JPS60152518A - クロマトグラフィー用の吸着剤または生物学的に活性な物質用の担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 物質全分離または精製するかまたけ分子量分′Ａ５　ｋ
測定する目的で重合体溜液のゲル浸透クロマトグラフィ
ーを行うためにポリマーゲルｔｌ史用することはずっと
以前から知られている。水性の系に適当であるポリマー
ゲルは親水性でおると百われているが、他方非水性系（
有機溶媒）においてのみ使用することができるポ１）マ
ーゲルは疎水性であると言われている。疎水性ゲルの例
は架橋したポリスチレンであるが、親水性ゲルは架橋し
たデキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル
アミドまたはポリビニルアルコールに基づくものである
。これらのゲルの膨潤し、従ってたとえばゲル浸透クロ
マトグラフィーにおいて高流量を阻止する極端な傾向は
架橋の程度を増すことにより防止することができる。

架橋したポリビニルアセテートに基づく疎水性ゲルはす
でにイ子在しており、それ〃＼らアセテート基全加水分
解することにより架橋したポリビニルアルコールに基づ
く親水性ゲルを製造することができる。ここで息要な点
は特にその架橋が加水分解に対して強く抵抗しなければ
ならないということである。

この分野においては従来多数の化合物がこの目的で架橋
剤としてすでに記載されている。たとえばドイツ特許第
１，５１７，９３５号明細書にはこの目的でジビニルア
ルキレン、ノカルボン酸のソビニルおよびノアルキルエ
ステルなどだけでなく、多価アルコールのノビニルまた
はジアリルエーテルもまた開示されているが、好ましい
のはブタンジオールジビニルエーテルである〔これに関
してはｒ　Ｍａｋｒｏｍｏｌ、　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｊ第１
７６巻第６５７頁およびそれ以降（１９７５年）も参照
されたい〕。上記の特許により得ることができる架橋し
た＋１？リビニルアセテートおよびポリビニルアルコー
ルはまた巨大多孔性ビーズの形態であってもよい。ブタ
ンジオールジビニルエーテルを用いる架橋は加水分解に
対して安定であるが、このエーテルは比較的ゆっくりと
しかビニルアセテートと共重合しないので、この架橋剤
を用いた場合には比＋Ｉｘ的低い架ａ＠度しか得られな
い。

存在する他の架橋剤たとえはエチレングリコールジメチ
ルアクリレートまたはグリシゾルメタクリレート（米国
特許第４，１０４，２０８号明細書）は加水分解に抵抗
する架橋を生成せず、しかも均等には含まれない。従っ
てビニルアセテート（Ｍ、）およびメチルメタクリレー
ト（Ｍ２）の共重合ノ９ラメータはｒ、＝＝　ｏ、　０
１、ｒ２−２０である。同様の共重合・ヤラメータは本
明細書中に記載されたメタクリレートに対しても同様で
ある。そこで上記２種の架橋剤は反応開始時に消費され
、従って均等な結合を得ることは不可能である。

また生物学的に活性な物質を分離する、すなわちそのよ
うな物質全固定化するためのアフィニティークロマトグ
ラフィーに対して親水性ポリマーゲル全使用すること、
およびこれを使用するまえにポリマーゲルの反応性の基
（それは通常ＯＨ基でおる）をいわゆるスペーサーと反
応させることはすでに先行技術の一部である（ドイツ特
許出願公開公報第２，１０２，５１４号およびドイツ特
許第２，４２１，７８９号明細書全参照）。

先行技術の上記の欠点を有しないような、特に加水分解
に抵抗し、そしてゲルクロマトグラフィーにおける吸着
剤としてか、または化学的に共有結合した生物学的に活
性な物質に対する担体物質として使用するのに特に適当
であり、そして化学的に共有結合した生物学的に活性な
物質の活性を殆んど損わず、しかも処理されるべき基質
の流れを妨けないような、ポリビニルエステルに、そし
て特にポリビニルアルコールに基づいた架ａ重合体全提
供することが本発明の目的である。

従って本発明は本質的にビニルアシレート単位および一
般式 （ただし式中、Ｒ４およびＲ２は同一または異なりて、
それぞれビニル、１−アシルオキシビニル、アリルまた
は２−アシルオキシアリルを表わし、Ａは２〜８個の炭
素原子を有する２価の炭化水素基を表わす）、および／
または（Ｃｈｚ＝？＋ＴｎＢ　（１） （ただし式中、Ｂは１〜８個の炭素原子を有する２価、
６価または４価の炭化水素基會表わし、ｍはこの基の原
子価に相当し、そしてＸはアシルオキシを表わす）を有
する架橋剤の単位（ただしこれらの架橋剤単位の量は重
合体の０．１〜６０重量％であるものとする）から成る
架橋重合体に関する。

好ましくはビニルアシレート単位のアシレート基は部分
的にか、または完全にＯＨ基により置換される。

また本発明により分散媒の存在下でビニルアシレー）１
−上記の式（１）および／または（ＩＤｔ−有する架橋
剤と共重合させることによる、この架橋重合体の製造法
が提供される。好貫しくはこのようにして得られた重合
体はつぎに部分的にかまたは完全に加水分解される。

ｉｂＬ後に本発明はまた本発明による１合体のクロマト
グラフィーにおける吸着剤としてか、または生物学的に
活性な物質の担体物質としての使用に関する。

本発明による１合体のビニルアシレート単位は好ましく
はそのアシレート基に２〜１８個の炭素原子、特に２〜
６個の炭素原子上含有する。

後者は好ましくはアセテートまたはプロピオネート基で
ある１、それはまた重合体中に存在する種々のアシレー
ト基に対しても可能である。すなわち重合体は適当なビ
ニルアシレートの混合物を用いて製造することもできる
。

