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JPS60164497A - 臨床試料中の微生物の迅速検出方法 - Google Patents

臨床試料中の微生物の迅速検出方法

Info

Publication number
JPS60164497A
JPS60164497A JP60005622A JP562285A JPS60164497A JP S60164497 A JPS60164497 A JP S60164497A JP 60005622 A JP60005622 A JP 60005622A JP 562285 A JP562285 A JP 562285A JP S60164497 A JPS60164497 A JP S60164497A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sample
composition
microorganisms
staining
medium
Prior art date
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Granted
Application number
JP60005622A
Other languages
English (en)
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JPH0655157B2 (ja
Inventor
ジエームズ・デイー・マンソー
トーマス・エツチ・シユルト
バーノン・アール・ニース
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Becton Dickinson and Co
Original Assignee
Becton Dickinson and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Becton Dickinson and Co filed Critical Becton Dickinson and Co
Publication of JPS60164497A publication Critical patent/JPS60164497A/ja
Publication of JPH0655157B2 publication Critical patent/JPH0655157B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
    • C12Q2304/10—DNA staining
    • C12Q2304/12—Ethidium

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  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物の検出に関する。より詳細には本発明は
試料中の他の成分の溶解（ｌｙｓｉ日）を起こす試薬で
試料を処理してその微生物のみが、染色される状態にし
たのち微生物を染色することによる、体液中の微生物の
検出および計数法に関する。
健康な個体においては大部分の体液、たとえば血液、髄
液または滑液は無菌であり、これらの体液中に微生物が
存在することは健康上の問題２示し、ある場合には生命
ンおびやかす可能性がある。
血液感染の効果的治療には早期診断が必要であり、病原
体が正確に同定されるまでは適切な治療を開始Ｊ−るこ
とかできない。これは感染の初期の段階では血液中の病
原体の濃度がきわめて低いため、著しく困難である。
これに対し尿は無菌的な液体ではなく、健康な人々にお
いてすら常に微生物が存在する。それにもかかわらず尿
路感染症（一般に細菌尿症と呼ばれる）は重大な健康上
の問題であり、尿のどのような微生物水準が感染２示し
、どのような水準が正常であるかについてはかなりの論
争がある。一般の尿分析法乞考慮したこの問題に関する
論評はｙｔ？ｏツク（Ａｎｌ、Ｊ　、Ｍｅｄｉａｉｎｓ
、　１９８３年６月２８日）により提示されている。
血液中の微生物を検出するためには、種々の系が提供さ
れている。２方法が現在病院内の微生物学研究室で採用
されている。一つは、増殖培地に患者の血液を接種し、
増殖を示す懸濁の増加を一定期間にわたって監視する、
一般的な血液培養法である。懸濁を生じる増殖に必要な
期間が長いことが著しい欠点である゛。ある遣の微生物
は混濁により検出するために７日に及ぶ日数を必要とす
る。
病院で採用される第２の方法は、放射性同位元素（”Ｃ
