JPS60114187A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 倣生物に関する。

ジカルボン酸は合成樹脂、１−：、縁間滑油、可塑剤、
香村二（′；の製）’ｌｊ　）ｈ！村としてイエ用な物
質であるか、合成７ノ、により製造されていたジカルボ
ン酸は炭素数にも限１隻かあり、炭素数１２個以上のジ
カルボン酸を製造することは困難であった。

そこで近イ「、微生物を利用した発酵法によるジカルボ
ン酸の製造法か注目されてきた。

従来、微生物によるジカルボン酸の製造法としてはキャ
ンディタ（Ｃａｎｄｉｄａ　）属（４）公開５０ー１９
６３０号’Ｉ９）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属（６公閉
４５−２４３９２号耐）　’．’ｒ・の酵１１によるも
のか多く、細菌によるものではコリネ／へクテリウム（
Ｃ：ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）ノＩハ（特公１
１／Ｊ　５　６　−　１７０７５−号等）しか見出され
ていなかった。特に４５°Ｃ付近で培養できる閑は皆無
であった。

そこで、本発明者らは、斯かる現状に鑑み、ノルマルパ
ラフィン、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を対応するジカルボ
ン酷に変換する能力を右する菌を自然界より広く検索し
た結果、ミコ／人りテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　）ノｉハにノ７６する微生物の中にＪＩＩｊかる
ｒ正方を右するものかあることを見出し、本発明を完成
した。

すなわち、本発明はミコバクテリウム／ｉｄに属し、ノ
ルマルパラフィン、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を資化して
ジカルボン酸を生産する能力を有する新規なミコハクチ
リウム・エスピー・ＫＳＭ−８−３３　（微工研菌寄第
７３１０号）に関するものである。

次に、本発明者らが分〜、採取した本菌株の蘭学的性質
を詳述する。

（ａ）形ｙル わずかに湾曲した知桿菌て、連動外はなく胞子も形成し
ない。ダラム染色陽性。抗酸性はあまり強くないが認め
られる。菌糸状には発青しない。

（１）各ｊ８地における生ｒＴ状１バ。

ｌ）シュクロース．硝酸塩寒天培地： 生育は豊冨であり、淡橙色の凸状のコロニーを生しる。

にふい光沢がある。

２）グルコース・アスパラキン寒天培地：生）′ｆはｇ
Ｌ１冨であり、橙色のしわ状のコロニーを生じる。光沢
はない。

３〕クリセリン・アスパラキン寒天’ｈＪＩｊ４。

生ＹＩ°は中程度であり、ピンク色の凸状のコロニ・−
を生しる。コロニーの周縁ははっきりしない。

４）スターチ寒天培地： 生ずｌは中程度であり、橙色の凸状のコロニーを生じる
。にぶい光沢がある。

５）チロシン寒火陪地： 生ｒｊは中程度であり、うすい橙色のコロニーを生じる
。コロニーの周縁ははっきりしない。光沢はない。

６）栄づ１寒天」１３地： 生イｌは中程度であり、淡橙色の凸状のコロニーを生じ
る。にふい光沢かある。

７）イースト・麦芽寒天培地： 生育は最も豊富であり、濃橙色の凸状の大きなコロニー
となり、光沢かある。

８）オーｉ・ミール寒天ｊ８地： 生育は豊富であり、橙色のしわ状のコロニーを生じる。

にぶい光沢がある。

（Ｃ）生理学的性質 １）生１′１範囲： 温度２３〜５１°Ｇ　（最適３５〜５０°Ｃ）ｐＨ２，
８〜８．３（最適５，３〜８．５）２）ゼラチンの液化
（グルコース・ペプトンセラチンｊｉ；ＩＩ！＋）：　
陰性 ３）スクーチの加水分解（スクーチ寒天ｊン４地）陰性 ４）脱脂牛乳の欠周、ペプ）・ン化・ともに陰性５）メ
ラニン様色素の生成：　陰性 （ｄ）炭素葛（の同化性 Ｌ−アラビノース、− Ｄ−キシロース　：　− Ｄ−グルコース　：　＋ Ｄ−フラクト−ス：　＋ シュクロース　・　± イノシｉ・−ル　− Ｌ−ラムノース　二　− ラフィノース　°　− Ｄ−マンニト−ル：　± （ｅ）糖からの酸、ガスの生成 フラクト−ス：　＋ （カスは生成しない） ソルヒト−ル：　＋ （ガスは生成しない） （ｆ）細胞壁Ｍ１成 ジアミノピメリン酸：　ｍ　ｅ　ｓ　ｏ　Ｗ糖　：アラ
ビノース、カラクト−ス リ）ミコール酸（ＴＬＣ：分析）：あり−１１）抗酸性
　：　あリ ーぞ１１）分、？７ｆｆｌ源：　土壌 以上の菌学的性質を有する菌について八−シエイのマニ
ュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅ
ｔｅ−ｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）　第８版（１９７５年）にノ＾ついて検索した結果、
本１４株はミコ／へクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　）　Ｗにｌｆする新菌株とＪめ、ミコバクテリ
ウム・エスピー−ＫＳＭ−Ｂ−３３（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ｓｐ、　ＫＳＭ−８−３３）と命名した。