式（１）の架橋剤においてＡは好ましくは２〜５個の炭
素原子特に２個または３個の炭素原子を有する分枝鎖状
または非分枝鎖状の脂肪族炭化水素基を表わす。この炭
化水素基は特に好ましくはエチレンまたはプロピレン基
である。この式（Ｉ）のＦｔ１／Ｒ２が１−アシルオキ
シビニルまたは２−アシルオキシアリルを表わす場合に
は、そのアシルオキシ基は好ましくは２〜１８個の炭素
原子特に２〜６個の炭素原子を含有する。アシルオキシ
は好ましくはアセテートまたはプロピオネート基を表わ
す。基Ｒ１／Ｒ２は好ましくはビニルを表わす。本発明
による重合体中の好ましい架橋剤単位は同様にＮ、Ｎ’
−ジビニルエチレン尿素から誘導される。この架橋剤は
特に加水分解に抵抗する架橋の形態を生成する。もう一
つの好ましい代表はＮ、Ｎ’−ジビニルプロピレン尿素
である。

これらの化合物の製造は知られており、そしてたとえは
米国特許第２，５４１，１５２号明細書およびＵｌ１ｍ
ａｎｎ氏著ｒ　Ｅｎｃｙｋｌｏｐａｄｉｅ　ｄｅｒ　’
　ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅｎＣｈｅｍｉｅ　（工業化学辞
典）」第２６巻第６１１負（第４版）に記載されている
。

弐叩の架橋剤においてＢは好ましくは２価の炭化水素基
特に２〜６個の炭素庫子好ましくは２〜４個の炭素原子
を有する分枝鎖状または非分枝鎖状アルキレン基を表わ
す。この場合アシルオキシ基は好ましくは式（１）にお
けるＲ基に対して上記に記載されたのと同じ意味を有す
る。

この型の好ましい架橋剤の例は６，６−シメチルペンタ
ジエン２，４−ジアセテートであり、それはビニルアシ
レートと特に容易に共重合する。

この釉の化合物はたとえは酸触媒の存在下で適当なヅケ
トン、トリケトンまたはテトラケトンをビニルアシレー
トまたはイングロペニルアシレートと反応させることに
より製造され、対応するエノールアシレートが生成する
。同時に生成するアセトンは蒸留により平衡混合物から
連続的に除去しなければならない。

架橋剤（ＩＩ）の単位の母は一般的に重合体中の架橋剤
単位の総量００〜１００％、特に０〜６０％である。

本発明による重合体中の架橋剤単位の総′ｉは特許請求
の範囲内であり、そして特定の使用目的に対して所望さ
れる架橋密度による。たとえばゲルクロマトグラフィー
においては高次元の安定性が望ましく、そのことは高い
架橋密度を、従ってより高い含有量の架橋単量体単位ヲ
做求する。これに対して他の使用領域においてたとえば
攪拌容器中での酵素反応に対するか、または診断剤に対
する担体物質として使用する場合にはより低い架橋密度
が有利である。大抵の楊合０．１重量−以下の架橋剤含
量ではもはや有用な生成物を生成しない。６０重量％よ
り高い架橋剤含量は基本的には可能であるが、概してさ
らに大きな利点を生じない。

使用目的により架橋剤単位の量は好ましくは重合体の１
〜５０！量チ特に１〜４０重量％である。生物学的に活
性な物質に対する担体物質として使用するためには、最
低限界は好ましくは２．５　、ｉ　ｉ％、特に好１しく
は１ＯＮＭ％である。式（ＩＯの架橋剤単位のみが存在
する場合には、それらの最低限界は特に好ましくは２．
ｓｉ’ｉ％である。

ある種の使用に対しては、ビニルアセテートと共１合す
ることができる単量体の単量体単位を含有することも本
発明による重合体に対して有利であり、それらの量は一
般的に総意合体の１０重ｉチを越えない量であり、そし
て好ましくは０．１〜５重Ｍ−ｑｂである。その混合物
中で使用することができるこれらの単量体の例はＮ−ビ
ニルピロリドン、ビニレンカーボネート、（メタ）アク
リル酸、（メタ）アクリルニトリル、（メタ）アクリル
アミド、それぞれアルキル基において２〜１２個の炭素
原子好ましくは２〜４個の炭素原子ｔ−Ｗするアルキル
（メタ）アクリレート、アルキル基において２〜６個の
炭素原子を有する（メタ）アクリル酸のヒドロキシアル
キルエステル、Ｎ−ビニル−Ｎ−アルキル−アセトアミ
ド、スチレン、α−メチルスチレンなどである。

本発明による架橋重合体は好ましくはビーズの形態をし
ており、それは主として球状であり、乾燥時の非膨飼状
態におけるその平均粒子サイズは２０〜８００μｍ１好
ましくは５０〜３００μｍであり、そして好ましくは狭
い粒子サイズ分布を有する。最も適当な粒子サイズは一
般的にそれぞれの場合における特定の使用領域による。

たとえは加圧しないで行われるカラム法の場合には上記
の範囲内で加圧法の場合よりも適当に大きい粒子サイズ
が選ばれるであろう。本発明による重合体ビーズは王と
して巨大多孔性であるように形成される。細孔の平均直
径は一般的には２〜１０．ＵＯＯｎ＋ｎ　、好ましくは
５〜２　Ｕ　Ｏｎｍ　、　特に２０〜２００　ｎｍの範
囲内である。

細孔直径（細孔容積）はまず第一に毛絢管圧力法（水銀
細孔測定法）〔これに関してはｒ　Ｕｌｌｍａｎｎｓ　
ＥｎｃｙｋｌｏＩ５Ｋｄｉｅ　ｄｅｒ　ｔｅｃｈｎｉｓ
ｃｈｅｎＣｈｅｍｉｅ　（ウルマンの工業化学辞典）」
第５巻（１９８０年）第７５１〜７５２貞を参照された
い〕により細孔容積ｋ　６ｉ１１定することにより決定
できる。

つぎに平均のｆ１１１孔直径りこの参考書の第７５２負
の左側の欄の上に与えられている式により細孔容積から
計算することができる。また走査電子顕微鏡により細孔
サイズを測定することも可能である。

