を２倍とする。

１上 例１と同様であるが、ビタミン類およびアミノ酸のｉｎ
を２倍とし、グルコースを１０００．Ｏｒａｇ／ｇＬと
する。

卵母細胞を黄体から分離し、試験管内で成熟さｔてもよ
い。培地２０ｍＩＬを満たした１００ｍ１ｌ注射器にＮ
ｏ、２０の釘を付ける。ｌ胞の成長を引き起こすための
ゴナドトロピン注射の後３２〜３６時間後に、または畜
生の興奮または発情の最初の２４時間以内に、好ましく
は発情検知後１４時間ｙｔ＝ないうちに、腹腔鏡検査に
より黄体を確認づる。

卵子の外科的回収について記述したやり方で、または畜
生の乳房の上演の腹中部を、１５〜２０ｃｍ切間づる。

腹腔を００２でふくらませ、腹腔鏡を挿入して、卵巣と
黄体の位置を知る。黄体を針で突き、卵母細胞を、一定
した減圧の下に、吸引する。

卵母細胞を、パラフィン油または鉱油で覆った培地５ｍ
９．入り時計皿に移す。卵母細胞を取り巻く即行細胞を
、ヒアルウロニダニゼに３〜５分間さらして、除去する
。卵母細胞をピペットと培地ｏ、ｉｍ駐とを用い分離し
、培地２　ｍｆＬで２回洗う。脱水を防止すべく、卵母
細胞が常に培地またはＰＢＳ培地（ダルベラ：］　（Ｄ
　ｕｌｂｅＣｃｏ　＞のリンｒｍｔｓｌＩＪ衝塩類溶液
）で覆われているのを確実にする注意を払うべきである
。

排卵過度をきたすのに用いたゴナドトロピン注射によっ
てプ胞の成長が始まっており、卵母細胞を薄くなった（
成長した）ヂ胞から分離したときには、！胞から吸引し
た卵母細胞は試辞管中で成熟するであろう。

成熟ヂ胞の黄体から回収するとき、卵母細胞は、即行細
胞が除去されているから、約４　Ｉｌ、＋１間で成熟す
るであろう。

発情検知後６〜１４時間してのと殺によって卵母細胞を
得ることができる。輸卵管を８分の１ずつの断片に分【
プ、未開黄体も吸引すべきである。

それらの切片および吸引した黄体の卵母細胞は、パラフ
ィン油または鉱油で覆った培地中に置くべきである。

°卵母細胞を回収したときには常に、それらをふ卵器中
で、または解剖用顕微鏡の温かい台の上で、潟かに保つ
べきである。パラフィン油は、培地中のＧＯ□５％含有
空気と平衡に保っているべきである。

即行細胞の凝塊（よ必要ならば取り去るべきである。

）胞液０．１１Ｉｌ麩を、ｌＩｌ麩当り１００〜２００
万という濃度の精子０．４ＩｌｌｆＬとともに尋人する
から、成るｍの新鮮ザ胞液を保有１“るよう配ｍすべき
である°。２〜４時間内に、卵母細胞を囲む即行細胞が
分離して、表面に層を形成する。その濃度の中で５）〜
７時間すると、受精が完Ｙし、卵子は培地へ入れて桑実
期までに成熟させることがでさ、また受容体へ移植する
ことができる。

試験管内での受精には、重炭酸ナトリウムと稀１１Ｃ（
とでｐＨ７，３〜７．５に緩衝した前記処方例の培地を
利用する。ピルビル醒ナトリウムまたはオキザロ酢酸ナ
トリウムをこの受精培地の成分とすべきで、ウシアルブ
メン（卵白）を体積で３０％使用する。受精および培養
用の培地は硫酸ストレプトマイシン５０ＩＩ１ｇ／ｍｇ
、を含有づべきであり、ペニシリンＣ（カリウム塩＞７
５ｍａ／ｍＨも添加すべぎである。しかしこれらは性に
よる精子分離を採用するときに使用すべきである。

排卵時期に関しての供給体と受容体との同期化の問題は
、改良法の採用により克服できる。

移植された細胞体を成る期間培養することにより、遅れ
を達成できる。

これは、本明細書記載の冷凍法により、または、■胞分
離により供給体細胞の発達を後戻りさせて、移植する鑑
別細胞の総数を、正常な経過を許されていたならばそう
なったであろう段階に持ってくることにより、達成でき
る。

