JPS59501194A - シ−．サ−モセラム由来ｄｎａ配列で形質転換した微生物特に大腸菌、該微生物に由来したセルロ−ス加水分解活性を有する組成物及びこれらの取得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シー、サーモセラム由来ＤＮＡ配列で形質転侠した微生物時に大腸菌、該微生物 に出来しセルロース刀り丞分解活在を再する組成物及びこれらの取得方法 不発ＯＡは、セルロース、ヘミセルロース及びこ几らの誘纏体、より一般的に、 まオリゴ楯類及び率楯孕のＬつなぞｎ目体邊酵によつで荷にエタノール、酢鍍及 び乳酸に変換し侍る奎メ町距な吻質全生籾転侠（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　 ）　Ｌ侍るセルロース力ロ水分解酵素（ｅｎｚｙｍｅｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔ ｉｑｕｅｓ　）の生産のための＊ａな手ｙｘり荷ポＢｇに・ま做生籾皿ひに辺現 な方法に係る。更に本発明は、セルロース又はセルロースめ４坏を美員的割せで き有する切電の産菓率位の変換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　）にそのよよ で１更用し侍る前記の如き一系の組波切又、ま（供袷〕源に係る。このような変 換町罷吻貞の列として、工、郁市光粱吻（檻芥）又は腫粟ｆ発業物、腿にわつの 如さ殖吻注＃貞が李げらｎる。

合口、ｙｌｊえげ、ＺｇＩＫＵＳ、　Ｊ、Ｊ、　（１９８０）　Ａｎｎ、　ｄｅ ｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。

３４、４２３−４６４　又はｄｌｓＡｉｔＩＡ、　Ｖ、Ｓ、及びｊｉ（ＯＳｆｆ ｌ、　’Ｌ’、に、　（１９８１，）ｇｎｚｙｍｅ　、ｙｌｉｃｒｏｂｉｏｌ、 　Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　３．９０−１０４の刊行吻が１証してい／Ｓ工うに、セ ルロース灯科の生籾転侠が児直さ扛ている。このような成魚から、上記刊行−に 記載のように、クロストリジヮム　サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔ ｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｒｎ）という名で佃ら几注の高いセルロース加水分解酵素 を大量に腫生じ将０ものでめり、例えば５０時間のインキュベーションで＠誉吻 １　ｔ”３９．３・ダのオーダーの酵素が得ら几る。

然しながら、屑圧耐気註で好熱狂の微生グを扱うという１米で、Ｃ，ｔｈｅｒｍ ｏｃｅｌｌｕｍの１更用Ｃ１ま困難がないゎσで’Ｓ４”＋　政生籾のこの工う な特注に１９、この微生物を工栗釣乗注で層誉丁金ことか比較的困燻になり。こ の工うな微生％・工、敢俗に教索ｔ−遁蔽し高温荷に６０’Ｃ裡変の１虻での層 誉という兼庄でし刀）セルロースｉ’ＪＯ水分解ｊ索を産生じない。

本発明は、セルロース刀口水分解醇累の産生にＬ９容易に団用し得る新税な手段 、Ｌ９旺細には、散票の不在下でに用する必要がなく・通常の憑岬仮術で十分に 計容し侍る弧度領域で多重の一系を産生し侍る手段を提倶丁＠ことを１四とする 。

不％’／１１よ、セルロース加水分解酵素會コードしているヌクレオチド配列を 言Ｍするに、　ｔｈｅｒｒｎｏｃｅｌｌｕｍの充分短刀１いｉ）　ＮＡ　ｉＪ（ ：クリが、異種の微生物の形頁転疾に使用し侍るという発見に４つくものでめる 。この異種の微生物は、）ｅ貞転侠阪、光分に多重のセルロース７１Ｉ］水分解 ｊ累を産生し侍る工りになり、そのため、こルら異４双生吻を所望の種類のセル ロース加水分解酵素源としてＣ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの代わジに１ｆ用で きると考えろｎる。ρ。

迦コ匹−訓が厳格！ｆ−醒葉全砿云した媒屓甲高温でインキユベートシた時し〃 為券業を産生じ得ないのに、他の微生物時に好気圧、１ＩＩＩＩ劇、・ま通盾７ ）層賃条注Ｆ元分低（゛温要でし〃１を満足な収ぶて＄紫金腫生じ祷ることが１ 餡さｎた。

この工うｔ攻生籾の列こして、・工、％に大腸菌（ｇｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ憇旦 ）９）イσろ几よう、この１厘の畝生物ｆ工、その培養物が急速疋成胃するたり 荷足典尿深いものである。この微生物が産生し侍る。酵素り盪こ廿わせ前記のタ ロク♂、速ｌζ増殖するたの、上述した工う１３’つと困嬢−工未１午のＦでＣ ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ全用いて侍らｆしてし゛た一系の量と比奴して回・ ：呈・麦・ＯオーダーＤ率位時間当り産生１で４累を産生丁。こと、ｊ′−０丁 Ｍａｌこなり。

促って木兄明、工、セルロースｎａ７に分解４累忙コードして２９、Ｃ，ｔｈｅ ｒｍｏｃｅｌｌｕｍタイプの好熱ＣＥ蔚休体受σ吐ｙｖ＝ｎり這伝切電（ｐａｔ ｒｉｍｏｉｎｅ　ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ　）　ｌ’ｃ　田禾丁４１）　ＬＵ　Ａ− じクリに工って、この配列が信王微生物内で元睨ヱが得９末汗で　形ズ転侠さ４ て（゛り。

Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｒｎと、工≠よ０ぼ土切、待Ｖこ詞圧又、工未汗的 好気注湘月６４．　エ　ジ　イ♀疋ぼづＶこ、ま　ｒＬ、ｃｏｌｉ　ｊｉこ・し 氏ゐ。

別記配列は艮ざ０尼分短刀）す゛もりθ）好２（、（，４０千口堰丞（ｋｂ）　 のオーダーを超えないものが好ｌしい。この工つな配列を用いると、宿主微生・ 吻は　待に削記珊！？ｌＪから侍ら几る細施佃出吻の所定の基質に対する酵素宿 性の程１夏で評価さｎる工うな光分な童の酵素を座生じ侍る。前記配列の好ぽし い長さは３ｋｂ禾調である〇 より＃定面には不発明は、Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ　Ｉｃ由白米るＤＮＡ 配列で形質転換した微生籾特に旦、圃に保９、この形質転換さｎた微生籾は、適 尚な緩衝液に名所したカルボモジメチルセルロースの最初栢・・周な浴液の粘度 全減少ざぞる酵素活江に工って識別し得る。このように形貞転滉さｎたば生籾〒 以後時にＩ　Ｃ，ＶＩＣＪと指体する。

＠記載）、’ＪＡ配列で形質転換した本発明θ減生籾ン：・　ｒΣＡ’ｆ’１（ Ｅｉ’ｌ・ａ、−ｖｒ、３７ひ＊０Ｏｉ）、　ｐ、ｔｒ、の技術（１９８２，” σｓｅ　ｏｆ　Ｃｏｎｇｏ　ｒｅｄ　−ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　１ｎｔ ｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔ ｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｆｒ ｏｍ　ｔｈｅ　ｂｏｖｉｎｅ　ｒｕｍｅｎ　’、　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ 。

ｄｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　４３　：　７７７−７８０）　ｆｙ艮して灰出丁ゐこ ともでさる。

この方法、よプレート（ｐｌａｑｕｅｓ　）上でのＣ，ＶｉＣａ８ｅ活注侠出に 基くものでめる。ｖｌｌえは、この仮付を谷臼且のクロー７に堰用する場合、呈 、錐クローンは、−ｖｌＩＬｉ、ｇｇ、　Ｊ、出（１９７２，”　ＩｎＪ：Ｘｐ ｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　’　、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｄａｒｔ＋ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）記載のしＩ ′３回体Ｎ３上３７℃で一晩堵誉丁ゐ。仄いでプレートを、４天０．７％の他に カルボキシメチルセルロース（Ｃ，ｖｌＣ）　０．５％γ言；ぼするＰＣ緩責液 （組成、ま後運丁０）５−で覆う。６０℃で３時、司インチユベーションした麦 、プレートを１％コンゴーレッド７に浴ｌで５漠（、・周囲温度に１分間置く。

