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JPS595275B2 - 新規な抗生物質生産菌 - Google Patents

新規な抗生物質生産菌

Info

Publication number
JPS595275B2
JPS595275B2 JP21554482A JP21554482A JPS595275B2 JP S595275 B2 JPS595275 B2 JP S595275B2 JP 21554482 A JP21554482 A JP 21554482A JP 21554482 A JP21554482 A JP 21554482A JP S595275 B2 JPS595275 B2 JP S595275B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
substance
soluble
culture
agar medium
water
Prior art date
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Expired
Application number
JP21554482A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS58121790A (ja
Inventor
武夫 出牛
昭夫 岩崎
一博 神谷
俊美 溝口
正人 中山
久克 伊藤
俊人 森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kowa Co Ltd
Original Assignee
Kowa Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kowa Co Ltd filed Critical Kowa Co Ltd
Priority to JP21554482A priority Critical patent/JPS595275B2/ja
Publication of JPS58121790A publication Critical patent/JPS58121790A/ja
Publication of JPS595275B2 publication Critical patent/JPS595275B2/ja
Expired legal-status Critical Current

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗生物質生産菌に関する。
本発明者らは、土壌微生物より各種菌株を分離し、それ
らが生産する抗生物質を探索した結果、5 兵庫県氷上
郡山南町の土壌から分離されたKC−7038株が、グ
ラム陽性菌ならびにグラム陰性菌に対して抗菌力を示す
新規抗生物質を生産することを見い出し、さらにその培
養液より該物質を単離することに成功した。
10この抗生物質はその物理的、化学的及び生物学的性
質が、既知抗生物質のそれと異なることから新規物質で
あることが認められ、KA−7038物質と命名された
KA−7038物質は、通常は分子式 15C17H3505N5で示されるアミノ配糖体(K
A−70381)を主とし、そのほか分子式C13H2
804N4で示されるアミノ配糖体(KA−70381
)及び分子式C15H3204N4で示されるアミノ配
糖体(KA−7038■)からなる混■0 合物として
生産される。
本発明のKC−7038株(微工研菌寄第4388号)
は、兵庫県氷上郡山南町で採取された土壌lyを常法に
より滅菌食塩水10mlに懸濁させ、窒素源としてのN
Z−アミン・タイプAク5(シエフイールド・ケミカル
社製)及びグルコースを含有する寒天培地(pH7.0
〜7.2)に混和し、27℃で7日間培養したのち、生
じた集落を採取し、次いで常法により純化して得ること
ができる。
このものは下記の菌学的性質を有する。各30種培地上
の性質は、特に指示しない限り27℃で21日間培養し
、常法に従い観察したものである。また色の表示はカラ
ー ・ハーモニー ・マニュアル(コンテイナー ・コ
ーポレーション・オブ・アメリカ)の分類に従つた。1
51、形態学的性質 本菌株は、各種培地上で真性気菌糸を着生し、菌糸は単
純分枝し、短い螺旋状の胞子鎖を形成する。
螺旋は2〜3回巻いている。胞子のうの形成は観察され
ない。胞子は楕円形ないし円筒形(0.5〜0.6μX
O.8〜1.2μ)で、胞子鎖に20個ないしそれ以上
形成される。胞子鎖の表面はやや粗面状を呈するが、明
確なこぶ状を呈するには至らず平滑と認められる。1.