）　）５識された栄養源が微生物の増殖により１４Ｃ標
識−ＣＯ２に変換されるのを上部空間のガス中で監視す
る、自動放射性同位元素検出法である。
この方法は陽性の血液培養物の３０係を１２時間以内に
、７０チを２４時間以内に検出することが示されたが、
これも検出のために増殖に依存している。検出は一般的
な培養法を用いた場合よりも速かに達成されるが、１２
〜２４時間という期間は病原体の迅速な検出が重要であ
る場合にはなお著しい欠点である。
敗血症または菌血症の迅速検知のために他の方法も提案
されている。ある方法では可能な限り十分に血球成分を
微生物から分離除去するために各種の濃度勾配が用いら
れた。これらの方法の一例は米国特許第４，１３１，５
１２号明細書（ドルン：Ｄｏｒｎ）に記載されたもので
あり、その場合溶解した血液試料を高濃度の液状クッシ
ョン剤（ｃｕｓｈｉｏｎｉｎｇａｇｅｎｔ　）上に乗せ
て遠心分離し、クッション剤と試料の界面に病原性微生
物２集める。集められた微生物を次いでクッション剤か
ら分離してコロニー形成のため各種の栄養寒天平板上で
培養する。
細菌尿の検出のために臨床研究所で現在用いられている
方法（一般に１×１０５コロニー形成単位／　ｍｌ　（
ｃｆｕ／＋＋＋Ａ’　）以上の尿中微生物濃度として規
定）も増殖に基づく方法である。これらの方法では尿の
サンプルの一定量（通常は１〜１０μｅ）を種々の型の
寒天培地の表面で１８〜２４時間培養し、コロニーな計
数する。これらの方法は培養に要する時間および最終的
に陰性であると証明された試料に費した材料費で欠点を
もつ。
血中および尿中の微生物の検出には双方とも染色法も用
いられ、種々の標準試薬、たとえばダラム、ライト、シ
ェンナーーギームザ、シイクユマン、またはメイーグル
ンワルドーギームザなどの染色法が用いられている。尿
試料に関しては、これらの方法は遠心分離されていない
ダラム染色されたスミアと有意の細菌尿との間に高い相
関を示した。陽性のダラム染色を伴う尿検体の約９０％
か１０　ｃｆｕ／ｍ１以上をもつ。さらに、採取と検査
の間の間隔が過度に長くならない限り、尿分析に用いた
遠心分離された湿潤標本上の細菌の存在との間にも高い
相関がある。これらの方法はグラム陰性菌感染症に関し
ては良好であるが、　１０’ｃｆｕ、／　ｍ１３　の水
準または症候性患者においては１０２〜１０　’　ｃｆ
ｕ　／ｍｌの水準で有意と思われるグラム陽性菌感染に
対しては十分ではない。
米国特許第４，０２５，３０６号明細書（スチューダー
：　５ｔｕｃｌθｒ）には血中のミクロフイラリアをホ
ルムアルデヒドによる血球の溶解、非螢光色素による染
色、および鏡検によって検出する方法が記載されている
、これらの生物は体腔および体液を冒す糸状虫の前幼虫
段階であり、本質的に単細胞性である微生物とは異なり
多細胞性である。
螢光鏡検法が安価な染色法に関する各種の報告書に採用
されている。たとえばアクリジンオレンジが血液および
尿道分泌液を含む各種の臨床試料において細菌な選択的
に染色するために用いられＣいる（Ｌ、Ｒ，マツカーシ
ー（ＭｃＣａｒｔｈｙ）　およびＪ、Ｅ。
センネ（Ｓｅｎｎｅ）、Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂ、
　１１　２８１　（１９８０）　ｓＧ、クロンヮル（Ｋ
ｒｏｎｖａｌｌ）およびＥ、マイン（Ｍｙｈｒｅ）　、
　ＡｃｔａＰａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂ、　５ｃａｎｄ　１
３５．２４９（１９７７））。臭化エチジウムは真核細
胞および原核細胞の双方ン染色するために広範に用いら
れている。しかしこれらの方法は微生物のみでなく、白
血球ならびにある程度他の血液成分（たとえば血小板お
よび赤血球）をも染色する。これらの染色された他の物
体があるため、微生物（これらは普通は少量で存在する
）の存在を確認するのが困難になるだけでなく、微生物
と他の染色された白血球成分および残肩とを区別するこ
とも困難になる。
、従って、血液試料および尿試料中の微生物の迅速検出
のためのより良い方法がめられている。
本発明は１０１ＶＡ／ｍｌ　（試料）程度の低い濃度で
約２時間以下の期間、しばしば４５分以内で微生物化検
出する方法を提供することによりこの要求２満たす。こ
れは検出限界が細胞約１０，０００個／ｍｅである既知
の染色法に比して実質的な改良である。
本発明によれば、試料中に存在する他の成分（たとえば
血球成分）の溶解を起こさせる試薬で試料欠処理したの
ち螢光色素で染色することにより体液試料中の微生物を
検出することかできる・（ここで用いられる溶解という