矢いでコンゴーレッド浴液を除さプレートをＮａｃｔ　の１−ｖＩ塔奴で況浄す ると、Ｃ，ＶｉＣａｓｅ　寸戎忙τ有する活性クローンが赤地に貢芭光を発して 現出丁Ｑつ不発明、よ＃に形質転換さｎた且鵠旦疋係り、この細胞を培饗、反砕 し・面施壁小う分砺して侍ろ几る粗抽出物ｔ、ＰＣ緩衝孜（５０ｍＭ　Ｋｔｋｉ Ｐ　ｏ、　；　ｌ　２．５　ｍ１ＶＩクエンｚ　：　ｐｉ（６，３）　ｃ４４し たカルボキシメチルセルロースの１．５％（重量／容重）浴液と・この浴液１ゴ につさ、タンパク貞６５μｌｔＳ有する粗抽出物を同じ抜衝孜５０μｔＩ：Ｐ（ Ｃ布状した重の割オで、接触させ、得らＣた混合物１６０ｃで３０分好ｌしくＩ ま１０分間インキュベーションすると、最初の積置が半分に低下する。

積度の減少測定にＩま公知のい丁扛の技術を使用してもよく、例えば　インキュ ベーションの両鏡で槓度抑Ｊ定に遡常用いらｎるタイプの伏足ピペット（ｐｉｐ ｅｔｔｅｓ　ｃａｌｉｂｒｅｅｓ　）　ｆ　４片切が通過する４間の変化を測定 する。、この測定は他の従来の粘度測定機器を用いても容易流行なうことがでさ ９つ形質転換さｎ之匹１匹止θ好ぽしいものよ、又、前記と同様な粗抽出物全別 記テストと同じ菫割曾でカルボキシメチルセルロースと接肚させて、昆片切を６ ０℃で１侍］司インチユベーションしたとき遊離丁０グルコースの当ｊｉ　（ｅ ｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ　ｄｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　）％で表わして、少なくとも０ ．３　％好フシ＜ｔま少・よくとも１％の（、ＶＩＣａｓｅ活証全示す。

本発明の好ぼしく・形貞転挨瀘生籾警；、上述し之定童附荷注に加えて、以下に 示す河刀口け９所注の１種看しくｌ工也のもの又は両刀をも示すものでめるっ 第１の付刀口的待庄り工、削口己ば主吻佃出切のトリニトロフェニルー刀ルボヤ ンメチルセルロース（ＴＮＰ　Ｃ，ｖｌＣ又よｒｃ、ｖｌｃ　）加水分解能でめ ９、この倣王吻を以後１−　ＴＣｙｆＴ　Ｊと指祢丁Ｑつ好ｌしい微生籾は、前 記の如さ粗抽出物が　タ７ノくり買６５μりに相尚する重で１更用し足場片、（ 昆台吻そ６０℃でイ／そユベーションした鏝、１時１間当り少なくとも０．０５ 早伍の吸収と（゛うＴＮＰ　Ｃ，ＶｉＣａｓｅ石注を示す工つなものでめる。

ここで、３５Ｌ）ｎｍのＶ艮の元の吸収変化の測定１直は、ｄＵＡＮＧ及びｆ’ Ａｔ’ＪＧの刀ｇ　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　（１９７６、ｌ、　７ ３．．３６９−３７７）Ｖこ促って表遣したＴＮＰ　−Ｃ−ｖ’Ｉｃ　かり成る 芭原不基質（５ｕｂｓｔｒａｔ　ｃｈｒｏｍｏｇ５ｎｅ）ｌこ対する前記混合物 の作用・に関し、並ひに、同−粂件但し＃ｌ施佃出物の不在Ｆでインキュベーシ ョン鏝上記成分の混合物について測定した吸収と比較して表わされる。

削記微生籾の上述のｙＯ＠将江のフ５第２７）ものは、荷ｌこグ１えば０ｕｃｈ ｔｅｒｌｏｎｙタイプの免役拡散試ｆｉ／Ｃ於いて、Ｊ、　ＰＥＴＲＥ、　ＬＬ 　Ｌ）ＮＧ　Ｉ　ｔ’Ｊ及びＪ、　−ＶｆｌＬＬｇ’ｌ’、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉ ｅ、　１９８１．６３．６２９−６３９　に釣に識別し得るという、削記前出物 千に言１ｎるセルロース加水分、′４＃素の能力でろ◇０ ス艮双土−７＋１・工、ｒ″ｊｒ足のベクターでフレ買伝侠し侍り政生籾小ら侍 るが、このベクター目！Ｉｆよ、フーラスミド、ファージ又ｌまコスミドｎ）； ）、４４ざユるもので、予じｊ）　Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ田米のイン丈 −トで収艮出来て２９、セルロース７１０７に分解酵素をコードして（″るＤ　 ｒＭ　Ａエヅリを言〜で−゛り。

当然でり、０が、月語ｌ−Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ田米インサート」の重 体出来もα工、Ω−ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ　Ｕ）通伝切Ｊｊ　（ｐａｔｒｉ ｍｏｉｎｅ　ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ）荷、（この双生籾の遣云子Ｆ−４按田米丁／ Ｄ　Ｕ　Ｎ　Ａ　ｄｅ列、又は、前記でルロース／＋［］水分≠酵素ｔコートし 侍るυＮＡ配タリりリ削記選云子看しくま対応丁り（！１）ＩＶＡ　ｆクローン 化して埒ろｎる配列でろめ。

好ぽしくｆよ、符に杉頁松侠倣王切が酋、薊でろる場汗に、・ま、微生物の形凪 伝侠及び層委凌少なくとも別記の敗低乗件を滴た丁に光分な菫及び活性のセルロ ース、７＋１１１水分屏４紫ｌＪ＼倣生吻にＬつて産生さｎるようにし得るセル ロース加水分解酵素コード配列を含むイン丈−トを選択子□。

本発明の好よしく・果画悪様によｎｄ、請求、セルロース７Ｊ１１７に分解４素 をコードしてい□遺伝子又は対・芯１）ＮＡの皓でなく、Ω、　ｔｈｅｒｍｏｃ ｅｌｌｕｍ甲での遺伝子の光男を訓脚する１）ＮＡ配列をも貧有するΩ、　ｔｈ ｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ田米１己列でめ０、荷に出来ン丈−トｔま、Ｃ９匝印皿皿 且皿千での通云十の発現が七の制＃Ｆで行なわｎるフロモーター金言ひ。当然で ろるが、この条汗ま必須ではなく、又、セルロース加水分解〆累をコードしてい る遺伝子は、セルロース別水分解能てＭ丁ゐポリペグチドτコードしてい６　ｐ ｆｌ　’）　、工、この遺伝子の一部のか又は寺１曲のυｉＶＡ＜列で代・δで さめ。７７７鋪不兜明Ｖ工、遺伝子（又ｌま遺伝子の−６を若しり１・ま寺１囲 の１）　ｒ’Ｊ　Ａ自じ列）が、宿王微生駒甲でｒｙｒ定タンパク質の転写及び 翻訳を確味丁々１憬閑（ｍａｃｈｉｎｅｒｉｅｓ　）　Ｊに工って識別ざｎ々異 騰めろらゆるプロモーター、符に　″−モーターの一♂ｊ、ＩＩ！下に別項って 瀘か汎でいるような微生物にも及ぶっ 不元明、工削］Ｃのノロさ１／サート７つ忠択室町ｎににする方法をも提共する ％Ｊつでめジ、この方法、まＣ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの１）　Ｎ　Ａ　ｆ 　ｌ橿の市１１眠ｊ素で呵片化丁めこと刀１ろ、ｔつて２９、こ６イてＬジ、光 分な奴り可庁列え汀Ｓａｕ　３　Ａ　Ｉ析片を王、皮し　この断片τベクターｌ こ、中入し　侍ろユ之厘々のツ艮ベクメーで做生物培蓋吻を形貞転侠し・　別記 の条汗でヤルコースｊＪＯ■分屑窮凛を互生丁；Ｓ匍り威層Ｊ吻て遇択丁０こと υ１−Ｔｉ巨１こな０．この選択方法の好よしい尖刑漂嫌で、工、コスミド型・ 、Ｑベクター士：更羽丁〇。このあので、比奴８う眠う几た奴のクローンて侍０ ことつ）でさ、便って遺択慄ｆの４易でり０゜ 央鐵不元明は、Ｃ，ｔｉ＋ｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの遺伝子、ともかくｔルロース ＤＯ丞分解４系を兄税し侍ゐいくつ刀）の遺伝子の発視て■１］仇するＬ）　Ｎ Ａ及びルｒ４　Ａ配列が、典橿イ占主時に旦、　ｃｏｌｉ　／Ｃ工って容認さ往 １与るという月と刀に丞いている。

