JPS5995221A - 食細胞機能調節作用を有する医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトペプシンおよび／またはヒト白血球ペプ
シン様酵素を有効成分とする食細胞機能調節作用を有す
る医薬組成物に関する。

生体が恒常性維持のため営む機能の１つに免疫能かある
。外界から侵入した異物や９体内で異物化した物質は生
体にとって害を及ばず場合があり。

感染：Ｉｉ’Ｉ：、　アレルギー、腫瘍あるいは自己免
疫疾患などの疾患はその発症および進展に免疫能が影響
を与えることが知られている。その為、近年、免疫能を
調節Ｊることによりこれらの疾患を治療する試みかなさ
れ１腫瘍の治療に免疫調節剤が用いられている。しかし
、従来の免疫調節剤は、主に体液性免疫や細胞性免疫の
エフエフクーとして働くリンパ球の機能を調節する薬剤
であり３食細胞の機能を直接調節する薬剤の研究は少な
い。

食細胞は微生物などの生体内に侵入した異物や腫瘍など
の生体内で生じた異物を寅食、消化するばかりでなく、
その異物の情報をリンパ球に伝えることにより免疫応答
を調節する重要な役割を担っている。また、痛風や動脈
硬化症は体内で生した尿酸あるいはコレステロール沈着
物により発症するものと考えられ、これらの沈着物の処
理にも食細胞が関与していることが推察されている。従
って９食細胞機能調節作用を有する薬剤は、従来リンパ
球機能調節剤が使用されてきた疾患だけでなく、感染症
、痛風あるいは動脈硬化症などの疾患の治療を可能にす
ると考えられる。

これらの観点から９本発明者らは食細胞機能調節作用を
有する医薬を開発すべく、長年にわたり研究を重ねた結
果、ヒトペプシンおよび／またはヒト白血球ペプシン様
酵素が食細胞を介する免疫調節作用を示し、感染症、痛
風および動脈硬化症を改善することを見いだし１本発明
を完成した。

本発明の有効成分であるヒトペプシンは公知の酵素であ
り〔エテリントンら（Ｅｔｈｅｒｉｎ−ｇｔｏｎ）、　
　ビオキミ力・エト・ビオフィジ力・アクタ（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ、　　Ｂｉｏｐｈｉ。

ＡＣｔａ）２３６巻、９２頁、１９’７１年〕、蛋白質
を精製する場合に用いる一般的方法２例えば塩析法、無
機吸着体による吸着クロマトグラフィー、イオン交換樹
脂によるイオン交換クロマトグラフィー、分子ふるい効
果を有するゲルクロマトグラフィーなどを適宜組み合わ
せることにより。

ヒト胃細胞、ヒト胃液、ヒト尿などから採取することが
できる。また、ヒト胃細胞などのペプシン産生細胞と癌
細胞を融合させた細胞の培養、あるいは遺伝子工学的手
法１例えばヒトペプシンのメソセンジャーＲＮＡを鋳型
として、逆転写酵素によりコンプリメンタリ−ＤＮＡを
調製し、このＤＮＡを大腸菌などに組み込むことによっ
て、大量に得ることができる。

例えば、ヒト尿をセイファーら（３ｅｉｊｆ−ｆｅｒｓ
）の方法〔アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロ
ジ−（Ａｍｅｒ、　　Ｊ、　　　Ｐｈ−ｙｓｉｏｌ、）
２０６巻、１１０６頁＋’　１９６４年〕に準じ、０．
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，３）にて平衡化したＤＥＡＥ
−セルロースカラムを通過させることにより、ヒトペプ
シンを吸着させた後、０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む
同緩衝液にて溶出する。溶出液を濃縮後、０．９％の生
理食塩水に膨潤せしめたセファデックスＧ−１００によ
るゲルクロマトグラフィーにてさらに精製し。

本発明のヒトペプシンを得ることができる。このヒトペ
プシンは、セファデックスＧ−１００によるゲルクロマ
トグラフィーによる分析の結果２分子量３２０００−３
８０００であり、アンフオライン等重点電気泳動法によ
る等電点は１−３であり、極大吸収２７４ｎｍ、ニンヒ
ドリン反応陽性。

水に易溶、エーテル、クロロホルムに不溶である。

また、ヒト白血球ペプシン様酵素は既に出願した酵素で
あり（特願ＰＣＴ−ＪＰ８２−００２１３）、蛋白質を
精製する場合に用いる一般的方法。

例えば塩析法、無機吸着体による吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換樹脂によるイオン交換クロマトグラフィ
ー、分子ふるい効果を有するゲルクロマトグラフィーな
どを適宜組み合わせることによりヒト白血球、アクチノ
マイシンＤで処理した前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０株
などがら採取することができる。また、ヒト白血球など
のペプシン様酵素産生細胞と癌細胞を融合させた細胞の
培養、あるいは遺伝子工学的手法１例えばヒト白血球ペ
プシン様酵素のメソセンジャーＲＮＡｔ［ｕとして、逆
転写酵素により、ご１ンブリメンタリーＤＮＡを調製し
、このＤＮＡを大腸菌などに組み込むことによって、大
量に得ることができる。