語は細胞乞化学的環境の変更により、または特定の試薬
により分解させることを意味する。）本方法は大部分の
微生物に適用できる。微生物は染色される唯一のもので
あり、検出を一般の培養法または染色法によるよりもい
っそう速かに行うことができる。
ある種の試料に関しては、溶解した試料につき直接に染
色暑行うことができる。試料中の計数がきわめて低い他
の試料に関しては、短時間もしくは限定的増殖を行って
もよい。この実施態様に関しては溶解剤を増殖後に添加
してもよく、溶解剤を増殖培地と組合せた組成物乞用い
てもよい。試料がこの組成物に添加された場合、微生物
の増殖および試料成分の溶解が同時に行われる。
従って本発明の目的は、体液試料中の微生物を迅速に検
出することができる方法ン提供することである。本発明
の他の目的は、結果が約４５分以内に得られる方法を提
供することである。さらに他の目的は、体液中にきわめ
て低濃度で存在する微生物を限定的増殖ののち、試料中
の他の成分を同時にまたは続いて溶解させて検出するこ
とができる方法を提供することである。さらに他の目的
は増殖培地および溶解剤からなる、同時増殖および溶解
のための組成物ケ提供することである。さらに他の目的
は、医師が正常であるかまたは感染症であるか欠判断で
きる、尿試料中の微生物の定量的計数法を提供すること
である。本発明の他の目的は、好気的条件下での増殖の
ために１１１６１の容器、および嫌気的条件下での増殖
のために第２の容器を必要とする一般法゛に比して、試
料の分析に１個の容器のみを必要とする体液試料中の微
生物の検出法を提供することである。さらに他の目的は
、体液試料において放射性同位体成分を使用せずに微生
物化検出できる方法ン提供することである。
本発明方法によれば、試料を溶解剤で処理して。
染色されこれにより微生物の計数を妨げる可能性のある
他の試料成分を分解させたのち螢光色素で染色すること
により、体液試料中の微生物が検出される。本発明によ
り検出できる微生物には下記のものが含まれるがこれら
に限定されるものではない。黄色プトリ球菌（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、゛大腸菌（＆
ｃ１１ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、大便連鎖球菌（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｅｃａｌｉｓ）、表皮ブ
ドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｌｅｒ
ｍｉｄｉｓ）、奇怪変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍ１ｒａ
ｂｉｌｉｓ　）　、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｅａ
θｒｕｇｉｎｏｅａ）、バクテロイデス・フラギリス（
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、肺炎桿
菌（Ｋｌｓｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎ　ｉａｅ　）
、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｅｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａｅ　）および髄膜炎菌（Ｎｅｉｅｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｌｉｓ）。検出および計数すべき微生
物は体液、たとえば血液、尿、髄液、滑液、膨水なとい
ずれの中に存在してもよい。
本発明の種々の特色を示すのに適した体液試料・ま、染
色されこれにより検出される微生物を体液に溶解および
染色の前に供給することによって供給できる。微生物は
いずれかの適切な培地（たとえばトリプチケース大豆肉
汁培地）において増殖させ、対数増殖期に取出すことが
できる。約１０３〜１０８　個、好ましくは約１０６個
の量の細胞を塩溶液で洗浄し、標準塩溶液に懸濁し、懸
濁液を微生物細胞ｔｄ　？＠液１容量部および試料約５
〜約１００容量部の比率で十分に混和する。好ましくは
ｌ容量−の懸濁液を使用する。血液試料を用いる場合、
全面、または抗凝血薬、たとえばへ・リン、エチレンジ
アミン四酢酸（以下ＥＤＴＡと呼ぶ）で、もしくはポリ
　アネトール硫酸ナトリウム（以下ＳＰＳと呼ぶ）で前
処理した全血を用いることができる。
次いで微生物と試料液の混合物を溶解剤で処理する。溶