本発明による重合体中のビニルアシレート単位のアシレ
ート基は好ましくはＯＨ基に加水分解されており、その
加水分解の程度は一般的には５０係よりも大きく、好ま
しくは７０％よりも大きく、そして特に９０〜１００チ
である。加水分解により得られた架橋重合体すなわちポ
リビニルアルコールが生物学的に活性な物質に対する担
体物質として使用される場合には、好ましくは少なくと
もＯＨ基の一部は以下に定義されるようないわゆるスペ
ーサー基により占められてい′る。これとは対照的にゲ
ルクロマトグラフィーのためには、少なくとも一定のＯ
Ｈ基はもはや反応性の基を含まない疎水性の基により占
められているのが有利である。

本発明による重合体は特に高い架橋密度とともに加水分
解に対する高い抵抗性を特徴とする。

この加水分解に対する高い抵抗性はゲルクロマトグラフ
ィーの場合だけでなく、生物学的に活性な物質たとえば
酵素に対する担体物質として使用する場合にも極めて重
要である。担体に支持された酵素はしはしは強アルカリ
性または強酸性媒質中で例年間も使用される。特にエス
テルまたはカルボキサミド結合全解裂する「非特異的加
水分解酵素」に関してこのことが言える。

その他については安定な架橋はまた本発明による重合体
中のアシレート基金ＯＨ基に加水分解する際にも有利で
ある。

本発明による重合体は特にゲルクロマトグラフィーにお
ける固定相として、そして生物学的に活性な物質に対す
る担体物質として使用するのに適当である。

本発明による架橋重合体は通常の方法で好ましくはビー
ズ重合条件下で、分散媒および分散安定剤の存在下で、
他の添加物の非存在下でかまたは存在下で、フリーラジ
カル開始剤および好ましくは不活性希釈剤の非存在下で
かまたは存在下で、そして酸素を排除して製造される。

ビーズ重合を行うために適当な分散媒は主として通常の
状態で液体であり、６０℃よりも高い、好ましくは８５
°から６００℃までの沸点を有し、そして乳濁重合を抑
制するために重合条件下で単量体、重合体が、そして好
ましくは開始剤もまたそれに不溶であるかまたは浴ける
としても殆んど溶解しないような化合物でちる。単量体
相の分散媒相に対する割合は広い範囲内でたとえは０．
５：ｉないし１：５０の間で、好ましくは１：１ないし
１：１５（３１量比）の間で変えることができる。本発
明によれば好ましい分散媒は水である。水は有利には緩
衝剤を含有しており、それはアルカリ性の範囲内で作用
し、そしてビニルアシレートの加水分解により生成した
酸に対して水素イオン濃度が左右されないようにする。

この緩衝剤は好ましくは燐酸水素二ナトリウム／燐酸二
水素ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムから成る。

重合の過程でビーズのアグロメレーション全防止するた
めの分散安定剤はこの目的で知られている化合物の一つ
であることができる。それは好ましくは親水性重合体た
とえはポリビニルピロリドン、月？リビニルアルコール
、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、メチ
ルセルロースまたはエチレンオキシド／プロピレンオキ
シド共重合体である。ポリビニルピロリドンはこの目的
のために特に好ましい。これらの分散安定剤は単量体総
量の０．００１ｉ量チ程度の少ない量で有効である。通
常使用される量は（単量体の総量を基準にして）ｏ、ｏ
ｏｓ〜５０ｉ量チ、好ましくは０．０１〜２０重ｆＡチ
である。

（分散媒が水の場合）電解質たとえば塩たとえば塩化す
）　ＩＪウムの水相への添加は一般的に有利である。な
ぜならばこれは外相から単量体ｋ　１１は完全に移行さ
せ、従ってほぼ完全に乳濁液の形成を阻止し、さらにビ
ーズの収ｆｉｆｆｉ増加させる効果全有するからである
。さらにまたこり）添加された電解質はある程度コロイ
ドを保護する作用も有することができる。通常この′ｉ
ａＭ質は分散媒全基準にして５０重量％好ましくは３０
重量係までの量で使用される。

本発明によれは適当なフリーラジカル開始剤は単量体の
相に易溶性であるべきであ、す、そして液体状分散媒に
できるだけ難溶性であるべきである。その例は有機過酸
化物たとえばジ第３級ブチルペルオキシド、ジベンゾイ
ルペルオキシド、クメンヒドロペルオキシドまたはシク
ロヘキザノンペルオキシド、および脂肪族アゾ化合物た
とえばα、α′−アゾシイ・ソゾチロニトリル、アゾビ
スシアノ吉草酸、１．１’−アゾシクロヘキサン−１，
１′−ノカルポゾニトリルまたはアゾジカルポキザミド
である。また適当なレドックス系全使用することもでき
る。開始剤の量は通常（単量体の総量を基準にして）０
．０１〜５１〜５重量％しくは０．１〜２重量％である
。また開始剤の非存在下でかまたは存在下で放射線処理
をすることにより重合を開始することもできる。

ビーズ１合体においてできるだけ高い多孔性を得るため
には、ある種の不活性な液体成分（希釈剤）が重合系に
かまたは好ましくは単量体に加えられる。本発明の目的
に対してはこれらの希釈剤は単量体がそれに容易に溶解
するか、または単量体がそれと混和性であるが、他方分
散媒には実質的に不溶性であり、従ってそれと非混和性
であるような物質である。この型の希釈剤およびそれら
の作用方法はたとえばドイツ特許第１，５１７，９３５
号明細書およびｒＭａｋｒｏｍｏｌ、　ＣｈｅｍｉｅＪ
第１７６巻第６５７頁およびそれ以降（１９７５年）に
記載されている。

