JPS60199386A - ヤロウイア・リポリテイカの形質転換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヤロウイア・リボリテイカ（Ｙａｒｒｏｗｉ
ａｌｌｐｏｌｙｔｉｃａ　、以下Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔ
ｉｃａ　と略す）の工業的目的における利用性を改善す
るためのＹ。

１１ｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換方法に関し、またその
方法に有用なベクターおよびそのサブクローン、とくに
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　、以下に
、Ｃ０１ｉと略す）内で自律的複製を行うが、Ｙ、　１
ｉＲｏｌｙｔｉｃａ内では組込まれても自律的複製は行
わないベクター、このベクターを含むもμｐｈｉ　オヨ
ヒＹ−１１ｐＯ１ｙｔｉｅａの形質転換体、ならびに蛋
白製造のためのその使用に関する。

分子クローニングに際しての宿主微生物としては、とく
に大腸菌（−シυす」ユ）また最近では枯草菌（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉθ）のような原核生物に注
意が向けられてきた。Ｅｌｆ、　ｃｏｌｉは非相同ＤＮ
Ａのクローニングや表現のための宿主微生物として広く
用いられているが、蛋白をその生育培地中に分泌せず、
したがってその単離が容易でないなどの問題点があるこ
とはよく知られている、このよう圧細胞内に生成した蛋
白は通常その天然の状態にはなく、封入体と呼ばれる不
溶性の集合体として存在する。この蛋白を回収するため
には細胞の破壊が必要になる場合があり、そのため毒性
物質が蛋白に夾雑する可能性を生じる。

このような問題から、蛋白を分泌し、毒素を産生じない
枯草菌が宿主微生物として注目されるようになった。し
かしながら、宿主微生物としては枯草菌にも限界がある
。形質転換された株が不安定なために、非相同ＤＮＡの
消失や、導入されたＤＮＡの宿主ＤＮＡとの共存能の低
下が起こるからである。

原核生物にみられる上述のような宿主微生物としての欠
点から、宿主微生物として真核生物、とくに酵母が研究
されるようになった。工業的に重要な酵母は毒性がなく
、きわめて高濃度に生育さ明細書の浄書（内容に変更な
し） せることかできる。一部の種については遺伝的にもよ（
解析されているし、蛋白を分必することができる。

酵母、５ａｃｃｈａｒｏｎｎｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　の形質転換を最初に報告したのはヒネン（Ｈｌ
ｎｎｅｎ）ら〔プロシーデイングナショナルアカデミー
オゾサイエンス（ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　ｓｃｉ、）、　７５　：　１９２９〜１９３３（１９
７８））で、彼らは、ＬＫＵ　２座をコードする酵母Ｄ
ＮＡのクローン化分節が、復帰をボさないｌｅｕ　２−
突然変異体酵母なＬ）１１表現型に形質転換できること
を明らかにした。この形質転換はＤＮＡのＬＩＮＵ　２
分節を含むグラスミドの染色体への組込みによって生じ
ることが示された。この組込みには、相同なりＮＡ分節
間の組換えが関与している。

ヒネン（）ｌｉｎｎｅｎ）らはタルムファンツル（Ｋｒ
ｕｍ−ｐｈａｎｚｌンら編“微生物生成物の過剰生産（
Ｏｖｅｒｐｒｏ−ｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）　’　（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、、　ｃｈ、　６０．　１９８２　
）に、酵母形質転換操作の総説を発表している。酵母の
形貴転デミーオデサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、）。

７４：４８７〜４９１　（１９７７））が、見法１１ｅ
ｕ、Ｂ突然変異体の 明細書の浄書（内容に変更なし） 相補による酵母（５ａｃｃｈａｒｏｃｎｙｃｅｓ　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ　）ＬＥＵ　２のクローニングに関連
して述べている。

スヨスタク（５ｊｏｓｔａｋ　）ら〔シラスミド（Ｐｌ
ａｓｍｉｄ）、２　：　５６６〜５５４（１９７９））
は、酵母のｔｂ；ｕ　２遺伝子とｒＤＮＡ　ｍ片を含む
シラスミドの構茶、このシラスミドのｒＤＮＡ　Ｐ＆へ
の組込み、酵母の形質転換について記載している。彼ら
の研究の基本点は、ｒＤＮＡ遺伝地図作製のための遺伝
的マーカーとして、ｒＤＮＡ座に挿入された遺伝的マー
カー、ＬＥＵ２遺伝子の組込みにあった。報告されてい
るプラスミドのひとつであるｒＤＮＡのＢｇｌ　ｌ−Ｂ
断片とＳａｌ　ｌ　−Ｘｈｏ　ｌ　ＬＥＵ　２断片を含
むｐｓＺ　２　Ｄは、酵母に酵母ＤＮＡの断片をクロー
ニングするのに有用なベクターであることが確認されて
いる。

オール−ライ−バー（０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ　）ら〔グ
ロシーデイングナショナルアカデミーオデサイエンス（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　
７８　：　６３５４〜６５５Ｂ（１９８１））は、Ｉ）
ＢＲ５２２由来の線状プラスミドの高頻度な組込みを示
した。そのオヘ・イ入ミ礒息ｄ、１弔り奇）−穎Ｕわり
千４うナチラス５♂ｈ−酵母染色体に相同のＤＮＡ配列
内で切断された場合、組込みによってのみ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃθθｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｋ
形質転換を認める。

工業的に重要な酵母種であるＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａはクエン酸や単一細胞蛋白の製造に用いられる。また
、エリスリトール、マニトールおよびインデロビルリン
デ酸の製造にも使用することができる。

Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　Ｋは利用可能な炭素源の
スペクトルが限定されているといった固有の欠点がある
。

しかしながら、Ｙ、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａの総合点な価
値はこのような欠点を、たとえば他の種からの矯正ＤＮ
Ａを導入することＫよって増大させることが可能と思わ
れる。Ｙ、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａは蛋白（アルカリ性プ
ロテアーゼ、酸性プロテアーゼおよびＲＮＡθｅ）をそ
の生育培地に分泌することができ、したがって非相同蛋
白を、産生細胞を破壊する必要なく自然の状態で回収す
ることが可能であるという点で価値があり、とくに興味
がもたれる。

Ｅ、　ｅｏｌｌ−およびＳ、　ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅの
いずれでも選択でき、両者から回収可能な複製ハイプリ
ドプラスミト、几Ｃθｒｅｖｉ日ａｅ　−Ｉ！ｉ、　２
遠見ハイプリドプラスミＶからなるＳ、　ｃｅｒｅｖｉ
ｅａｅの形質転換のた明細書のｉ７＋心（内容に変更な
し） めの効率の高いシステムがＢｅｇｇｓ　Ｋよって報告さ
れている〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、２７５　：
　１０４〜１０９　（１９７８））。シゾサツカロミセ
スの高ｆＭＫ形質転換システムは、それぞれＢｅａｃｈ
ら（Ｎａｔｕｒｅ、　２９０　：　１４０〜１４２　（
１９８１）およびＤａｓら（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ　、　６　：　１２３〜１２８（１９８２）に
より報告されている。

本発明は、Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａに相同の領域と
検出可能な遺伝的マーカーからなるＤＮＡをＹ　、　１
ｉｐｏｌｙｔｉｃａに導入することによるＹ、　１ｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａの形質転換方法を発見し、完成されたも
のである。とくに興１１ｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡの断
片を含有もしくは包含するベクターをＹ、　１ｉｐｏｌ
ｙｔｉｃａ　に導入する方法、その方法に有用なベクタ
ー、そのベクターからなる微生物形質転換体である。一
般に、この形質転１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で機能する選
択可能なマーカーを含有する。とくにその選択可能なマ
ーカーに相当する遺伝子に突然変異を有する”ｉ、主尤
四８Ｉ見粘Ａ−内で機能する選択可能なマーカーを含有
する。本発明においてとくに興味深く価値が大きいもの
は、生合成または代謝酵素をコードする遺伝子たとえハ
ＬＦＩＵ　２遺伝子（酵素β−インデロビルマレートデ
ヒドロデナーゼ１０１．１，１．８５をコーＶする）、
望」遺伝子（酵素ＡＴＰホスホリぜジルトランスフェラ
ーゼＥＣ２，４，２，１７をコードする）、ＵＲＡ３遺
伝子（酵素、オロチジン−５′−ホス７エートデカルポ
キシラーゼｚｃ４，１゜１．２３をコードする）まタハ
ＸＰＲ２ａ伝子（酵素アルカリ性細胞外ゾロテア−ＩＫ
Ｏ３，４゜ある。

本発明における新規なプラスミド（またはベクター、本
明細書においてはこの２つの語は同義に用いられている
）は共通のいくつかの性質を有する。すなわち、大腸菌
内で増幅を可能圧する微生物レプリコンであり、大腸菌
内で機能し検出できる選択可能な遺伝子マーカーの存在
、Ｙ、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で生理的に機能し大腸菌
内でもしばしば機能する構造遺伝子の存在およｙ　Ｙ、
　１１ｐＯ１７ｔｉＱ＆のデノムへの組込みに必要なＹ
、　’１ｉｐｏ１７ｔｉｃａ　ＤＮＡ断片の存在を特徴
とする。

一般に、本発明の目的に有用なベクターの製造は、異種
微生物（すなわち、Ｙ、１１ｐＯ１ｙｔｉｃａ以外の任
意の種）内で、望ましくは細菌内で、好ましくは大腸菌
内で、Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内と同時に機能する
ベクター、すなわちハイデリツＶベクターの製造に基づ
くものである。このようなベクターは微生物ＤＮＡと、
Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａの染色体ＤＮＡの断片から
なり、この断片は少なくとも１個の選択可能な遺伝子マ
ーカー、すなわちＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で機能
し検知可能な遺伝子を含有する。このように構築された
ベクターはＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内の相同染色体
配列と相互に作用し、その染色体に組込まれ、かくして
形質転換が行われる。

本技術分野の熟練者には明らかなように、酵母起源の２
個以上の遺伝子を含むベクターを形成すれば、そのベク
ターからの組込み体、すなわちそのベクターからなる形
質転換体、とくに２個以上の遺伝子を有する組込み体の
形成が容易になる。

多数の遺伝子の存在により、酵母内におけるベクターの
存在の検出能が増加し、改善されるのはもちろんである
。

組込みは、このベクターの環状型、直線型および切れ目
のある直線型によって行われる。直線型および切れ目の
ある直線型ベクターが環状型ベクターよりも蕎い効率で
組込まれる。したがって、ベクターは独特の制限部位、
すなわち起源の微生物ＤＮＡベクターまたはベクターの
Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ断片成分内の他の部分に存
在しない部位を有することが望ましい。ベクターをこの
ような部位で直線化すれば、同種染色体配列における組
込みＫよるＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換が可
能な高頻度組換え末端を有する二重鎖ＤＮＡが生成する
。Ｏｒｒ　−Ｗｅａｖｅｒ　ら（前出）が８．　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅで示したように、切れ目のある直線状デ
ラスミＰも組込み可能である。この種のプラスミドは、
ベクターのＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮＡセ
グメント内で制限酵素による２個所の切断を行えば製造
できる。後述するｐＬＤ　２５の場合、Ｂｇ１■部位が
２個所存在するので、切れ目のある直線状デラスミｒの
製造に便利である。

本発明のベクターの価値は、その内部［、Ｙ。

１１ｐｏｌｙｔｉｃａ内で検出でき、機能する選択可能
な遺伝子マーカー、すなわち検出可能マーカーが存在す
ることである。適当なマーカーとしては、以能なことは
、本技術分野の熟練者には自明のとおりである。ＬＥＵ
　２遺伝子の全部または一部はとくに有用である。この
遺伝子またはその部分はＹ。

ｘｉｐｏｘｙｔｉｃａの染色体ＤＮＡを、適当な制限酵
素たとえばＳａｕろＡで部分消化することにより、Ｙ。

１１ｐＯ１ｙｔｉｃａから得られる。このベクターまた
はそのサブクローンは、公知方法に従ってＤＮＡのラン
ダムセグメントを挿入することにより、モーｘｉｐｏｌ
ｙｔｉｃａクローニングベクターの産生を可能にする。

得られたベクターをついで、選択可能マーカーに相当す
る遺伝子内に突然変異を有するＹｉｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ株の形質転換に用いられる。このような±１ｉｐｏｌ
ｙｔｉｃａマーカーを有する形質転換ＤＮＡは受容株に
選択的生育の利益を与えたり、受容株の栄養要求性変異
を矯正することができる。

一般的には、全Ｌｍ！ｆＵ　２遺伝子を含有するＹ。

１１ｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡ断片を用いることが好ま
しい。

この断片によれば、大腸菌内でもＹ、　１１ｐＯ１ｙｔ
ｉＣａ内でも生理的に機能するベクターの製造が可能だ
からである。しかしながら、全ＬＨＪ　２遺伝子を有す
るＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡ断片の使用が本
発明の方法で好結果を得るのに必須なわけではない。受
容株に組込まれて野生型遺伝子を生成するのに十分な量
の野生型配列を包含するＤＮＡ　ｌｉ片を用いさえすれ
ばよい。この断片は大腸菌内で機能しないが、本発明に
有用なベクターの製造には、Ｙ、−１１ｐＯ１ｙｔｉｃ
ａ染色体ＤＮＡの完全ＢａｍＨＩ　消化により得られＨ
工Ｓ１遺伝子を含むか、または−Ｙ、−１ｉｐｏｌｙｔ
ｉｃａ染色体ＤＮＡの部分Ｓａｕ　３　Ａ消化忙より得
られＵＲＡろ遺伝子を含Ｑ　Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ　ＤＮＡの断片も価値がある。これらの断片は結合可
能な末端を有し、直線状の、たとえばＢａｎ　ＨＩ、　
、ＹＫｐ２４を用い、ｆｃ、ｃｏｌｉ　−Ｓ、Ｃ［ｒｅ
ＶｉｅｉＬｅベクター（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら：Ｇｅｎｅ
８：１７〜２４．１９７９）と結合させれば、Ｈ工Ｓ１
遺伝子またはＵＲＡ　３遺伝子を持つハイブリッドベク
ターが得られる。