侍っｎ’ｆＣ形質＝侠Ｓ生吻の生駒イ、まＣ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの屋切 でり／ｂでルロースノＪ口水分所畔系をせ成丁〇といつ舵力、ま、個王減生駒、 工９４疋Ｂ万こは差、鵠肛が、ｆａｌｌ記のｙ口く合板きｎ之ぷ累を培地’Ｆに 分泌し侍、その結果、実ｐｉｐ　Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの層餐に於いて 分泌にｆ−なって現実に行なゎルる工うな４索の成熟化を司罷にする「細施憬関 Ｃｍａｃｈｉｎｅｒｉｅ　ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅノ」を実ｍ（ＣｉＬ、て（・な （゛ため、と９わＶ″ｆ注１丁へぎことである。

勿論、古注クローンを用いて、イン丈−トτ再単離しその配り１］を解析するこ とρ・でさる。更に、再断片化によって、より小さい断片を単離し、この小斯片 ｔプラスミド又、まファージの如＠適轟なベクターに再挿入し、かくの如く変侠 さｆしたプラスミド又１よファージγ再度決定し、こ′ｎ−に工９同じタイプの 微生物を再度形員転俣し得、最後にセルロース刀日水分解−累を合成し得る工つ にｒｊつたば生カそ洒択丁◇ことが日丁龍ですな。

この析片化を行なうｆ゛こは　荷に、訓戒〆話を作用させ、ＡｉＪ記のｙ口く改 変したインナートｔ−ぼ丁Ｑ形貞転侠双生駒のセルロース刃口水分解１＃系発挽 龍刀τ大なわぜないように入夫を生だせしめて竹助詔がでさめ。Ｆ１１４の領王 吻ヂで発揚ざｎ侍０インサートを宮Ｍするプラスミド忙用いて、発成７℃関与丁 ゐυｉ’Ｊ　Ａ配り１］の正しく外部にめる市１ｊ威ｄ笹（荷にイノ丈−トタを 部のベクターの制ｐｄ部ｇ、）で直線化し、この直線１トゲラスミドでエキソヌ クレアーゼ−系レリえは扉索Ｂａｌ　３１７こ工９電ｉ１；ｍＦに木屑切味し、 ＤＮＡ　’）ガーゼを用いてプラスミドご再度碩比し、元米惑頁松侠０Ｔ罷でめ る適当な微生物を同じベクターで形ズ転換し、符に別記のｙＯさ試験の（・ずｎ ρΔτ用（・てこの工う乙形頁松侠さｎた微生物のｏｆ能な光睨屋物の千にりジ 侍ζセルロース別水分解酵素又ｒ’！　ホｌ）　ヘクテドの存在を慣出するここ つ）でさる。ここに記載した１運の操作７よ、ＦｆｒＪ記ぼ生駒が元々発成して いたセルロース刀＋］＊分解酵素又５・まポリベグテドρ）快出ざＣよくなるｌ で媒９返丁。

当、恣のことながら、Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ田米の光分短いＤＮＡ、出 来ｒ片が既：で入手してろｎば、上には溺全記或した一連の原作をあ１９に多く 繰９返丁必要がなく、１回の別記の礫葎が正に予想し侍０７時には適当な配りリ の解析才取って完了するこｎらの操１手・ま・当栗者が合口利用している細織、 例えば　異種プロモーターの制御Ｆ疋（同位相に）配直し工つとする点について は。

Ｃ−、ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ　＋Ｉの全調即這云子安ｇ　（ｇｅｎｅ　−ｅ ｌｅｍｅｎｔｓ　）　ＶＣ対応丁ゐＩ）　ＮＡ配列の単離又は該双生駒の天然の プロモーターから分服さｔ′した遺伝子の一１ｉ論に関する細織を以って丁ｎは 当菓肴にｌま実迦町馳でめ０・フ 更に０足的に１よ本発明は、セルロース加水分所活性、Ｌり荷ｉ　ｄ”ｌ　：Ｃ を工工７ドーβ−１，４−グルカナーゼ、Ｄタイプの活性ｆｉし、荷・に５０〜 ７０Ｃ程度好ぽしくは６０℃程度の温度でセルロースざ一１１７１頁の処理Ｆ− 直接通用し侍る１ｎ戊な組成吻に係る。

この組成吻は犬ノ〕いずｔ′１．刀為でるる。

−罰記条汗で形貞転侠さｎた政生物エク荷足釣には旦、任旦を培地から分離し、 機侃釣又は細施屋清鱗に工って咲ｋｄ砕した後の金庫。侍らｎた組成吻は乾床し て及び／又ｌまその１１使用し優る。

−ＦｉｉＩ記の、丑調製吻から侍ら１、更に一動又、ヱ后庄成分疋槓裏したｍ放 物。後者の場汗、不発明の組既吻ν工、細函壁及び他の梢製残食刀）ら分離して 侍らｎる水名匠抽出吻かつ成り、例えば６０℃のインキュベーン３フ１時間当９ ０．５率団の吸収と（・うＴＮＰ−ＣｍＣａｓｅ活注をＭす活性つ、Ｃｒｌって いる。

徂組成吻・ｌ工そｎ目坏公知の（゛ずｎの方法でも製造できるっ符に、層養吻を 率に乾朦処理するだ汀では壁の仮枠が光分でない礪曾、製造しょうとしている酵 素の活性を変貞丁ゐことなく、製造を促進し得る化学？ｌＪ頁ｌ狸又１工そｎ以 上を礪曾にニジ慶弔する方法によることかできる。

目的とするセルロース刃口水分解＄累が熱的に安定でろるのでそ扛疋ｖ′ｆ谷易 に温度ｔいくらρ）上げりことに工９この目己分牌を容易にすることかでさる。

この温度會上灯ることにより、前記のμ口く処理さｆＬｆＣ砿生切が言Ｍする個 の酵素の大部分を必要に応じて不活化するという効果も得らｎる。

前記の如く破砕さルた。Ｉｔｔｉ施の言Ｍ吻は、特に鈑砕壁の分は後そｎ目体公 知のいずＡかの方法で回収し侍る。傅らｎた抽出物流不溶性残漬の洸浄渚液を混 ぜてもよい。この沈漬を行なうによ、目的とする４素の活性を株存し；：ｊ）； つ二１更用し得る任意の緩衝浴液が便４羽できる。

久いで侍ら几た浴敵ｔ、補足梢裂処４にかげてもよい。このｆｃのｖＣ，ま、そ ｎ目体公知の技術例えばｒ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ’ｒｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｊ、　ＫＩＲＫ　０ＴｄｈｖＩＥＲ，ｖｏｌ、　８ ．　第２版に記載の技術を１更羽する。