最も適当な希釈剤または希釈剤混合物は２．３の簡単な
常套的実験により容易に決定される。

細孔サイズは不活性成分の性質、組成および量により影
響されるが、また架橋成分の量にもよる。

希釈剤は単独でかまたは混合して使用することができ、
そしてポリビニルアセテートに対する溶媒または凝固剤
であることができる。例としてはアルカノールたとえは
ブタノール、シクロヘキサノール、インオクタツールま
たはグリコール、エステルたとえばブチルアセテート、
ブチルグリコールアセテートまたはグリ七ロールトリア
セテート、アミドたとえばジメチルホルムアミド、ジメ
チルアセトアミドまたはピロリドン、ケトンたとえはア
セトンまたはシクロヘキザノン、エーテル、少なくとも
６個の炭素原子を有するジアルキルエーテルたとえはジ
−ｎ−ブチルエーテル、７−ｎ−アミルエーテルまたは
ジフェニルエーテル、および炭化水素たとえはヘキサン
、ベンゼン、インオクタンまたは／４’ラフイン油であ
る。分散媒として水を使用する場合好ましい希釈剤は少
なくとも６個の炭素原子を有するジアルキルエーテルた
とえはジ−ｎ−ブチルエーテルまたはノーｎ−アミルエ
ーテルである。他の好ましい希釈剤はポリグリ：Ｉ−ル
でｈす、それはエチレンオキシドおよびプロピレンオキ
シドの混合物または７’　ｏ　ヒＶ　ンォキシドだけ全
出発分子としてのアルコールたとえばブタノールに加え
ることにより生成され、エチレンオキシドおよびプロピ
レンオキシドがランダムに分布しているか、または号？
す（オキシエチレン）単位がポリ（オキシエチレン）鎖
の両端に結合しているエチレンオキシドおよびプロピレ
ンオキシドのブロック重合体である。

加えられる希釈剤の量は大きく変えることができる。そ
れは特に単量体の組成、特に架橋剤の含有量、所望され
る多孔度（細孔サイズ）、および重合体に対して意図さ
れた正確な目的による。従って架橋の程度が高い場合に
は、ある程度の多孔度（細孔サイズ）を得るために希釈
剤の量も多い方が好ましい。同様に架橋の程度が一定で
ある場合には、希釈剤の量が多けれは多いほど多孔度（
細孔サイズ）は高くなるであろう。もちろん希釈剤の量
には限界がある。さもなければ機械的強度が不光分に低
下するからである。大抵の場合に祉希釈剤の容量が使用
される単量体の容置の０．０２〜５倍好ましくは０．０
４〜３倍である場合には満足できる結果が得られる。

ビニルアシレート、架橋剤および他のコモノマーは上記
の水準の単量体単位を含有する重合体を生成するような
量で使用される。

本づ６明による方法は攪拌器を装備した反応容器中で通
常２０〜１５０℃好ましくは２０〜１００℃の温度で且
つ１〜１０バ一ル好寸しくは１〜５バールで有利に行わ
れる。ビーズ重合体の粒子サイズは通常の方法で攪拌器
の速度および相比により設定される。該反応容器は好ま
しくは厳密に具化であり、そして還流冷却器、滴加痛斗
、ガス導入管および温度測定器を装備することができる
。該容器は一般的に液体浴たとえば油浴または水浴を用
いて加熱され、そして冷却される。

大気中の酸素の非存在下で本発明による方法を行うのが
有利である。この理由で開始するまえに反応容器に不活
性ガス好ましくは窒素を通じて置換する。

重合反応が終了したのちにたとえば減圧下で好ましくは
０．１〜１　ｓｌ＋＋＋Ｉ（ｇの圧力下で蒸発させるこ
とにより反応していない単量体を反応容器から除去する
。残留している単量体全除去したのち、たとえば傾瀉す
るか、涙過するか、または吸引して上澄ＪｈＹｔｋ除去
することにより固体状重合体から分散媒を分離する。希
釈剤を使用する場合にはあらかじめ水蒸気蒸留によりそ
れを除去することができる。その後必要な場合には重合
体を低沸点の有機溶媒たとえば炭化水素、低級アルコー
ル寸たはアセトンで洗浄し、そして最後に通常２０〜１
００℃好ましくは２０〜８０℃の温度で理想的には減圧
下で乾燥する。

このようにして得られたＩリビニルアセテートグルは親
水性ではない。そのエステル基は水中で使用するまえに
加水分解しなければならない。加水分解はアルカリ性条
件下通常の方法で、生成物音アルコールたとえはメタノ
ールで膨潤させ、そして水性アルカリたとえば水酸化ナ
トリウム浴液を加えることによるか、またはアルコール
で膨潤させた生成物を触媒量の敵または塩基を用いてエ
ステル交換するが、その際生成したエステルをたとえは
蒸留により連続的に除去しながらエステル交換すること
により行うことができる（ドイツ特許第１，５１７，９
３５号明細１を参照）。加水分解は任意の段階で中断す
ることができるので、使用目的に従ってゲルの親水度を
ｌ整することができる。

ビーズの形態の架橋したポリビニルアルコールゲルが生
物学的に活性な物質に対する担体として使用される場合
（それは共有結合により担体に固定される）、多くの場
合そのゲルをあらかじめいわゆるスペーサーで修飾する
のが有利である。本発明の目的に対してはスペーサーは
支持重合体および生物学的に活性な物質の両方と反応し
、そして２つの間にいわは橋を形成する化合物である。

ビーズ重合体のスペーサーとの反応は直接にかまたは好
ましくは初めにアシレート基音加水分解したのちに行う
ことができる。変換の程度は特にスペーサーの大きさお
よびアシレート基の近づきやすさ、またはそれから生成
した第２級ヒドロキシル基による。本発明によれは適当
なスペーサーはこの目的で知られていて、その第２の官
能基が固定されるべき生物学的に活、性な物質と結合す
るようなホモ−およびヘテロ−二官能性化合物である〔
ドイツ特許第２，４２１，７８９号および同第２，５５
２，５１０芳容明細書、ｒ　Ｕｌｌｍａｎｎｓ　Ｅｎｃ
ｙｃｌｏｐＡｄｉｅ　ｄｅｒ　ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅｎ
Ｃｈｅｒｎｉｅ　（ウルマンの工業化学辞典）」第４版
、第１０巻第５４０頁およびｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚ−ａｔｉｏｎ　ｏｆＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｂｉｏ
ｃａｔａｌｙｓｔｓ　Ｊ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ
社発行、ワインハイム、第１９７９年第５５頁を参照〕
。