本明細書に述べる新規なベクターを用い、ショットがン
法で、Ｙ、１１ｐＯ１７ｔｉＣａのランダムセグメント
を挿入することができる。生成したベクターは、標準方
法で選ばれる各種突然変異体、形質転換体の形質転換に
使用できる。たとえば、ＩＪＵ２含有ベクターは、他の
μ１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子たとえばＵＲＡ　３のク
ローニングに使用できる。選択された任意の形質転換体
中にクローン化されたＤＮＡ化でき、有効なＹ、１１ｐ
Ｏ１ｙｔｉｃａベクターとして利用できる。

一般Ｋ、バクテリアたとえば大腸菌のプラスミド複製起
源とそのバクテリアの選択可能な遺伝子？　−カー　ハ
、公知の方法に従い、Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で
検出可能な選ばれたＪユ１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子の
全部または一部と結合させることができる。大腸菌クロ
ーニングシステムは、大腸菌内での生！および増幅によ
りプラスミドＤＮＡの大ｔＣバルク）産生が容易で、大
腸菌内でのベクターおよび遺伝子ライブラリーの構築が
可能なので、とくに有用である。

本明細書に述べるシラスミｙは、組換えＤＮＡ技術にお
けるベクターとして有用である。たとえば、適当な制限
酵素で切断して結合可能末端を有する直線状ＤＮＡを得
、ついでこれを結合可能末端を有する外因性遺伝子と反
応させることにより、プラスミドに各種の遺伝子を挿入
することができ６゜得られたプラスミドで次に適当な宿
主微生物、たとえば−シｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＹ、１
ｉｐｏｌｙｔｉｃａのような酵母の形質転換を行い、こ
れを適当な条件下に培養すれば、所望の生成物を産生ず
る。いずれも工容株内で選択され、検出可能である。し
たがって、これらはＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａクロー
ニングベクタ〜の製造に使用できる。

さらに１本明細書に述べるシラスミｒは、微生物とくに
：！Ｌ４匹江ｔｉｃａの発酵特性を改良し、その固有の
欠点を除去し、工業的有用性を増大させる方法を提供す
る。たとえば、各種の炭素源の利用をコードする遺伝子
をプラスミド忙導入し、得られたプラスミドでＹ、　１
ｉｐｏｌｙｔｉｃａのような適当な宿主を形質転換すれ
ば、その宿主の栄養特性を改良し、Ｙ、ｘｌｐｏｌｙｔ
ｉｃａに利用可能な炭素源ｘ４クトルを拡大することが
できる。

この目的に必要なベクター、たとえばプラスミドまたは
コスミドは組換えＤＮＡ技術の技術分野における熟練者
によく知られた技術によって構築される。特定のペリプ
ラズム酵素をコードするＬｌｌｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮ
Ａ配列が公知方法で単離され、たとえばｐＬＤ　２５ま
たはその誘導体に挿入される。

所望の構造遺伝子、たとえばマルターゼの遺伝子はべり
デラズム酵素のＤＮＡ配列に融合され、得られたプラス
ミドでＹ、　ｘｉｐｏｌｙｔｌｃａを形質転換すること
ができる。このシラスミｒは本発明の方法によってＹ、
　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａの遺伝子のひとつに組込まれる
。かくして産生された形質転換体は、培養するとマルト
ースをグルコースに加水分解することができ、しかも母
株の持っていなかった望ましい性質を有する。

プラスミドｐＬＤ　２５は大腸菌内で自律複製を行う。

Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内では組込まれるが自律複
製はしない。大腸＠複製プラスミドｐＢＲ５２２内に、
望ましくは以下の２つの識別性、すなわち第一にＹ、　
１ｉｐＯ’１７ｔｉｃａ内でまた好ましくは同時に大Ｗ
ｋ菌内でも生理的に機能し、Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ内で検出可能な構造遺伝子の存在、第二にＹ、　、　
１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ宿主の構造遺伝子における欠点矯
正の目的で宿主に導入されたＤＮＡ配列の側面に位置す
る領域における独特の制限部位（起源の大腸菌プラスミ
ド、Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ宿主断片の他の場所に
存在しない）の所持、が与えられたＹ、　’１ｉｐｏｌ
ｙｔｉｃａ　ＤＮＡ断片を挿入すること罠より得られる
。高頻度形質転換を達成するためには、独特の制限部位
の所持が必須である。

それぞれＹ、　’１ｉｐｏｌｙｔｉｃａのＨ工Ｓ１遺伝
子を持つ後述のデラスミＹ　ｐＬＤ　２１およびｐＬＤ
　２３は、Ｙ、　１ｉｐｏ１ｙｔｉｃａの染色体ＤＮＡ
の完全Ｂａｎ　ＩＩ　消化によって得られる断片をそれ
ぞれＹＫｐ　２４およびｐＢＲろ２２１Ｃ挿入して作製
される。

デラスミＰｐＬＤ２５は大腸菌１ｅｕＢ−突然変異と相
補的な工Ｊ吐匹す旦ｃａ　ＤＮＡ断片を含有し、プラス
ミドｐＬＤ　２１およびｐＬＤ　２３は大腸菌ｈｉｓＧ
−突然変異と相補的な断片を含有する。

デラスミ）’　ｐＬＤ　２　Ｂも、大腸菌内で自律的に
複製するが、Ｙ、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内では組込み能
はあるものの自律的複製はしない。これは、Ｙ、　１ｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａＬＥｉＵ　２遺伝子を含む５ａ１１断
片をＹＥｉｐ　２４の５ａ１１部位に挿入して構築され
る。これはｌｅｕ　’ｌ工突然変異株で選択可能なＹ、
１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内組込みペクラスミドであり、ア
ンピシリン抵抗性によって選択可能な大腸菌内マルチコ
ピーである。ｐｙｒ　？突然変異株内でのＳ、　ｃｅｒ
ｅｖｉｅｉａｅ　ＵＲＡ　３遺伝子の適切な機能、また
効率は悪いが、１ｅｕＢ突然変異株内でのＹ、　１ｉｐ
ｏ１ｙｔｉｃａ　ＬＫＵ　２遺伝子の弱いが検知可能な
機能によっても選択可能である。

プラスミドｐＬＤ　２５は大腸菌とＹ、　１ｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａのシャトルベクターである。これは、大腸菌内
でＤＮＡ複製を可能にするバクテリア配列と酵母内での
組込みを可能にする配列との両者を含む。すなわち、大
腸菌の複製起点と相同のＹ、　１ｉｐＯ１７ｔｉＣＩＬ
領域を含む。「シャトル」の語は、大ｐＡ菌内で構築さ
れたそのベクターがＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体
へ組込み可能で、大腸菌に再導入されて環を完成できる
ことを意味する。シラスミドｐＬＤ　２　Ｂも　Ｂ。

ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅのシャトルベクターである。これ
らのシャトルベクターは大腸菌の突然変異株の相補によ
り、また８、　ｃｅｒｅｖｉｅａｅまたはＹ、　１ｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａの突然変異株の直接相補により、Ｙ、　
ｘｉｐｏｘｙｔ１ｃａ遺伝子のクローニングを可能にす
る。これらの現象は、機能性ＩＪＵ　２遺伝子産生物が
両異種システム内で形成されることを示している。Ｙ、
１ｉｐｏｌｙｔｉｃａＫおける直接相補の発見釦より、
突然変異を同定できろ任意の遺伝子のクローニングが可
能になった。

以下に述べるデラスミＰｐＬＤ　Ａ　Ｏは、ｐＢＲ３２
２のＥｃｏ　ＲＩ　部位Ｋ　ＳＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａのＬｌｌ領領域含む、１）ＬＤ２５の部分Ｋｃｏ　
Ｒ１消化で得られた小セグメントを挿入することＫより
構築される。

プラスミドｐＬＤ　５５は、ＵＲＡ３含有デラスミＰで
、ｐＬＤ　４　ＤのＢａｎ　Ｈｌ、、部位にＹ、　、１
１ｐｏｌｙｔｉｃａのＵＲＡ灸遺伝子を挿入することＫ
より得られた。

第１図は、ｐＢＲ５２２中Ｙ、　１ｉｐｏ’１７ｔｉｃ
＆の５ａｕ３Ａ部分消化遺伝子ライプラリ−である。こ
のアがロースダルは、このライブラリー（Ｌより）は２
．３’　ｋｂ　ｌａｍｂｄａ　−Ｈｌｎｄ　ｌ標準（Ｓ
ＴＤ　）のわずか上部に＃動し、挿入ＤＮＡのないｐＢ
Ｒ３２２超らせんデラスミＰを含むこと、一方、分子の
残部は、標準４．３　ｋｂ上にほぼ連続したスミアとし
て移動したＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡの多様
の（４〜１０ｋｂ）大きさに分割された挿入体を含んで
いる。中間のレーンは切断されていないデラスミＹ　（
ｐＬＤ　２１）で、２個の分離したパンＰが認められる
。

第２図は、ＨｃＯＲＩ消化Ｙ、　’１ｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａバルクＤＮＡと放射活性ｐＬＤ　２５で確認されたｐ
ＬＤ　２５のサデーンハイプリダイゼイションである。

ｐＬＤ２５のす、ｃ、ａの３個の内部パンｒは、全ち一
１１ｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡの同じ大きさの小片に相
同であることを示している。Ｙ、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ
　ル−ンのさらに２個の薄いバンド（１および２）は多
分、プラスミドバンドａおよびｅの小″Ｙ、−ｖ」旦す
３士需部分に相同性を有するものと思われる。ＳＴＤと
記したレーンはｌａｍｂａａ　−Ｈ１ｎｄｍサイズ標準
を含有する。Ｐと記したレーンは約２ｎｇのｌｃｏ　Ｒ
Ｉ　消化ｐＴ−＋Ｄ　２５を含有する。Ｙｌと記したレ
ーンは全Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡ　約Ｉ　
Ａｌｌを含有する。ｐＢＲ３２２をゾローベとして用い
た同様のサデーン夾験では、ＰＬＩ）　２５からのバン
ドａおよびｅのみがハイデリツｒされる。

第６図は、ｐＬＤ　２５の制限酵素地図である。単一消
化および一部の二重消化に基づく部分制限酵素地図を示
す。括弧を付した部分は相互の関係が決定されていない
。大きさはすべてアガロースデルでの観察に基づく推測
値である。細線はｐＢｌ３２２ＤＮＡ　（Ｅｃｏ　ＲＩ
　部位を１２時の位置にした標準ホーマットにおいて）
で、太線はＹ　、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａからの挿入Ｄ
ＮＡである。この挿入体は３個のＫＣＯＲＶ　（ＲＶ　
）、８個のＡｖａｌ（Ａ、１個しか地図化されていない
）、１個のＳｐｈ　ｌ　（Ｓｐ　）、１個のＫｐｎ　Ｉ
　（Ｋ　）、２個のＳ＆１１　（Ｓ　）、４個のＢａａ
ＲＩ（ＲＩ）、２個のＸｈＯｌ　（Ｘ　）および２個の
互いに接したＢａｌ　ｌ　（Ｂ　）部位を有する。挿入
体にはＨ１ｎｄ　ｌｌ　、Ｏｌａ　ｌ　％　Ｂａｎ　Ｉ
Ｉ　およびＮｒｕ　１部位を欠く。ＢｃｏＲＩ末端、ｌ
ｅｕ　２マーカーを有する２、３　ｋｋ＋のサブクロー
ンはｐＢＲ５２２のＩｃｏ　Ｒ１部位においてただ１個
のオリエンテーションでのみ大１１Ｉ菌内で機能する。

第４図は、放射性ｐＢＲ３２２デローベを有するＹ、　
１ｔｐｏｘｙｔｉｃａ形質転換体からのＨ１ｎｄ　１１
消化バルクＤＮＡのサデーンハイプリダイゼーションで
ある。４種の異なる形質転換体および母株から単離され
た全ＤＮＡのＨ１ｎｄ　７１消化物をアガロースデルに
かけ、プロットし、標識ｐＢＲ３２２でデローベする。

Ｙ、　１ｔｐｏ１ｙｔｉｃａ形質転換体＃６は完全な環
状ｐＬＤ　２５で形質転換した培地からランダムに選択
した。形質転換体１１．１２および１５はＫｐｎ■直線
化ｐＬＤ　２５で形質転換した培地から得られた。Ｙ、
　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ形質転換体はすべてノ１イデリ
ダイゼーションの２個のパンＰ１すなわち長さ２３ｋｔ
１以上の強いバンド１と長さ９．３ｋｔ）のｌａｍｂｄ
ａ　−Ｈ１ｎｄ　［１標準と同じ大きさの薄いパンげ２
を与えた。ｐｃと記したレーンは母株（ＰＣ３０８２７
、ＡＴＯＯ２０６８９）　ＤＮＡで、ゾロ−ぺに対する
有意なハイブリダイゼーションはみられない。