かくして、最初の細胞または細胞体を分離したときおよ
び受容体の正常受精のときから２．３３日にあたる時期
に、受容体へ細胞体を移植するのが好ましい。その目的
は、発生の胚盤胞期にＪ５　Ｇプる移植を可能ならしめ
る時期あたりに、供給体の細胞を受容体に与えることで
ある。

これは、予期される胚の胚盤胞期または桑実期と、受容
体が自分の胚盤胞期または桑実期を予測ｊ　させる日と
の１２日間の同期化であることが好ましい。

かかるタイミング（時間調節）は、非外科的移植を、ま
た時期がそれより後の外科的移植をより一層利用するこ
とを可能とする。そのタイミングは、受容体の排卵後１
０日間まで、好ましくは排卵後７日目までに、行なうべ
きである。

この結果を達成するのに用いる細胞分離法Ｊ３よび冷凍
法は水用ＩＢ書に開示しである。

１１雄鑑別は多くの理由から重要であり、受精後の胚の
雌雄鑑別または本明細書記載の他の方法で行なうことが
できる。

Ｘ、Ｙ染色体を持つ精子の分１１【によって精子の性を
前もって決定でき、得られた分離体を用いて成熟卵母細
胞を受精させることができる。

分離を達成する一方法は、精液を含有する閉じたピペッ
トを数分間７５０　ｒＥｌｌＩｌで遠心分離することに
よる。［雌ｊ精子は重さが若干多（、管の下部に濃縮さ
れる傾向がある。精子は遠心分離の間、稀薄な緩衝液中
に懸濁させておくべきである。電気泳動法が精子分離の
ために用いられることがある。現在の技術水準から見れ
ば、これらの方法はいずれもあまり満足すべきものでは
ない。

しかし、ここに記載するイオン交換材料を用いる改良法
を採用することができる。精子は正味負の電荷を持つこ
とが認識されている。しかし、モの電荷は精子の頭また
は尾のいずれかに局在するようである。イオン交換材料
法を単独でまたは遠心分離と組合わせて用いるとき、所
望の雌精子を１りるのに一層良い結果が得られるようで
ある。

「雄」精子を捕えるのにはカチオンが、「雌」精子を捕
えるのにはアニオンが用５いられる。この捕捉は、体積
に比して表面積の大きい暗君１皿の中で所望しない精子
の凝結を起こさせることによってなし得る。好ましい方
法を以下に述べる。

緑砂およびゼオライトをイオン交換材料として使用し得
ることが知られているが、より満足すべきものは微細に
分割したイオン交換樹脂である。

カルボン酸−ジビニルベンゼンコポリマー、すなわちメ
タクリル酸−ジビニルベンゼン共重合生成物および無水
マレイン酸−スチレン−ジビニルベンゼン共重合物から
なるカチオン交換樹脂が適当である。ストレプｉ〜マイ
シンは、カルボン酸型樹脂とイオン交換を起こすため、
それらと共に支持培地に使用覆ることはしない。これら
カチオン交換樹脂は雌の子を産出し得る精子を生じさせ
るであろう。

アニオン交換体は、スチレン−ジビニルベンゼンコポリ
マーをニトロ化し、次いで還元して、製造できる。これ
らは雄を生じ得る精子を与えるであろう。

得られた樹脂はたとえばそれぞれ次の構造を持つ： 塩基型アニオン交換樹脂 −二１１ ｌ！ｊ斐斐７７オノン女４５存靭ｂ −ＣＨ＝ＣＨ２− 使用する樹脂はダウ１ツクス（Ｄ　ｏｗｅｘ　）樹脂（
ミシガン州ミツドランドのダウ・クミカル社の商品名）
を基礎とすることができる。スチレン−ジビニルベンゼ
ン型の塩基性のより強いアニオン樹脂ダウエックス１，
２．２１Ｋを使用してもよいが、塩基性の弱いポリウチ
レンボリアミン型のダウエックス３は、７．１〜７．３
の吐域の培地中でより良好に使用できる。メツシュサイ
ズは１００またはそれより太く１００〜３００　）　／
）＜好ましい。適当な樹脂は、アニオン交忰体としての
８３．４２−ＡＧ３、Ｂ５４３”−ΔＧ３（（ｌ’ずれ
も１　ボＩＪ　、、ｆ　１／アｄ：　！Ｊ　ｌよア）お
よび、１４３−９゜１、Ｂ１４４−ΔＧｌ（ポリスチレ
ン第四級アンモニウム型）、カチオン交換体としてＢ　
５４４−△Ｇ５０．Ｂ５４３−△Ｇ５０（ダウエックス
５０をベースとしたもの）を使用でき、これらはバイオ
・ランド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ、−Ｒａｄ　１−ａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　、カすフォルニア州すッチ
七ンドから入手できる。