解剤は試料中の他の成分の溶解が、溶解により生じる残
層が約０．２ミクロン以下、好ましくは約０．１ミクロ
ン以下の最大粒径なもつように制御された様式で行われ
るように選ばれる。同時に溶解は検出されるべき微生物
までも溶解するほど苛酷なものであってはならない。王
としてプロテアーゼ活性をもつが若干のヌクレアーぜお
よびリパーゼ活性をもつ酵素製剤を用いることが本発明
による溶解を行うのに適切であると判定された。
適切な溶解剤にはチール）　（Ｚｉｅｒｄｔ）の溶解試
薬（ペンシルベニア州フィラデルフィアのローム・アン
ド・ハース社からローザイム（Ｒｈｏｚｙｍθ）４１の
商品名で市販されている０、５％酵素製剤、０．７チの
ツウイーン（Ｔｗθθｎ）２０を含む０．０１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ８，０）　中−ジャーナル・オノ・クリニ
カル・マイクロバイオロジー１５：１７２〜１７４．１
９８２年）、および４チのツウイーン２０乞含む０．０
１Ｍトリシン緩衝液（ｐＨ８，５）中の２．５％ローザ
イム４１よりなる溶解剤（以下５　ＸＬＡと呼ぶ）が含
まれる。
溶解剤は試料に直接に添加される。用いられる溶解剤の
量は試料の量に対し約１〜２０容量部であってよい。チ
ールトの試薬を用いる場合、約８〜１０容量部の溶解液
が用いられる。好ましい５ＸＬＡ溶解剤を用いる場合、
約１〜約５容量部の溶解液が用いられる。
染色前に試料中の微生物ビ増殖させることが望ましい場
合は、２種の増殖法乞採用することができる。第１の場
合、標準培地に試料を接種する。
標準培地、たとえばトリプチケース大豆肉汁培地、コロ
ンビア肉汁培地、脳心臓浸出物培地、はプトン肉汁培地
およびＢＡＣＴＥＣ培地（ベクトン・デイツキンソン・
アンド・カンパニーのジョンストン・ラボラ）ＩＪ　７
：部門、マリーランド州コツカイスピル）を用いること
ができる。約Ａ〜約２時間インギュベートすることによ
り限定的増殖ケ誘発する。大部分の場合、約１ｉ時間の
インキュベーションによって、検出するのに十分な細菌
数が得られる。次いで　溶解剤ン添加し、前記のように
溶解を起こさせるためにインキュベーションヲ行つ。
第２の増殖佛様においては、溶解剤と血液含有増殖培地
を組合わせた組成物に試料を接種する。
この組成物は培地７０〜９０容量チ、および溶解剤１０
〜３０容量％を含有する。好ましい組成物においてはト
リプチケース大豆肉汁培地８０容量チを溶解剤２０容量
チと混合する。この組成物に試料７約５〜約２０％、好
ましくは約１０％の容量濃度で添加−する。
溶解剤または溶解剤−増殖培地組成物乞添加したのち、
試料２約１０分ないし約６時間インキュベートシて溶解
、または溶解と増殖ン起こさせる。
インキュベーションはほぼ周囲温度から約５０℃までの
温度で行うことができる。溶解は温度が高いほど速かに
進行し、好ましくは約４０〜４５℃、好ましくは４２℃
で行う。
インキュベーションののち、溶解した試料を臭化エチジ
ウムで染色する。この染料は０．００１％水溶液として
試料に添加される。本明細書で用いられるチは特に指示
しない限り車量チである。添加する染料の量は微生物お
よび用いられる試料により定められ、一般に染料の最終
濃度は約１〜約１０００μ＆／ｅｃ最終容量）、好まし
くは約２．５〜約１００μｙ７ｍｌｌ　の範囲にあるで
あろう。
染色は染色促進剤として作用する緩衝液の存在下に行う
のが最も良い。細胞による色素の吸収乞促進する各種の
緩衝液が知られている。この種の緩衝剤の一例はホウ酸
ナトリウム、ＥＤＴＡ、ホルムアルデヒド、および界面
活性剤（たとえばトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　−Ｘ　
−１００）　からなる水性組成物である。好ましい実施
態様においては、これらの成分は緩衝化された試料中に
それぞれ４０ｍＭ、２４ｍＭ、０．０２容遺チおよび０
．０２容量チの最終濃度で存在する。
染料を含有する緩衝化された試料混合物乞短期間放置す
る。後記のように、染色された細胞の観察は緩衝化され
、染色された試料中で直接に行うことができ、あるいは
所望により染色された細胞を観察する前に試料からいず
れかの一般的分離法により（好ましくは遠心分離により
）分離することができる。この実施態様においては、細
１１ＬＩ’ｔ　液状クッション剤、たとえばフッ素化さ
れた炭化水素に対して遠心分離する。この種のフッ素化
された炭化水素はフルオルイナート（ＦＬＵＯＲ工ＮＥ
ＥＲＴ　）の商品名でスリーエムカンパニー（ミネソタ
州ミネアポリス）により市販されているものである。遠