第５図は、ｐＬＤ　２３およびｐＬＤ　２４　Ｋよる制
限消化である。このアガロースデルは１ａｍｂｄａ　−
Ｈ１ｎｄ　ｌｌサイズ標準を左外側のレーンに含み、そ
れぞれａ）　ＪＣｃｏ　ＲＩ　処理、ｂ）　Ｂａｎ　Ｈ
ｌ、処理、Ｃ）ｐＬＤ　２３　（相補的Ｆ、、ｃｏｌｉ
　ｈｉｓ　Ｇ突然変異体）およびｐＬＤ　２４　（相補
性なし）の′酵素非処理である。それぞれのレーンｂは
２個の互いに隣接するＢａｍ　ＨＩ　バンドを含む。大
きい方はｐＢｌ　３２２　Ｋ相当し、わずかに小さいパ
ンげ（約４　ｋｂ　）はちユ１１ｐｏｌｙｔｉｃａ　Ｂ
ａｎ　ＨＩ　挿入体を表す。３ｃｏ　ＲＩ　消化体はＹ
、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ小片が２個のプラスミドの逆
方向にあることを示している。

第６図は、ｐＬＤ２８の制限酵素地図である。

ＬＥＵ　２領域を含む５，３　ｋｂのＹ、　１ｉｐｏｌ
ｙｔｉｃａ　Ｓａｄ　１小片に加えて、このプラスミド
は酵母２ミクロンデラスミｙからの複製起点をもつ２．
２　ｋｂ　ＥＣ０Ｒ１小片と、ｐＢＲろ２２の相当部位
に挿入された５６ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＵＲＡ　３遺
伝子をもツ１．１ｋｂ　Ｈ１ｎｄ　ＩＩｌ小片を含んで
いる。

第７図は、ｐＬＤ４０の制限酵素地図である。制限部位
の略号は前回と同じである。さらにＮｅｏ　１（Ｎ）、
ＡｐｅＬＩ　（Ａｐ　）およびＢｓｔ　Ｘ　ｌ　（Ｂｅ
　）の部位が地図化されている。Ｙ、　１１ｐＯ１ｙｔ
ｉ（！ａ　ＬＫＵ　２含有セグメントは２．６〜２．４
　ｋｂで、ｐＢＲ３２２のＢｏｏ　ＲＩ　部位に挿入さ
れている。ｐＢＲ３２２中の制限部位は示されていない
。

第８図は、ｐＬＤ　５５とｐＬＤ　４０の制限消化を比
較したものである。このデルのレーン（１ａｍｂａａ−
Ｈ１ｎｄ　ｍサイズ標準に加えて）は、ａ）非消化ｐＬ
Ｄ４０、ｂ）　Ａｐａ　ｌ消化ｐＬＤ　４０、ｃ）　Ｅ
ｃｏ　Ｒ１１消化ｐＬＤ　４　［１、＋１）　Ｋｃｏ　
Ｒ１消化ｐＬＤ　５５である。これらの消化体から、ク
ローン化されたＵＲＡ　３含有領域は２個の’ｆＬｃｏ
Ｒ１部位を有し、長さは約４ｋｌ）であることを示して
いる。

プラスミド プラスミドｐＬＤ　２５は大腸菌およびＹ、　１ｉｐｏ
ｌｙｔｉｃａに対する選択可能な遺伝子マーカーを含有
し、マルチコピープラスミドである大腸菌複製シラスミ
ドＰＢＲ３２２から誘導される。これはｐＢＲ３２２の
ＢａｍＨＩ部位に、ｙ、　’１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色
体ＤＮＡの８ａｕ　５　Ａによる部分消化で得られた約
６，６　ｋｂの断片を挿入することにより構築される。

プラスミ明細書のｒｌｌこ（内容に変更なし） ドｐＬＤ　２８はｐＬＤ　２５のサブクローンで、これ
も遺伝子マーカーも有し、ＹＥｐ　２４から妨害される
。

ｋｂのＳａｌ　Ｉ断片をＹＥｐ　２４のｓａｌ　１部位
に挿入し【構築される。

７’ｌスミドｐＬＤ　４０もｐＬＤ　２５ｆ）サブクロ
ーンで、Ｉ）ＬＤ　２５からの２．６〜２．４　ｋｂ　
Ｅｃｏ　Ｒ１部分消化断片をｐＢＲ５２２のＥｃｏ　Ｒ
１部位に挿入して構築される。

微生物 使用した微生物は大腸菌の休およびη、　１ｉｐＯ−１
ｙｔｉｃａ　の株で、これらはファイデー社（Ｐｆｉｚ
ｅｒＩｎｃ、）の培養コレクションにそれぞれに、　ｃ
ｏｌｉ　ＪＣ−５５５（クラーク（ｅＬａｒｋ　）ら：
モレキュラージエン　ゾエネテイク（Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇ
ｓｎ、　（）ｅｎｅｔ、）＋　１０５：１（１９６９）
、大腸菌遺伝株センター、エール大学から８６７号株と
して得られた〕およびち１１ｐｏｌｙｔｉｃａ　ｐ　ｃ
　−３０８２７として寄託されている。このＹ、　１ｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａはドウゼーウ（Ｊ、Ｒ。

ＤｅＺｅｅｕｗ　）の米 明細書の浄書（内容に変更なし） 国特許出願第５３９，３６３号（１９８５年１０月６日
出厭）の主題となっている。ベクターｐＢＲ６２２中で
Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａの遺伝子ライブラリーの装
造に用いた他の微生物、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｍ　Ｃ１０６
１はカサダバ７　（Ｃａ５ａｄａｂａΩ）ら：ジャーナ
ル　モレキュラーバイオロジー（Ｊ’、　Ｍｏ１．　Ｂ
ｉｏｌ、）。

１！１８：１７９〜２０７（１９８０）に記載されてい
る。この微生物は高頻度形質転換が可能なので、この目
的にと（に有用である。他の微生物もｍ、　ｃｏｌｉＭ
ｃ　Ｉ　Ｕ６１に代わりに使用できる。適当な微生物の
代表は、制限マイナスの大腸菌株、たとえばＥ、　ｃｏ
ｌｉ　ＨＢ　１０１（ＮＲＲＬＢ　１１６７１、または
ＡＴＣＣ３３６９４としても入手可能）であり、この株
は形質転換のためコンピテントにすることができる。

ロイシンおよびウラシル遺伝子を欠（大腸菌株（ＤＢ　
６５０７、Ａ’ｌ’ＣＣろ５６７６、ＨＢ　１Ｑ１の・
１・Ω５　（Ｉｌ１人突然変異体、Ｄ、　Ｂ、　ＢｏＬ
ｓｔｅｉｎより）はｌｅｕ　Ｂ　ＩＩ）’Ｙｒ　Ｆ　７
４　：　：　’ｌ’ｎ　５　ｈｓｄ　Ｒ−Ｍ−で、プロ
リン本要求するへ 以下の微生物がアメリカン　タイプ力ルチャーコレクシ
ョ７　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏΩ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＸＭ
ａｒｙｌａｎｄ　ＸＵ、Ｓ、Ａ、）に寄託されていて利
用できる。すなわち、ＡＴＯＯ２０ｔ５８８Ｙａｒｒｏ
ｗｉａ　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　Ｐ　Ｏ−０８２７ ＡＴＯＯ２０６８７Ｙａｒｒｏｗｉａ　１１ｐｏｌｙｔ
ｉｃａ　Ｐ　Ｏ−３０８２７のｐＬＤ　２５　Ｋよる形
・賓転換体 ＡＴＯＯ３９４６４ＫｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪ
Ｏ−３５５のｐＬＤ　２５　Ｋよる形質転換体 ＡＴＯＯ２Ｑ　７　ｉ　８Ｙａｒｒｏｗｉａ　１ｉｐｏ
ｌｙｔｉｃａ　Ｐ　Ｏ−３０８２７のｐＬＤ　５５によ
る形質 転換体 これらはブタベスト協約に基づいてＡｍｅｒｉｃａｎＴ
ｙｐｅ　Ｏｕ：Ｌｔｕｒｅ　Ｏｏ’１ｌｅｃｔｉｏｎ　
（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　）　Ｋ寄託されている。公認された
寄託機関は永久寄託とこの出願が登録されれば公衆への
提供とが保証される。この出願の係属中には、米国特許
庁のコミッショナーが３７０ＦＲ１，ｉ　４および３５
　ＵＥＩＯ１２２により資格ありと定めた者に、また本
願の対応特許または関連特許が出願された外国ではその
国の特許法により、利用が許される。

寄託された微生物の公衆利用に関するすべての制限は、
特許登録時に解除される。

ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　Ａ’ｒｃｃ　２０６８８
の分類学的研死はり、　Ｈ，Ｈｕａｎｇ博士によって行
われた。これを以下に示す。使用したメジウムおよび方
法はロツダー（Ｌｏｄｄｅｒ　）著：酵母（Ｔｈｅ　Ｙ
ｅａｓｔｓ　）第２版、Ｎ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　。

１９７０に推賞されたものである。

ら）としてｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗａｌｔおよびｖａｎ　Ａ
ｒｘ（Ａｎｔｏｎｉｅ　ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅ
ｋ　４６　：　５１７〜５２１．１９８０）により分類
されている〕の培養菌株ＣＢＳ　５９９と比較した。

ＰＣ−５０８２７株はロイシンおよびウラシルを要求す
る（　Ｊ、　Ｒ，ＤｅＺｅｅｕｗンので、ロイシンエチ
ルエステルおよびウラシルをそれぞれ１４９〜／沼およ
び２０Ｉｎｇ／、、ｇの濃度、以下の培地、すなわち、
炭素化合物の同化をみる基質培地、硝酸カリウムの同化
をみる肉汁、生育をみるビタミンを含まない肉汁、およ
び生育刺激に対するビタミンの効果をみる肉汁である。

ロイシンエチルエステルはロイシンに比べ、炭素源とし
てゆっくり利用される。他の培地は有機性で、添加物な
しで生育を支持するものでなければならない。上述の培
地に添加物を加えまたは加えないで、０ＢＢ−５９９株
についても使用した。

以下に述べるよう釦、両株は大部分の培養的および形態
的特性が等しい。２．ろの相違がみられるのみである。

たとえばａＢｓ　−５９９をグルコース−酵母抽出物−
々デトンアが−ル上で画線培養すると、わずかに粗また
はわずかに縮毛状を呈するのに対し、ＰＣ−３０８２７
の場合は明瞭な縮毛状を示す、、ＰＣ−３０８２７はＯ
ＢＳ　−５９９株に比べて、コーンミールアガール上で
の生育が貧弱で、真の繭糸体の産生は低い。

ＣＢＳ　−５９９では、上述の培地にロイシンエチルエ
ステルおよびウラシルを補給した場合の結果は、補給物
がないときはクエン酸を使うが補給物ない場合の結果と
同一であった。これは補給物が炭素源としても望素源と
しても利用されていないことを示し、したがってＰＣｉ
０８２７株の培地への飽加物の添加は各誌できる。

ＣＢｓ　−５９９株に比べて、ｐｃ−３０８２７株は、
コハク酸、Ｄ−グルシトールおよびグリセロール上、「
良好」ではな（「なし」〜「弱」の生育を示し、ビタミ
ンを含まないメジウムおよびサリシン上の生育は「弱」
ではな（「なし」、生育刺激に対するチアミンの効果は
「良好」ではなく「なし」〜「弱」である。ｐｃ−５０
８２７株はＬ−ノルボース上では生育しないのに対し、
ｃＢｓ−５９９では逆である。

生化学的試験におけるｐｃ−３＋０８２７とｃ、Ｂｓ−
５９９の間のいくつかの相違は、定量的なものである。

ｐｃ−３０８２７の突然変異株の生化学的試験結果はＣ
ＢＳ　−５９９暗型培養の場合と等しかった。この箱釆
をファン　ウーブン（ｖａｎ　Ｕｄｅｎ）とバラフレー
（Ｂｕｃｋｌａｙ　）が提案したカンゾダ（Ｃａｎｃｌ
ｉｄａ　）種に対するキーに用いると（酵母（Ｔｈｅ 明細書の浄１！！：（内容に変更ない Ｙｅａｓｔ　）、ロツダー編（Ｅａ、　Ｊ、　Ｌｏｄｄ
ｅｒ　）　、１９７０）、この２株はそれぞれカンジダ
　リボリテイカ（Ｃａｎｄｉｄａ　１ｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ　）、すなわちＹａｒｒｏｗｉａ１１ｐｏｌｙｔｉｃ
＆の不光全状悪に分類される。

艷 ６日間２８°Ｃで培養後、細胞は丸、長丸〜長で、１〜
６個の芽胞を伴う。丸い細胞は５〜１６ｘ６〜７μｍ１
長い細胞は６０μｍまでの長さを示す。

擬−糸体あり。菌膜あり。沈殿。

グルコース−酵母抽出物−ベプトンアガール上での生育 ２８℃で１力月培養後、培地はクリーム状で、隆起。わ
ずかに租またはわずかに綿毛状、光沢のないあるいは湿
潤した表面を呈す。

コーンミールアガール上Ｄａ１ｍａｎ平板培養生育：中
等度。灰白色。擬菌糸体および真の分かれた丙糸体あり
。単一、対または６個の罪状の芽胞が一系または擬菌糸
上、木端または９Ｊａ面に、あるいは輪生状に形成され
る。