レルロースタイブのアニオンおよびカチオン交換樹脂で
もよいが、力°チオン交換体の方が好ましい。ニューヨ
ーク州ニューヨー’ｙ　’５　ｍ　ｕ’ｉ　５５５　Ｍ
地のブラウン（Ｂ　ｒｏｗｎ）社のタイプ２０ＣＭ−セ
ルロース（カルボキシメチルセルロース）という１００
〜２００メツシユの交換体を使用できる。

試料を得るためには、精液を２回洗って、ｐｌ−１７，
３〜７．５の緩衝液中に保持する。樹脂は、下端がろう
斗となり、口は広くした試験管に入れる。この試験管は
受け集め用試験管の中に立てる。

精液を樹脂の上から入れ、樹脂層を、好ましくは１分間
以上７５０　ｒｐｍで遠心器にかけることによって、通
過させる。外の受け集め用の管の底には、分離された精
子を集めるために、追加の支持緩衝液を入れておく。

そのとき精子は層別されるので、所望の精子を分離し、
授精に用いるが、凍結する。

精子画分分離のために、上記イオン交換材料と組合わせ
または中独で使用することが考えられる他の１つの方法
は遠心分離と圧力差（ｐｒｅｓｓｕｒｅｄｅｆｅｒｅｎ
ｔｉａｌ　）との組合わせである。

この方法は、畜生に対しては、Ｘ染色体とＹ染色体どの
人ささが人さく相違Ｊ−るため、特にｈ効である。向流
（Ｃ０Ｕｎｔｅｒ−３ｔｒｅ、ａＱｎＯ）遠心分離器の
円錐管分ｌ１Ｉｔ室を利用する。洗い、稀釈した精液を
、単独または適当なイオン交換体と組合わせて、遠心分
離器に入れ、１１０００ｒｐよりも低速の７５０　ｒｌ
）ｍでその希釈液を遠心分離することにより、所望の雌
両分が得られる。ここで、第２または第３の力、すなわ
ち精子が得られたときのそれど比較して１５〜３０ｃｍ
の圧力差をかける。

雄の選別のためには、上の方法を用い、速度を１ＱＱＱ
ｒｐｍ以上、１２００ｒｌ）ｍ以下まで上げる。

精子回収圧と比較しての差として１５〜３Ｑｃｍ程度の
真空を適用り−る。

両分をこのようにして得て、希釈剤から分離し、濃縮す
る。次いで、授精を用い、または後の使用のために緩衝
液中で凍結すればよい。　゛好ましい実施態様では、イ
オン交換材料と組合わせた向流遠心分離を採用する。圧
力差が結果を向上させるようであるが、別に述べるよう
に、満足すべき両分を得ることができる。かかる両分を
回収卵子への授精に使用づる。

胚から分離した細胞を調べることにより、雌雄を鑑別で
きる。胚盤胞期の場合、胚を、解剖用位相差顕微鏡加熱
された台の上の室に入れる。マイクロピペットを用い、
わずかな真空の下で、透明帯を保持する。第２のマイク
ロピペットを透明体に当て栄養芽層にわずかに圧力を加
えることにより、細胞を外し、毛管側を差込んで、栄養
芽層から２．３の細胞を取出１６次に、これらを電気顕
微鏡で調べて、雌雄を鑑別する。

ｆｆｉ雄鑑別が済むと、胚盤胞を受容体へ移植して、成
熟させることができる。

胚の細胞には、遺伝学的に優れた動物の生殖を助け、受
容体に同一性の複数の胚を担Ｊｉｊさせるのを可能にす
るところの、いくつかの異なる操作を果たさせることが
できる。これは、フリー７−チンを避けて、畜生の子宮
キャパシティをより十分利用することを可能ならしめる
。このことは他の動物種についても占える。

受精した卵子および小さい胚、好ましくは桑実胚期より
も寸法の大きくないもの、は−１９６℃まＴ−ａ結する
ことができる。これは、本明細書で例示した培地または
ＰＢＳ溶液２　ｍｌ中で胚を洗って、行なう。黄体から
回収した卵子は、培地中で３〜５分間分間ルアルウ０ニ
ダーゼ３１当り１５０アメリ力薬局方単位）にさらして
、何者しているグラーフｆ胞の丘細胞を除去すべきであ
る。