本発明により使用されるスペーサーの例はつぎの基 （ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２；　ｎ＝２〜１２７０、 −　（Ｃ）］　２　）ｎ−Ｃ”Ｈ−Ｃｌ　２　：　ｎ　
＝１〜８Ｎロ ー（Ｃ１１２）ｎ−ＣＨ：　ｎ＝１〜６０ＲＢ＝１〜６
個の炭素原子を有するアルキル−ａＨ２−０ｙ　：　Ｙ
＝ＮＨ２，Ｎ２．　ＮＣＯを導入するものである。

本発明によれば好ましいスペーサーは加水分解抵抗性の
化学結合を形成し、そしてそれらにはエピクロロヒドリ
ンまたはその同族体（α。

β−エポキシ−ω−ハロゲノアルカン）が含マれる。ポ
リビニルアルコール（ポリビニルアシレート）の反応は
溶媒の非存在下でかまたは存在下で、好ましくは触媒の
存在下で生起する。

その反応は一般的に温度により６０分ないし２４時間か
かり、温度は室温ないしエビクロロヒドリンの還流温度
（１１６〜１１５℃）であることができる。適当な触媒
の例は水酸化す）　ＩＪウム（粉末の形態）、水性アル
カリ、ジメチルホルムアミド、トリエチルアミンおよび
他の酸受容体である。

本発明の目的に対しては生物学的に活性な物質は生体内
でかまたは試験管内で活性である既知の天然または人工
の物質たとえば酵素、活性化剤、阻害剤、抗原、抗体、
ビタミン、ホルモン、奏効体、抗生物質、蛋白質などで
ある。蛋白質にはまたある種の非蛋白質置換基たとえば
金属イオン、多糖類、ポルフィリン基、アデニンジヌク
レオチド、りぎ核酸、燐脂質などを有する蛋白質も含ま
れる。生物学的に活性な物質にはポリペプチドフラグメ
ントたとえば酵素分子の活性部分さえも含まれる。

本発明によれは上記の生物学的に活性な物質のうちでは
酵素が好ましい。酵素の例はウレアーゼ、ペニシリンア
シラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アデニルデアミ
ナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アスパラギナー
ゼ、カルー？キシペゾチダーゼ、キモトリプシン、ジホ
スホエステラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコースイ
ソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６
−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、転
化酵素、β−ラクタマーゼ、ラクターゼ、ラクテートデ
ヒＦロゲナーゼ、種々のレクチン、ＮＡＤキナーゼ、ノ
イラミニダーゼ、パパイン、（ルオキシダーゼ、アルカ
リおよび酸ホスファターゼ、５′−ホスホノエステラー
ゼ、ピルベートキナーゼ、リゴヌクレアーゼオよびトリ
プシンで６．６゜ 他の生物学的に活性な物質の例はホルモンたとえはイン
シュリンおよび種々の下垂体ホルモン、ガンマ−グロブ
リン部分の蛋白質たとえばＧ、　ＭＸＡＸＤおよびＥク
ラスの抗体、他の血液因子たとえば抗血友病性因子、凝
血因子、特定の抗体たとえば肝炎、灰白髄炎、麻疹、流
行性耳下腺炎、インフルエンザまたは家兎の抗体、精製
するためかまたは適当な抗体反応を刺激するための抗原
たとえは肝炎、灰白髄炎、麻疹、流行性耳下腺炎、イン
フルエンザまたは家兎の抗原〔この場合（一度不溶化さ
れた）抗原は不溶性の形態のままで存在し、従って体内
に浸透し且つ損傷を与えることができない〕、ならびに
一般的な体の蛋白質たとえばヘモグロビンまたはアルジ
ミンである。

生物学的に活性な物質との結合反応は通常の方法でたと
えばドイツ特許出願公開公報第２．４ａ乙３４０号また
はドイツ特許第２，２１５，６８７号、同第２，４２１
，７８９号および２，５５２．５１　（１芳容明細書に
記載された方法で行われる。その反応は通常室温で、す
なわち＋４０℃でかまたはそれ以下で生起し、後者は特
に結合されるべき生物学的に活性な物質が本来不安定で
ある場合に使用される。この場合温度は＋１０℃以下、
好ましくは０°〜＋５℃である。

その結合反応は好ましくはほぼ中性の−１でたとえばｐ
Ｈ５〜９で行われる。なぜならばこのＰＩＸ範囲におい
て大抵の生物学的に活性な物質は最も安定であるからで
ある。巨大多孔性ビーズ重合体は中性の範囲内において
さえも大抵の問題の物質と迅速に反応するので、一般的
により強い酸性またはアルカリ性の条件を保持する必要
はない。生成する結合は長期間の保存に対して充分に安
定でありそして操作中も高い安定性を有する。

本発明をさらによく理解せしめるために以下に実施例を
あげて説明する。

実施例　１ ビニルアセテート９７．５５’　、ジビニルエチレン尿
素２．５ｆおよびアゾイソブチロニトリル０．１１の溶
液から成る有機相全攪拌器、温度計および還流冷却器を
装備したフラスコ中窒素下で燐酸水素二ナトリウム４．
２ｔ、燐酸二水素す）　ＩＪウムＣＬ２５ｔＸｙｌｅリ
ビニルピロリドン７．　Ｏｆおよび水７００−から成る
水相に攪拌しながら懸濁する。加熱浴を用いて７５℃に
加熱することにより重合全開始させる。２時間後にその
温度は８５℃に上昇する。さらに２時間後に重合は完結
する。得られた懸濁物を氷に注ぐことにより冷却し、微
細に分散した乳濁液をくり返し傾瀉により分離し、重合
体’ｔＦ別し、そして乾燥する。得られた乾燥生成物の
量は８０ｆである。

生成物を加水分解するためには、その５０１をメタノー
ルに膨潤させ、そして加熱することなくまた逆に冷却す
ることなく水中水酸化ナトリウム５０１０）溶液ｔ−２
５℃で加える。１２時間後に生成物ｔ−Ｆ別し、中性に
なるまで多量の水で洗浄し、そして乾燥する。