／ 発酵 グルコース、カラクトース、シュクロース、マルトース
、トレハロースおよびラクトース上で発酵しない。

シンエチルエステルおよびウラシル） グルコース　＋（＋） がラクトース　−（−） Ｌ−ソルボース　＋（＋） シュクロース　−（−） マルトース　−（−） セロビオース　−（−） トレハロース　−（−） ラクトース　−（−） メリビオース　−（−） ラフィノース　−（−） メレジトース　＝（−） クエン酸　＋（−） 可溶性デンプン　−（−） Ｄ−キシロース　−（−） Ｌ−アラビノース　−（−） Ｄ−アラビノース　−（−） Ｄ−υピース　弱（弱） Ｌ−ラムノース　−（−） エタノール　＋（＋） グリセロール　＋（＋） エ　リ　ス　リ　ト　−ル　＋　（＋）イノシトール　
−（−） リビトール　−（−） がラクチトール　−（−） Ｄ−マニ′トール　＋（＋） Ｄ−グルシトール　＋（十） サリシン　弱（弱） ＤＬ−乳酸　弱（＋） α−メチル−Ｄ−グルコシド　−（−）コハク酸　＋（
＋） 硝酸カリウムの同化（ロイシンエチルエステルおよびウ
ラシルの添加または非添加） なし シンエチルエステルおよびウラシルの添加または非添加
） 弱い生育 ビタミン刺激の生育 ロイシンエチルエステルおよびウラシルを含むまたは含
まない肉汁中でチアミンは生育を刺激する。

食塩耐性 １１％〜１２チ ３７９Ｃ〜４５°Ｃ 育 ５日間２８℃で培養後、細胞は丸、長丸、長型、まれに
楕円型で、１〜５個の芽胞を伴う。元型細胞の大きさは
５〜１４×６〜６μｍ１長型細胞の大きさは２５μｍま
でである。接菌糸体あり。菌膜あり。沈殿。

での生育 ２８℃で１力月間、画線培養後、培地はクリーム状、隆
起。明瞭圧縮毛状。光沢のない表面を示す。

生育：貧弱。灰白色、接菌糸体あるが、希薄で短い。真
の分かれた菌糸体はまれにある。単一、対または３個の
埋伏ないし球形の芽胞が、末端または側面に１ときＫは
群生して、形成される。

発酵 グルコース、カラクトース、シュクロース、マルトース
、トレハロースおよびラクトース上で発酵しない。

シンエチルエステルおよびウラシル） グルコース　弱 がラクトース Ｌ−ソルボース シュクロース マルトース セロビオース トレハロース ラクトース メリビオース ラフィノース メレジトース 可溶性デンプン Ｄ−キシロース Ｌ−アラビノース Ｄ−アラビノース Ｄ−リボース　弱 し−ラムノース エタノール　弱 グリセロール　−〜弱 エリスリトール＋ リビトール ガラクチトール Ｄ−マニトール　＋ Ｄ−グルシトール　−〜弱 サリシン ＤＬ−乳酸　弱 α−メチル−Ｄ−グルコシド　− コハク酸　−〜弱 クエン酸 イノシトール 硝酸カリウムの同化（ロイシンエチルエステルおよびウ
ラシル添加） なし ビタミン　まｔいメジウム　での生　（ロイシンエチル
エステルおよびウラシルの添加）なし ビタミン刺激の生育 ロイシンエチルエステルおよびウラシルを含む肉汁中で
チアミンの生育刺激は「弱」〜「なし」である。

食塩耐性 １１％〜１２チ 生育最高温度 ３７℃〜４５°Ｃ １１細書の浄凹（内容に変更なｌ、、）ビルマレートデ
ヒドａ）ｆナーゼ（ＥＣ１，１＋１゜８５）をコードし
、大腸−の１ｅｕＢｉｔ伝子によりｆたＳ、　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ　Ｏ）　ＬｋＵ　２遺伝子によりコードさ
れる。

ＡＴＣＣ２０６８８のそれぞれにＩ）ＬＤ　２５を挿入
すると、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｃ−５５５およびＹ、１
ｉｐｏｌｙｔｉｃａＡＴＣＣ２０６８８それぞれのｐＬ
Ｄ　２５を有する形質転侯体が得られる。これらは、フ
ァイザー社（Ｐｆｉｚｅｒ　ＩΩｃ、）のカルチャーコ
レクション（Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎン
にょ９それぞれＦ、　Ｄ。

２７５３４およびＦ、　Ｄ、　２７５３３と同定されて
いる。

Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＮＲＲＬ　Ｙ　−１０９
４、野生型体（すなわち、微生物学の分野での熟練者に
よって通常用いられている株）からの染色体ＤＮＡ　ヲ
ヒアフオード（Ｈｅｒｅｆｏｒｄ　）ら：細胞（Ｃｅ１
ｌ　）　Ｎ　１８：　１２６１〜１２７１　（１９７９
）の方法で得た。

本発明の新規シラスミＦ　ｐＬＤ２５は、直線化ｐＢＲ
３２２を、Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮＡの
部分８ａｕ３人消化体と、Ｔ、　Ｉ７ガーゼを用いて結
合させることにより構築される。ｐＢＲ３２２はバクテ
リアＤＮＡからの共有結合的に閉じた超コイルｐＢＲ３
２２を分離するため％　ＣｓＣ１−エチジウムブロマイ
ド勾配で遠心分離して単離された。ｐＢＲ３２２を制限
酵素１３ａｍ　Ｈｌで消化してテトラサイクリン抵抗性
遺伝子（ＴＣＲ）内で分裂させ、直線化すると、コヘツ
シブ末端（粘着末端）を有し、アンピシリン抵抗性（ｍ
ｐＲ）を表現型形質として残した線状の断片を生じる。

ダル（アガロース）電気泳動に付すと、このベクターは
バクテリアＤＮＡを実質的に含まないことがわかる。が
（して得られた線状ＰＢＲ３２２を所望によりアルカリ
ホスファターゼで処理し、自己結合、すなわちベクター
ＤＮＡの再環化およびダイマー形成を防止する。

ＰＬＤ　２５の第二の成分は、Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａ株ＮＲＲＬ　Ｙ　−１０９４、野生型体の染色体Ｄ
ＮＡを、コヘツンブ末端を有して、ｐＢＲ３２２のＢａ
ｍ　ＨＩ　開明細書の浄書（内容に変更ない 裂の断片に相補性のほぼランダムな断片を生成する制限
酵素Ｓａｕ　６Ａ部分消化に付すと得られる。

アガロースデルから収穫される、範囲４〜１０ｋｂのＤ
ＮＡを公昶方法で精製したのち、ＢａＩＩＩＩＨＩ　切
断部でアルカリホスファターゼ処理ベクターｐＢＲ３２
２を結合させる。

本発明の方法においては、ＤＮＡ断片の犬ささにはｆｌ
ｉｌＪ限はない。ＤＮＡ断片に関する限定は、それが検
出可能なマーカーたとえばＬＥＵ　２遺伝子のすべてま
たは十分な部分を含有することである。さらに、大腸菌
プラスミド、この場合はｐＢＲ３２２の制限酵素開裂に
よって生じた断片に相補的なコヘツシプ末端を持たねば
ならないことである。

ベクターＤＮＡと、Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　％％
色鉢体ＤＮＡ３ａｕ３Ａ１ｆｌＳ分消化体は、補因子と
してアデノシン三リン酸（ＡＴＰ　）の存在下にＴ、リ
ガーゼを用いて結合させる。

結合混合物は、まずＬ　ｃｏｌｉＭｅｌ　０６１　（カ
スダバン（Ｃａ５ａａｂａｎ　）ら：ジャーナルモレキ
ュ２−バイオロジー（、ｒ、　Ｍｏ１．　Ｂ１０１．）
＋　１６８　：１７９〜２０７．１９８０）の形質転換
に用いる。

大腸菌の株はきわめて高い形質転換頻度を示し、ｈｅ４
　Ｒ−１ｈｅｏｌ　Ｍ＋であるので、上記大Ｉｌ＆歯で
ち一１ｉｐｏｌｉｔｉｃａ遺伝子ライブラリーを与える
。且ユｏｏ１ｉ　ＭＣ１０６１ノ全＜異なるアンビシ１
ノン抵抗性形質転換体をアンピシリン抵抗性アが一ル平
板上で生育させ、収穫した。収穫した培養細胞をアンピ
シリン含有メジウム１１中で生育させた。遺伝子ライブ
ラリーを作るための標準方法で混合シラスミドが単離さ
れた。このライブラリーの一部をとり、Ｅ、　ｃｏｌｉ
　Ｊｃ　−３５５を形質転換させた。

形質転換体はアンピシリン抵抗性によって選択した。こ
れらの形質転換体を次にレゾリカ法で、ロイシンを含ま
ない合成培地に転写した。また、形質転換混合物を直接
、ロイシンを含まないアンピシリン含有合成培地に置い
てもよ（・。このようにして選択された形質転換体はロ
イシン原栄養株である。この形質転換体中のシラスミド
を標準方法によって４４し、ｐＩ、Ｉ）　２５と比較す
る。

ロイシン原栄養性形質転換体から得られたシラスミドの
微量サンプルをＨｌｎｄ　ｌおよび８ａｌ　Ｉで明ｍ書
の浄！Ｆ（内容に変更なし） 消化させて分析したとこｂ１期待されたｐＢＲ３２２か
らの６．７　ｋｂ断片、および約６．６　ｋｂのサイズ
の挿入体を示す２個の大きな断片を含むことが明らかに
された。また、小さ７よ断片（ｐＢＲ３２２のＳａｌ　
１部位から挿入体のＳａｌ　１部位近くまで、第６図参
照）も発見された。シラスミドｐＬＤ　２５のすず−ン
グロットハイプリダイゼーション（サザーン（５ｏｕｔ
ｈｅｒｎ　）　：ジャーナルモレキュラーバイオロジ−
（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｅｌｏｌ、）、　９８　：　５０３
〜５１７．１９７５）を、ＥｃｏＲＩ消化Ｙ、　１ｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮＡのハイブリダイゼーション
と比較すると、クローン化挿入体の内部の３個のＤＮＡ
は染色体ＤＮＡのものと同一であることがわかった。

Ｙ、　１ｉｐ０１７ｔｉｃ＆の完全ｐＬＤ　２５および
Ｋｐｎ　ｌ切断ｐｒ、ｐ　２５による形質転換体につい
て、それが組込まれたかまたは独立に複製されるｐＬＤ
　２５（ＬＲｌＪ　２含有プラスミド）を含むかどうか
を試験した。染色体ＤＮＡはロイシン原栄養性形質転換
体と母株の−Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＸＡＴＣＣ
２Ｕ　６８８から作成したｃ、ＤＮＡサンプルはＢｉｎ
ｄ　Ｉで切断し、０．５チアガロ−スプルにかけ、サン
プル中のプラスミ明細書の浄書（内容に変更なし） ドｐＬＤ　２５の存在を調べるため放射性Ｉ）ＢＲ３２
２を用いるサデーンプロット法により解析した。母は−
められなかった。ｐＬＤ　２５には１個のＨｉｎｄ量部
位がある（　ｐＢＲ６２２セグメント内）から、そして
Ｙ、　１ｉｐｏＬｙｔｉｃａセグメントにはないので、
１）ＬＤ　２５が形質転換頻度で独立に複製されている
のであればＮ　Ｉ）ＬＤ　２５サイズの１個のバンド（
約１１　ｋｂ　）か４られるはずである。このようなバ
ンドがないことは、形質転換体はいずれも組込み体であ
るとの結論になる。環状、直線状および切れ目のある直
−状プラスミドは、相同の染色体配列との組侯えによっ
て、Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａを形質転換できる。し
かしながら、形質転換頻度は、完全プラスミド処理細胞
におけるよりも、Ｋｐｎ　ｌ−切断ゾラスミド処理細胞
の方が著しく高いことがら、さら番（、オールーウイー
バ−（０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ　）らによりＳ、　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅについて記述された組込み形質転換（プ
ロシーディングナショナルアカデミ−メゾサイエンス（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）。

７８　：　６５５４〜６６５８．１９８１）がＹ。

１ｉｐＯ１ｙｔｉｃａでも同様に起こることをボしてい
る。上述のサデーンプロットは直線分子から銹導された
ｍ込谷形負転候体の構造は、環状分子（すなわちプラス
ミド）から縛導された形質転換体と同じ挙動をすること
を示している。さらに、すず−ンプロット実験により、
完全なプラスミド処理から生じる布な形質＝ｍ体の一部
はｐＢＲ３２２ハ・イブリッド可能材料を欠き、多分、
遺伝子変換または二貞組換えによって生じたものと思わ
れる。

本明細書に記載の形質転換システムの有用性は、その形
質転換システムに述べた組込みプラスミドより、サイク
ルを完成することから明白である。

さらに、組込みシャトルベクターは、遺伝子ライ受答体
内でついで選択またはスクリーニングする。

実験 材料と方法 Ｂａｕ＋　ＨＴ、Ｓａｌ　Ｉ　、　Ｂｇｌ　ＩＩ、Ｈｉ
ｎｄ　ｌおよび５ａｕ６Ａを含めた大部分の制限酵素は
ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ　）（Ｎ＆Ｓ　）から、Ｔ　４　ＤＮ
Ａリガーゼおよび’ｆｔ、　ｃｏｌｉポリメラーゼ１も
同様に得られた。Ａｐａ■はベーリンガーーマンハイム
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）から得
られた。すべての酵系は各製造業省によって記載されて
いるその使用伯仲に従って使用した。Ｓａｌ　Ｉは、バ
クテリアアルカリホスファターゼ、Ｋｐｎ　ｌおよびＸ
ｈｏ　ｌと同様、ベセスダ　リサーチ　ラボラトリ−（
Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓバＢＲＬ）から傅た。バクテリアアルカリホス
ファターゼは、直線状プラスミドＤＮＡ　１μｙにつき
約１００単位の割合で、６５°Ｃにおいて、ＢａｍＨＩ
アツセー緩衝浴中、２時間使用した。

制限消化悴はＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤ’Ｊ’Ａ緩
衝液を用い、浸漬０．８％アガロース中電気泳動によっ
て解析した（マニアテイス（ＭａΩ１ａｔｉｓ　）ら：
　″モレキュラークローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　）’、ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎ、　Ｙ、　＋　
１９８２）。