非常に小さい培地滴（約０．０１　ｍｌ＞中の卵子を、
培地０．１　ｍｌの入ったとベットへ移す。

浴中で毎分２℃以下、最適には毎分０．３〜０゜４℃の
速度で冷Ｗを行なう。０℃になったとき、２Ｍジメチル
スルホキシド０．１１ＩＩＱ、を緩衝剤として加える。

１５分間以上後に、試料を約−４℃の浴へ移し、それか
ら２分後に微細な氷の結晶を種どして入れる。試料を次
いで同じ速度で一７０℃まで、次に一１１０℃まで（エ
タノールとドライアイスの浴）冷却し、それから液体窒
素（−１９６℃）浴へ直接移す。温度勾配と冷゛却速度
をもたらすために、液体ヘリウムを使用することができ
る。

融解は、ピペットを４０Ｘ２００ｍｍの管中の一１１０
℃のエタノール中へ入れ室温の空気との接触によって、
−６５℃になってからは毎分４℃の速度で加温すること
によって、行なう。０℃で、０．２　ｍ艶、次いでもう
０．２　ｍ麩、最後に０゜４ｍｍの培地を加える。次い
で胚を培地１　ｍ見へ移し、同ｍを用いて濯ぐ。５０倍
の顕微鏡で調べて回収率をめ、たとえば時計皿へ移し、
鉱油の下で、３０〜３８℃（好ましくは３１・〜３３℃
）で、ＣＯ２５％と酸素または空気との雰囲気中で、ｉ
Ｆ４養する。

このようにして凍結で−る細胞体は、ピルビン酸す１〜
リウムとオキザロ酢酸ナトリウムを同量含有する好まし
い培地の中で凍結すべきである。これらの物質を含有す
るＰＢＳ溶液も使用でき、グルコースの添加も望ましい
。

回収した卵子の利用率を高めること、および同じ容器で
同じ性の胚を凍結することが大切である。

この目的には、ここに記載するようにしＣ１つの卵子を
溶解素（Ｉｙｓｉｎ　）によって個々のＩＩｌ胞に分離
し、同じ性格の細胞を同じ容器に入れることが望ましい
。

溶解素で分離した細胞は、融解後に分化が十分可能であ
り、凍結ブ０セスにおい文改善された結果が得られる。

桑実胚期の透明帯または下方胚細胞体は、溶解素処理に
よって分離したものを含めて、凍結前に分離することが
可能で、また望ましい。

細胞体は、融解後、他の細胞の透明帯へ移すことによっ
て、保護することができる。

これらの操作法はいずれもっと詳細に説明する。

細球を上のようにして凍結し、０℃に融解し、精子の連
結した滴を、好ましくは後述のようにデ胞液と共に、液
体支持培地の世が約０，８〜１１１１見となるまで、支
持培地に混合し、培地を空気の温度に３時間さらして暖
まらせる。試験管内での受精についてのより詳しい説明
は、凍結に関係なく挙げた例を参照されたい。

１［１ｆＬ桑実胚および胚盤胞に対する操作は解剖用位
相差顕微鏡を用いて行なう。用いる細胞支持体は小コツ
プ状゛の時計皿で、これには蓋がされており、側部に小
さい孔があってそれを通して操作具を挿入することがで
きる。これらの孔および蓋はシリコーン油の躾でシール
し、道具は微小定位装置（ｌｉｃｒ６ｐＯ３ｉｔｉＯｎ
Ｏｒ　）で把持して、油膜を通して挿入することができ
る。顕微鏡の載物台は加熱すべぎである。

微小＆４（ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅ　）は１１ＩＩＩｌ
ｌ太さのパイレックス（コーニング・グラス社の商品名
）ガラス棒またはホウケイ酸塩ガラス棒から、細い°（
約０゜３ｍｍ）長さ５０ｍｍの軸棒に引き仲ばじて製作
づることができる。垂直ベンドに、微小道具のホルダー
と顕微鏡の載物台との間にすき間を提供させる。

相棒をかぎ形に曲げて、おもりをか（づられるようにし
、このかぎ（フック）つき棒に１ｇの荷重をかけ、４５
°の角度を引き伸ばづ。先端はビードとともに形成し、
このビードはその後ぬぐい去る。