心分離したのち上澄液を捨て、細胞ン塩溶液に懸濁させ
る。
細胞は螢光を用いて観察することができる。約０．０１
１１１／７取出し、顕微鏡スライド上に広げ、適切な波
長（好ましくは５１５　ｎｍ）の励起光線を用いて５８
０　ｎｍ以上の波長で放出される光線を観察することに
より約１分間ないし約１時間観察する。
螢光活性化されたフローサイトメトリー（流動旧教法）
により分析を行うこともできる。この方法は微生物が低
濃度で存在する場合に検出および定量するのに特に有利
である。この方法においては、細１１１Ｍ　’を一度に
一個づつ光源の集束したビーム（たとえばレーザー）を
通過させ、これにより計数された螢光信号を発生させる
。本発明においては、溶解され、染色された液体試料を
、約０．０５〜約０．３ｍ１１分、好ましくは約０．１
　ｍｌ　７分の速度でビーム乞通過させる。
以下の実施例は本発明をさらに説明するために提示され
るが、いかなる様式でも本発明の範囲乞制限するものと
解すべきではない。
例１ ＳＰＳで前処理された全血の試料を各０．１．ｍｌづつ
４本の試験管に入れた。試験管のうち２本を大腸菌２．
７４　Ｘ　ｉＯ’ｃｆｕを含有−する標準塩溶液１０μ
ｅで処理し、他の２本の試験管は対照として用いた。
各試験管にチールトの溶解試薬０．　ｇ　ｍｌ！を添加
し、試験管を３７℃で３０分間インキュハートシた。
内容物ｏ、’ｒｔｒｔｌｙ各試験管から取出し、臭化エ
チジウム１００μｅおよび染色緩衝液２００μｅで処理
した、 一組の試験管（被験および対照）に１００μｅのフルオ
ルイナート（ＦＬＵＯＲ工ＮＥＲＴ　）を添力１比、試
験管欠遠心分離し、上澄液７捨て、ペレットｙ標準塩溶
液０．７　ｒａｌに再懸濁した。次いですべての試験管
ン螢光活性化されたフローサイトメーターで分析した（
ＦＡＣ８ＩＶインスツルメント、ベタトン０デイツキン
ソン・アント９・カン／ミニ−のＦＡＣ８部門、カリフ
ォルニア州すニーベール）。洗浄した対照試料および被
験試料はそれぞれ９８５および２．２Ｘ１０’計測咬を
含んでいることが認められた。後者は対照方法による計
数（２，７Ｘ１０ｃｆｕ／ｍ／＋）の約８０％の回収率
ン示した。
例２ 例１に記載したと同じ方法で、血液試料１　ｍｌに、標
準塩溶液０．１　ｒａｌ中の懸濁状混合細菌培養物約１
０８ｃｆｕ　’ｆ接種し、チールト試薬１．ＢｍＡ！で
処理し、３７°で１５分間インキュベートした。
０、３５　ｍｌのインキュベート物を直接に染色用緩衝
液中の臭化エチジウムで染色した。これと別にインキュ
ベート物０．７０ｍ１ｚフルオルイナー　ト０．１　ｍ
ｌの添加により洗浄し、遠心分離し、染色前に標準塩溶
液に再懸濁した。
顕微鏡下で見た場合、洗浄した試料および洗浄しない試
別の双方において細菌のみが染色されているのが認めら
れた。染色はきわめて鮮明であったが、未洗浄試料の方
がより鮮明であった。
例３ 例１に記載したものと同様な方法で、　ＥＤＴＡにより
あらかじめ抗凝血処理した血液各１　ｍｌｙ　５つの容
器にとって、下記ｃｆｕの大腸菌により系列希釈処理し
た。
１・・・・・・４Ｘ１０５ ２・・・・・・４Ｘ１０’ ３・・・・・・４ＸＩＯ” ４・・・・・・４×１０２ ５・・・・・・対照 各０．２ｍｌ！’を取出し、チールトの試薬１．　Ｂ　
ｍｌｌ乞それぞれ添加した。すべての試験管を、３７℃
で３０分間インキュベートした。各試験管から０．７ｍ
１分を二つ取出し、臭化エチジウム１００μｅおよび染
色用緩衝液２００μｅで染色した。−組の試験管を遠心
分離し、標準塩溶液に再懸濁することにより、標準塩溶
液で洗浄した。他は未洗浄のままであつＴこ。洗浄した
試料を螢光活性化されたフローサイトメーターで分析し
たところ、下記のＣｆｕ／ｍｅ回収率が得られた。
接種（ｃ　ｒｕ　／ｍｌ　）　回収（ｃｆｕ／ｍＡ’）
４Ｘ１０５・・・・用用・・　１．４Ｘ１０５４×ｌＯ
・・・・・・・・・・・・　１．７Ｘ１０’４Ｘ１０３
・・・・・・・・川・　３Ｘ１０３４×１０　・・・・
・・・・・・・・　１．３Ｘ１０２対照・・・・・・・
・・・・・　１１４２例４ ＳＰＳで抗凝血処理した全面を用いて例３と同様な実験
を行った。血液０．、３　ｍＡ　（被験および対照）を
溶解剤（５ＸＬＡ）　０．３　ｍｌと共に４２℃で６０
分間インキュベートした。次いでこの試料０．５１１１
％：臭化エチジウムおよび染色用緩衝液により室温で１
５分間染色した。洗浄した試料暑螢光活性化されたフロ
ーサイトメーターで分析したところ、下記の結果が得ら
れた。
１．４ＸＩＯ’　・・・・・・・・・・・・　８．３Ｘ
ＩＯ”１．４Ｘ１０３　・・・・・・・・・・・・　１
．６８Ｘ１０３１．４Ｘ１０２　・・・・・・・・・・