メジウム 大腸開用メジウムは１男あたり、１０１！のＢａｃｔｏ
−トリプト７．５ｇのＢａｃｔｏ−酵母抽出物、および
食塩５ｇを含み、−を７．５に調整したＬ苦汁である。

犬＃Ｊ耐最小培地はｕ、５３　％デキストロースに５６
種の塩を含む（ロウ（ＬＯ！　）　：ジャーナルオデバ
クテリオロジー（Ｊ、　ＢａＣｔｅｌｒｉＯｌ、）＋　
１１３ニア９８〜８１２．１９７５）。アミノ酸または
塩基は必袂な揚台、５０μＩ／−津加した。バクテリア
は６７°Ｃで生対させ１こ。

酵母用メジウムは１％Ｂａｃｔｏ−酵母抽出物、２％Ｂ
ａｃｔｏ−ペプトン、２％デキストロースを含むＹＰＤ
である。酵母最小粘地、ＳＤは、０．６７％Ｂａｃｔｏ
酵母窒素塩基（アミノ酸を含まない）および２％デキス
トロースを含有する、合成完全培地は、アデニンＷＨＭ
塩、ウラシル、トリットファン、ヒスチジン塩ば塩、ア
ルギニン塩酸塩およびメチオニン各２！ｊ１チロシン６
ｇ、ロイシン６Ｆ、フェニルアラニン５ｇ、スレオニン
２Ｌ１ｇ、リジン６ｇを合して乳鉢、乳棒を用いて粉砂
して粉末添加剤を８７０Ｉ＃＆＃３の割合で含鳴する。

栄養試験または選択に際しては、完全メジウムから過当
なた。

ａ）　ＤＮＡのクローニング：野性型体ＮＲＲＬ　Ｙ−
１０９４を、振ＷＩＦｅｒｎｂａｃｈフラスコを用い、
ＹＰＤ　４Ｘ３００−中１１！ｔ′ＶＣツきｌＸ２Ｘ１
０８個の細胞をとり２８℃で生育させ、ついで新鮮な靜
的相培地から１５μノを接種した。以下の細胞操作はす
べて２８℃ｆた呈温で実施した。細胞は遠心分離で収穫
し、５０ＩＬｔのＩ　Ｍ　−Ｎａｃｌで洗浄し、再び遠
心分離した。遠心分離収復後に、５０ゴの０．２　Ｍ　
）リス（ヒドロキシメチルンアミノメタン塩酸塩（Ｔｒ
土１ｌ−ＨＣＩ　）　ｐＪ（８，５，０，０２Ｍ　エチ
レンジアミン四酢戚（ＫＤＴＡ　）、１Ｍ食塩およびＬ
ｌ、Ｉ　Ｍ　２−メルカプトエタノール中で前スフエロ
ゾラスト接櫨τ１５分行５゜細胞ペレットを、１Ｊｌｊ
Ｋつき１〜のディモリアーゼ５ＬＩ００（キリン醸造所
、日本（Ｋｉｒｉｎ　Ｂｒｅｗｅｒｉｅｓ　、　Ｊａｐ
ａｎ　）　）を含む１Ｍ−ＮａＣ１４Ｑ　ｘｒｌ中ＫＦ
）懸濁し、４５分間インキュベートシた。この時点で９
０％以上の細胞は、水中への希釈による細胞分解で顕微
規約に検査すると、スフェロプラストに変換されていた
。

スフェロプラストを遠ＩＬ？分離し、計１６ゴの１Ｍ　
−ＮａＣ１に４本の試験管に分けて再懸濁した。

分解緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｏ　ＰＨ６，８、Ｉ　Ｑ
ＱｍＭＮａＣｌ、１００　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、Ｑ、５％
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ８　）　：］、０．１ダ
／ｄプロテナーゼに含有、４０−を加え、リゼートを６
７℃で１．５時間インキュベートした。リゼートを等容
量のフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出した。

９．０００　ｒｐｍで遠心分離して相を分け、水相は再
びフェノール−クロロホルムで抽出した。最終水相を２
容量のエタノールと合し、ＤＮＡを沈殿させる。液体を
傾瀉して、ペレットを７０％および１００％エタノール
で洗浄したのち、真空乾燥した。乾燥ペレットを８−の
Ｔｇ　（１０ｍＭ　ＴｒｉＢ−ＨＣｌｐ）（８，１ｍＭ
　ＥＤＴＡ　）に６５°Ｃで再溶解し、ついで３００　
ｐｉのＲＮ＊ｓｅ　Ａ　（１ｍ９／　ｒｄ、５分間煮沸
）を加えて３７℃で１時間ＲＮＡ１］ｆｌ消化を行う。

混合物をフェノール−クロロホルムで２回抽出し、前と
同様にエタノールで沈殿させた。最終沈殿をエーテルで
洗浄したのち、真空乾燥した。

ＤＮＡペレットを前回と同様にしてＴＥに再溶解し、１
０１００ＸＴＩＥ２ついで水を加えて２９．０４明細書
の浄書（内容に変更なし） Ｉとした。この溶液なＣｓＣ１３７，６９１Ｋ加え、遠
沈管に移し、’ＶＴｉ５Ｑローターを用いたＢｅｃｋｍ
ａｎ　Ｌ　８−７０超遠心分離機によｒｉ、４０，００
０ｒｐｍで１７時間、遠心分離した。針で孔をあけて、
遠沈管の紙から約１．２５−を含むフラクションに分け
℃、勾配を収穫した。各７２クシヨンのサンプルをＱ、
５ｍｃｇ／ｍｌのエチシウムグロマイドを含むアガロー
スゲル上を走らせてＤＮＡを分析し、分ｌ［１ｌｉ１６
．１７および１８（全２６から）を集めた。

これらのＤＮＡ　＠有分画をプールし、１ＸＴＥを４回
かえて透析し、エタノールで沈殿させた。ＤＮＡンｌ　
Ｘ　ＴＥ　Ｏ，＜ＩＪＫ再浴解し、この生成物を２６Ｏ
ｎＩｉＩ０）吸収で評価すると、ＤＮＡ１２９μｌを含
むことが明りかにされた。

（５ｈｅｒｉｏａｎ　）ら：酵母遺伝学における方法（
Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　
）　、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　ｒ　Ｎ、’１．＋　１９８１ノからの
ＳＤＩ：Ｉ　スフェロプラスト分解と酢酸カリウム処理
力ζ±１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡを得るのに便利で
あった。

明細書の浄書（内容に変更なし） プラスミドＤＮＡの真裏 バクテリアプラスミドＤＮＡをホルムス（Ｈｏ１ｍｅθ
〕ら〔アナル　オシ　バイオケミストリー（Ａｎａｌ。

Ｂ１０Ｃｈ８＋１１．）　ｌ　１　１　４　：　１　９
３〜１　９７　（１９８１）〕の急速蕉洲法で製造した
。大量の製造の場合のみ、次１ＣＣｓｃ１−エチシウム
グロマイド勾配中の遠心分離を行った。ＤＮＡ製品は滅
菌ＴＢ緩衝液中４℃Ｋｆｔｌｆ存した。

ダシヤード（Ｄａｇａｒｔ　）ら〔遺伝子（Ｇθｎｅ〕
。

６：２６〜２８（１９７９））のＣａＣｌ２法を用いた
。形質転換には一夜ＣａＣｌ２処理および短時間処理細
胞の両者を用いた。

ｔ＋′ゾーンプロット集験 ニトロセルロースに移送した（　５ｏｕｔｈθｒｎ１９
７５　）　ＤＮＡを、６ｘＳＣＰ緩衝ｉ　（２０Ｘ　Ｓ
ＣＰ保存液は２．０　Ｍ　Ｎａ１１　％　０．６　Ｍ　
Ｎａ２ＨＰＯ４、および０．２　Ｍ　ｇＤＴＡｐ！４６
．２を含有するり中、３２Ｆ標識「二ツク翻訳」プロー
ベにハイブリダイズした。

Ｊ！！、　ｃｏ１１ポリメラーゼＩとともに、ニック翻
訳法（Ｍａｎｉａｔｉｅら、前出ンを用いた。

明細書の浄書゛（内容に変更なし） ！ このＤＮＡ約１５１４を、４個の各試験管にＤＮＡ１μ
ｇあたり、０．０５．０．１．０．２および０゜４酵素
率位の制限酵素３　ａｕ　３　Ａ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ：
ＬａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　）により、６７℃で０．５時
間、購入会社のプロトコールに従つ１部分消化した。６
５℃に１０分間加熱して反応を停止し、ついで０．８％
の製造用アガロースゲルに負荷した。サイズ範囲４〜１
ＱｋｂのＤＮＡ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　ＬａｂｓからのＨｌｎｄ　ｉｌｌ　９ＪＨＩＴｌａ
ｍｂｄａサイズ標準と比較うをグルから収穫し、眠気溶
出し、ＤＦ：５２カラム上で精製しくヤング（Ｙａｎｇ
　）ら：＃素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
ｌｎｚｙｍｏｘｏｇｙ　）　＋　６８　：　１７６　ｒ
１９７９ノ、エタノールで沈殿させ、ついでＢａｎＨ工
切断、アルカリホスンアターゼ処理ベクターｐＢＲ６２
２と結合させた。

約１μｇのＤＮＡな宮む結合混合物を、Ｋ、　ｃｏｌｉ
株ＭＣ１０６１（カサダバン（Ｃａ５ａｄａｂａｎ　）
ら：ジャーナル　オシ　モレキュラー　バイオロジー（
；ｒ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）ｌ　１３８　：　１７
９〜２０７．１９８０）の形質転換 に用い、ｙ、　１ｉｐＯ１ｙｔｉｃａ遺伝子ライブラリ
ーの作成に用いた。形質転換混合物は１０〜／ｄアンピ
シリン＋Ｌアガール平板上に約１．４　Ｘ　１０’個の
コロニーを与えた。５０個のコロニーを１個の平板上に
置き、レプリカ法で５１１Ｑ／ｌｉｔのテトラサイクリ
ンに対する抵抗性を試験した。４４個（８８チ）は感受
性を示し、大部分はＢａｍ　ＨＩ　部位に１）ＢＲ５２
２の抵抗性８遺伝子を妨害する挿入体を含むものと考え
られる。１８個のランダムに選ん７’Ｌ　ａｍｐＲコロ
ニーからの微量シラスミド製造について、Ｈｉｎｄ　Ｉ
およびＳａ’ｉ　ｌ二重消化ならびＫ　ＢａｍＨｌ　消
化を行い、制限酵素の消化を検討した。１０個のプラス
ミドが平均約７　ｋｂの大きさの挿入体を持っていた。

約１．４×１０′の大腸菌形質転換体コロニーを含む４
８個のアンピシリン平版上ＬＢ＋１０４／１ｔｔｌアン
ピシリンに転写し、試験した。レプリカをそれぞれ０．
８５％ＮａＣｌ３＋ａ／で洗浄した。細胞をプールし、
遠心分離してペレット化し、１１＋ａ６’ＬＢおよび２
．５ｍＪの８０％グリセロールに再懸濁した。

１１のＬＢと１０μｉ／ｌｄのアンピシリンを加えたＦ
ｅｒｎｂａｃｈ　７ラスコシ個に１それぞれゾールした
バクテリア４−をとって培養した。残りのバクテリアは
一７０’Ｃに保存した。この培養はｐＢＲ３２２中Ｓａ
ｕ　３　Ａ部分消化断片のＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ
遺伝子ライブラリーであるプラスミドＤＮＡの調製に用
いられた。

リーニング 各種遺伝子マーカーのために数種の大腸菌突然変異株を
遺伝子ライプラリ−で形質転換した。遺伝的相補性を得
るためＫは、２つの主要な因子が必須である。（１）相
当するＹ、、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子が、このラ
イブラリー中のシラスミドの少な（とも１個に完全に含
有されていること、（２１Ｙ、　１ｉｐｏｌｙ−ｔｉｃ
ａ遺伝子は十分な程度、大腸菌細胞内で機能しなければ
ならない。ライブラリーは適当なメジウム上での各マー
カーの直接選択と同時に、まずアンピシリン抵抗性の選
択、ついで選択されたメジウム上へのレプリカ転写によ
ってスクリーニングされた。検査した各遺伝子マーカー
について、少なくとも１０５個の形質転換体が検査を受
けた。

菌株ＪＣ３５５はｒ、ｇｕ　２遺伝子を有効にクローン
化するのに用いられた。

選択メジウム上に生育した任意の大腸菌コロニーについ
て、さらに再形質転換試験を実施した。

この試験に際しては、選択メジウム上に生育した菌株の
培地５ｄからシラスミドを製造した。母体である大腸菌
突然変異株を形質転換するためにプラスミド微量製造法
を用いた。多（のアンピシリン抵抗性形質転換体が選択
メジウム上に存在するが、コロニーはほとんどまたは全
（ないことから、はじめのコロニーは所望のＹ、　１ｉ
ｐＯ１ｙｔｉｅａ遺伝子を含まず、プロトロフへの突然
変異のため生育しタト考えてよいように思われる。アン
ピシリン抵抗性コロニーのすべてが、やはり試験した遺
伝子に対する選択メジウム上で生育するのであれば、は
じめのコロニーから得られたシラスミドは大腸菌突然変
異を相補する挿入体を含んでいたと結論される。ｐＢＲ
ろ２２に同一の挿入体が含有されたＪＣ３５５のロイシ
ン独立性形質転換体（ｌｅｕ　Ｂ６）は全部で７個発見
された。これらのコロニーの２個からプラスミド微量製
造法を行うと、再形質転換試験においてアンピシリン抵
抗性、ロイシンゾロトロフ形質転換体が１００％（ろ７
／３７および６１／ろ１）認められた。このシラスミｒ
はｐＬＤ　２５と命名された。