更、・て不発明□・＝、セルロース吻貞さ肩素材の処理力法に係り、この方法疋 工９羊楯又まオリゴ棚のタイプの基質が生産され、この楯、まそｎ目不発罪によ り利用しや丁い腫物、例えばエタノール、酢酸又は礼赦ｌＣ変侠ざｎる。不元明 方法の待機は、前記素材と不発明の４系的に活性な組成吻とて、５０〜７０℃、 荷に６θ℃程度の症、ｔで、削占己でルロース百Ｍ累材、こり特定的に、よその β−１，４グリコリル紹８を劇呻丁に分所（解能）するのに必要な噂間反ポざぜ りことでめり。

ｊ！に不発明の補足的持家、ま、酔系回に古注な形貞転侠減生物の取得丙及びそ の活性レベルに関する、図面を５照した非威定面実Ｍ？ｌＪの記載′Ｄ）ろ明ら かとなろう。

図面の簡単な説明 図面中、 一部１図１家、形貞転侠さｌした微生物の抽出物を用いて侍らｎた・種々の活性 試験にｆ−７する代表的な謔素古注囲、腺を示し・−ｇ２ａ図及びｇ２ｂ図は、 Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのセルロース刀ｒＪ７に分４≠素をコードしてい る配列を言肩丁ゐフリスミドＤ序１］衣地図でろ９、 一部３ａＩＡ及び第３ｂ図、ま、前記プラスミド刀）ら切沫しｋＤＮ人配列配列 ＢＲ３２２に弾入するステップの、峨略説明図でろジ、−第４図は、Ｑ、　ｔｈ ｓｒｍｏｃｅｌｌｕｍゲノム田釆の・°セルロース刃口水分解酵素をコードして いＯｉ云−３−ｒ含ひｉ）　ｉ”ｊ　Ａ断片の劇限旭図でろ９・ 一ポ５図、よ、ｐＩ３Ｒ３２２かう誘尋さ、ル之プラスミド（第３ａ図及び第３ ０図ン又ｌま同速ｔＣｐｄＲ３２２から誘導さｎたプラスミドの一部の？！＋Ｉ Ｊ眠地図でめρ、こｎろのプラスミド°、よＳｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍゲノム のＤＮＡ　ｍｅ列・ｌこ田米丁りインサートを含有して２９、このインサートは 、第３ａｄ及び第３ｂ図の改１３ｎ７７プラスミドのインプートとのハイブリダ イゼーシヨノ丑ひにｐＢｉ（３２２９でのこの記クリのクローニング仮のもので ろ０゜ 形ズ伝侠し１４０双生吻こして工、昼ｃｏｌｉ　４２ｇ２　（１山８６゜ｔｒ＋ １１Ｅ３８．　ｍｅｔ　Ｅ７０　ｒｅｃ　Ａ＋　ｓｕｐ　Ｅｒ　）　（Ｙａｌｅ 　（Ｊｎｉｖｅｒｓｉｔｙの≦、」出Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｚｅｎｔ ｅｒ、Ｃ寄託）ＡｔＰＬＧ又びＣａＲＴＩＳＳ、　ｔ９６７゜Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 、　５６．５０３参照。又、１９ｇ２手７月２日ｎｌ−１９７と以ってＣ，Ｎ、 　Ｃ−＝Ｊ、に静託ｐ及び旦叫ｄＢ１υｌ（ξ独■加ｈｓｄＲｒｅｃ　Ａ、）（ ｎ’ｌ　１９６　ｆ以ってＣ，：（Ｃ，−Ａ、　ｔこ寄託＞ｔｑｔ用し７こ。ｊ 更用したコスミドよ、ｒｂ）ｄ＝”Ｊ　、３．　ｓびＣ，ＪＬ、ＬＩ−４ＳＪ、 　（１９８０，ＩＧｅｎｅ＋旦、　２９１−２９８；Ｃ記載さ几、ｄＱｇｄｄＩ ＮＧｇＲ５ＩＡｉ４ＮｄＥｉ−Ｖｆ〃ｈら市販さ扛て（・るｐｄＣ７９である。

Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの１）　、’Ｊ　Ａ　取得ＰＥＴＲｇ　Ｊ、ｅｔ 　ｃａｌｌ、（１９８１）ｄｉｏｃｈｉｍｉｅ、６３．　６２９−６３９ｉＣｊ ｅＪＣの完全培地（ｍ１ｌｉｅｕ　ｃｏｒｎｐｌｅｔ　）　’Ｆで培養したポ抹 ＮＣＩｄ　１０６８２の培誉物刀）ら侍らＪしたＣ、　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕ ｍの全Ｌ）　ｈ’Ｊ　Ａ　ｆ、ＭＡＡ、ｖｌσＲＪ、　（１９６１）　Ｊ、　１ ｉｏＬ　Ｒｉｏｔ、、　３，２０６−２１８に記載の方法により、但しプロテイ ナーゼＫ（１ダ／ゴ）による補足処理τして単記した。？！：！且４２８２の冶 養吻刀λう侍らｎ足プラスミドＤ　Ｎ　Ａｆ　、　ｄＵ、ｖＬＰｔ（ｒｌｆＳＦ 、　ｅｔ　ｃｏｉｌ、　（１９７５）　ｄｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　 Ａｃｔａ＋３８３、４５７−４６カカ法に従って梢装した。父、＠＃物ｌ−から の８品ら 、息速佃出に、工、８ＩｋＬｉ（Ｂｔ）ＩＡ、　ｄ、　ｃ、及び００１．Ｙ、　 Ｊ−（１９７９）　Ｎｕｅｌ。

Ａｃ１ｄｓ、　ｋＬｅｓ、、　７．１５１３−１５２３　に記載の’ｉ１ｇ’ｔ 　Ｉ史用した。

Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの遺伝子バンクの作成Ｑ、　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌ ｌｕｍ’　Ｄ　ＮＡ　５　Ａ　’Ｊ　ｆ　Ｅ５　’Ｔ’！する試料ｔ、０．５単 位の（ｄｉ　Ｓａｕ　３　Ａ　ｌ　（Ｂｉｏｌａｂｓ　）の存在下で５’、ｌＯ 及び２０分間消化した。消Ｉこ友試料そ♂わぜた。九片吻のＤ　Ｎ　Ａ　５μノ 才、予じめ市＋１１＝Ａ　４素、）ａｍ　ｉ（１（Ｂｉｏｌａｂｓ　）に工っで ？６化したｐｄｃ７９６μｇ疋全容槓３０μＬ′：Ｐで頚フロした。１単位のＴ ４０　Ｎ　Ａ　リガーゼ（ｇＯｇＨル１．（Ｇｇ）りの存在下１０℃で１６時間 刀有ブて績片した鏝、フェノール油出及びエタノール化べ疋工ってＤｒＭｋｋ） Ｆｆｌ裏し、欠いでｉ（（ＭＮ　Ｂ、及びＣ０ＬｂＩＮＳＪ、（上掲）に記載の 如き也商用−ｉ衝液（巨□、。ｎ　ｄ　ｅｍｐａｑｕｅｔａｇ。）３０μを千疋 再恐濁した。

矢に、この浴液１５μｔを・開用して同家に１（Ｌ）ｉ（ｘ”４文ひＣ０ＬＬＬ ＪＳの方法に従って大ファージの頭部に桓恨三包甜（ｅｍｐａｑｕｅｔａｇｅ　 ）し之。傅らｎたファージを１更用して旦、９旦４２８２の培譬吻にｇｉｇぜた 。アンピシリン耐圧（λｍｐ　）のクローン１５００１向を単一した。こ几もの クローンのうも１２００個はＩ’ｅｔ　％ボした。こｎ；）（８）ｑ、を腸ｒｍ ｏｃｅｌｌｕｍの遺伝ナバンクτ購成寸よ。