かぎつきＳｌの場合は、先端を少し冷却し、次いで約１
２０°の角度だけ曲げて、含まれる角が約６０°のかぎ
つき剣を形成させる。

マイクロピペットは、１ｍｍ太さのガラス毛管から、針
と同様にして製作する。引き伸ばし操作の間にピペット
をかぎ形に曲げ、最後のピペットを角度４５°、加重２
５０＋１１１１で引き伸ばし、極めて細い部分とする。

オリフィス（ロ）を表面に成形して、はす緑ビードオリ
フィスを形成させる。

道具を保持するのに市販の微小定位装置（ライン（ｌ　
ｅｉｔｚ）社）を用いることができ、このようにして準
備した道具をその微小定位装置で保持しながら、細胞レ
ベルの操作を遂行する。

２細胞期には、分裂前の細胞を厳密に観察して、１　４
細胞期への分裂を持ち構えるべきである。４細胞期には
、４細胞期の同じ半球の上下の象限を顕微手術的に分離
できる。これは、ガラス製微小ｉ＋を透明帯に機械的に
貫通させ（溶解素ぐ前もって透明帯を除いてない場合）
、ゆっくり一様な圧力を加えて２つの半球を分離するこ
とによって行なう。この手続は、全く同じ双生子を生み
出すのに利用できる。

受精卵の分校系増殖（ｃｌｏｎｉｎｏ　）が可能である
。

ここで利用すべき技術は、桑実胚期ま゛たは８細胞期な
いしは１６細胞期にトリプシン処理によって透明帯を除
去することである。細胞を肉汁中に懸濁させ、トリプシ
ン溶液に暉露し、１５分後にガラス製微小剣で機械的に
かき混ぜて各々の細胞を分ＩＩＩＩする。細胞をリン酸
塩緩衝培地で速やかに洗う。これと同時に、透明帯を無
傷のままとして追加の受容体（ｄｏｎｅｅ）卵子を入手
することが望ましい。顕微鏡下に滅菌針を用いて、個々
の受容体（ｄｏｎｅｅ　）細胞の核を除去または破壊す
る。供給体（ｄｏｎｏｒ　）細胞を、注射器に付けた針
の中へ吸引し、この細胞を受容体細胞の核部に注入し、
次に、これら受容体細胞を培地または受容体（ｒｅｃｔ
ｐｉｅｎｔ　）へ移し、成熟させる。一般には、注入か
ら移植までの間の最初の分裂の間ずっと細胞を観察する
。

透明帯はトリプシンで除去することができ、細胞はトリ
プシン処理または他の溶解ｉによって分離することがで
きる。

細胞は、好ましい培地またはイーグル（Ｅ　ａａｌｅ）
の基本培地（８０体積部）−両者とも、アミノ酸および
ビタミンを通常の２倍量含有するようにしたちの−およ
び糖（ｔｙｐｔｏｓｅ　）リン酸含有肉汁（１０体積部
）ならびにコウシ面清蛋白（１０体積部）を平らな１１
２ｍ１ペトリ皿に２０１１１１入れて、パラフィン油ま
たは鉱油で覆った中へ、懸濁させる。次に、トリプシン
１％溶液中の０．５％酢酸ナトリウム溶液を培地に加え
る。透明帯が除去されるまで、１５〜３０分間細胞を培
養する。

透明帯が除去された後の細胞の分離は、１回結晶化させ
たトリプシン（ニューシャーシー州フリーボールドのワ
ージントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇ、’ｔｏｎ）　−バイオ
ケミカル社）のＰＢＳ溶液（イーグル塩類を含むリン酸
塩緩衝塩類溶液）中の１％溶液によって行なうことがで
き、１５〜３０分後にそっとビベッ］〜で取る。ＰＢＳ
、０．０１　１１１ｆＬとトリプシン溶液０．００５１
１１１Ｌとを使用してもよい。崩壊を、かき混ぜまたは
その他の機械的補助手段、たとえば細胞集団への細い針
の挿入とがき混ぜ、にょって促進することができる。

トリプシンまたは他の溶解層による崩壊の後、滅菌した
注射器により培地約０．１１ＩＩｇ、を満たし、細胞を
取出し、ぎれいな溶液で２回洗って、トリプシンを除去
する。細胞の１つ以上を電子顕微鏡によって１雄鑑別づ
”ることができる。