各種培地上の性状 1.しよ糖・硝酸塩寒天培地 生育:貧弱、無色。
気菌糸:中程度、粉状、コバートブラウン(211)。
可溶性色素:なし。
2.グルコース・アスパラギン寒天培地 生育:中程度、クリーム(1ica)。
気菌糸:中程度、粉状、白色(a)ないしコバートブラ
ウン(211)。
3.グリセリン・アスパラギン寒天培地 生育:貧弱、無色。
気菌糸゜貧弱、粉状、白色(a)。
可溶性色素:なし。
4.殿粉・無機塩寒天培地 生育:良好、パール(3ba)。
気菌糸:良好、粉状、白色(a)ないしシルバーグレイ
(3f)。
可溶性色素:なし。
5.チロシン寒天培地 生育:良好、アイポリ一(2db)。
気菌糸.中程度、粉状、白色(a)。
可溶性色素:なし。
6栄養寒天培地 生育:良好、ハブ(2fb)。
気菌糸:なし。
可溶性色素:なし。
7.イースト・麦芽寒天培地 生育:良好、ライトホウイート(2ea)。
気菌糸:貧弱、粉状、白色(a)。可溶性色素:なし。
8.オートミール寒天培地 生育:中程度、無色。
気菌糸:良好、粉状、コバートブラウン(211)。
可溶性色素:なし。
9.ペプトン・イースト・鉄寒天培地 生育:良好、クリーム(1−Fca)。
気菌糸:なし。
可溶性色素:わずかに黄色。
.生理的性質 1.生育温度範囲:17〜37℃。
2.ゼラチンの液化:陽性。
3,殿粉の加水分解:陽性。
4.ミルクに対する作用:生育しない。
5.メラニン様色素の生成:陰性。
.炭素源の資化性 ブリドハム・ゴツトリーブ寒天培地上では、下記に示す
炭素源は利用しない。
L−アラピノース、D−キシロース、 D−グルコース、D−フラグドーズ、 しよ糖、イノシトール、 L−ラムノース、ラフイノース、 D−マンニツト。
前記の培地から硫酸銅を除いた培地上ではD−キシロー
ス及びD−グルコースを利用する。
以上の諸性質から、KC−7038株はストレプトミセ
ス属に属するものと考えられ、胞子鎖が螺旋状を呈し、
気菌糸が白色ないし灰色で、胞子表面が平滑で可溶性色
素を産生せず、糖の利用性のうち分類上安定した性状を
示すとされているイノシトール及びしよ糖を利用しない
菌株を、バージーズ・マニユアル・オブ・デイターミネ
イテイブ・バクテリオロジ一第8版(1975年)、シ
ヤーリング及びゴツトリーブのISP菌株、ならびにワ
ツクスマン著[ザ・アクチノマイセテス」に記載の既知
菌株の中から検索すると、ストレフトミセス・アルゲン
テオルス(ISP5226)、ストレプトミセス・グリ
ゼオフスカス(ISP5l9l)及びストレプトミセス
・ピリドミセテイカス(ISP5O24)の3株があげ
られる。しかしKC−7038株はイノシトール及びし
よ糖を除く他の炭素源の利用性及び胞子の微妙な形態に
おいて、ストレプトミセス・アルゲンテオルス及びスト
レプトミセス・グリセオフスカスとは明らかに異なる。
一方ストレプトミセス・ピリドミセテイカスとは、プリ
ドハム・ゴツトリーブ寒天培地上ですべての炭素源を利
用しない点でKC−7038株は共通するが、下記の諸
点で明らかな相違が認められる。すなわち、ストレプト
ミセス・ピリドミセテイカスはSPの各種培地上での生
育が、KC一7038株に比較して悪く、気菌糸の着生
がほとんどみられない。
またKC−7038株はミルク培地上で発育せず、ゼラ
チンの液化が陽性であるのに対し、ストレプトミセス・
ピリドミセテイカスはゼラチンの液化が陰性で、ミルク
培地で生育する。更に硫酸銅を除いたプリドハム・ゴツ
トリーブ培地上でのグルコースとしよ糖の利用性におい
て明らかに相違する。またこれらの代射産物も異なつて
いる。これらの結果から、本菌株に該当する既知菌株は
存在せず、本菌株は新菌株であると認められ、本発明者
らはこれをストレプトミセスSp.黒KC一7038と
命名した。
本発明の抗生物質生産菌は、菌糸が単純分枝し、短い螺
旋状の胞子鎖を形成し、気菌糸が各種培地上で白色ない
しコバートブラウンを呈し、プリドハム・ゴツトリーブ