なお、本菌株は、微工研菌寄第７３１０号として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

分＋’ｉｎ　ｓの土壌からの木１メ１株の分離はノルマ
ルパラフィン含有培地を用い常法で行なった。

木］゛々株のＪＨ’ｙ、養に使用する培地の組成は、使
用する菌株が良好に生育し、ノルマルパラフィン、脂肪
酸又は脂肪酸１誘導体からのジカルボン酸の生Ｊ？ζを
１１「１調に行なわしめるために適当な炭素源、ｊｆ　
Ｊ：　Ａｊあるいは有機栄養源、無機塩などからなる。

炭素源としては、炭水化物（例えば、クルコース、フラ
クト−ス、シュクロース、マンニ！・−ル等）、有機酸
（例えは、クエン酸、コハク酸、脂肪酸及びそのエステ
ルぢ一］、炭化水素（例えば、ｎ−ドデカン、１１−へ
゛午すテカンツヘ゛）など資化されるものならはいすも
も使用できる。また、窒素源あるいは有機栄養源として
は、例えば、イ６酸すトリウム、硝酸カリウム、硝酸ア
ンモニウム等の硝酸ｉｉＡ類、酵ｔｉＪエキス、肉エキ
ス、ペプトンか挙げられる。

また、９！！ζ機塩としては各種リン酸塩、イＩＭ　酸
マグネシウムなどが使用できる。さらに微量の重金属塩
類が使用されるが、天然物を含む培地では必ずしも添加
を必要としない。また栄養要求を必要とする変異株を用
いる場合には、その栄養要求を満たす物質を培地に添加
しなければならない。

Ｊ７’ｔ、査はＪ’ｉ　ｉｌ！！を加熱等により殺菌後
、菌を接種し、４０〜５０　’Ｃで３〜５■振τｆｔｋ
又は通気攪拌すれば良い。ｐ　Ｈは６．５〜８程度に調
整すると良い結果か？１）られる。水に難溶性の炭ふ源
等を使用する場合には、ポリオキシエチレンソルビクン
等の各種界面活性剤を培地に添加することも可能である
。

斜上の如く（Ｉ）られた培イｉ物は、そのまま酵素源と
して用いることもできるが、菌体を培ｅｌ　？ｆｋより
分離する場合は、通畠の固液性Ｎ１手段か用いられる。

このように分固された生菌体及びそ１１：帽１処理物（
凍結乾燥菌体等）も酵素源としてもノルマルパラフィン
、脂肪酸又は脂肪前詰導体を反応基質として本菌株を上
記の如く１１１養するとジカルボン酸か生産される。該
ノ１（質は炭素数１２〜１８のものが特に適当であり、
脂肪酸１：ｆ５導体としては脂肪酸の低級アルキルエス
テルが好ましい。

これらのｊＨλ養液から目的物質であるジカルボン酸の
採取および精製は、一般のイ〕機化合物の採取および精
製の手段に準じて行うことができる。たとえは培養前か
ら菌体り９・を除去したろ液もしくは培養液そのものを
酸性とし、エチルエーテル、酢酸エチル又はクロロホル
ム−メタノール１１４滴等の有機溶媒で抽出する。この
抽出物をカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶など
の方法を用いてジカルボン酸をｒｌ　ｆｌ［することが
できる。

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 採取した土壌サンプル約０．５ｇを減菌水１０−［］１
文に懸濁し充分１〜２拌後、この土壌ｒぴ、ハ：）掖０
．２”１１！文を下記組成の液体培地（Ｉ）１０ｍ文（
５０、゛）・π１文６試験管にて）に接種し、３０°Ｃ
にて４日→ｆＩ振盪ｊ８肴を行なう。

ネ　ｔｔｋ体Ｊｉζ地（Ｉ）　組成 ｎ−ヘキサデカン　１００　ｇ （ＮＨ４）２ＳＯ４２０ｇ ＫＨ，ＰＯ４２ｇ 酵ＩＪＪエキス　２ｇ Ｍｇ５（Ｊ４　＃　７Ｈ２０５００ｍｇＦｅ５０４　＊
　７Ｈ２０１０ｍｇ ＭｎＳＯ４−４〜８Ｈ２０８ｍｇ イオン交換水　１　文 ｐＨ７ 木１．５ｈｉｉｏ　ａｎｄ　Ｒ，Ｕｃｈｉｏ。

Ａｇｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｍ、　、　３５（１３）
、２０３３〜２０４２（１９７１） 上記ｊ：３　＆＆により増殖を示した培づ１液は、減菌
水により適度に霜釈した後、肉汁寒天」）〜地（米研化
学製；晋通寒天培地）に移し、３０°Ｃにて２日間用品
し、生した複数のコロニーか相互間に相ＲＬないことを
肉眼的及び顕微鏡的に確認できるまで、肉汁寒天培地へ
の移植を繰り返す。

Ｌ記コロニーのうち１０　（）！のコロニーをそれぞれ
下記組成の斜面寒天Ｊ？’Ｌ　Ｊ（！！（Ｉ　Ｉ）に接
Ｊ１１ｉ　Ｌ、１、ｄｌ　Ｑ　’Ｃテ３１１　ｒｌｊｌ
　Ｊｉ？　ｉｂ　Ｌ、１０．４＜ノＪｉＭｉ陪ｊ＆上ノ
４□１−株が肉眼的及び顕微鏡的に同−菌ａＳであるこ
長４１を確認し、また、これらＩｉミソ１ａ各培地上の
性状及び生理学的性質か同一であることを確１１５シた
。

斜面寒天Ｊ１−ノ山（ＩＩ）　組成 ｎ−ヘキサデカン　２０　ｇ ｐＨ、７ 上記菌株の１１３地上の性状及び生理学的性質は前述し
た通りである。上記試験の結果、各１０本の」８ム菌は
すべて目然界より純粋に分Ｎ［された単一菌株であるこ
とが判る。

次いで、上記で純粋ｊ８肴された斜面ｊ）３地上の菌株
から一白金耳を、減菌したｌＯ％グリセリｊト読溶液（
２ｍ文）の入った凍結保存用バイア（′ルｊに懸、濁し
、−８０°Ｃにて凍結保存する。かくＩｊ、ソて３ケ月
凍結保存後、迅速に解凍し得られる懸濁液の一白金耳を
肉汁寒天Ｊｊ３地に蘇生後、前記と同条件下に各Ｊ）３
地上での性状及び生理学的性ｒ′↓を調べた４′１果、
凍結前とは変化が認められなかった。

また、」二足凍結及び解凍を１ケ月４１すに５度繰り返
した菌株について同様に、各ｊ８地上ての性状及び生理
学的性質を調べた結果、変化は認められなかった。

次いで、本菌株を利用してジカルボン酸を製造した例を
参考例として挙げる。

参考例１ バルミチン酸メチル５０ｇ、リン酪ニアンモニウム　１
０ｇ、リン酸−カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム（７水
塩）　０．２ｇ、硫酸第一鉄（７水塩）　０．０２ｇ、
硫酸亜鉛（７水〃盈）　０．０１６ｇ　、硫ＱＱ−ｙ　
７カ７　（４−６水Ｊｊｊ、）　Ｏ，０１６ｇ　、酵／
＋ｊ　エキス２ｇを水道水に溶かして１文にし、ｐＨを
７．０に調製した。この液体」８地５　ｍｌを５０　ｍ
ｌ容振盪試験官に仕込み、１２０°Ｃで１５分間７Ａ気
減、−菌子た後、ミコバクテリウムφエスピー・ＫＳＭ
−八〇 ｒ・ｆｉ３　（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　＊　ｓｐ
、　ＫＳＭ−Ｂ−３３）を−白族＃−＋：接ＪΦし、４
５°Ｃで１２０時間４ｈ？　ｒＪ（’Ｌ　Ｊ：’ｒ肴し
た。

−′」８養終了後、この項五！ｔｋに９Ｎ硫酎１＋ｏｌ
を加えｐＨを強酸性として、クロロホルム−メタノール
（２：　ｌ）イｊ−Ｌ　１（１２０ｍ　ｌで抽出した。

この抽出液を鍬圧下濃縮した後メタノール−ＢＦ３触媒
でメチル化し、ガスクロマドクラフィーにて生成物の定
量を行なった。その結果、培養液１１当り　１３　ｍｇ
のα、ω−テトラデカンジカルホン酸が得られることが
わかった。