上記の生成物はゲルクロマトグラフィーにおいて使用さ
れる。加水分解されていないゲルはテトラヒ、ドロフラ
ン中ポリスチレンに対する排除分子量が１．２００であ
ることが見い出された。

加水分解生成物は水中ポリエチレングリコールに対する
排除分子量が１，１００である。

実施例　２ 実施例１の重合金水相中塩化ナトリウム１４０ｔの存在
下で行う。その懸濁物全氷水に注ぐことにより反応を終
了させるとすべてのビーズ重合体は山ちに沈降するので
乳化物は殆んど得られない。ビーズ重合体の単離可能な
収率は（重合可能な相に基づｂて）９０％以上である。

テトラヒドロフラン中目？リスチレンに対するゲルの排
除分子量は１，５００に達する。加水分解後には排除分
子量は水中ポリエチレングリコールに対して１，３００
であることが見い出された。

実施例　６ 実施例１０重合をくり返すが、ただし架橋成分としては
ジビニルエチレン尿Ｘ２．Ｏｒおよび３．３−ツメチル
ペンタジェン２，４−ゾアセテー）　０．５９を使用す
る。

ゲルクロマトグラフィーのデータは実施例１のそれに相
当する。

３．３−ジメチルペンタジェン２，４−ジアセテートは
下記に記載されたようにしてろ一メチルブタンー２−オ
ンｔルイス酸の存在下で無水酢酸ヲ用い゛Ｃアシル化し
、ついで生成するジケトン全イソグロペニルアセテート
と反応させることにより製造される。

新たに蒸留した３−メチレンブタノン３３０ｆ（−５，
８４モル）をフラスコ中で工業用無水酢酸（９５％）５
００Ｓ’（５モル）と混合し、そして窒素気流中で攪拌
しながら塩化亜鉛１６０ｆ（１，１５モル）を加える。

フラスコの内容物を１２０℃で６時間加熱し、冷却し、
そして水流真空下で蒸留する。

この操作によりす、ｐ、　６２℃（１２闘Ｈｇ）’に有
しそしてガスクロマトグラフィーによる純度が８６チで
ある粗生成物３６３ｔが生成する。

この物質を水流真空下で再度蒸留するとす、ｐ。

６０℃（１２朋Ｈｇ　）の均一な生成物２８９ｆが生成
し、それはＨ−ＮＭＲ分析により３，３−ジメチルペン
タン−２，４−ジオンである仁とが証明された（、　１
．３　ｐｐｍおよび２．０５　ｐｐｍに一重線）。

６．６−ノメチルペンタンー２，４−ジオ／１１０１を
窒素下で無水のインプロペニルアセテート５００２と混
合し、そしてｐ−トルエンスルホン酸５ｆｋ加える。こ
の混合物金短い充填カラムを用いて数日間還流温度に加
熱するが、その際数日間にわたって１２時間おきに短時
間５４℃〜９０℃の蒸留分画を取り去る。その反応混合
物の組成をガスクロマトグラフィーにより調べる。６日
間の反応期間が終了したのち炭酸塩を加えることにより
酸触媒を中和し、そしてその反応混合物を水流真空下で
迅速に留去する。反応しなかったイソゾロベニルアセテ
ートを除去するために大気圧下で再度蒸留を行う。水流
真空下で再び蒸留するとガスクロマトグラフィーにより
１００％純粋な物質５９１（８７，５℃／１２１１ｍ１
４ｇ　）が生成する。この生成物は３，３−ジメチルペ
ンタ−１−エン−４−オン−２−イルアセデートである
（　’Ｈ−ＮＭＥ　：　１．３　ｐｐｍおよび２．１　
ｐｐｍに一重線、４．９　ｐｐｍに二１線）。

粗生成物の残り全さらに蒸留すると０．０１　ｇＩ（ｇ
のオイルポンプ真空下でモノエノールアセテートおよび
第二のさらに高沸点の化合物との生成混合物が生成する
。これは０．０１＝＝ｕｇ’Ｆ５４℃〜６５℃でさらに
ジエノールアセテート１５ｆｋｇ３％の純度（ＧＣ）で
与える。

実施例　４ 架橋ビーズ重合を不均質に行うためには、ビニルアセテ
ート８０ｆ、ジビニルエチレン尿素２０２、アゾイソブ
チロニトリル１ｔおよびｎ−ヘプタツール２００ｆの溶
ｉを水５０〇−中燐酸二水素ナトリウム０．１７５ｒ、
燐酸水素二ナトリウム５１およびポリビニルピロリドン
５ｔの溶液に分散させ、そして重合させる。温度の変化
は実施例１の場合と同様である。４時間後に水蒸気蒸留
により希釈剤上除去し、そして生成物全単離する。光合
に球状の透明なビーズ重合体の収量は７７．７　ｆであ
る。平均の粒子直径は約６０μｍである（攪拌器の速度
４６０　ｒｐｍ　）。

その生成物はかさ容積が１．５５　ｒｎｔ／ｆ／である
。テトラヒドロフラン中でそのゲル床“容積は５．７７
　ｄ／１であり、°そしてポリスチレンに対する排除分
子量はａｏ、ｏｏｏである。加水分解生成物はかさ容積
が１．５４　ｍｌ／ｌであり、それは水中で膨潤すると
５ｍｌ／ｆになり、そしてポリエチレングリコールに対
する排除分子量は２０，０００である。

加水分解されたビーズ共重合体２０ｔｆエピクロロヒド
リン２００ｍ７！中室温で２４時間放置して膨潤させる
。つぎにゆっくりと攪拌しながらその温度を１１６〜１
１５°Ｉｃ上昇させ、そして４時間保持する。冷却した
のちその混合物を吸引濾過し、そして共重合体上一度に
アセトン中で１時間くり返し摩砕する。アセトンで混っ
た共重合体を恒量になるまで真空箱中５０℃で乾燥する
。エポキシ相当重量は２４４である〔アキセン法により
測定：　ｒＡｃｔａ　Ｃｈｅｍ、　８ｃａｎｄ、、Ｊ第
２９＠第４号（１９７５年）〕。