寒天培地上でL−アラビノース、D−キシロース、D−
グルコース、D−フラグドーズ、しよ糖、イノシトール
、L−ラムノース、ラフイノース及びD−マンニツトを
炭素源として利用せず、硫酸銅を除いたプリド・・ム・
ゴットリーブ寒天培地でD−キシロース及びD−グルコ
ースを利用し、抗生物質KA−7038生産能を有する
ストレプトミセスSP.fKC−7038である。
本菌株の培養には通常の放線菌の培養方法が用いられる
培養基の炭素源としては種々のものが用いられるが、例
えばブドウ糖、殿粉、しよ糖、果糖、デキストリン、糖
蜜、グリセリンなどを単独で又は組み合せて用いること
ができる。更に菌の資化性によつては炭化水素、アルコ
ール類、有機酸、植物油なども用いられる。窒素源とし
ては、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿
素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、大豆粉、酵母
工キズ、乾燥酵母、ペプトン、肉工キズ、コーンステイ
ープリカ一、カザミノ酸、デイステイラーズソリユブル
などが単独で又は組み合せて用いられる。その他必要に
応じて無機塩、例えば食塩、硝酸塩、炭酸カルシウム、
塩化カリウム、塩化コバルト、硫酸鉄など、ならびに微
量の重金属を添加することができる。
更に菌の発育を助け、KA−7038物質の生産を促進
する有機及び無機物質を適宜に添加することができる。
通気培養法を用いる場合には、更に脂肪油、シリコーン
油、パラフインなどの消泡剤が用いられる。培養方法と
してぱ、固体培地上での培養も可能であるが、一般抗生
物質生産の方法と同様に液体培養法、特に深部培養法を
用いることが好ましい。
培養は好気的条件下で行われ、培養温度は一般に20〜
35℃で、24〜27℃付近が好ましい。KA−703
8物質の生産頃振盪培養、タンク培養のいずれの場合も
2〜10日間培養を行うと、本抗生物質が培養液中に生
産蓄積される。培養液中の生産量が最大に達した時点で
培養を停止し、培養物から目的の抗生物質を単離精製す
る。培養▲液から本物質を単離精製するには、KA−7
038物質が水に可溶で一般の有機溶媒に難溶な水溶性
塩基性物質であるため、通常の水溶性塩基性抗生物質の
単離精製法を利用することができる。例えばイオン交換
樹脂、活性炭などによる吸脱着法、セルロース、シリカ
ゲル、アルミナなどを用いるカラムクロマトグラフイ一
、補助剤として高級脂肪酸を加えて、ブタノール、アミ
ルアルコールなどで抽出する方法などを適宜組み合わせ
て用いることができる。培養▲液を、好ましくはPH7
〜9に調製したのち、弱酸性陽イオン交換樹脂のカラム
に通すと、KA−7038物質が吸着される。
これを0.1〜3.0規定のアルカリ又は酸で溶出し、
活性成分を凍結乾燥すると、KA−7038物質の粗粉
末が得られる。弱酸性陽イオン交換樹脂としては、例え
ばアンバーライトIRC−50,.IRC−84又はC
G−50(ローム・アンドハース社製)、ダイヤイオン
WK−10又はWK−20(三菱化成社製)などが用い
られる。
アルカリとしては、例えばアンモニア水、水酸化ナトリ
ウム水溶液など、酸としては例えば蟻酸、塩酸、硫酸な
どが用いられる。培養▲液をPH7〜9に調整し、目的
物質を活性炭に吸着させ、酸性の水又は塩酸メタノール
で溶出させる方法も利用できる。こうして得られる粗粉
末を、弱酸性陽イオン交換樹脂、CM−セフアデツクス
、CM−セルロースなどに吸着させ、アンモニア水、蟻
酸アンモニウム水溶液などを用いて濃度勾配法又は濃度
段階法で溶出することにより、それぞれ遊離塩基として
KA−70381物質、KA−7038物質及びKA−
70381物質が順次溶出され、各成分に分離すること
ができる。
上記各成分は各々濃縮後凍結乾燥することにょり粉末化
でき、さらにこれを例えばセルロース、強塩基性陰イオ