仄ｌこｌ　２００１１ｉｉｉ１のＡｎｎｐ　Ｔｅｔクローンの一〇ｔグラスミド Ｎ　ｆＪＡ宮童について解析した。インサートの長さは２５〜４０ｋｂで変化し ていた。こうして侍らｒｔｆＣ，岨洟体コスミドに１−１２００（ｐＣＴ　ｌ　 ”　ｐｃ’ｒ　１２００でｈ　ツｆｃも））ノ蒼号ｔ’ｎ￥’ｆＬ。

１１表−５９−５０１１９４（８） ４、−４２８２のクローンを、アンピシリン５０μ７／／’ｅ言Ｍする［ルリア ブイヨン（ｂｏｕｉｌｌｏｎ　ｄｅ　ＬＩＪｔｌＡ　）Ｊ　（ＡＩＬＬＥｍ、　 Ｊ。

ｄ、、　ｇｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　＋ｄｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ　：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｏｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１ ９７２．４３３　頁〕として矧らｎて（・０老地千で１晩培養した。；Ａｍｆ− ５７０ｎ　ｍでの吸収の埴が１５になるまでＰＣ緩衝辰千に再度人ルた。

次に釉ｔＳｔ超昔波で磯燻的に仮枠した。不浴注画分の分離硬、得らルた浴液を その１１使用して試験にかしす、Ｃ，ＶＩＣ浴液の粘度の、或少を測定し且つこ の同じ浴数干に遊離した還元性残基を測定した。

ｔシロ−スフ１Ｄフに７）屏４索にオ生し侍ると認めろｎたクローンに河しても 同僚疋、細施悪濁孜〃）ろ５７０ｎｍの光学ぞ度が７５でめる粗細出物を侍、こ の粗細出物に対して矢の補足梢裏処理τ施し之。

−侍っ几た浴数＞　６　ＬＪ　’Ｃ（Ｃ５分間刀口熱し、−面層アンモニウムｔ Ｂ口えて最終−要が朗和の９０％になるまでタンパク貞を工跋し。

一班殿”ｌ　鰭ｔ　Ｐ　Ｃ緩勇敢甲に得度扇濁し、−〇の浴数”７に’Ｃ裳簀液 に対して虚析して懺戚アンモニワムをｇ　云り且ツ婬索、−ａ　ｄの竣ｆｋＡＱ σＡＣＩＤ　ｌ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　）で調整する。厳格濃度は徂抽出吻 の初期容量に対して１／２５であゐ０ セルロース刀ロ丞分所ン古注を慣■右Ｊ−るクローンの恢出＠記バンクの１２０ ０個のクローンの粗細出物ｔｉＯ個丁つＩとめ、得らｎｆｃ″＆佃出吻の油出Ｃ ａ５ｅ活注を、感度が艮（・こと全考慮して粘度測定に工っで職層した。混曾粗 抽出吻のつり２個〃）もポジティブな昭釆、が侍っ４１之。仄に対応する単一ク ローンかう傅らｎた粗細出物につ（゛てこのテスト’に慄ジ返した。コスミドｐ ｃＴ１８２及びｐＣＴ２６２を担持するクローン２１向（こＡｅｐＣＴＬ及びｐ ｃ’ｒ　２と再度館名した）がＣ，ｖｌＣの屏ｊＬ　’Ｔｊｆｒ　ｔ　ｍ起する 相刀勿ｆｉ侍していた。この耕しい硲名にエロ名称ｐｃＴ１及びｐｃ’ｒ２ｉ以 鹸このクローンに対して１更用した。

りｏ−７ｐＣＴｌ及びｐｃ’ｒ２；ｏｘら傳らｒ’−７’Ｃ４佃出？ＩＪｌｃよ って誘起ざｔ′Ｌ／）解重会の効果を評何丁な定めＶ′こ使用した栢〈徂１１足 法に、ｋＬｄＨＮ　Ｋ、　Ｅ、　ａｔ　Ｃｏ１１．　（１９７５，ｌ　ｇｕｒ、 　Ｊ、　Ｒｉｏｃｈｅｍ、、　５１．２０７−２１１に記ｇざｎている。この方 法の原理は本発明の好ましく゛微生物（皿、ｉＱ！ｉ）の定義、・ζ関して上述 した。反応屁せ吻拭料０．２−が周囲温度で０．２ｍｌのピペットＫ１．ａＡＡ 　５１７紙３７０２２　ケ通泊丁心時間會剣足して枯藏変化全評１曲した。屁酋 切ｌまＰＣ緩衝ｇ１ｆ＋１．５％Ｃ↓ｄｃ１−及び粗油出物５０μｔから構成ざ ｎていた０Ｃ−ｖＩＣとＥ、　ｅｏｌｉ　（ｐＣＴ　１　）の油出物との混合物 及びｃ、ｖｔｃと呈、　ｃｏｌｉ　（ｐＣＴ２　）の油出吻との混汗吻で侍らｎ た通過時間（秒）の変化を、インチユベーション４間の増加に対する関数として 大々第１図の曲縁１及び４疋示す。上記クローン２個から侍ろｎた粗細出物？、 上述の条件で、本発明の形質転侠さｎた好孟しい旦、釧の刀テゴリーに片わせ、 Ｃ，’１Ｃａｓｅ及びｒｚ’ＺＰＣ−ｖｉｃａａｅ活性りつ（・て同機ｔこ拭議 した。ＣｔＶＩＣａａｅ活注に関してｌま　Ｓｔ）＋ｖｌ＋）ＧＹＩ　ＮＥＬＳ ＯＮ　（Ｊ９４４）　Ｊ、　８ｉｏ１．　Ｃｈａｍ−、１５３，３７５−３８０ ７）７ｊ法に工ってＣ−ＶＩ　Ｃ刀・ら遊離さｎた遁元楯の量を測定して評面し たことを江記丁ゐっ ｄ禰２及び３．・ま、大々、ｐｃ’ｒｌで形貞伝決し之茎、二但小ら得らｎる粗 油出物のＣ，ｖｉＣａｓｅ活注い従軸の一刀に遊離÷６造グルコース当童（％） として示す）反ひＩ’ＮＰ　ＣｙｉＣａｓｅ活注（成力の媛帽に吸収４位として 示す）の変化を表わしている。ｄ巌５及び６は・大々・　ｐ　ＣＴ　２で形誓転 侠じ之旦、ヨ旦の祖梱出吻の向−栄注で評１曲し之ＣＭＣａｓｅ及びＴＮＰ−（ ｊｌｔｃ卸ｅ活江を示すっｇ１図の結果を侠討すると、昼二巾４２ｄ２　（ｐＣ Ｔ　１　）及び卦恕旦４２８２　（ｐＣＴ２　）の油出吻両者に汝いて、刀ルボ ー！−／メチルセルロース爾奴の柘岐が息ば／Ｃ戚少し、各々の揚台に遊堰這元 楯の重が峙１用と云に頷渭丁りことに江目さ７１．之い。−刀、旦、二但４２８ ２　（ｐｃＴｌ　）のみが同様に有意義１４　ＴＮＰ　−ＣＭＣａｓｅ活注ｋｑ していた。比較のためにベクターｐｄｃ７９　で形頁転俣した番、ｃｏｌｉ　４ ２８２刀）ら得らｎた粗抽出物を試験してみ友ところ、検出し侍るＣ、１４Ｃａ ｓｅ又ｌまｒｓＰ　−ＣｈＡｃ　ａｓｅ活注テ有していなかった。

Ｆ、、　ｃｏｌｉ　４２８２　（ｐｃＴｌ　）及びＥ−ｃｏ、ｌｉ　４２８２　 ＜、　ｐＣＴ２　）　ｔよ、１９８３手７月４日付で夫々％ｌ−２２８及びＩ　 −２２９としてＣ，Ｎ。