来することを確認するため、すず−ンプロット実験を実
施した。ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ全ＤＮＡの製造を
新たに行った。ただし、最終のＣｓＣ１勾配工程は省略
した。　Ｙ−１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡのＥｃｏＲ
Ｉ消化パターンからｐＬＤ　２５　（第２図）の挿入体
の内部の３個のバンドと同一であることが明らかＫされ
た。

数種の通常の酵素を用いてｐＬＤ　２５の部分制限酵素
地図を作成した（第３図）。このプラスミド明細書の浄
：（内容に変更なし） ｋｌ）と評価された。

形質転換プロトコール 酢酸リチウム法（イト−（工ｔｏ　）ら：ジャーナル　
オグ　バクテリオロゾー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
）。

１５３　：　１６３〜１６８．１９８３Ｊをｓ、ｃｅｒ
ｅ−ｖｉｓｉａｅの形質転換に用いた超音波処理ギヤリ
ヤーＷＡ添加で改良し、この方法を用い’ＣＹ、　１ｉ
ｐｏ−１ｙｔｉｃａの形ＪＸ転換を行った。対数期の後
期の６〜ｉ　ｏｘｉ　ｏフ細胞／　ｔｔｒｌでの培養が
、対数期（１８１０７ｍ胞／ｌ１ｌ）培養よりも、多い
形質転換体を与える。ＹＩ’Ｄ　Ｊ＠女物５０訳シをペ
レット化し、ついでｉ　０　ｍＭ　Ｔｒｉ８．１　ｒａ
ＭＥＤＴ°ｈＡ７．５の１０ゴ忙再懸濁した。これを再
びペレット化し、上記緩衝液にさらＫＬｌ、１Ｍ酢酸リ
チウムをプラスした緩衝液２〜３　’４１　ｋ　Ｋ再縁
濁し、Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　ｏ　−５−ドラム
上、２８’ｃで１時間おだやかｌＣ混合した。

リチウム処理梢胞を０．１〜１．０個に分け、形質転換
プラスミド１４および超音波処理異種キャリヤーＤＮＡ
　（大きさの範囲はアガロースゲル上で０．５〜９　ｋ
ｂと推定された〕とともに多形質＠換管にとった。形質
転換管を２８℃に６０分間放置たのち、ＰＥＧ試薬（４
０チポリエチレングリコール４０００．０．１　Ｍ　Ｌ
ｉＡＣ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｏ　、１　ｍＭｌｉＤＴＡＰ
）４７．５−滅菌ろ過）７容量を加えた。さらに１時間
２８℃に放置したのち、熱衝撃を加えた（通常は３７℃
、５分間）。最後に細胞を３＋０００　ｒｐｍで２分間
遠心分離し、水に再懸濁し、適当なメジウム上に置（。

ｐＬＤ　２８の構築 ＰＬ、Ｄ　２５およびＹＥＰ　２４　（ＡＴＣＣ３７０
５１）各２μｇの混合物を、８ａ’ｌ　Ｉ緩衝液５０μ
ｌ中、Ｓａｌ　Ｉ　６．２５単位とともに、６７℃で１
．５時間インキュベートした。消化物を等容のフェノー
ルで１回、エーテルで３回（１，５ｄ）抽出した。これ
に食塩と無水エタノールをそれぞれ濃度が０．１Ｍおよ
び７０％にするのに十分な量加えてＤＮＡを沈殿させた
。ＤＮＡを取り出し、等容のＴＥ緩衝液に処理した。所
望の組換えプラスミドの選択は、以下の方法に従ってＥ
、　ｃｏｌｉ　ＤＢ　６５０７を形ｌｊ［転換して実施
した。すなわち、形質転換混合物を、スレオニン、プロ
リンおよびロイシンを含み、ウラシルを含まない１１　
Ｂ、　００１１合成培合成板上に置いた。平板１個に１
００個以上のコロニーが得られた。生成した形質転換体
はロイシン欠乏平板を用いたレプリカ法で検査し、各シ
ラスミド上のＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉａａ　ＬＥＵ　２
遺伝子の存在を調べた。ロイシンを添加しないで徐々に
生長させたこれらのコロニーヲアンビシリン平板上で単
一のコロニーに画線し、テトラサイクリンに対する感受
性を試験した。アンピシリン抵抗性、テトラサイクリン
感受性の２４個のコロニーをプラスミド微量製造に用い
た。ゲラスミ−ＤＮＡ製品を８ａ’ｌ　Ｉ消化によって
期待される２個のパンＩＰ　（ＹＥｐ　２４からの７．
５　ｋｋ＋とＬｇＵ　２からの５．３　ｋｂ）およびｇ
ｃｏＲＩ消化によって期待される５個のバンドを調べた
（第６図）。２個のプラスミドは適当なパターンを示し
た。最初のグラスミドを集め、Ｔ）ＬＤ２８と命名した
。

ＬＩＣＵ　２セグメントを有するシラスミー１）ＬＤ　
４０の構築 約２５μＩのｐＬＤを２００μｌ中、２０単位の制限酵
素で処理して、ＰＬＤ　２５の部分ＥｃｏＲＩ消化を行
い、９．１２．１５．１８および２１分後にサンプルを
採取した。各時点で総容量の２０チを、３５　ｍＭ　Ｆ
ｉＤＴＡ含有（希釈後）ゲルサンプル緩衝液にとり、反
応を停止させた。各時点をｒル上で追い、所望のバンド
（２，３ｋｂのｌａｍｂｄａ　Ｈｌｎｄ　ｌサイズ標準
よりもわずかに遅く移動）をカミソリで切り取った。バ
ンドを透析袋中で電気溶出し、ミ二カラム（８ｃｈｌθ
１−Ｃｈｅｒ　＆　８ｃｈｕｅｌｌ　ｇｌｕｔｉｐ　Ｄ
　）を供給会社の指示に従って用い、精製した。ＬＫＵ
２含有バンドのクローニングに使用したベクターは、Ｅ
ｃＯＲＩ消化、バクテリアアルカリホスファターゼ処理
ｐＢＲ５２２であった。ベクターと挿入ＤＮＡをＴ４　
ＤＮＡリガーゼと合し、得られた混合物をＥ、　ｃｏｌ
ｉＭｃ　１０６１株のアンピシリン抵抗性への形質転換
に使用した。シラスミドの微量製造後、ｇｃｏＲＩ制限
酵素で消化して試験した。最初の明細書の浄１（内容に
変更なし） ３４個の輿品中、４個が所望の挿入体を含んでいた。各
プラスミド中での挿入体の方向性を試験するため、Ｈｌ
ｎｄｌ［およびＸｈＯｌ　（二重消化を行った。

３個がｐＬＤ　４０　（第７図］と同じ方向性を示した
。

これらのプラスミドの２＠をＡ、　ｃｏｌｌ、ｒｅ　−
５５５の形質転換に用い（ＭＣ１０６１中で大規模生産
後）　、Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＬＥｊ［Ｊ　２
遺伝子の表現を試験した。驚くべきことに、ｐＬＤ　４
０ン含む形質転換体ハロイシンを含まないメジウム上で
も生育した（　ｐＬＤ　２５またはｐＬＤ　２８を含む
形ＪＲ転換体よりも良好〕が、ｐＬＤ　４　ｌを含む形
ＪＪ！Ｌ転洪体はロイシンを銑加しないと生育しなかっ
た。こり実験のバクテリア完全培地は５６／２＋ビタミ
ンＢｌ、グルコース、ヒスチジン、アルギニノ、メチオ
ニン、ロイシンおよび２０μｆｉ／Ｒｅのアンピシリン
であった。ｐＬＤ　Ｊ　Ｑ中でのＬＪＵＵ　２遺伝子の
転写はスチューバ−（＋３ｔｕｂｅｒ　）とブシャール
ド（Ｈ，Ｂｕｊａｒｄ）（１９８Ｌ　ゾロシーディング
　ンサイエテイーナショナル　アカデミ−オグ　サイエ
ンス（Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｂｃｉ）　、　７８　：　１６７〜１７１　）＆Ｃよ
って報告された反時計回りのプロモーターによってプロ
モートされると結論された。

明細書の浄似内容に変更なし） ＬＢｏ　２遺伝子のｐＬＤ　２５およびｐＬＤ　２８内
での低いバクリア性衆現（ｐＬＤ　４０　Ｋ比べてすは
、Ｈ℃・バクテリアプロモーターとして作用ブるＹ、　
１ｉｐＯ−１ｙｔｉｃａ　ＤＮＡのセグメントから生じ
るものである。

よる形質転換 ドウジーウＡ　（Ｊ、Ｒ，ＤｅＺｅｓｕｍ）によつｉｍ
築をｐＬＤ　２５　＆Ｈクローン化されたＬｎｕ　２逼
広子の受容様として用いた。生長後期での培養が、対数
期初期の細胞より高い形質転換頻度ン与えることがわか
った。この所見は、はぼ同絃の初期および後期対数期細
胞を別（Ｍ　ｉｃ　ＤＮＡで処理し、ロイシン欠乏平板
Ｋｍいたとぎにも確認された・Ｙ、　１ｉｐｏｌｙ−ｔ
ｉｃａ　ＤＮＡを独特の制限部位で切Ｗ「するかまたは
小さな切れ目（Ｂａｌ　ｌ切断）％Ｉ０：！！４すこと
Ｋよって直線化プラスミドとすると、完全なｐ］、ＬＤ
２５またはＨｌｔｏｌ　ｌ［制限酵素で切断して直線化
し７こプラスミドよりもはるかに形質転換頻度が鳥い。

この結果は０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ ら（前出）によって開発されたＳ、　ｃｅｒθｖｉθ１
ａθにおける組込み形質転換システムと類似している。

形質転換に使ったｐＬＤ　２５に超音波処理Ｅ、　ｃｏ
ｌｉＤＮＡを添加すると、もつと高分子のＤＮＡを加え
たかあるいはキャリヤーＤＮＡを加えなかったときに比
べて形質転換頻度は高い。細胞をＤＮＡやポリエチレン
グリコールとインキュベートしたのちの熱衝撃の持続や
温度を少し変えても、形質転換体の収率にはわずかな影
響がみられたにすぎなかった。

有する形質転換体（本明細書ではＤＬ　１０と呼ぶ）の
コロニーをＹＰＤ平板上、１個のコロニーずつに画線し
、ついでＹＰＤ平板上非選択生育させた。生じたＹＰＤ
培養平板をロイシン欠乏合成メジウム上に転写した。約
５０個の完全に分離されたコロニーはすべてロイシンに
独立で、形質転換体は安定なことが明らかにされた。

ロフト Ｙ、　１ｉｐＯ１ｙｔｉｃ＆の形質転換体は安定で、形
質転換頻度も受容体シラスミドＤＮＡの直線化によって
著しく上昇する。これはＯｒｒ　−Ｗｅａｖｅｒら（前
出）によりＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓ１ａｅシステムに発見
されたようＫ、形質転換体は受容体ＤＮＡの末端に相同
な部位で染色体ＤＮＡにプラスミドが組込まれて生じた
ことを示している。Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮ
ＡのＨｌｎｄ　１消化体のすず−ンプロット実ｗｋ（第
４図）では、完全または直線化シラスミドのいずれから
生じた形質転換体にもｐＢＲ３２２と相同の同じ２つの
バンドがみられた０１つのバンドは２３　ｋｂ　ｌａｍ
ｂｄａサイズ標準より太きいという所見は、染色体ＤＮ
Ａへのプラスミドの組込みの証拠である。

ベクターｙｇｐ　２４　（Ｂ’ｏｔｓｔｅｉｎら二ｏｅ
ｎｅ　＋　８二１７〜２４．１９７９）を、ｐＢＲ３２
２Ｋついて前述したと同様１ｃ　Ｂａｍ　ＨＩで消化し
、アルカリホスファターゼで処理した。結合反応に用い
た挿入明細書の浄ｖＪ（内容に変更なし） Ｙ−１０９４から得られたＹ、　１ｉｐｏユｙｔユｃａ
染色体ＤＮＡの完全Ｂａｎ　Ｈ工消化体であった。染色
体ＤＩ＝ｌＡ消化は、結合前忙大きさＫよる分ｉ［１１
１化を行わず、フェノール抽出のみを笑顔した。結合生
成物を用いて、Ｂ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１のアンピ
シリン抵抗性形質転換体コロニーが８１約２７．ｌＪ　
ｏ　０個潜られた。これらのプールされた形質転換体コ
ロニーの培養から得られたプラスミドＤＮＡはＹａｐ　
２４中のＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　Ｂａｍ　ＨＩ　
断片のライブラリーと命名した。挿入頻度は９５％と評
洒され（１９／２０の形質転換体がテトラサイクリン晟
受注であった〕、平均挿入サイズは４．２１ｃｂであっ
た。

Ｈ工Ｓ工遺云子の単離 突然変異Ｅ、　ｃｏ１１遺伝子を相補するＹ、１ｉｐＯ
１７−ｔｉｃａ迫阪子の発見を試みて、ＢａｍＨエライ
ブラリ−を多くの異なるＢ、　ｃｏｌｉ栄誉累要求株の
形翼転換ニ用いた。Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｈｉｓ　Ｇｉ突然
変異体ＡＴ　２５３５（大腸函遺伝子貯蔵センター（Ｅ
、　ｃｏｌｉ　ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ　Ｃ’ｅｎｔ
ｅｒ　）　、Ｙａ１θ大学で＄４５１７として得られる
ノの２種の形ｊｘ転換体のコロニーがヒスチジンを欠き
、アンピシリンを 含む合成メジウム上に単離された。いずれのコロニーも
同じシラスミドｐＬＤ　２１を含み、これはベクター内
に約４　ｋｂの挿入部を形成していた。再形質転換試験
は、ＡＴ２５３５のアンビンリン抵抗性形質転換体と、
レプリカ法でヒスチジン独立と評価されたｐＬＤ　２１
とで４１９／４１９場性で、％ツた。すず−ンハイブリ
ダイゼーション実験では、ＰＬＤ　２１中のＢａｍ　Ｈ
Ｉ挿人体もＢａｍ　Ｈｌ　＋　Ｅｃ。