なお生成物のガス−マス（ＧＣ−ＭＳ）データは標品の
それと一致し、α、ω−テトラデカンジカルボン酸であ
ることが確認された。

参考例２ バルミチン酸メチル５０ｇ、リン酸ニアンモニウム　１
０ｇ、リン酸−カリウム２ｇ、４Ｍε酪マグネシウム（
７水ｉＭ）０．２ｇ、ポリペプトン１ｇ、酵母エキス２
ｇを水道水に溶かして１９．にし、ｐＨを７．０に調製
した。この液体培地１００ｍ１を５００＋ｎｌ容振盪フ
ラスコに仕込み、１２０°Ｃで１５分間／に気鍼菌した
後、ミコ／＼クテリウム・エスピー・ＫＳＭ−８−３３
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　＊　ｓｐ、　ＫＳＭ−
Ｂ−３３）を−白金耳接種し、４５°Ｃで１３２時間振
盪Ｊｉｌｊ、１着１した。

””’ｂＢ　ｈ終了後、この培ａ　ｉｔｙに９　Ｎ　４
ｔｌｉ酸　１０　ｍｌを１シ縛えｐＨを強酸性として、
エチルエーテル１００１で抽出した。この抽出ｔｔｈを
無水硫酸すトリウムにて乾帰した後、誠圧下濃縮し、メ
タノール−ｎＦ：＋触媒でメチル化して、ガスクロマト
ゲ・用フィーにて生成物の定！ＩＸを行なった。その結
１．２１Ｉ１、用品液１文当り　１３　ｍｇのα、ω−
テトラテカンジカルポン酸が４ＩＪられることかわかっ
た。

なお生成物のカス−マス（ＧＣ−ＭＳ）データは杷１シ
品のそれと一致し、α、ω−テトラデカンジカルボン酸
であることが確認された。

出願人　：　工業技術院長

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の性質を４１する微エイ１ノ１菌′、δ°第７
   ３ＩＯ号として寄託された新規なミコバクテリウム・エ
   スピー＠ＫＳＭ−Ｂ−３３株。 （ａ）形態 わずかに湾曲した短桿菌で、連動性はなく胞子も形成し
   ない。ダラム染色陽性。抗酸性はあまり強くないか認め
   られる。菌糸状には光ｆＴ　Ｌない。 （ｂ）各」８地における生育状ｙｌ； １）シュクロース・イ０酸１１Ｊ寒天Ｊ８地：生ｒｒは
   豊富であり、淡橙色の凸状のコロニーを生じる。にぶい
   光ｌ〈がある。 ２）グルコース拳アスパラギン寒天培地：生？ｊは豊富
   であり、橙色のしわ状のコロニーを生じる。光沢はない
   。 ３）グリセリン壷アスパラギン寒天ｉ１３地：生ｎは中
   程度であり、ピンク色の凸状のコロニーを生じる。コロ
   ニーの周縁ははっきりしない。 ４）スクーチ寒天培地： 生ｒＪ゛は中程度であり、橙色の凸状のコロニーを生じ
   る。にぶい光沢が“ある。 ５）チロシン寒天Ｊ８地： 生育は中程度てあり、うすい橙色のコロニーを生じる。 コロニーの周縁ははっきりしない。光沢はない。 ６）栄養寒天Ｊン３１山： 生育は中Ｊ、Ｉ、１瓜てあり、淡橙色の凸状のコロニー
   を生じる。にぶい光沢がある。 ７）イースト・皮芽寒天Ｊ７’５地： 生育は最も豊富であり、濃橙色の凸状の大きなコロニー
   となり、光沢かある。 ８）オートミール寒天Ｊ８地： 生Ｙｆは、Ｓ冗・；イであり、（α色のしわ状のコロニ
   ーを生しる。にぶい光沢がある。 Ｃ）生理学的性質 １）生Ｙｊ　ｊｋ囲ニ アｆｕ’を度２３〜５１°Ｃ（最適３５〜５０６Ｃ）ｐ
   Ｈ２，８〜８．３（最適５．３〜８．５）２）セラチン
   の液化（グルコース・ペプＩ・ンセラチンＪ７’＜地）
   ：　陰性 ３）スターチの加水分子Ｑ’ｒ″（スターチ寒天Ｊ）°
   １地）陰ｆｊ： ４）脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：ともに陰性５）メラ
   ニン様色素の生成：　陰性 （ｄ）炭素ｐ：（の同化性 Ｌ−アラビノース：　− Ｄ−キシロース　二　− Ｄ−クルコース　：　＋ Ｄ−フラクト−ス、＋ シュクロース　・　士 イノシト−ル　・　− Ｌ−ラムノース　：　− ラフィノース　・　− Ｄ−マンニト−ル：　± （ｅ）オＪｌｊからの酸、カスの生成 フラクト−ス・　＋ （ガスは生成しない） ンルビｉ・−ル：　＋ （カスは生成しない） （ｆ）細胞壁組成 ジアミノピノリン酸：ｍｅｓｏ型 ３Ｊリ　・アラビノース、カラクト−ス（ｇ）　ミコー
   ル酸（ＴＬＣ分析）、あり（ｈ）抗酸性　：　あり