・・　１．６４Ｘ１０１４　・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・　４９対照・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・１６例５ この例においては、対照ウサギおよび大腸菌感染させた
（細菌血症）ウサギから得た血液を用いた。被験動物お
よび対照動物から得たＳＰＳ抗凝血処理した血’ｌ＆　
ｌ　ｍｌｌ　ｙ　５ＸＬＡ溶解剤１ｍｌと共に４２℃で
６０分間インキュベートした。臭化エチジウム０．４　
ｒｕｌおよび染色用緩衝液１，６ｍｎ７室温で１５分間
添加した。フルオルイナート０．５ａｌ１％：添加し、
混合物乞９，０００×９で１０分間遠心分離した。上澄
液７捨て、ベレットヲ標準塩溶液２ｍｇに再懸濁し、懸
濁液乞螢光活性化されたフローサイトメーターで分析し
た。結果を次表にまとめる。
試　料　コロニー成形数７ｍｌ　検出数／　ｍｌ。
対照４＋１００ ＋２　０　６ ≠３　０　０ ≠４　０　６ ＋５　０　０ 被験＝ｌｌ−１１，４Ｘ１０’　５．２Ｘ１０’≠２　
２．３ＸＩＯ’　２．０ＸＩＯ５≠３　０　１５２ ＋４　０　３８８ −４＋５　１０　８４ 例６ 肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　、ス
タフィロコッカス・サブロフイチカス（Ｓｔａｐｈ、　
５ａｐｒｏ宵ｔｉｃｕｓ）および奇怪変形菌（Ｐｒｏｔ
ｅｕｓ　ｍ１ｌａｂｉｌｉｓ）　ｆ　）リプチケース大
豆肉汁培地で対数増殖中期になるまで増殖させ、細胞を
分離し、洗浄し、標準食塩液に懸濁して最終濃度約Ｉ　
Ｘ　１０　ｃｆｕ／ｒｎｌにした。次いで１０／Ａｅの
容量の各細胞懸濁液乞無菌濾過した族１ｍ１ｆ含有する
試験管に添加した。次いで各試験管に溶解試薬５ＸＬＡ
　１ｒｎｌｔｔ入れ、すべての試験管を４２℃で２０分
間インキュベートした。染色用緩衝Ｉｅｊ、ｌ、　５　
ｍｌおよび臭化エチジウム０．４　ｍｌを各試験管に添
加し、すべての試験管を室温に１０分間放置した。接穂
菌数は注入平板により測定され一微生物数はＦ’ＡＣ８
ＩＶ螢光活性化されたフローサイトメーターで測定され
た。この実験に関する微生物の回収率を次表に示す。
例７ 無菌濾過した尿１　ｍｌに約ｌＸ１０’ｃｆｕの黄色ノ
ド９つ球菌、スタフィロコッカス・サブロフイチカス、
奇怪変形菌、大腸菌、肺炎桿菌、および大便連鎖球菌を
接種した。各試験管を溶解剤５ＸＬＡ　１ｍｌで処理し
、４２℃で３０分間インキュベートした。染色用緩衝液
１．６　ｍｌおよび臭化エチジウム０．４ｍ１ｔ、Ｈ次
いで添加し、試、駄賃な室温で１５分間インキュベート
した。次いでＦＡＣ８ＩＶ分析を行い、注入平板により
得た生存細胞数と比較することにより回収率（％）を測
定した。
生物　ＦＡＣ８Ｎ回林（％） 黄色ブドウ球菌　８６ スタフイロコツカス・サブロフイチカス　１４２奇怪変
形菌　６３ 大腸菌　１００ 肺炎桿菌　９４ 大便連鎖球菌　１２６ 例８ 無症候性の８対照供与者から尿検体２得た。生菌数は注
入平板によりめられた。各対照尿１ｍｌを溶解剤５ＸＬ
Ａ　ｌ　ｍｌと共に４２℃で３０分間インキュイードし
た。染色用緩衝液１．６　ｍｌおよび臭化エチジウム０
．４　ｍｌ　ｔｔ次いで添加し、試験管を室温で１５分
間インキュベートした。次いでＦＡＣ８ＩＶ分析を行い
、検出された計測数／　ｍｌｌを生菌数（ｃｆｕ／　ｍ
ｌ　）と比較した。結果は下記のとおりであった。
１　９１　１４３ ２　０　２２９ ３　１．５Ｘ１０　２．４６Ｘ１０３ ４　４４　６００ ５　２．１２Ｘ１０　１．２３ＸＩＯ’６　５Ｘ１０　
２．２７ｘｌＯ’ ７　５Ｘ１０’　６．１３ＸｌＯ’ ８　１ＸＩＯ５２，０８Ｘ１０５

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）体液試料成分の溶解を試料中の微生物の実質的部
    分の溶解なしに行い、該微生物を臭化エチジウムで染色
    し、そして該微生物欠螢先により検出することよりなる
    、体液試料中の微生物の検出法。 （２）試料が血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料ま
    たは胸水試料である、特許請求の範囲第１項に記載の方
    法。 （３）試料が血液試料である、特許請求の範囲第２項に
    記載の方法。 （４）試料が尿試料である、特許請求の範囲第２項に記
    載の方法。 （５）血液試料を抗凝血薬で前処理する、特許請求の範
    囲第３項に記載の方法。 （６）抗凝血薬がヘパリン、　ｓｐｓおよびエチレンジ
    アミン四酢酸よりなる群から選ばれる、特許請求の範囲