例えば、上記培養細胞をホモジェネートした上請液を０
．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ　Ｈ５，３）にて平衡化したＤＥ
ＡＥ−セルロースカラムを通過させることにより、ヒト
白血球ペプシン様酵素を吸着させたのち、０．５Ｍの塩
化ナトリウムを含む同緩衝液にて溶出する。溶出液を濃
縮後、０．９％の生理食塩水に膨潤せしめたセフアゾ、
クスＧ−１００によるゲルクロマトグラフィーにてさら
に精製することにより、ヒト白血球ペプシン様酵素を得
ることができる。このヒト白血球ペプシン様酵素は、セ
ファデックスＧ−１００ゲルクロマトグラフイーによる
分析の結果２分子（ｆｔ３５０００−４１０００．アン
ホライン等電点電気泳動法による等電点は２．５−３．
５であり、極大吸収２７８ｎｍ、　ニンヒドリン反応陽
性、水に易溶、エーテル、クロロホルムに不溶である。

また、ヒト白血球ペプシン様酵素は、１）Ｈ７，０以下
の酸性領域にて、ヘモグロビンに対して高い氷解活性を
示し、その至適ｐＨは２．０−３．５である。

以下、このヒトペプシンおよびヒト白血球ペプシン様酵
素の有効性、毒性、用法および用量について説明する。

実験例１．ヒト単球の異物實食能におよぼす影響ヒト末
梢血単球１０６個にヒトペプシンもしくはヒト白血球ペ
プシン様酵素を含むＩＯＶ／Ｖ％牛脂仔血清添加イーグ
ル培地５ｍｌを加えて３７’Ｃテ培養Ｌ　タ。２０時間
後、培地をヒトペプシンもしくはヒト白血球ペプシン様
酵素および加熱処理したパン酵母２Ｘ１０６個を含む１
０％牛脂仔１１１１　？ｌ￥　ｍ加イーグル培地に替え
、さらに２時間培養した。培＃後、単球を観察し、貧食
率を次式により、δを算した。

貧食率（％）−赤血球貧食単球／全単球結果を第１表に
示した。

第１表 イーグル培地　　　　　　　　３７ｏ３±２，９ヒトペ
プシンおよびヒト白血球ペプシン様酵素はヒト単球によ
る酵母の寅食を促進した。この結果から、ヒトペプシン
およびヒト白血球ペプシン様酵コ；は食細胞の寅食能を
増強することが明らかになった。

実験例２．ヒト単球の抗原情報提供能におよぼす影響 ヒト末梢血単球１０６個／ｍｌに、ヒトペプシンもしく
はヒト白血球ペプシン様百ゲ素を含む１０％牛脂児血清
添加イーグル培地を加えて２０時間。

さらにヒトペプシンもしくはヒト白血球ペプシン様酵素
およびヒツジ赤血球２Ｘ１０７個／　ｍ　ｌを含む１０
％牛脂児血清添加イーグル培地に替えて３７℃５３０分
間培養した。培養後シャーレを洗い、ヒト末梢血リンパ
球３Ｘ１０７個／　ｍ　ｌを含む１０％ヒト血清添加Ｒ
ＰＭ１１６４０培地を加えて７日間培養した。培養後の
リンパ球を集め。

トノシュ（Ｄｏｓｃｈ）らの方法〔ジャーナル・オブ・
イムノロシー（Ｊ、、Ｉｍｍｕｎｏ　１゜）１１８巻、
３０２頁、１９７７年〕に従って。

プラーク数を測定した。結果を第２表に示した。

第　　２　　表 イーグル培地　　　　　　　　　８６±１１ヒトプペプ
シンおよびヒト白血球ペプシン様酵素は異物であるヒツ
ジ赤血球に対するリンパ球の抗体産生を促進した、。こ
の結果から、ヒトペプシンおよびヒト白血球ペプシン様
酵素が食細胞のリンパ球に対する抗原情報提供能を増強
することが明らかになった。

実験例３．マウスマクロファージの異物亥食能におよぼ
す影響 マウス腹腔マクロファージ１０６個にヒトペプシン、ヒ
ｉ・白血球ペプシン様酵素もしくはマウスペプシンを含
む１０％牛脂仔血清添加イーグル培地５ｍｌを加えて３
７℃で培養した。２０時間後。