Ｒに重油化により生じた２個の挿入体断片も、同様にし
て切断したＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮＡと
一緒に移動した。

ｈｉｓＧの他の対立遺伝子がｐＬＤ　２１によって相補
されるかどうかを試験するために、ＨＩＳＧ遺伝子への
Ｔｎ　１Ｑ挿入体を含むＥ、　ｅｏｌｉ　ＮＫ　−５５
２６株（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　
Ｃｅｎｔθｒ＋６４１６）をシラスミーで形質転換した
。すべてのアンピシリン抵抗性形質転換体コロニーは、
レプリカ法についでヒスチジンを含まないメジウムでの
遅い生育が可能であった。これは、ヒスチジンオペロン
の下流遺伝子に対するＴｎ　ｉ　Ｑの極性効果から期待
されたとおりであった。ヒスチジンを欠き、アンピシリ
ンを含まないメジウム上での形質転換体の直接選択は不
可能であった。多分、強い極性効果によるものと思われ
る。ｐＬＤ　２１へのＹ、　１ｉｐｏ−１ｙｔｉｃａ　
ＤＮＡ挿入はＥ、　ｃｏｌｉのｈｉｓ　（）突然変異な
相補することができ、それがＥ、　ｃｏｌｉ内で機能で
きる形でＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＨＩＳＩ遺伝子
を含むものと結論された。

と独立に機能するかどうかを試験するために、Ｂａｍ　
Ｈｌ小片をＩ）ＢＲ３２２内にサシクローン化した。両
方向での挿入体をｇｃｏＲＩ消化パターンによって決定
した（第５図）。ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位のほか
さらに挿入体のＥｃｏＲＩ部位を持つシラスミド、シラ
スミドｐＬＤ　２３は前に用いた２ｓのｈｉｓ　Ｇ　Ｅ
、　ｃｏｌｉ突然変異株を相補したが、他の方向性では
突然変異株を相補できなかった０すなわち−Ｙ、　１ｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ　ＨＩＳＪ遺伝子のこのＢ、　ｃｏｌ
ｉシステムにおける効率的な発現には、グラスミド明細
書のｃＴ量書く内容に変更なし〕 上での配列が必要である。ｐＢＲ３２２のｔｅｔＲプロ
モーターが必要な因子であると考えられる。

５−３〜５．４　ｋｂのＳａｌ　ｌ小片（ｆラスミド消
化体からグル精Ｈａ）がＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　
ｌｅｕ　２突然変異受容株を高頻度で原栄賞体に形′Ｘ
転侠できることが明らかにされた（１μｇにつきｉ　０
　Ｌｌ　Ｏｉｂ以上の形質転洪体う。この組込みにより
、直厭化プンスミドでの形質転換から異種の凪俟え法が
提供さレル。それは、Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　Ｄ
ＮＡ　Ｏ）領域内Ｖｃｆ９＋望の配列を挿入し、また所
望の配列をバクテリアベクターに組込むことなく宿土に
組込むことをり能にする。この楓のシステムは、Ｓ、ｃ
θｒｅｖｉｓｉａθでロスシュタイン（Ｒ，Ｒｏｔｈｓ
ｔθ工ｎ）（酢免字における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ〕、ＩＬｌｌ：２０２．１９
８３．）Ｋより開発されている。

Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮＡプレバレージ
ョンは、高分子のものでも短（切断したものでも、ＬＥ
Ｕ２形ＩＪｉＬ転換体を得るために使用できる。

ＵＲＡ　３遺伝子のクローニング 第一工程はｐＬＤ　４０のＢａｍＨＩ　部位でのＹ。

１ｉｐｏ：Ｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡの８ａｕ　３　Ａ部分
消化体の遺伝子ライプラリ−構築である。これはｐＢＲ
３２２遺伝子ライゾラリーの構築九ついて前述した操作
によるＯ 高頻度の形質転換を達成し、またライグラ＋７−におけ
る分子なＬＥＵ２部位における組込み体に集中させるた
めに、ライブラリーＤＮＡを母体ベクター　ｐＬＤ　４
０のＬＥｅＵ　２領域で１個所だけ切断する酵素Ａｐａ
　Ｉで消化した（未知のＵＲＡ　３遺伝千日体がＡｐａ
　１部位を含むかどうかはわからないので、ライブラリ
ーＤＮＡのサンプルの部分Ａｐａ　ｌ消化も実施して、
そのように製造された分子では１個所だけで切断される
ことを確認した。しかしながら、部分消化は必要でなか
った。

を受容法とし、その培養ｇ、５０ＷＬｅを、ＹＰＤ肉汁
中、６００　ｎｍのＯＤが４．９になるまで生育された
。これは細胞の圧縮容量０．９１１１ｊ　Ｋ相当し、以
下、前述の形質転換プロトコールに従ってｐＨ７，５の
ＴＦｉ緩衝液で洗浄した。ついで細胞をＴｇ中酢酸リチ
ウムの２倍容に懸濁し、回転ｒラム上、６０℃で１時間
おだやかに混合し、ついで３本の形質転換管に分けた。

各管（１５−のコーニングポリスチレン遠沈管）Ｋ１細
胞懸濁液０．９ｄ１超音波処理、異種Ｅ、　ｃｏｌｉキ
ャリヤーＤＮＡ　３　Ｄ　ＯμＮ　（１００μｌ）およ
びＡｐａ　Ｉ処理ライブラリーＤＮＡ　６μ９をとった
。形質転換管を３０℃で６０分間インキュベートし、７
　ｗｔｌのＰＥＧ試薬（前述）と混合し、さらに１時間
インキュベートした。この管をついで、５７℃、１０分
間の熱ショックに付し、細胞を５．００　Ｏｒｐｍで２
分間遠心分離した。各管からの細胞を０．５扉ｌの滅菌
水に再懸濁し、ロイシン欠乏合成完全メジウムの１２個
の平板に置いた。

６日後に１合計約１０，０００個のコロニーがロイシン
欠乏メジウム上に生育した。形質転換実験に平行して行
った陰性対照板（ＤＮＡは用いず、はかは形質転換細胞
と全（同様に処理した）Ｋはロイシン独立コロニーの生
育は認められなかった。

６６個の形質転換平板をウラシル欠乏合成メジウムの平
板に転写した。ウラシル独立の唯１個のコロニーが翌日
認められた。このコロニーをさらに下記のように処理し
て、ＵＲＡ　５遺伝子を回収した。第２の形質転換は、
シラスミげを受けた細胞の第一選択（ロイシン独立）よ
りもウラシル独立の直接選択が所望の形質のスクリーニ
ングに先立ち可能かどうかを決定するため忙行われた。

この第２の実験は第１の実験九類似したが、形質転換Ｄ
ＮＡ　１μＩＫつきｓ、ｏ　ｏ　ｏ〜１０，０００個の
形質転換体が得られ、高頻度の形質転換が達成された。

この実験で、さらに３個のＵＲＡ、！ｌ形質転換体がウ
ラシル欠乏メジウム上での直接選択により、またさらＩ
／Ｃ１個がロイシン選択ついでスクリーニングにより得
られた。

ＵＲＡ３含有プラスミｌ’　ｐＬＤ　５５　ｆ）回収最
初のウラシル独立形質転換体のＹＡＰ培養５０−を−夜
生育させ、前述のフェノール−クロロホルムとプロテア
ーゼ法を用いて、ＤＮＡｆレパレージョンを収穫した。

この染色体ＤＮＡ　ｆレパレーション約６μ、Ｐ（７チ
）を酵素Ａｐａ　［で完全に消化し、ついでフェノール
、フェノール−クロロホルムおよびクロロホルム−イソ
アミルアルコールで抽出し、エタノールで沈殿させた。

このＤＮＡを総容量８０μ！中で’ｒ４　ＤＮＡ　＋７
が−ゼにより結合させた。この反応液１０μｌを用いて
、コンピテントＥ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１株１００
μ）をアンピシリン抵抗性に形質転換した。９個の形質
転換体からに、　ｃｏｌｉ　ミニ−プラスミド製造を行
い、制限解析に使用した。開裂可能なりＮＡを与えた７
個のプレバレージョンは酵素Ａｐａ　ｌおよびＥｃＯＲ
Ｉと同一の制限パターンを含んでいた（第８図）。２個
のプレバレージョンは酵素消化が可能なほど十分精製さ
れていなかったと考えれるが、他の７個と同様に移動す
る超コイル化グラスミドを含んでいた。

回収されたシラスミドはｐＬＤ　４０へのＬＥＵ　２挿
入体の特性を示す２個のＥａｏＲＩバンドと、さらに他
の３個のバンドを含んでいた。ｐＬＤ　４０中のＵＲＡ
６含有挿入体はＡｐａ　１部位を欠き、２個のＥｃｏＲ
Ｉ明細書の浄書（内容に変更なし） 部位を含んでいた。

このグラスミドが本当Ｋ　ＵＲＡ　３遺伝子を含むかと
５かを確認するため、再形質転換夾験を行った。

ミニプレバレージョンＡｐａ　ｌ消化体馨Ｙ、１ｉｐｏ
ｌｙ−ｔｉＣ＆受容体の形質転換に用いた。この形質転
換混合物の一部をつ之シル欠乏メジウム上に、一部ンロ
イシン欠乏メジクム上Ｖｃｆｆｉいた。各メジウムごと
に約１００個の形質転換体を持つプレートを他のメジウ
ムへのレプリカル−ティングのために選択した。ロイシ
ン選択コロニーばすべ℃ウラシル独立であった。篤くべ
ぎことに、ウラシル欠乏メゾタム上に選択されたコロニ
ーはｔｈはその手分だけがロイシン独立であった。後者
の結果は像的領域における形質転換ＤＮＡの分解および
修復に関するある仮説洗よって説明できるものと思われ
る（オール−ライ−パー（Ｏｒｒ　−Ｗｅａｖｅｒ　）
ら：酵素学ＶＣオける方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｇ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ八１０１　：　２２８．１９８６Ｖ
ｔ：おけるよ５Ｋ）ｏ”イシン独立形質転換体のすべ℃
がウラシルａ立でもあったことから、ＩＪＩＵ２領域に
おける７″ラスミドの組込みはｕｒａ　３突然変異を相
補し、ｐＬＤ５５と命名したシラスミドはＹ、　１ｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａの男椿６遺伝子を含むと結論できる。

（ＡＴＣＣ２０６８７）から、前述のフェノール−クロ
ロホルム／プロテアーゼ法によるが、以後の塩化セシウ
ム勾配の適用は行わないで、ＤＮＡを製造した。

このようＫして単離された数種の微生物のＤＮＡを酵素
Ｋｐｎ　Ｉ　（形質転換に用いたと同じ酵素）で消化し
、フェノールで抽出し、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆５ｃｈ
ｕｓｌｌ　ｇｌｕｔｉｐ−Ｄミ二カラムで精製しく製造
会社の指示に従い）、ついでＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪが−
ゼを用いて結合させた。両メジウム（１ゴ中ＤＮＡ　５
０μｙ以上）で、低濃度（１０μｇ／−以下）での結合
がそれに続（バクテリアの形質転換を成功させた。

結合混合物を前述のようＫしてＬ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０
６ｉ株のアンピシリン抵抗性への形質転換に用いた。

１０個以上のＬ　ｃｏｌｉ形質転換体が得られ、ミニシ
ラスミドの製造を実施した。これらの大部分は制限パタ
ーンがｐＬＤ　２５と同一のプラスミドを含有していた
。ｐＬＤ　２５のＫｐｎ　１部位に異なるＤＮＡ小片が
挿入されたものがわずかにあった。これらの異常小片は
、結合の間に直線化ベクターに挿入されたＹ、　１ｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡの異なるＫｐｎ　ｌ　；ｙラグ
メントと考えられた。

第２の実験はグラスミド１）ＬＤ　２８　Ｋ関するもの
ＡＴＣＣ２［１６８８株をＢｇｌ　１１切断ｐＬＤ　２
８で形質転換スるとＤＬ　１１株が生成し、これはロイ
シン欠乏合成メジウム上で選択された。ウラシル欠乏合
成メジウムに移すと生育はみられず（酵素定量試験θ１
ａｅＵＲＡろ遺伝子と同じ酵素なコーｒするから）、Ｓ
、　＋Ｊｒθｖ１ｓｉａｅ遺伝子は相当するＹ、　１ｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ突然変異を相補しなかったと考えられ
る。回収されるシラスミドが小さいＢｇＩ　ＩＩ断片を
欠（ので酵素Ｂｇｌ　ｌを用いたはかは前述のとおり処
理して、明細書の浄書（内容に変更なし） １１ｐｏｌｙｔｉｃａ　ＩＪＵ　２遺伝子が、Ｂｏｔｓ
ｔｅｉｎの研究室で構築され、プラスミドの宿主として
広く用いられ℃いる（たとえばグアレンチ（Ｇｕａｒθ
ａｔｅ　）およびプタシュネ（Ｐｔａｓｈｎｅ　）、１
９８１、プロシーディング　ナショナル　アカデミ−オ
シ　サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７８：　２１９９　）　Ｓ、　ｃ
ｓｒｅｖｉｓｉａｅでも機ｈヒできる７１’どうかＷＵ
験するため、ＤＢ７４５株（１ｏｕ　２−３．１　１　
２　ｕｒａ　３　−　５　２　ａｄｅｌ　−１００）　
（スロ　似の株はＡＴＣＣ４４７７３およびＡＴＣＣ４
４７７４として利用できる）をＩ）ＬＤ　２８で形質獣
侠し、ウランル欠乏メジウム上で選択した。Ｓ、　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換体をロイシン欠乏メジウムに
移した場合、ロイシンを添加しな（ても徐々に生育する
ことがわかった。１θｕ２をわずかに相補するｈＩｌ、
力に基づいて、ｓ、　ｃｓｒｅｖｉｓｉａｅ中のｐＬＤ
　２３をｌｉｔ接ｍ択することも９馳であるが、形質転
換体は２４〜４８時間後にはウラシル欠乏平板上よりも
ロイシン欠乏平板上に多（生じ、わずかに低い形質転ｍ
ｈ度を示した。すなわち、Ｙ、　：ｔｉｐＯ１３’ｔｉ
Ｃａ　ＬｎＵ　２　、＠　臥子は、Ｓ、Ｃθｒθｖｉｓ
ｉ＆θ中のこのマルチコピーシラスミド上にある場合も
、わずかではあるが機能で明細書の汀１出（内ｂ゛に変
更なし） きる。