    第５項に記載の方法。 （７）溶解が緩衝液中の酵素からなる溶解剤により誘発
    される、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （８１酵Ｘがリパーゼおよびヌクレアーゼ活性をもつプ
    ロテアーゼからなる、特許請求の範囲第７項に記載の方
    法。 （９）溶解剤が５ＸＬＡである、特許請求の範囲第８項
    に記載の方法。 （１０）　溶解剤がチールト試薬（Ｚｉｅｒｄｔ’　ｅ
    　ｒｅａｇｅｎｔ）である特許請求の範囲第８項記載の
    方法。 圓　酵素が緩衝液中でエマルジョン化されている特許請
    求の範囲第７項記載の方法。 （ｌり　緩衝液が、４％ポリオキシアルキレン　ンルビ
    タンまたは０．Ｏ１モルＮ−〔トリス（ヒドロキシメチ
    ル）メチルコグリシンよりなる特許請求の範囲第７項記
    載の方法。 （１３）体液試料成分の溶解により生じる分解破片が約
    ０．２ミクロンより小さい粒径な有する特許請求の範囲
    第１項記載の方法。 （１４）　体液試料成分の溶解により生じる分解破片が
    約０．１ミクロンより小さい粒径な有する特許請求の範
    囲第１項記載の方法。 Ｑ５１　培養工程７有し、試料を培養培地に添加し。 培養期間の後に該培地中の試料に溶解剤ケ添加すること
    により溶解を行なう特許請求の範囲第１項記載の方法。 （１６）　培養工程娑有し、試料を溶解剤および培養培
    地よりなる組成物中に添加し、そして染色ン培養期間の
    後に行なう特許請求の範囲第１項記載の方法。 （ｌη　体液試料中の微生物ｌ検出するための方法であ
    って、 （ａｌ　該試料を溶解剤で処理し、 ［ｂｌ　該試料乞インキュベートし、 ｌｃ）　該試料を臭化エチジウムを含む染色用組成物で
    処理し、 （ｄ）該試料を螢光により分析する、 工程からなる方法。 ０１１０　染色用組成物がさらに染色用緩衝液を含む、
    特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 （ＩＣＪ　試料が血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試
    料および真水試料よりなる群から選ばれる、特許請求の
    範囲第１７項に記載の方法。 （２０１溶解剤が緩衝液中の酵素からなる、特許請求の
    範囲第１７項に記載の方法。 ０υ　酵素がリパーゼおよびヌクレアーゼ活性をもつプ
    ロテアーゼである、特許請求の範囲第２０項に記載の方
    法。 （２２１溶解剤が５ＸＬＡおよびチールト試薬（Ｚｉｅ
    ｒｄｔ’　ｓｒｅａｇθｎｔ）　よりなる群から選ばれ
    る、特許請求の範−四第２１項に記載の方法。 （２３）　さらに、微生物を分離し、該微生物を染色後
    に塩溶液に懸濁させる工程を含む、特許請求の範囲第１
    ７項に記載の方法。 ｃ１４）　さらに ｌ）試料を血液培養培地に添加し、 ２）この試料および培地の混合物を溶解剤の添加前に約
    捧〜約２時間インキュベートして限定された水準の微生
    物の増殖をはかる、 工程を含む特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 （２５１体液試料中の微生物を検出するための方法であ
    って、 ａ）該試料を培養培地および溶解剤からなる組成物に添
    加し、 ｂ）この試料および組成物の混合物を約捧〜約２時間の
    間インキュベートシ、 Ｃ）該試料を臭化エチジウム含有組成物で処理し。 ｄ）この懸濁液乞螢光サイトメトリーにより分析する 工程からなる方法。 （ハ）染色用組成物がさらに染色用緩衝′ｔＬヲ含む、
    特許請求の範囲第２５項に記載の方法。 （２７）試料が血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料
    および真水試料よりなる７ＪＦから選ばれる、特許請求
    の範囲第２５項に記載の方法。 （２秒　溶解剤が緩衝液中の酵素からなる、特許請求の
    範囲第２５項に記載の方法。 翰　酵素がリノξ−ぜおよびヌクレアーゼ活性欠もつプ
    ロテアーゼからなる、特許請求の範囲第２８項に記載の
    方法。 ００）溶解剤が５　ＸＬＡおよびチールト試薬（Ｚｉｅ
    ｎｉｔ’　ｓｒｅａｇθｎｔ）　よりなる群から選ばれ
    る、特許請求の範囲ｇ２９項に記載の方法。 ０１）　さらに、微生物を分離し、該微生物を染色後に
    塩溶液に懸濁する工程を含む、特許請求の範囲第２５項