培地をヒトペプシン、ヒト白血球ペプシン様酵素もしく
はマウスペプシンおよびヒツジ赤血球もしくはヒト赤血
球２Ｘ１０　個を含む１０％牛脂仔血清添加イーグル培
地に替え、さらに２時間培養した。培養後、マクロファ
ージを観察し、ｔｔ食率を、実験例１と同様にして、計
算した。結果を第３表に示した。

第　　３　　表 ヒトペプシンおよびヒト白血球ペプシン様酵素は、マウ
スペプシン同様、マウスマクロファージによるヒツジ赤
血球の寅食を増強した。しかし。

マウスマクロファージによるヒト赤血球の貴会において
は、マウスペプシンかそれを促進したにもかかわらず、
ヒトペプシンおよびヒト白血球ペプシン様酵素は、いず
れも、それを抑制した。これらの結果から、ヒトペプシ
ンおよびヒト白血球ペプシン様酵素は、異種にあたるヒ
ツジ赤血球に対する貴会を促進し、同種にあたるヒト赤
血球に対する貴会を逆に抑制する３食細胞機能調節作用
を有することが明らかになった。

実験例４．好中球の殺菌能におよぼす影響ヒト末梢血白
血球１０５）固、ポリスチレンラテックス粒子１０７１
固、ニトロブルーテトラゾリウム試液５０μｍおよびヒ
トペプシン、ヒト白血球ペプシン様酵素もしくはヒトペ
プシン・ヒト白血球ペプシン様酵素等量混合物を含むタ
レブス・ヘンセライト緩衝液１５０μｌを３７°Ｃ９１
５分間インキュベイトした後、才力ムラ（Ｏｋａｍｕ−
ｒａ）　らの方法〔ケミカル・ファーマシューテイカル
・ビラレチン（Ｃ’、ｅｍ、　　Ｐｈａ　ｒｍ。

Ｂｕｌ　１．）２４巻、２１７５頁、１９７６年〕に従
うて、波長７１０ｎｍにおけるの吸光度を測定した。結
果を第４表に示した。

第　　４　　表 ヒトペプシン　　　　５　　　０．１８１±０．０２０
ヒトペプシン、ヒト白血球ペプシン様酵素および両者の
混合物は好中球の殺菌能を増強した。この結果から、ヒ
トペプシンおよびヒト白血球ペプシン様酵素のみならず
両者を併用した場合にも食細胞機能調節作用が認められ
ることが明らかになった。

実験例５．緑膿菌感染症治療作用 体重的１８ｇのＩＣＲ系マウスを１群１０匹とし、緑膿
菌　（Ｐ、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ＩＦ０３４５株）１
０’ｌｔｌを生食塩水０．２ｍｌに浮遊′した液を脂性
した。１時間後からヒト血清アルブミン、ヒトペプシン
、ヒト白血球ペプシン様酵素もしくはヒ）・ペプシン・
ヒト白血球ペプシン様酵素等量混合物を含む生理食塩水
０．１ｍｌを７日間連日静注し、動物の生死を観察した
。結果を第５表に示した。

第　　５　　表 ヒトペプシン、ヒト白血球ペプシン様酵素および両者の
混合物は感染症治療作用を示した。

実験例６．動脈へのコレステロール沈着におよぼす影響 体重的１８０ｇのＷ　ｉ　ｓ　ｔ　ａ　ｒ系雄ラットを
１群１０匹とし、１０％コレステロール付加飼料にて飼
育した。飼育開始と同時に、ヒト血清アルブミン、ヒト
ペプシン、ヒト白血球ペプシン様酵素もしくはヒトペプ
シン・ヒト白血球ペプシン様酵素等量混合物を含む生理
食塩水Ｑ、１ｍｌを連日静注した。３ケ月後動物を層殺
し、動脈を採取した。動脈１００ｍｇを凍結乾燥後、２
０倍量のメタノール：クロロポルム（１：　３）にて抽
出し。

抽出液５ｍｌを窒素ガス中で乾固させた。残渣中のコレ
ステロールを和光コレステロールキットを用いて測定し
た。結果を第６表に示した。

＊　Ｉ）　＜　０．０５ ヒトペプシン、ヒト白血球ペプシン様酵素および両者の
混合物は動脈へのコレステロール沈着を抑制し、動脈硬
化症治療作用を示した。

実験例７．尿酸塩結晶による炎症におよぼす影響体重的
１０ｋｇの雄イヌの左前脚関節に尿酸ナトリウム結晶１
０ｍｇを注入し、直ちにヒト血清アルブミン、ヒトペプ
シン、ヒト白血球ペプシン様酵素もしくはヒトペプシン
・ヒト白血球ペプシン様酵素等量混合物を含む生理食塩
水１０　ｍ　ｌを静注した。以後２４時間、イヌの歩行
状態を観察した。結果を第７表に示した。