ン交換樹脂などを用いるカラムクロマトグラフイ一によ
つて精製し、純品を得ることができる。
これらの遊離塩基(1,.1及び)はそれぞれ無機酸例
えば塩酸、硫酸、臭化水素酸など又は有機酸例えば酢酸
、しゆう酸などを加え、常法により対応する酸付加塩に
導くことができる。
KA−7038物質は、KA−70381物質より末端
のグリシル基を除去した構造を有するので、KA−70
381物質をアルカリ又は酸で分解することによつても
KA−7038物質を製造することができる。
この際作用させるアルカリ試薬としては、例えば水酸化
ナトリウム、水酸化バリウムなどの0.1〜4.0規定
水溶液、あるいは酸性試薬としては、例えば0.1〜1
.0規定の塩酸、硫酸などを用いることができる。KA
−70381.同l及び同はいずれも塩基性水溶性の白
色物質で、主としてグラム陽性菌及び陰性菌に対して抗
菌性を示し、更に各種の既知抗生物質に耐性を有する菌
に対しても抗菌性を示す有用な新抗生物質である。
本物質の理化学的及び生物学的性質は下記のとおりであ
る。
KA−70381物質(遊離塩基) (1)外観:白色粉末 (2)分子式:Cl7H35O5N5 (3)元素分析値: CHN 計算値(%) 52.429.0617.98実験値(
%) 51,988.7117.64(4)分子量:3
89(マススペクトル)(5)融点:83〜90℃ (6)比旋光度:〔α〕甘+120.5)(c=1、H
2O)(7)紫外線吸収スペクトル: 220〜360nmで特異的な吸収を示さず、末端吸収
のみを示す。
(8)赤外線吸収スペクトル: 臭化カリウム中にペレツトした赤外線吸収スベクトルは
第1図に示すとおりである。
(9)溶剤に対する溶解性: 水に極めて溶けやすい。
メタノールに易溶。エタノールにやや溶ける。アセトン
にわずかに溶ける。クロロホルム、酢酸エチル、エーテ
ル、ヘキサン、石油エーテルに不溶。GO)呈色反応: ニンヒドリン反応及びライドン・スミス反応に陽性。
坂口反応、塩化第二鉄反応及びフエーリング反応に陰性
。a1)安定性:PH2,O〜8,0で安定。
(自)NMR値:塩酸塩としてδD2O(Ppm)2.
75(3H..s..N−Qb)3.12(3H.s.
N−CH3)3.45(3H..s10Cも) 4.06(2H,.s.C0C川N) 5.32(1H,.d..J−3.5Hz1アノメリツ
クH)(自)マススペクトル値: m/Z39O(M++1)、3601276、258、
230114304)▲紙クロマトグラフイ一 Rf値:0.86 ▲紙:ワツトマン篇1 溶媒:クロロホルムーメタノール一17%アンモニア水
(2:1:1)の下層A5)薄層クロマトグラフイーリ プレートとしては、TLCアルミニウムシート・シリカ
ゲル60−F254O.2mTIL(タルク社製)を用
いた。
KA−7038川物質(遊離塩基) (1)外観:白色粉末 (2)分子式:Cl3H28O4N4 (3)元素分析値: (4)分子量:304(マススペクトル)(5)融点:
85〜102℃ (6)比旋光度:〔α〕甘+61ク(c−1、H2O)
(7)紫外線吸収スペクトル:220〜360nmで特
異的な吸収を示さず、末端吸収のみを示す。
(8)赤外線吸収スペクトル: 臭化カリウム中にペレツトした赤外線吸収スベクトルは
第2図に示すとおりである。
(9)溶剤に対する溶解性: 水に極めて溶けやすい。
メタノールに易溶。エタノールにやや溶ける。アセトン
にわずかに溶ける。クロロホルム、酢酸エチル、エーテ
ル、ヘキサン、石油エーテルに不溶。,.(代)呈色反
応: ニンヒドリン反応及びライドンスミス反応に陽性、坂口
反応、塩化第二鉄反応及びフエーリング反応に陰性。
(自)安定性:PH2.O〜9.0で安定。
02}NMR値:塩酸塩ど・して δD2O(Ppm):2.83(3H..s,.NCH
3)5.84(1H.d.J=3.5Hzアノメリツク
H)(自)マススペクトル値: m/Z3O5(M++l)、214、205、177、