ｃ、−ｖｒ、に谷託さｎている。

以後、ｐｃＴｌに吉’ＥＡるセルロース加水分屏静素ｔコードしている遺伝子ｆ ｚ　ｃｅｌＡ　とし、ｐＣＴ２に言１７１．る対応する遺伝子ｆ　ｅｅｌ　Ｂと する。

第２ａ図及び第２ｂ図１て罪Ｊ限地図を示したグラスミドｐ　Ｃｒ１０１及（Ｊ ：　ｐＣＴ　２Ｌ）　３　ｔｔ、夫々、ｐｃ’ｒｌ＆ひｐＣＴ２ゐイン−ｙ−− トｃ敢初百１６てい之ＥｃｏｇＩ所片と入夫した結未侍らｎたっこの１夫（成功 のイン丈−トの９／１０Ｌジ多い八′こ工っても、（Ｉ）ｉ’ＪＡリガーゼによ って）丹１ｔｉｆｆｌ−３！したグラスミドが、ｐｃｆｌ及びｐＣＴ２ｖこ工っ て大々元−Ａざｎていたてルロース加水分所諦索と明らρ為に同一の坪系七発机 し１４０エクに旦、−沌７辿全変侠する舵力を失なうことｌまながった。侠ぎ丁 りと、２個のプラスミド便って、この入夫によって、白心と丁０グラスミドの艮 ざが、ｐｃＴｌ（１）場ｏｔｌ　３５ｋｂ７＞５１２．５ｋｂ　１Ｃ１ｐ　Ｃ’ ｌ’　２　Ｏ揚＆は４０ｋｂ刀）ら１１Ｊ、３　ｋ　ｂに減少さｆＬる。

第２ａ図及び第２ｂ図、ζカいて、実（太）線部、・工厳初のコスミドｐｌ（Ｃ ７９＜白米して２ジ、帷巌都はＣ，Ｌｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ　′８７）ｌ）　 ＮＡ配列に出来してし・ることに注意さｎたい。市ｎｄ　１部征で視界を定めら ｎる断片を又入夫式せっことがでさ、このＬ′）ｆ−入夫しても再髪閉壊咬侍ら 几侍ゐ再環化グラスミド、工旦、塑」−雁にｉｇ片（ソノグア　スミトｐｃｒ１ ０１及びｐＣＴ２１）３’ｌ：Ｉノ位ｄ’ｔｔ、太夫、第２ａ図及び第２ｂｌＡ に破線弧で概略的に示すンケ切９出し、第３ａ（ｇｌ及び第３０図に従ってｐＢ Ｒ３２２中に仲人してプラスミドｐｃ’ｆ’１ｔ３３　ｍびｐｃ’ｒ２０７　（ 犬ｋ　６．８及び６．７　ｋ　ｂ　）　ｆ侍ｆｚこのプラスミドｐｃＴｉｏａ及 びｐｃ’ｆ’２０７も二、常に、旦１匹扛に辰挽−ス万口水分所謔系を汗成し侍 る工つにでさる。

上記配列Ｓａｌ　Ｉ−ｄｉｎｄ　Ｉ及び１３ａｍｔ（ｌ−出ｎｄｌｒ１更用して １司様に、プリダイモーション法’ｘｒ”ｆＲ’ｒｃ。

寿う几たｍｌ［限断片の長さｉＦ記表１ν℃示す。この断片、・まｃｅｌＡ反び ｃｅｌｌ　を百んでいた。

こｎらの垢釆並びにこルろ■庁とプラスミドｐｃ’ｒ１０１及びｐｃ′ｌ’２０ ３との１拘者について実施した制酸解析の比碩所討に工っで、ゲノムの対応丁心 配列の制限地図をｆ放し之、この訓峡進図を第４図に４１晒的に示す。第４１千 の父子、ま欠り重体ｔ・打丁６　：　Ｂ　：　ｊ３ａｍｄＩ　＋　Ｋｇ　；ｄｇ ｌｌｌ　、　Ｍ　；ｍｎｄＪ　＋　Ｐ：Ｐｓｔｌ　、　ｔＬ：ｇｃｏＲＩ０第４ 図の細長（・艮力形は、夫々、遺伝子ｃｅｌＡ　及びｃｅｌＢ　ケ含むゲノム断 片に対応している。断片ｃｅｌＡ　は３ｋｂよジ短刀１く、唯一のＲａｍｃｔＩ 　ｅＡ位を有して２す、Ｂｇｌｌｌ　、　ＥｃｏｒＬＩ及び出ｎｄｌＨｔ１１位 を欠いている。ｃｅｌＢ’：言む目じ列は３ｋｂエク短刀）く、唯一のＢｇｌ　 Ｉｌ郁鮭有して２ジ、ｒ３ａｍｄ工、　ｇｃｏＲＪ及びｍｎｄ　Ｉ　ｍ位を人い ている。

前記配列を含み、１（ｉｎｄ　！１部位を両端にＭするＤＮＡ断片を再度逆回さ でｐＢ凡３２２中に仲人した。この断片ｌま夫々３．４及び３．６ｋｂの長さを 有して（゛た。このＬうにして遺伝子ｃｅｌＡ及びｃｅｌｌ３の各々乙対して２ 対のプラスミド、り・侍らｎ之。グラスミドｐｅＴｉＵ４及びｐＣＴ１０５は、 反対の２刀回に配回４（ｂたｅｅｌＡ析片全断片でいゐっグラスミドｐＣＴ２０ ８及びｐＣＴ２０９は、同１承疋反対の２ｂ回に配回さ扛たＣｅｌ　Ｂ断片をよ んでいる。この工う、４−シて侍；）ｎたプラスミドの関係のめる部分差ひに比 較のためにｐＣＴ１０３及びｐｃ’ｒ２０７の対応部分を第５図に概略的に示Ｔ 　）　コｔ”Ｌ　；）　７）プラスミドｌま全て、差、」旦例えば旦、鵠１ｉｄ Ｂ１ｄｌ又、ま「ミニｇＩ厩（英佃で・よ皿ｎ１ｃｅｌｌｓ　）　Ｊτ影形成る 塵臼…の形貞転洟ｌこｌ更刊し侍、こｎろのＡ、―Ｌよ既に記載した条件でｆ芙 出０Ｔ罷且つ回収可屈・よ入着のセルロース〃日本分解４紫を産生し侍る工うｌ 【よる。前記イノーゲート７Ｃさデ几る遺伝子が、・受溶俸プラスミド千でのｄ 己１司がどづつごりってｔ、元現ざｎ得ゐという事契７エ、問題こしていつイン 丈−トつ）、元現さ７′Ｌ侍る遺伝子のみなら丁、火照１ｄ王モでこの遣云＋の 転与及び翻訳の調節τ擢美ｌこ丁・０目己グリτもざんで（゛つと（゛り往足の ・阪罠と・ｌゐ。史に。

こｊＬらの粘呆は、呈、μ但中での転与及び−訳を正Ｋに副−丁ゐｒ二ｑｕｌａ ｔｉｏｎＪを識別することもできるという仮説をも叉愕丁め。

児侵学的試嫉 ＰｆＥＴＲｇ　ｔｒ、　ｅｔ　Ｃｏ１１．　（ｇｌｕｃａｎａｓｅ　Ａ　）に記 載の力演ＫＮつで布製したＱ、　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのエンド−β−１， ４−グルカナーゼ、℃対して調製した免授皿Ｔｆｔを用いてこの試験を美施した 。

この免役皿ｒＬよ、ワシ皿ｍアルプミ／の伴在Ｆ予じｆ）　Ｆｒｅｕｎｄアジュ バント千に乳濁した梢裏酵゛累０．２５ｊηｔワ丈キニ圧射して得た。ｃＥ射は ３週「司に亘って規則的に実施した。谷ワ丈ヤ、Ｃ酵素を３Ｌｇｌｌ江射した故 につ丈ギ刀）つ皿渭を採奴した。