上記タイプの分校を繰返したいときには、培地中で細胞
を再び桑軸胚期まで成長させねばならない。このときに
は、細胞を３２Ｉｌｌ１１のプラスティック製組織培養
用ペトリ皿の中の２−４ＮＬの培地へ入れ、それからＰ
ＢＳ溶液１．０ＩＩｌｆＬの入ったより大きい皿に入れ
、プラスティックの袋へ入れでしつかりシールし、より
大きい寸法にまで成長させる。

しかし、このプロセスは反復するごとに、不完全な胚の
発生の可能性を大きく増づことを理解しておくべきであ
る。

分離した細胞を透明、帯なしで成長さゼることは可能で
あるが、透明帯は受容体中で天然の保護物として働き、
かくして成熟までの生存が一層容易に実現されるのであ
る。先に述べたにうに、これは供給体細胞から受容体細
胞への移植によって達成される。これは、細胞を吸引し
、無傷の透明帯を持つが、核を破壊された受容体細胞中
へ注入覆ることにより達成される。これは種々のやり方
で行なわれる。それを以下に記述する。

解剖用顕微鏡の下で卵母細胞をビペツ１トで保持する。

透明体をかき何針で貴き、核を細胞外へ引出すか、また
はかき混ぜて破壊する。次いでこの領域に供給体細胞を
挿入する。細胞が分裂し得るとき、細胞から染色体を押
し出すことによっても、核を破壊することができる。中
期にシリコーン油１　の小滴を細胞に隣接して置く。そ
うすれば、細胞はその油の中へ染色体を押し出し、これ
をそこから除去することかでバる。しかし、核原形質の
機械的除去の方が好ましく、中間期の分裂中の細胞また
は卵母細胞を使、用することができる。毛管ｉを用い、
吸引によって核を取出すことも可能ぐある。粗い釦を使
って、太い組が引き起こす細胞の変形を避ける。

１つの胚からいくつかの細胞体を移植する他の一方法は
、透明帯から溶解層の切用により、または外科的に、細
胞を取り外すことである。次いで取り外した細胞を新し
い透明帯租移植し、そこで成長さ往る。元の細胞の核は
、好ましくは核の破壊（ｅｎｎＬＩｃＩｅａｔｉｏｎ）
　、または切株によって、破壊することかできる。

これらの方法またはそれらの組合わＵを採用して、必要
な移植の時期を涯らせ、より多くの分校体（ｃｌｏｎａ
ｌ　ｂｏｄｉｅｓ　）を獲得覆ることができる。

移植する細胞は全体を移植してもよく、または、核とそ
れを取り巻く細胞質のみを新しい細胞体に移植すること
もできる。後者の場合には、受容体細胞の核を破壊し、
核とその周囲の細胞質を養育細胞の細胞質の中へ移植す
ることが必要である。

上記した技法が簡単であり、便利であるが、代わりの方
法を採用し得ることも考えられる。供給体細胞の透明帯
を無傷のまま残して、細胞を側法または桑実胚から外し
取り、上記のようにして受容体細胞へ移植することがで
きる。細胞は完全細胞として摘出でき、良好な結果を得
ることができる。しかし、核自体を摘出して、この核を
受容体細胞に移植づ”ることも可能である。この最後に
述べた方法はタイミングが一層臨界的である。それは、
核も受容体細胞もともに崩壊する傾向を持つからであり
、両操作は平行して、または短時間に、行なって、移植
を完遂しなければならない。

これらの方法は、全く同じ「双生子−１を産出し、遺伝
形質は胚細胞分離前の受精によって決定されるから、そ
れら双生子は父または母と同じ遺伝形質のものではなく
、両方の遺伝子を含んでいる。

駆動物と同じ遺伝形質を持つ雌の子孫が特に望ましい場
合がある。

下等動物では、精子による受精なしに、新しい個体が既
に作られている。七面鳥の卵はビールスによって「受精
」さけられ、雄の七面鳥を生み出している。

以下に述べる２つの方法によれば、雌の染色体のみの利
用が意図されている。

２つの卵母細胞を用いる。各卵母細胞は２次卵母ｌｌＡ
ｌ１１で、１個の掻体を放出し又、排卵時と同様に、第
２の成熟分裂の有系分裂中期達しているものである。

掻体および前核はともに半数体である。２つの卵母細胞
を、解剖用位相差顕微鏡の加熱した載物台の十の閉じた
解剖室に入れる。室内の圧力を注意して監視する。支持
培地は例１の記載の重量割合のグルコースで強化すべき
である。支持培地は、等量のヒアルウロニダーゼとトリ
プシンを添加したトリプシン処理用のものど同じであっ
てもよい。