129a4)▲紙クロマトグラフイー: Rf値:0.18 ▲紙:ワツトマン黒1 溶媒:クロロホルムーメタノール17%アンモニア水(
2:1:1)の下層(自)薄層クロマトグラフイーリ プレートとしては、TLCアルミニウムシート・シリカ
ゲル60−F254O.2mm(タルク社製)を用いた
KA−7038物質(遊離塩基) (1)外観:白色粉末 (2)分子式:Cl5H32O4N4 (3)元素分析値: (4)分子量:332(マススペクトル)(5)融点:
74〜83℃ (6)比旋光度:〔α〕帛+78ク(c=0.5、H2
O)(7)紫外線吸収スペクトル: 220〜360nmで特異的な吸収を示さず、末端吸収
のみを示す。
(8)赤外線吸収スペクトル: 臭化カリウム中にペレツトした赤外線吸収スベクトルは
第3図に示すとおりである。
(9)溶剤に対する溶解性: 水に極めて溶けやすい。
メタノールに易溶。エタノールにやや溶ける。アセトン
にわずかに溶ける。クロロホルム、酢酸エチル、エーテ
ル、ヘキサン、石油エーテルに不溶。AO)呈色反応: ニンヒドリン反応及びライドンスミス反応に陽性。
坂口反応、塩化第二鉄反応及びフエーリング反応に陰性
。(自)安定性:PH2.O〜9.0で安定。
02) NMR値:塩酸塩として δD2O(Ppm)2.73(3H.s.N−CH3)
2.83(3H,.s,.N−C塩)3.46(3H.
s.0C財) 5.43(1H..d..J−3,5Hz1アノメリツ
クH)(自)マススペクトル値: m/Z333(M++1)、332、283、2301
219、191、143a4)F3紙クロマトグラフイ
ー: Rf値:0.92 ▲紙:ワツトマン黒1 溶媒:クロロホルムーメタノール一17%アンモニア水
(2:1:1)の下層A5)薄層クロマトグラフイーリ プレートとしては、TLCアルミニウムシート・シリカ
ゲル60−F254O.2mm(タルク社製)を用いた
これらの理化学的性質から、本物質はそれぞれ下記の構
造を有することが認められた。
抗菌作用. KA−7038物質(1、l及び)の各種微生物に対す
る抗菌スペクトルは第1表に示すとおりである。
毒性: KA−70381物質のマウスに対する急性毒性は、1
00ワ/Kg以上(静脈内投与)及び400T1f7/
K9以上(腹腔内投与)である。
本物質は前述のように広範囲の優れた抗菌スペクトラム
を有することから、抗菌性物質として医薬、動物薬など
として有用である。また本物質は種々の誘導体を合成す
るための出発物質としても有用である。次に本発明の菌
を用いてKA−7038物質を製造する場合の具体例を
示す。
例1 殿粉4%、大豆粉0.5%、コーンステイーブリカ一4
%、硫酸マグネシウム・七水塩0.05%、第一リン酸
カリウム0.1%、食塩0.3%及び炭酸カルシウム0
.1%の組成を有し、PH7.Oに調整して滅菌した培
地に、ストレプトミセスKC7O38株を接種し27℃
で約48時間前培養したものを第1種菌とする。
2001容のタンクに種菌培地と同じ培地に綿実油1%
を添加した培地1001を仕込み、第1種菌500m1
を接種し、27℃で通気撹拌方式(220rpm、通気
量501/分)により4日培養する。
培養終了後、培養物に希硫酸を添加してPHを2.0に
調整したのち、f過助剤としてダイカライト(ダイカラ
イト・オリエント社製)を加えて菌体を▲去する。
▲液に希水酸化ナトリウム水溶液を加えてPHを8.0
に調整し、弱酸性陽イオン交換樹脂アンバーライトIR
C−50(NH4+型)のカラムに通し、水洗したのち
1規定アンモニア水で溶出して活性区分を集め、減圧下
に濃縮後凍結乾燥すると、KA−7038物質の粗粉末
9.77が得られる。この粗粉末9.7fを蒸留水11
に溶解し、希硫酸でPHを7.0に調整し、陽イオン交
換樹脂CMセフアデツクスC−25(NH4+型)のカ
ラム(3×150cm)に通し、水洗したのち0.05
規定のアンモニア水51と0.5規定のアンモニア水5