実施例　５ 実施例４の重合上くり返すが、ただし希釈剤を２−エチ
ルヘキサノール８０ｔおよびエチレンオキシドおよびプ
ロピレンオキシドから成るポリグリコール（重量比１：
１、ランダム分布）２０ｆの混合物で置きかえて行う。

ポリグリコールは分子量が約１．２００であり、そして
エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドをスタータ
ーとしてのブタノールに加えることにより得られる（　
ｒ、Ｐｏｌｙｇｌｙｋｏｌ　Ｂ　１１１５０　ｊヘキス
ト社製）。

単離するとこれはチョーク様白色の球状ビーズ重合体７
６ｔｋ生成し、その粒子サイズは攪拌速度４６０　ｒｐ
ｍで５０〜２００μｍである。

実施例　６ 実施例４０重合をくり返すが、ただし希釈剤′ｆｔ２−
エチルヘキサノール７０Ｆおよびポリグリコール３０？
の混合物で置きかえて重合を行う。そのポリグリコール
は分子量が約７００でアリ、プロピレンオキシドをスタ
ーターとしてのゲタノールに加えることＫより得られる
（ヘキスト社製ｒ　Ｐｏｌｙｇｌｙｋｏｌ　Ｂ　０１／
２０　Ｊ　）。

単離するとこれはチョーク様白色の球状ピーズ重合体Ｂ
２ｆを生成し、その粒子サイズは攪拌速度４６０　ｒｐ
ｍで５０〜２００μｍである。

実施例　７ 上記の重合をくり返すが、ただし希釈剤ｔ−２−エチル
へキサノール８０ｆおよびエチレンオキシドおよびプロ
ピレンオキシドから成るポリグリコール２０ｖ（重量比
４：１、ランダム分布、分子量約５，０００）の混合物
で置きかえて行う。そのポリグリコールはエチレンオキ
シドおよびプロピレンオキシド全スターターとしてのブ
タノールに加えることにより得られる（ヘキスト社製ｒ
　Ｐｏｌｙｇｌｙｋｏｌ　Ｆ　４１／３００　Ｊ　）。

単離するとこれはチョーク様白色の球状ビーズ重合体６
８９に生成し、その粒子サイズは攪拌速度４６０　ｒｐ
ｍで５０〜２００μｍの範囲内である。

実施例　８ 実施例４０重合ｔくり返すが、ただし希釈剤を２−エチ
ルヘキサノール８０ｔ１およびポリオキシプロピレンお
よびポリオキ７エチレンから成るポリエーテルグリコー
ル２０ｆの混合物で置きかえて行う。そのポリエーテル
グリコールはポリオキシエチレンを線分子の１０重量％
含み、ポリオキシエチレン単位がポリオキシプロピレン
鎖の両端に加えられている（分子量約１．７５０）　（
ＢＡ８Ｆ、グイアントッテ社製のｒ　Ｐｌｕｒｏｎ、＋
ｃ　ｐｏｌｙｏｌ　６１　Ｊ　）。

単離するとこれはチョーク様白色の球状ビーズ重合体７
２１會生成し、その粒子サイズは攪拌速度４６０　ｒｐ
ｍで５０〜２００μｍの範囲内である。

実施例　９ 実施例４０重合をくり返すが、ただし希釈剤全２−エチ
ルヘキサノール１００ｆおよびジ−ｎ−ブチルエーテル
１００ｔの混合物で置きかえて行う。単離するとこれは
チョーク様白色の完全に球形をしたビーズ重合体を生成
し、その粒子サイズは実施例４と同じ攪拌速度で７０μ
ｍである。

その生成物のかさ容積は２．８１ｄ／ｆであり、これは
テトラフラン中でゲル床容積７．４８ｒｎｔ／Ｓ’を有
し、ポリスチレンに対する排除分子量は２×１０６であ
る。加水分解生成物はかさ容積が１．６ｒｕｔ　／　？
であり、水中でのゲル床容積が１２．８　吻りであり、
そしてポリエチレングリコールに対する排除分子量が２
ｘ１０６である。

実施例　１０ 実施例４の重合をくり返すが、ただしその分散相はビニ
ルアセテ−）　７０　ｒ、ジビニルエチレン尿５ｉ１０
Ｆ、アゾビスイソブチロニトリル１１およびジ−ｎ−ブ
チルエーテル１５８ｔから成る。これにより平均直径２
００μｍの白色ビーズ重合体７７１が生成する。

そのかさ容積は２．９ｍｌし′１であり、テトラ・ヒド
ロフラン中のゲル床容積は７．４５　ｍＡ／ｒである。

生成物の排除分子量はゲルクロマトグラフィーにより測
定することができなかった。分子量２５．０００，００
０　ｔｌ−有するポリスチレンは大体内部容積で溶出し
た。走査電子顕微鏡により細孔の直径は１００，０ＯＯ
Ｘよりも大きいことが示された。

その加水分解生成物はかさ容積が６．５　ｍｅ／ｆであ
り、それは骨格構造が完全に保持されることを示してい
る。水中でのゲル床容積は１４．５　Ｗ４／ｆであり、
ゲルクロマトグラフィーによる分析では分子量！Ｌ８Ｘ
１０　’ｉ−有するポリエチレングリコールはほぼ完全
な内部容積に近い。

加水分解された共重合体１０ｆｋエピクロロヒドリン１
００を中で２４時間放置して膨潤させ、つぎに攪拌しな
がら温度を１１０°まで徐々に上昇させ、そして１２時
間保持する。室温まで冷却したのちその混合物を吸引濾
過し、そしてその共重合体を一度にアセトン中で２時間
くり返しゆっくりと攪拌する。真空箱中５０℃で乾燥を
行う。エポキシ相当重量は担体物質１ｔあた９１０５マ
イクロモルである。