０（ｌｃｄＴＥＲＬＯＮＹ　（７）　免ｆ＆敢拭３　（Ｃｔｅ　イテ、ｒｌ、　 ｃｏｌｉ　４２８２（ｐＣＰｌ）の油出物のみが類以条汗で試績したＱ、幽圧画 皿比皿のエンド−β−１，４−グルカナーゼに工って形成さｆした線と竜骨（突 起、二ｐｅｒｏｎ　）全形１１することなく１不の沈殿朦（ｕｎｅｌｉｇｎｅ　 ｄｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　）　ｆ形成する。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　４２８２　（ｐｃ’ｆ’ＬＬ）４ノ　の発＝差ｍｃついても同 様の結果が侍っｎた。ポリベグテド１ｍにポリアクリルアミドゲル上の或気永動 麦分子這５６．ｊ　００　、５５．Ｌ）　ＯＬ）及び５０，２００　（グルカナ ーゼＢ）のバンドに率ｄ匝でさ／）。こｊＬ　′；）ｒ工前記の免投皿清に工っ て兄役沈神丁り。Ｃｆｌ／こ対して、卦！旦４２ｇ２（ｐＣｒ２Ｊ皮ひ酋、ヨ肛 ４２８２　（ｐｄＣ７９）菌体の元曵襦吻で、ま（・刀為なゐ反応も政祭さ几な 刀）つた。

更に、四５己仇皿清５μｔを互、三＋ｌｉ　４２８２　（ｐｃ’Ｊ’　１　）の 粗油出物５０μを疋亮刀口丁めと、ｆ１５変徂１］炬拭躾ｌζ工って一１足した ＣＭＣａｓｅ活注が８５％１凪薔ざｆＬるっ１！！！足、このエフを種類のい刀 ｉ７ｊる阻害モρ、Ｓ山４２８２　（ｐＣ’ｒ２　）の油出物で工児っｎ・Ｉい 。

こｎもの８Ｔ：雇刀１つ侍う几／：Ｉ粘珊、よ、ｐｃｒｌ、フ’要銹９１譚匹匹 肋皿の公知のエンド−β−１，４−グル刀ナーゼｔコードしているＣ。

ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの遺伝子全担持しているということでめる。ｐＣＰｌ が含むインサート、・マ、ｌｏＪ　ａ　Ｋ　Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍがｅ 　ｒ５Ｚ　Ｔる別のセルロース刀日水分所ｍ索ｔコードしている遺伝子七言刊し ている。このこと、工、星、９旦ｄＢｌｏｌ　（ｐｃｒｌＵ８）の発現屋切のう り（ポリアクリルアミドゲル鑞気泳期分４によって侍う几る）分子量６６，００ ０硅変のバントｔこ言ｌｎゐグルカナーゼＢに対して予じめ調装した仇皿清が、 塵！川４１８２　（ｐｃｆｌ　）の発机産物と反−Ｅ＝（、ｔ’ｔかったといり ４冥によって確認した。

Ｅ弓ｏ１ｉ　４２８２　（ｐＣ′ｒ　１　）Ｂｌ−１ｊ　ＪＩＥ、　ｃｏｌｉ　 ４２８２　（ｐｃＴ２　）ノ２１［１１）１１株、工９一般而には辻］及びセユ 」−金言ひ組侠俸で形貞伝侠した≦ベルポ体が腫生丁り洋系后匠レベルは丼茗に 高い。荷に、６０℃での旦、　ｃｏｌｔ　４２８２（ｐｅ’Ｌ’ｌ　）タノバク 頁１．ダ当、ＱＴＮＰ−ＣｉｖｌＣａｓｅ　１ｉ！ｉ注は、Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃ ｅｌｌｕｍ　ｆ同じ層地千同じ条件で５０時１司増殖友１（捩祭ざ４を将０右圧 の３０％のオーダーであり、言い侠え１’Ｌｄ、　Ｑ、　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌ ｕｍ　ｔま卦竺工工９４〜５活程度劣る培養速度である。

前記のｆＡ決不０１橿及び／又ｌ工旧の橿で形貞松侠し之卦ヨ且菌体工、呟呆上 好よしく・層繋条件向えば一１殖速度・ 一非偏在嫌気注そ養、 一濃逓の如さ安！＋１１１な４貞のＩ更、弔という点心≦みて、上記に定義した 条件でセルロース加水分鱗活注を生起させるべく符ｌＣ選択さｎ之淑生吻でのΦ つ従って、不発明Ｊま又、荷に偏性又は条汗面好気江双生吻ｌｃ係９、この倣生 吻の＃敢、・工、Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ　、ｖ％　ｉ生丁り少ｌ−ｊ　 （とも１棟のセルロース刀口水分所膨素に対して予じＪＤ形厩ざ几た兎侵皿Ｔｆ ｔに工って識別さ几ロセルロース別水分所−系を座生じ侍る目巳刀にりめ。ニジ 時定的には、不発明８よ、；）０，２Ｌ）ＩＪ　、　５５，０００゜５６．５０ ０又ｌま６６、Ｌ）００のオーダーの分す重ｔＭするセルロース刃口水分′Ｓ酵 素を少なくとも１種産生丁ゐ偏性又は未汗刊好気江微生切に係る。好デしいば生 吻の例としては、遺伝子ｃｅｌＡ又はｅｅｌＢの全部又は一部がコードしている グル刀ナーゼλ又をよりの１種に対して予じの形成さｎｆｃ兇反皿撹によって識 別さユるセルロース７１Ｉｌ１７に分１ｉｓ与累を産生する倣生吻が革σらｎる つ勿緬　この識別のために、ま、過当な二用」兎反反応将に免疫沈降を１四相丁 ゐことかでさる。好孟しく゛倣生吻はｐ、　ｃｏｌｔ刀λろ訪４ざｒｔ、ｂＯ＊ に、高いＣ，ＶｉＣａｓｅ及び／又はＴＮＰ　−Ｃ，ＪＣａｓｅ　后ａｋ示す粗 細出物を侍ることρ）できる。

上記の分子量の指喋は　ＬＡ＝ｉ４．ｖｉＬＩ、　Ｕ、　Ｋ、　（１＊　７０　 ）　”　Ｃｌｅａｖａｇｅｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｔｕ＋　 ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆｂａ ｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ｒ４”　、　Ｎａｔｕｒｅ＋　２２７　：　６８０− ６７３５の技術に従って、同一の亀気水動糸で１０％’　”ト’デシルｉ改１曲 したっ即ｂ、ミオノン２（１０ｋｄａ１．ホスホリラーゼｂ９２−５　ｋｄａｌ 　＋ワ７皿虜アルブミノｔｉ９ｋｃｉａｌ　＋オバルブミン４６　ｋｄａｌ　、 灰改脱７Ｋ１１：系３Ｊ　ｋｄａｌ　、リソチーム１４．３　ｋｄａｌ　０上記 の目面と丁６　Ｄ　＝”Ｊ　Ａ　折片の分罷は、ＭＡｉ”ＪＩＡｒＩＳｅｔ　Ｃ ｏ１１゜（ｌ　−ｎｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　１ａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　Ｊ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｆ（ａｒｂｏｒＬａ ｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｉ’Ｊｅｗ　′ｌ′ｏｒｋ）　／Ｃａ己ｇの如くして不つ ａＮ　ａ　ｙＲ数千で実流した。市１」眠析斤ｔ１気浴出・ｌでよってゲル刀為 つ口状し罠。一般に、ｘｇ、　ｃｏｌｉの形ｊｊ　ｆ、　Ｉ　、’Ｓ、Ｃ０ｒｉ ＥＮ　ｅｔ　Ｃｏ１１．　の方法（ｒ細＝＜おσ０井呆巳）！ｃＥ仇生吻貞ｍａ ：　Ｒ−因子Ｏｉ’Ｊ　Ａ　／ＣＬ　／；＞　ｇｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ２１１４ ）／Ｃ促って実流した。Ｉ）、ｑ　、入グローブ〆よ、いわゆる［ニック−トラ ／スレージョンＪ　（ｄＩｊ４Ｙ　ｅｔ　Ｃｏ１１．、１９７７、　［Ｌａｂｅ ｌｉｎｇｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｏ　ｈｉｇｎ　５ｐ ｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｂｙ　ｎ１ｃｋｔｒａｎ ｓｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｊ　１．　Ｊ、　 、ｄｏｌ、　Ｒｉｏｌ、　１１３　：　２３７−２５１）ノＭ術Ｋｆ）で、（ａ 　−”Ｆ’、）　ｄＡ’Ｉ’Ｐ　ｘ　用イｌ鍼＝ｃ。