1の間で濃度勾配法を用いて毎時60m1の速度で溶出
する。
溶出液を30m1ずつ分画し、各画分の活性をバチルス
・ズブチリスの寒天平板を用いてペーパーデイスク法で
測定する。活性画分113〜134を凍結乾燥すると、
KA一70381物質の粗粉末0.47が得られ、活性
画分135〜149からはKA−70381物質と物質
の混合物の粗粉末0.367が得られる。
更に活性画分150〜172から、無色不定形粉末とし
てKA−70381物質の遊離塩基の純品0.9tが得
られる。KA−70381の粗粉末0.31f7を蒸留
水に溶解し、弱酸性陽イオン交換樹脂CM−セフアデツ
クスC−25(NH4+型)に吸着させたのち水洗し、
水2.25.eと0.5規定のアンモニア水2.251
の間で濃度勾配法を用いて溶出する。
前記と同様に活性を測定して活性画分を集め、凍結乾燥
すると、無色不定形粉末としてKA7O38l物質の遊
離塩基0,217が得られる。
KA−70381物質と物質の混合物0.26yをセル
ロース粉末300m1を充填したカラム上に均一な層と
して充填する。クロロホルム−メタノール−17%アン
モニア水(2:1:1)の下層部を溶出液として毎時3
0m1の速度で溶離し、溶離液を10m1ずつ分画して
前記と同様な方法で活性を測定する。初めにKA−70
381物質が溶出し、次いでKA−7038m物質が溶
出する。KA−7038物質を含む画分を集め、減圧下
に溶媒を留去し、再び水20m1に溶解して弱酸性イオ
ン交換樹脂CM−セフアデツクスC−25(NH4+型
)5m1のカラムに通す。水洗したのち0.5規定のア
ンモニア水で溶出し、活性画分を集めて凍結乾燥すると
、無色不定形粉末としてKAー7038物質の遊離塩基
0.05yが得られる。こうして得られるKA−703
81物質、物質及び物質の遊離塩基は、それぞれ前記の
諸性質を示す。例2 KA−70381物質14.5ヮを水2m1に溶解し、
水酸化バリウムの6水塩700ヮを加え、100℃で3
.5時間加熱する。
反応終了後、反応液に炭酸ガスを通し、生成する炭酸バ
リウムを除去する。▲液を弱酸性陽イオン交換樹脂CM
−セフアデツクスC−25(NH4+型)3m1のカラ
ムに通し、活性物質を吸着させる。水洗したのち、1規
定のアンモニア水で溶出し、活性画分を集めて凍結乾燥
すると、無色不定形粉末としてKA7O38物質の遊離
塩基6,5即が得られる。
【図面の簡単な説明】
第1図はKA−70381物質の赤外線吸収スベクトル
、第2図はKA−7038川物質の赤外線吸収スペクト
ル、第3図はKA−7038物質の赤外線吸収スペクト
ルである。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 菌糸が単純分枝し、短い螺旋状の胞子鎖を形成し、
    気菌糸が各種培地上で白色ないしコバートブラウンを呈
    し、プリドハム・ゴツトリーブ寒天培地上でL−アラビ
    ノース、D−キシロース、D−グルコース、D−フラク
    トース、しよ糖、イノシトール、L−ラムノース、ラフ
    ィノース及びD−マンニットを炭素源として利用せず、
    硫酸銅を除いたプリドハム・ゴツトリーブ寒天培地でD
    −キシロース及びD−グルコースを利用し、抗生物質K
    A−7038生産能を有するストレプトミセスsp.N
    o.KC−7038。
JP21554482A 1982-12-10 1982-12-10 新規な抗生物質生産菌 Expired JPS595275B2 (ja)

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JP21554482A JPS595275B2 (ja) 1982-12-10 1982-12-10 新規な抗生物質生産菌

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