Ｙ、　１ｉｐｏ１７ｔｊＪａ遺伝子を、Ｙ、　１ｉｐｏ
ｌｙｔｉｃａ内で機能するその遺伝子を探すことにより
ライブラリーから得る上述の方法の一般性は、Ｙ、　１
ｉｐｏｌｙｔｉｃａプロテアーゼ遺伝子およびＹ、　１
ｉｐｏ１７ｔｉｃａアデニン遺伝子の形質転換成功例か
らもさらに明らかである。

前述のｐＬＤ　４０に基づくライブラリーと本発明のシ
ャトルシステムン用いて、Ｙ、　１ｉｐｏユｙｔｉ（！
＆プロテアーゼ造臥子（ＸＰＲ２）のクローニングに成
功した。使用した方法は、ＵＲＡ　３のクローニングに
ついて前述した方砥とはぼ同じである。ＸＰＲ２は分泌
されるアルカリプロテアーゼ“の＃ｊ造退臥子である（
シムス（５１ｍ５　）およびオシリゾアク（Ｏｇｒ７ｄ
ｚｉａｋ）：ジャーナル　オシ　バクテリオロシー（Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ’１．）ｌ　１４５　：　４　Ｃ
１４，１９８１）、）Ｊｔ′ｍ的マーカマ−カー１ｅｕ
ａｄｅｌおよびｘｐｒ　２を含むＹ、　１ｉｐｏ１７ｔ
ｉｃａの受容株を標準遺臥子技衝忙よって構築した（オ
シリゾアク（Ｏｇｒ　−ｙｄｚｉａｋ　）ら：モレキュ
ラー　ジエネ　ゾエネテイクス（Ｍｃｌ、　Ｇｅｎ、　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）、１６３　：　２２９．１９７８
）。ｌｅｕ　２突然変異株については本明細書に述べた
。各種のｘｐｒ　２対立遺伝子お明細シーレノＣ０、’
　Ｌｊ　、ｌ　’Ｌ　−ニー変更なし）よびａｄｅｌ対
立遺伝子はＯｇｒｙｄｚｉａｋ　Ｋよって寄託されたＡ
ＴＣＣ４６０２６〜４６０２８号および４７５０６７〜
４６０７０から利用できる（　５１ｍ８およびＯｇｒｙ
ｄｚｉａｋ　１前出参照）０パーカー（ＲｌＰａｒｋｅ
ｒ　）らのエチジウムプ０マイト部分消化法（プロシー
ディング　ナショナルアカデミ−オブ　サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｃｌ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　７４　：　８５
１．１９７７）に従い、酵素Ｂｇｌ　Ｔｌを用いてライ
ブラリーを処理した。Ｂｇｌ　’ｆｌ酵素の適当量を決
定するため、エチジウムブロマイドおよび使用するＤＮ
Ａを、エチジウムブロマイドは濃度筒１１４４Ｄ、００
５から１μｇ／μｌとし、１管中には酵素４単位を含む
１０μｌをライブラリーＤＮＡ約１μｓと使用した。イ
ンキュベーション時間は５７℃で１時間としたつ約０．
５μｇ／μｌのエチジウムプロマイｒを含む管で、ライ
ブラリー中のシラスミドの直線化が最大となり、分子あ
たり２個以上の切断が行われたことを示す小さな断片の
産生もなかった。各成分をこの割合でスケールアップし
て形質転換のためのライデンＩＪ　−ＤＮＡを製造した
。ライブラリーＤＮＡのこの処理により、標的組込み部
位（ＬＥＵ　２領域）明細書のｒ′Ｉ＋告−（内容に変
更ないおよび所望の未知遺伝子（ＸＰＲ２）の両者が、
直線化に用いられる酵素（Ｂｇｌ　ＩＩ　）に対する部
位をもっていたならば生じるであろう問題が回避される
。このように処理したＤＮＡから得られる形質転換体は
、デノムのＬＥＵ　２またはＸＰＲ２いずれの領域にも
組込まれることになろう。前述したと同じ形質転換法を
用い、ロイシン欠乏合成メジウム上に８０，０００個以
上のコロニーが得られた。これらをスキムミルクインデ
ィケータ−平板にレプリカ法で転写した（オグリジアク
（Ｄ、　Ｏｇｒｙｄｚｉａｋ　）ら；ジ１ネテイクス（
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）、８７：６２１゜１９７７）。プ
ロテアーゼ陽性形質転換体が、スキムミルク平板への透
明ゾーンの形成により６（ｆ＋８された。

さらに、Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａのアデニン遺伝子
が相補性によってクローニングされた。二重突然変異受
容株（ｌｅｕ　２　ａｄｅｌ　）を上述のように形質転
換し、ロイシン独立コロニーをＡＤＥ　１を選択するた
めのメジウムに転写培養した。ＡＤＥ　１含有シラスミ
ドが形質転換体から回収され、再形質転換によりそれが
確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、粒子構造を示す写真であってと’１ｉｐｏｌ
ｙｔｉ　Ｃａ遺伝子の８ａｕ　３　Ａ部分消化した断片
をＩ）ＢＲ３２２Ｋ結合させた遺伝子ライブラリーのア
ガロースデル電気泳動図（ＬＩＢ　）であり、第２図は
、粒子構造を示す写真であって、ＥｃｏＲＩで消化した
Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａバルクＤＮＡと放射性ｐＬ
Ｄ２５でプローブとしたｐＬＤ　２５によるサデーンノ
＼イゾリダイゼーションを行い、その電気泳動分画であ
り、第６図はｐＬＤ　２５の制限酵素地図であり、第４
図は、粒子構造を示す写真であって、Ｈｉｎｄ■で消化
したＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａバルクＤＮＡと放射性
１）ＢＲ３２２ゾローデとのサデーンハイプリダイゼー
ションを行い、その電気泳動分画であり、第５図は、粒
子構造を示す写真であって、ｐＬＤ２３およびｐＬＤ　
２４の制限消化体の電気泳動分画であり、第６図はｐＬ
Ｄ　２８の制限酵素地図であり、第７図はｐＬＤ　４０
の制限酵素地図であり、第８図は粒子構造を示す写真で
あって、ｐＬＤ５５の制限消化体の電気泳動分画をｐＬ
Ｄ　４０の場合と比較して示した図である。 代理人　浅　村　皓 手続補正書（方式） 昭和／；ρ年ｑ月ニジ日 特許庁長官殿 １゜事件の表示 昭和ｒ９年特許願第Δり９９１＞Δ　号２゜発明の名称 シψζり一２イア・　１ノ爪°リテイノフａ＞４ぞ４睡
（トチカブデシ２！３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和６Ｑ年３月Ｊイ１日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図　面（ｔ、１．ｔａ、ｒβゼ田■） ８、補正の内容　別紙のとおり 方式　−・。 ■−の浄書　（内容に変更なし）ｌＪＸ　Ａ　ｉ　”　
’図面の浄書（内容に変更なし） ８ し４曲の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、４ 王 ＦＩＧ、　６ ＦＩｏ　７ Ｓ　Ｓ Ｔ　Ｔ ＤａｂｃｄｅｆＤ ＦＩＧ、　８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ヤロウイア・９？リテイカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ
   １江麹±」、以下−Ｘ２−月」旦すＮ復Ｖ−と略す）に
   相同の領域と検出可能な遺伝的マーカーからなるＤＮＡ
   をＬ−リ」ユリ３１ｃａ　Ｔｉｃ導入することを特徴と
   するＹ、　１ｉｐｏｘｙｔｉｃａの形質転換方法（２１
   ＤＮＡはＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡの断片か
   らなり、そのＤＮＡはＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内で
   検出できる特許請求の範囲第１項記載の方法 ｆ３１　ＤＮＡはＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡ
   の断片を含むベクターである特許請求の範囲第２項記載
   の方法（４）　ベクターは自律的複製を行う大腸菌（Ｅ
   ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、以下ｇ、ｃｏｌｉ　
   と略す）プラスミドであってＹ、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ
   　ＤＮＡ断片を含み、その断片はＹ、　１ｉｐｏｌｙｔ
   ｉｃａ内で生理的に機能する遺伝子を有する特許請求の
   範囲第６項記載の方法（５ｊ　Ｙ−工匠江見」％＠　Ａ
   ＴＯＯ２Ｑ　６８８　（７）鑑別特性を有するＹ、　１
   ｉｐｏｌｙｔｉｃａである特許請求の範囲第１項記載の
   方法 （６）　Ｙ、　１ｉｐｏ１７ｔｉｃ＆の染色体ＤＮＡに
   相同の領域と検出可能な遺伝的マーカーからなる、−彫
   ユｃｏｌｉ内で自律的複製を行うベクター （７）　Ｌ　Ｃ０１ｉプラスミドのＤＮＡとｂ品ｐｏｌ
   ｙｔｉｃａの染色体ＤＮＡからなり、その染色体ＤＮＡ
   はと１１ｐｏｌｙｔｉｃａ内で検出できる選択可能な遺
   伝的マーカーを有する、自律的複製を行うＥ、−ｃｏｌ
   ｉベクター （１３１Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮＡは、Ｊ、
   −叩逗およびＬｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内のいずれでも機
   能する遺伝子を含むＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＤＮ
   Ａ断片からなる特許請求の範囲第７項記載のベクター はＵＲＡ　３遺伝子を含む特許請求の範囲第９項記載の
   ベクター ドｐＢＲ３２２からなる特許請求の範囲第８項記載のベ
   クター （Ｉｌｌ　第２図の制限酵素切断地図によって特徴づけ
   られるプラスミドｐＬＤ　２５ （Ｊ’Ｊ　（ａ）７’うｘミｒｐＢＲ３２２を制限酵素
   忙より直線化し、（ｂ）直線化されたｐＢＲ３２２をＹ
   　、１ｉｐｐｌｙｔｉｃａに相同の領域と検出可能な遺
   伝的マーカーからなるＤＮＡ　［結合させ、（ｃ）　Ｌ
   　ｃａｄｉ突然変異株を工程＋１））の生成物により、
   機能性Ｙ、　１１ｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子を検出するた
   めに形質転換することを特徴とするＹ、　１ｉｐｏｌｙ
   ｔｉｃａ形質転換ベクターの製造方法Ｑ３１　選択可能
   な遺伝的マーカーに相当する遺伝子に突然変異を有する
   Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ内に特許請求の範囲第６項
   記載のベクターを含む形質転換体０滲　寄託受付番号Ａ
   ＴＣＯ２０６８８のＹ、１１ｐｏ１ｙｔｉｃａ内に特許
   請求の範囲第１１項記載のベクター、ｐＬＤ　２５を含
   み、ＡＴＯＯ２０６８８（１’）鑑別ｅ性ヲ有する形質
   転換体 Ｑ！９　、に、　ｅｏｌｌ　Ｊ　Ｏ−３５５内に特許請
   求の範囲第１１項記載のベクター、ＰＬＤ　２５を含み
   、ＡＴＯＯろ９４６４の鑑別特性を有する形質転換体（
   ｔｅ　第６図の制限酵素切断地図によって特徴づけられ
   るプラスミドｐＬＤ　２８ αη　第８図の制限酵素パターンによって特徴づけられ
   るプラスミＦ　ｐＬＤ　５５ αυ　Ｂ、　、ｃｏｌｉ内に特許請求の範囲第８項記載
   のベクターを含む形質転換体 ＱＩ　Ｙ、１ｉｐ０１ｙｔｉｃ＆内に特許請求の範囲第
   １７項記載のベクター、ｐＬＤ　５５を含み、ＡＴＣ＋
   ０２０７１８の鑑別特性を有する形質転換体 （イ）第７図の制限酵素切断地図によつ゛Ｃ特徴づけら
   れるプラスミドｐＬＤ　４０ ＋２１）　Ｙ、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａに相同の領域と検
   出可能な遺る突然変異体の（■補による遺伝子クローニ
   ング方法 （２邊　Ｙ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａは選択可能な？−
   カーＫｍ当する遺伝子に突然変異を有する特許請求の範
   囲第２１項記載の方法 （ハ）突然変異はＹ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａのＩＪＵ
   　２またはＵＲＡ　３遺伝子内にある特許請求の範囲第
   ２２項記載の方法 Ｃ’４１　ＡＴＯＯ２０６８８の鑑別特性を有するＹ。 １１ｐ０１ｙｔｉｃａ ＠　Ｙ、１１ｐＱｌｙｔｉＱａ　２　Ｑ　６８８