ハイブリダイゼーショ／工、５ＯＵｒＨｔｋｔＮノ）５　ｒ　（１９７）　。

ｌ−１）ｅＬｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａ ｒｒｌｏｎｇ　１）ＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｇｅ ｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　Ｊ　＋　Ｊ、　’４ｏ１．　ｄｉｏｌ、 、　９８　：　５０３−５１７ノによって実施した。

明らかに、本発明は例として記載した実施態様に眠足ざｎることｌく、当栗者ｊ ま後記請求の範囲を逸税丁ゐことｔく１６正ケし侍る。辺調、前記セルロース刀 ロ水分解−索七片成し得る工つにさルる限９、全ての昼蝕英然変異体若しり、・ お変共体又は番臼旦以外の多くの微生′ａ３１−庚用することもでさる。列えば 、池の横内＃ｌ歯又１工佃のｆ４看しくｔよ橿、例えばバチルス料丙えば旦。

ｓｕｔ＋ｔｉｌｉｓ　、更に酵母例えＢ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｓａ　ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ　ｆ便っても工い。勿謔、谷々の場曾に、Ａ択した愼生切を形頁 松侠し侍０適当・１ベクタ−ｋｆ用丁ゐが、その多くのＦｌｌよ既に文献に記載 ざｎてい６゜ｆＦ＋１ｉｊｉこルらのベクターはＣ−ｔｈｓｒｍｏｃｅｌｌｕｍ 由米の配糸τ０−ドして白米、旦、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合、例えは前記 の配列ｃｅｌＡ又まｃｅｌＢのいずｎかを挿入してりるグラスミド２μで序貝伝 侠した４母が関与する。

−５、ｔｃ、必要に応じてプロモーター又、・よプロモーターとして吸舵し侍Ｑ 目巳グリの近傍にＣ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ田米配列が押入さｎてば出来ｎ たベクターケＪ用する。このプロモーターｌまベクターで形貞転洟丁べさよ生籾 の円細施圧ｔ　ｔＶ　Ａポリメラーゼに工って刻成し侍る。

ビ堡 キロｍ暮

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍとは異なり、＝ａ又は条件的好ｉａでろジ、 セルロース力ロ水分ｍ４ｇｋコードして２９Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍタイ プの好熱注醒沫の２を伝物質に白米するＤ　Ｎ　Ａ配タリに工って形質転換さル て３す、且つ、該Ｄ　Ｎ　Ａ配列の発現を生起ぜしの侍る微生物。 ２、、旦、−刀）ら誘導でれたものであることｔ特徴とする請求の乾ｄ１に記載 の微生物。 ３、＠記載）ＮＡＡ配列、４０キロ塩基のオーダーを越えない長さｔ石して３９ 、且つ、軸側の培養、仮砕反ひ維雁壁の分磁麦、侍られた徂佃出＃ρ・、こｒｌ 　Ｐ　Ｃｄ＆Ｋ　（ｓ　ｏｍ、ｙｘ　Ｋ、ｄＰｏ。 ：クエンば１２．５　ｍ−Ｖｌ　：　ｐｄ　６．３　）甲の１．４％（直重／容 重）カルホキツメチルセルロース浴孜とこの浴歇１ｒｎｔ当９削記緩衝奴５０μ ｔで希釈したタンパク貞６５μノｔ′ざＭする重の徂佃出吻の−Ａ曾で按屏ぞし のたとさ、形成した混合物の３０分、好ｌしくは１０分の６０℃インキュベー７ ヨン波に初期積度で少なくとも子分ｌこ減少丁０工つなものでめることを特徴と 丁０謂ポの縄ｄ１又１ま２に記載の値生り。 ４、　削６己Ｌ）ＮＡ目己タリは、４０ヤロ温丞ｔさえない長さをＭしてた徂佃 出吻が、請求の４Ｑ川、３に記載の割付でカルボキシメチルセルロースと媛嘘波 、１昆会吻ｉ６０℃で１時間インチユベーションした衾、遊離したグルコースの 当室％で茨わして少なくとも０．３ガ、好プレ〈Ｉよ少なくともｌガのＣＭＣａ ｓｅ活注を示す工うなものでめ０ことを特徴とする請求の範囲ｌ乃至３のいずｎ 小ｆ−記載の方法。 ５、　前記粗佃出吻りζ、更に、こｎｆタンパク貞６５μ７に相当する量の副台 で１史弔したとさ、イ昆合吻で６０℃でイνモユベー７ヨンした麦、１４百当り 少なくと％０．０５率位の吸収の’Ｅ’ＮＰ　−Ｃ−ＶｉＣａｓｅ　Ｈ方圧でト リニトロフェニル−カルボキシメチルセルロースを方口水分鱗り吋目カをＭして （・々ことｔ時双とする請求の範ｄ３又１・よ４１て記載のば生籾。 ６、　削ｄ己徂佃出吻千に言１ｎ６セルロース刀日水分屏誦系ρゝ・０ｕｃｈｔ ｅｒｌｏｎｙタイプの兄ｓ−ｉ敢試躾に於（゛て、Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕ ｍの細胞外エンド−β−１，４−グルカナーゼに対して予じの調製さｎた仇体に よって免役学的に緘別ざｎることを特徴とする請求の範囲３乃至５のいずｎかに 記載の微生物。 ７−　前記、ｄ佃出吻−Ｆに百１扛めでルロース刀口水分解醇索が、０ｕｃｈＬ ｅｒｌｏｎｙタイプの兎没循淑試滅に於いて、Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃａｌｌｕｍの グル刀ナーゼａ＜対して予じめ調製さｎた抗体によって免役学的に識別さｎＯこ とケ待敢とする請求の範凹３又は４に記載の微生物。 ８、Ｃ，ＬｈｅｒｍｏｃｅＨｕｍの＠　ｉ　０　＝Ｊ　Ａ　ｇ己夕Ｉｆ　”ｚ　 ＨＮするコスミドから成ゐベクターでるり、該コスミドが２５乃至５０キロ塩基 をＭする析片を比収的遇択的に也尉し侍るタイプのものでらることｔｆｊ鐵と丁 り、請求の範囲１乃主６のいずｎｐ＞に記載のば土切を侍るためのベクター。 ９・　嬬ボの４咄８で定義した配列１こ出来する配列にＬつて変換ざｎて２り且 つ削記減生９ＩＪｔ形貝伝俣して該微生物が削記セルロース刀Ｕ水分／Ｗ酵素を 片波し侍０エラにし借るグラスミド又、・よファージ７１＋λら成ることを＋ｆ 畝とする・請求の馳Ｊ１乃至７の（゛ス往刀１に６己框の微生物を得るたＤのベ クター。 １０．３ｋｂ’ｉ４えない炎さのＱ、　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのＤｔｖ　Ａ 　ａｅ列’＆ＫＭするプラスミドから成ることｔ待激とする、請求の範囲ｌ乃至 ７のい丁ｎかに記載の微生′ｍτ侍るためのベクター。 ＩＬ　Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの１）ＮＡ配列が、セルロース７１１Ｃ分 ＄７素全コードしている遺伝子の畑に、元の癲施千で該遺伝子の転写及び翻訳を 制＃する調節要素ｔざんでい０ことｔ符ばとする請求の乾曲８乃至１０のい丁れ かに記載のベクター。