受容体細胞を穿刺し、卵黄膜の表層粒をよ（観察する。

５〜１０分間で、トリプシン処理した第２の卵母細胞の
前核は必要な生長を終え、これを取出し、第１の受容体
卵母細胞へ注入する。ｇｊ」のアンドロガモン■、脂肪
酸、およびドデシル硫酸ナトリウムおよび蜜蜂毒を支持
培地に加える。等しい重量パーセントのトリプシン、ヒ
アルウロニグーゼおよびアンドロガモン■、ドデシル硫
酸ナトリウムおよび蜜蜂毒から、受容体細胞の偽受精が
成る程度前られる。

一代用体として、精子の洗った、淵厚な懸濁液をトリプ
シン溶液中で作り、高速で遠心分離することができる。

上澄液は、前記プロセスの同じ時点で同重吊の脂肪酸お
よび表面活性剤に置換えられるところの抽出物を含有す
るであろう。

他の具体１１例では、掻体を第２の卵母細胞−の前核の
代わりに置換えてもよい。

中期が観察されるとき、２つの半数体あ接合の結果、融
合して２倍体接合子を形成しており、胚の性は、母動物
のみから得た染色体にＪ二つて決定される。

細胞が受精に特徴的な激しい反応を示していると観察さ
れたとき、２倍体接合子を取出し、洗い、培地へ移す。

次に、その細胞が正常な分裂を起こすかどうかを確認す
るため観察した後、正常の受精の結果であるもののごと
くにその細胞を取扱う。

行きている滅菌精子は偽受精を開始ざゼることができる
。かかる精子は、正常精子を紫外線にさらすことによっ
て得られる。曝光量は変えることができ、種、光源の近
さ、曝露時間に依存する。

暴露が多過ぎると、精子を殺１であろう。３０秒〜３分
間が満足すべき結果を与えるから、好ましい曝露時間の
範囲は極めて広い。

紫外線に当てたかかる滅菌精子（またはハエ制御語画で
行なうごとぎ放射線８露といった他の方法で滅菌した精
子）は終期を開始さゼることができる。

掻体の放出（ｅｘｐｕｌｓｉｏｎ　＞は正常半数体をも
たらし、これは、分裂がはかどる一方、成熟しないであ
ろう。

追加の半数体を供給するための前記方法に加えて、所望
の２倍体を生産するのに他の方法を採ることもできる。

畜生の正常卵母細胞成長温度は１００　＝−１０２。

５Ｆの間にあるが、卵母細胞を採集して、これより低い
温度で維持することができる。

畜生、豚および馬の産出する卵子は３０℃で培養でき、
また、先に述べたように、一層低い温度域３０〜３４℃
、好ましくは３１〜３３℃で、望ましい結果を得ること
ができる。

偽受精は、これらの温度で、前記の方法により達成でき
る。これは顕微鏡下で行なって、［受精Ｊ卵の発育を観
察できるようにすべきである。第２極体の放出が進行中
であるが、卵黄膜を通しての放出がまだ起こっていない
ことを認めたとさ、培養スライドを高温の湯浴へ入れる
ことによって、卵子に約１０℃の熱ショックを与えるべ
き・である。

これにより、正常温度より高いが、細胞が死ぬであろう
温度よりは低いところまで、温度が上げられる。

歩留りは低いが、正常な２倍体を生じることが認められ
た。これらは正常な経過をとって分裂し、さらに成長さ
せるため移植することができる。ぞの細胞を培養して、
前述のように、胚の細胞分裂によって追加の分校系複製
（ｃｌｏｎａｌ　ｃｏｐｉｅｓ　）を作ってもよい。

前に述べたように同じ動物の他の卵子から冑た核を移植
することにより、歩留りを向上させることができる。熱
ショックをこの処置と組合わせて用いてもよい。この方
法を、分枝系（ｃｌｏｎａｌ　）細胞体の生産のため、
滅菌精子の使用と組合わせることもできる。

卵母細胞の受精に用い得る予備選択精子調製の他の一例
では、前に述べた方法を採用し、好ましくはカチオン交
換樹脂を通して、またはアルブメン（卵白）、好ましく
ウシアルブメン（グランド・アイランド・バイオケミカ
ル相、）を、２０〜４０％含有する培地を用いて、分離
を行なう。ここでは、前記のカチオン交換樹脂を使用す
べぎである。得られる精子は、雌を産生ずる精子の率（
％）が大きい。