第　　７　　表 ヒトペプシン　　　６　　異常なし ヒトペプシン、ヒト白血球ペプシン様酵素および両者の
混合物は尿酸塩による歩行異常を抑制し。

痛風治療作用を示した。

実験例８．急性毒性試験 体重２０−２５ｇのｄｄＹ系雄マウスを１群１０匹とし
、生理食塩水に溶解したヒトペプシン。

ヒト白血球ペプシン様酵素もしくはヒトペプシン・ヒト
白血球ペプシン様酵素等量混合物２　ｇ　／　ｋｇを静
脈内または腹腔内にそれぞれ投与した後。

１週間にわたって症状を観察したが、何ら異常を認めな
かった。

以」二の実験例で明らかなように１本発明の医薬組成物
の主成分であるヒトペプシンおよび／またはヒＩ・白血
球ペプノン様酵素は食細胞機能調節作用を示すと同時に
１食細胞機能と関連する。腫瘍。

アレルギー、感染症、自己免疫疾患、免疫不全。

動脈硬化症、痛風などの各種の疾患に対する治療作用を
有し、その用量は、急性毒性実験の結果から、充分安全
な量である。また、ヒト由来の蛋白質であるために、抗
原性に起因するアナフィラキシーシａ　’７りなどの重
篤な副作用を招来する危険性も少ないと考えられ、諸種
の腫瘍に対し、臨床上極めて有用な薬剤と考えられる。

　本発明の治療剤は通常注射剤として、静脈内、動脈内
、皮下。

筋肉内および疾患局所などに投与されるが、経口剤、吸
入剤、直腸用坐剤として用いることもできる。ヒトペプ
シンまたはヒト白血球ペプシン様酵素の成人の治療量は
１日当り１〜１０００ｍｇ。

好ましくは５０〜５００ｍｇであるが、症状あるいは用
法に応して適宜増減することができる。また、ヒトペプ
シンおよびヒト白血球ペプシン様酵素を任意の割合で併
用するすることもできる。ヒトペプシン・ヒト白血球ペ
プシン様酵素混合物の成人の治療量は１日当り１〜１０
００ｍｇ、好ましくは５０〜５００ｍｇであるが、症状
あるいは用法に応じて適宜増減することができる。

ヒトペプシンおよび／またはヒト白血球ペプシン様酵素
は任意、慣用の製薬用担体あるいは賦形剤とともに慣用
の方法で医薬用製剤に調製することができる。

注射剤としては用時溶解して用いる凍結乾燥製剤あるい
は注射液剤、経口投与剤としてはカプセル剤１錠剤、顆
粒剤、散剤、あるいは経口用液体製剤、吸入剤としては
凍結乾燥剤、直腸内投与剤としては直腸用坐剤とするの
が好ましい。

次に本発明の実施例を示す。

実施例−１ ヒトペプシン１０　Ｑｍｇを生理食塩水１０　ｍ　ｌに
溶解し、メンブレンフィルターを用いて無菌的に濾過す
る。濾液を滅菌したガラス容器に１．Ｏｍｌずつ充填し
て凍結乾燥し、これを密栓して凍結乾燥粉末製剤とする
。

実施例−２ 凍結乾燥したヒトペプシン１００　ｇ、乳糖９７ｇおよ
びステアリン酸マグネシウム３ｇをそれぞれ秤量した後
均−に混合する。これをＮＯ１２のセラチンカプセルに
２００ｍｇずつ充填したのち腸溶皮膜を施し、腸溶カプ
セル剤とする。

実施例−３ ヒト白血球ペプシン様酵素１００ｍｇを１０ｍ１の生理
食塩水に溶解し、メンブランフィルタ−を用いて無菌的
に濾過する。濾液を滅菌したガラス容器に１．、Ｏｍｌ
ずつ充填して凍結乾燥し、これを密栓して凍結乾燥粉末
製剤とする。

実施例−４ 卵黄レシチンとコレステロールとジアセチルホスフェー
トとを７対２対ｌのモル比で混合し２その１００ｍｇを
１２．５ｍｌのクロロポルムに溶解し、フラスコ壁に薄
いフィルムを調製した。このフィルムとヒトペプシン５
９　ｍ　ｇおよびヒト白血球ペプシン様酵素５　Ｑｍｇ
を含むリン酸緩衝液２５　ｍ　ｌを混合し２分散液を調
製した。超音波処理後、１ｌ１００００Ｘにて遠心し、
得られた沈殿を３　ｍ　ｌの生理食塩水に懸濁し、滅菌
処理後。

ヒトペプシン・ヒト白血球ペプシン様酵素等量混合物含
有リボゾーム封入製剤を得る。

特　許　出　願　人　　持田製薬株式会社１３２

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒトペプシンおよび／またはヒト白血球ペプシン様＾ゲ
   素を有効成分とする食細胞機能調節作用を有する医薬組
   成物。