本発明によるビーズ状重合体である担体の生物学的に活
性な物質との反応はつぎのようにして行われる。

実施例　１１ トリズシン溶液８００　ａｔ　（６，２５ｍ？／ｌｄ、
３４５　Ｕ／＃＋７りを実施例４と同様にして製造した
担体１００２に加える。１Ｍ燐酸カリウム緩衝液を加え
てその酵素浴液をｐｌｌ　７．８となし、そして１．６
Ｘ１０一２Ｍベンズアミノン溶液を加えて酵素の活性中
心を安定化する。酵素の担体への固定時間は２５℃で７
２時間である。つぎに担体と共有結合していないトリグ
シンをｆラス濾過器で吸引濾過し、残留物ｔ−１Ｍ塩化
す）　ＩＪウム溶液で、そしてつぎに緩衝液でくり返し
洗浄する。濾過器上の湿った物質の収量ｔｒｉ　３２４
　ｍｇである。測定はＮ／−ペンソイル−Ｌ−アルギニ
ンエチルエステル塩酸塩（ＢＡＥＥ）　’ｉ使用し自動
滴定器を用いて３７°で且つｐＨ７，８で行われ、湿っ
た状態で２２７．５　Ｕ／ｆ　。

また乾燥重量に基づいて５５６　Ｕ／ｌの値が得られた
。出発時および洗浄水の活性から固定収率は２０％であ
ると計算することができる。

実施例　１２ １Ｍ９１！酸カリウム緩衝液でｐｉｉ　ａ　Ｏに調節し
たウレアーゼの溶液１５００μｔ（５０Ｗｐ／ｄ、５１
Ｕ肩）ｔ−実施例１０と同様にして製造されたエポキシ
化担体２００■に加える。室温で１６時間固定したのち
、担体を１Ｍ塩化ナトリウム溶液で、そしてつぎに緩衝
液でくり返し洗浄する。濾過器上の湿った担体の収ｉｔ
は７５４キである。基質として尿素を使用し６０°で且
つｐｉ（ａ　Ｏで自動滴定器を用いて測定したところ、
１００Ｕ／ｆ（湿潤時）または担体の乾燥Ｍ量に基づい
て３７７　Ｕ／ｒの活性が得られた。出発時および洗浄
水の活性から固定収率は９８襲であると計算することが
できる。

特許出願人　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト第１
頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号 Ｇ　Ｏｌ　Ｎ　３０７４Ｂ 庁内整理番号 ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 り　本質的にビニルアシレート単位および式（ただし式
   中、Ｒ４およびＢ２は同一または異なりて、それぞれビ
   ニル、１−アシルオキシビニル、アリルまたは２−アシ
   ルオキシアリルを表わし、Ａは２〜８個の炭素原子を有
   する２価の炭化水素基を表わす）および／または式 ％式％（１１） （ただし式中、Ｂは１〜８個の炭素原子を有する２価、
   ５価、または４価の炭化水素基を表わし、ｍはこの基の
   原子価に相当し、そしてＸはアシルオキシを表わす）゛
   含有する架橋剤の単位全台み、これらの架橋剤単位の量
   が重合体の０．１〜６０重量％であるような架橋重合体
   。 ２）ビニルアセテート単位を含有する特許請求の範囲第
   １項記載の架橋重合体。 ６）式（Ｉ）の基Ｒ１およびＲ２におけるアシルオキシ
   基または弐Ｑ［）のアシルオキシ基が２〜６個の炭素原
   子を特徴する特許請求の範囲第１または第２項記載の架
   橋１合体。 リ　式（１）の基Ｒ１／Ｒ２がそれぞれビニルを表わす
   、特許請求の範囲第１〜５項記載の架橋重合体。 ５）架橋剤単位の量が１〜５０重量％である、特許請求
   の範囲第１〜４項記載の架橋重合体。 ６）架橋剤単位の量が１〜４０電量チである、特許請求
   の範囲第１〜５項記載の架橋重合体。 ７）ビニルアシレート単位に含まれるアシルオキシ基の
   少なくとも１０重量％がヒドロキシル基により置換され
   る、特許請求の範囲第１〜６項記載の架橋１合体。 ８）ビニルアシレー）を分散媒の存在下で特許請求の範
   囲第１項記載の式（１）および／または（ＩＱ　’に有
   する架橋剤と共重合させ、そして所望により生成する重
   合体を部分的にかまたは完全に加水分解すること〃１ら
   成る、特許請求の範囲第１〜７項記載の架橋重合体の製
   造法。 ９）ビニルアシレートがビニルアセテートである、特許
   請求の範囲第８項記載の方法。 １０）ビニルアセテートと共重合しうるもう一つの単ｉ
   ｔ体も存在する、特許請求の範囲第８または９項記載の
   方法。 １１）重合がビーズ重合として行われる、特ｉｆＦ請求
   の範囲第８〜１０項記載の方法。 １２）分散媒がアルカリ性の水性緩衝液である、特許請
   求の範囲第１１項記載の方法。 １６）分散媒がＣ〜５０Ｍ量チの電解質を特徴する特許
   請求の範囲第１２項記載の方法。 １４）分散媒が分散安定剤として非イオン性界面活性剤
   を特徴する特許請求の範囲第１１〜１３項記載の方法。 １５）重合が不活性希釈剤としての、少なくとも６個の
   炭素原子を有するジアルキルエーテルの存在下で行われ
   る、特許請求の範囲第８〜１４項記載の方法。 １６）ビニルアシル基を含有する重合体が、そのアシレ
   ート基の７０％以上がＯＨ基により置換されるような加
   水分解に付される、特許請求の範囲第７項記載の架橋重
   合体の製造法。 １７）特許請求の範囲第１〜７項記載の架橋重合体の、
   クロマトグラフィーにおける吸着剤としての使用。 １８）特許請求の範囲第１〜７項記載の架橋重合体を所
   望によりスペーサーと反応させたσ〕ちに、担体で支持
   された生物学的に活性な物質全製造するために使用する
   こと。 １９）スペーサーがエビクロロヒドリンである、４；ｉ
   　ｔｉ′−Ｆ請求の範囲第１８項記載の使用。