実際上では、供給体の遺伝子型を持つ分子系複製を生ぜ
しめようとするときには、前もって雌雄を分別した滅菌
精子の使用が、移植可能体の歩留り向上を保証してくれ
るであろう。というのは、未滅菌の同じ精子が真の受精
を起こさせるのに有効であり、その成績体は、供給体の
遺伝子型ではないが、移植体として利用できるであろう
からである。

特許出願人　リン・ローレンス・Ａ−グズバーガ手続補
正書 昭和６０年３月１９日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和６０年３月１９日提出の特許願 ２、発明の名称 胚移植法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　大阪市北区天神１２丁目３番９号　八千代第一
ビル自発補正 ６補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７、補正の内容 （１）　明１１ｔ！第８頁第１０行ノｒ　栄養」ヲ「ク
ロンの」に補正。

（２）　明１Ｉｌｌ書第８頁第１３行の「滅菌溶液Ｊを
「受精溶液」に補正。

（３）　明細書第８頁第１７行のＵ栄養系」を「クロン
」に補正。

（４）　明細書第１６頁第９行ないし第１０行の［これ
が・・・望ましいものとする。」を「このために多産ま
たは双生子の出産がとくに望ましいものとなる。」に補
正。

（５）　明細書第１７頁第３行および第６行の「バイア
ル」を「小瓶」に補正。

（６）　明細書第１７頁第１３行「フリーマーチンとな
るから、」を「フリーマーチン（牡牛と双生子とに生ま
れた牡牛で、普通は不妊性〉となるから、」に補正。

（７）　明細書第２７頁第２０行の「透明体を保持し、
Ｊを「透明？！（卵子の最内側にある２つの透明被膜で
放線孔により横断されている）を保持し、Ｊに補正。

（８）　明細書第２８頁第２行の［栄養芽層を突＜、Ｊ
を「栄養芽層（トロニブラスト：胞胚壁外胚菓の胚体外
にある細胞層でで子宮壁に卵子を耐着せしめて栄養を供
給する組織）を突く。Ｊに補正。

以上 手続補正書（方式）− 昭和６０イＴ’６月２ｆＥｌ 特許庁長官殿 ２、発明の名称 胚移植法 ３、補正をする者 事件どの関係　特許出願人 住　所　アメリカ合衆国、ミシガン州、バーミンガムフ
ェアファクス、６４２ 氏　名　リン・ローレンス・オーグズパーガ４、代理人 住　所　大阪市北区天神橋２丁目３番９号　八千代第一
ビル電話　大阪（０６）３５１−６２３９（代）自発補
正 ６、補正の封殺 明＠　８全文 ７、ｈＭ正の内容 ・タイプ中古した明ＩＩＩ店全文を別紙の通り提出致し
ます。−なお、内容についての変更はありません。

以上

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）　回収した胚の核を卵子または単細胞胚（受容体
   細胞）に注入し、受容体細胞の核を破壊して、移植核が
   養育細胞中で成長できるようにすることを特徴とする有
   蹄哺乳動物の胚移植法。
2. （２）　雌から回収した卵子の前核の染色体一式を、同
   じ雌から回収した卵子に注入することを特徴どする、肝
   移植のためのクロンの創出法。
3. （３）　クロン的に得られる特定の遺伝子型の本体がク
   ロン遺伝子型の再生を可能とするために、草食性および
   雑食性哺乳動物の雌配偶子から調製されることによる肝
   移植方法であって、選択された供給体咄乳動物から卵母
   細胞を取得し、かつ卵母細胞を生命維持溶液に置き、そ
   の後に、前記卵母細胞を、擬似授精手段にさらずことに
   より、前記卵ｆｆｉ細胞内で擬似授精反応を生じさせ、
   かつ 卵母細胴の細胞質内で第１および第２のゲノムを結合づ
   ることにより、前記卵母細胞内に倍数核の形成を引き起
   こし、前記第１のゲノムは、前記卵母細胞の前核に含ま
   れる半数の染色体からなり、および前記第２のゲノムは
   、通常は、掻体を形成する半数の染色体からなり、また
   は第１の掻体を通過しかつ第２の成熟分裂の中期に達す
   る第２の卵母細胞の前核の半数の染色体からなる、こと
   を備える肝移植方法。