    に記載の方法。 （３２１試料を約１０分間ないし約６時間インキュベー
    トする、特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 （３３）　試料を周囲温度ないし約５０℃でインキュベ
    ートする、特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 ０ａ　染色用組成物中の臭化エチジウムの濃度が約１〜
    約１０００μｇ／ｍｌである、特許請求の範囲第１７項
    に記載の方法。 ０５）染色用組成物中の臭化エチジウムの濃度が約２．
    ５〜約１００μｆｊ／ｍｌ　である、特許請求の範囲第
    ３４項に記載の方法。 （３）染色用緩衝液が水中のホウ酸ナトリウム、エチレ
    ンジアミン四酢酸、ホルムアルデヒドおよびトライトン
    −Ｘ−１００からなる、特許請求の範門弟１７項に記載
    の方法。 Ｃ３７１染色用緩衝液が水中のホウ酸ナトリウム４０ｍ
    Ｍ。 エチレンジアミン四酢酸２４　ｍＭ、ホルムアルデヒド
    ０．０２容量チ、およびトライトン−Ｘ−１０００，０
    ２容量チからなる、特許請求の範囲第３６項に記載の方
    法。 （２）クッション剤であるフッ素化炭化水素液を用いる
    遠心分離により微生物を特徴する特許請求の範囲第２３
    項に記載の方法。 （３ｇｌ　試料を５２０ηｍ以下で励起したのち５８０
    ηｍ以上の波長で顕微鏡により分析する、特許請求の範
    囲第１７項に記載の方法。 （４（ｌｌ　試料を螢光活性化されたフローサイトメー
    ターにより分、析する、特許請求の範囲第１７項に記載
    の方法。 （旬　懸濁液を螢光活性化されたフローサイトメーター
    に約０．０５〜約０．３ｍ１１分の速度で流通させる、
    特許請求の範囲第４０項に記載の方法。 （４２１＠濁液な螢光活性化されたフローサイトメータ
    ーに約ＯＡｍｌ１分の速度で流通させる、特許請求の範
    囲第４１項に記載の方法。 （４３試料を５２０ηｍ　以下で励起したのち５８０η
    ｍ以上の波長で顕微鏡により分析する、特許請求の範囲
    第２５項に記載の方法。 （４４）試料を螢光活性化されたフローサイトメーター
    により分析する、特許請求の範囲第２５項に記載の方法
    。 （４５１懸濁液を螢光活性化されたフローサイトメータ
    ーに約０，０５〜約０．３１１ＬＩＩ／分の速度で流通
    させる、特許請求の範囲第４４項に記載の方法。 （４Ｇ）１Ｍｔ？蜀液な螢光活性化されたフローサイト
    メーターに約０．　ｌ　ｍｌ１分の速度で流通させる、
    特許請求の範囲第４５項に記載の方法。 （４η　体液試料中の微生物を検出するだめの方法であ
    って、 ａ）該試料１　ｍｌｌを溶解剤５ＸＬＡ　１　ｍｌに添
    加して混合物となし、 ｂ）該混合物を４２℃で１時間インキュベートし、 Ｃ）染色用緩衝液１．６ｄおよび臭化エチジウム溶液０
    ．４　ｍｌｌからなる染色用組成物２ｍ１７該混合物に
    添加し、 ｄ）該混合物欠１５分間放置し、 ｅ）該混合物乞螢光活性化されたフローサイトメーター
    にｏ、１ｍｅＺ分の速度で流通させて微生物を８１数１
    −る、 工程からなる方法。 （４８１微生物用増殖培地および溶解剤からなる組成物
    。 四　増殖培地がトリプチケース大豆肉汁培地、コロンビ
    ア肉汁培地、脳心臓浸出液培地およびはプトン肉汁培地
    よりなる増殖培地よりなる群から選ばれる％特許請求の
    範囲第４８項に記載の組成物。 （５０）増殖培咄がトリプチケース大豆肉汁培地である
    、特許請求の範囲第４９項に記載の組成物。 ｔ５１１　増殖培地７０〜９０容量チおよび溶解剤１０
    〜３０容量チからなる、特許請求の範囲第４８項に記載
    の組成物。 ６２１トリプチケース大豆肉汁培地約８０容量チおよび
    溶解剤２０容量チからなる、特許請求の範囲第５０項に
    記載の組成物。 ６３１　溶解剤が緩衝液中の酵素を含む、特許請求の範
    囲第４８項に記載の組成物。 （５弔　酵素がリパーゼおよびヌクレアーゼ活性をもつ
    プロテアービからなる。特許請求の範囲第５３項に記１
    １１ｇの組成物。 −５５）溶解剤が５ＸＬＡである、特許請求の範囲第５
    ４項に記載の組成物。 （５６１溶解剤がチールト試薬（Ｚｉｅｒｄｔ’ｓ　Ｒ
    ｅａｇｅｎｔ）である、特許請求の範囲第５４項に記載
    の組成物。
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