JPS59500632A - 遊離リガンドアッセイ方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遊離リガンドアッセイ方法および組成物本衾凱亘１且 本発明は、当該リガンドが内因性受容体へ封鎖されても発見されるテストサンプ ル中の遊離リガンドの直接的特異結合アッセイに関する。本発明は特に、ＴＢＧ およびアルブミンのようなチロキシン結合タンパクを含んでいるテストサンプル 中の遊離チロキシンのイムノアッセイに関する。

ここの目的で遊離リガンドとは、当該リガンドのための内因性受容体を含んでい るテストサンプル中に非結合状態で存在する、通常低分子量であるが必ずしもそ うでない物質と定義される。そのような受容体の生物学的役割は明確に確立され ていないが、それ、らは遊離リガンドが生物学的プロセスにおいて消費されるに つれて質量作用によって解離し得るリガンドの貯蔵庫として作用するらしい。典 型的には、リガンドの小パーセントを除いてすべてはその受容体へ結合状態で存 在する。

そのような受容体は典型的にはタンパクである。受容体は自家抗体、トランスコ ルチンおよびＴＢＧの場合のように特異的でもあり得るし、または例えばアルフ ミンのように比較的非特異的でもあり得る。内因性なる術語は、該受容体が通常 患者のサンプル中に存在するとか、または生物超厚のものであることさえも意味 しない。それは単に、患者から得られたま＼のテストサンプルが、関心あるリガ ンドのいくらかの割合を結合する受容体を含んでいることが予想されもしくは可 能性あること全意味するだけである。

機敏な臨床医は、彼等の患者の状態を一層正確に評価しようとして、遊離リガン ドアッセイへ益々転じつつある。この努力は遊離リガンドのいわゆる直接イムノ アッセイ、特に遊離チロキシンイムノアッセイの市場への出現によって容易にな った。直接リガンドアンセイは、遊離、チロキシンインデックスにおけるような 計算によってその後に遊離リガンド濃度へ相関させる他の測定法ではなく、遊離 リガンド自体を測定することによって特徴付けられる。

現在直接遊離リガンドアッセイのために二つの手法が存在する。

平衡透析のほかに、スピーディでそして日常的な臨床検査用に特に良く適しない 手法である。両手法において、遊離リガンドはテスト１′　キットに含まれる受 容体に結合され、そして次に結合したりガント′め量が測定される。こ゛れら方 法は、テストサンプル中に存在する内因性受容体がアッセイを妨害することを防 止する仕方に違いがある。

英国特許出願第２，０３０，２９０号の方法においては、内因性受容体は、テス トサンプルから遊離リガンドの吸収後にテストサンプル残渣をテスト受容体結合 リガンドから物理的に分離することにより、すなわち、テストサンプルをリガン ドに対する不溶性化した抗体とインキュベートし、テストサンプル残渣を傾斜し 、洗浄し、トレーサー標識リガンドを加え、そして該抗体に結合したトレーサー の量（これはテスト受容体へ結合したりガントの量外反比例する）を測定するこ とによって除去される。この方法は簡単な既存の試薬を使用するので商業的に有 利である。総チロキシンテストに時々使用されている放射標識チロキシンは、前 記直接チロキシンアッセイに使用するためにも満足である。しかしながら、各リ ガンドは当該リガンドの類縁体を必要とし、そしてすべてのりガンドアソセイに 共通の標識した免疫試薬を使用できなかった。

欧州特許出願第００２６１０３号に記載の直接遊離リガンドアッセイは、内因性 受容体による可能性ある妨害を中性化するための他の系を使用する。受容体を系 から洗浄することにより、標識したりガント類縁体との相互反応から内因性受容 体を排除するのではなく、リガンド類縁体は内因性受容体への結合から化学的に 排除される。

これはりガント類縁体として、内因性受容体へ実質的に結合しないがしかしテス ト受容体へ比較的よく結合するりガント誘導体を使用することによって達成され る。この誘導体は、以後便宜上示差結合リガンドと呼ばれるであろう。この遊離 リガンドのアッセイは、中間洗浄ステップを必要としない利点を有する。しかし ながら、それはアッセイすべきめいめいのそしてすべての示差結合リガンドのた めの注意深くデザインされたトレーサーの特別な合成を必要とする。

将来は種々のリガンドがこのような直接法によってアッセイされると信じられる ので、どのような可能なアッセイについても共通な試薬を使用することが商業的 に望まれるであろう。加えて、もし可能ならそのようなアッセイにおいて標識し た抗体を使用することが有利であり、その利益は製造の容易さ、安定性および改 良されたアッセイ性能を含む。

従って本発明の目的は、遊離リガンドの直接アッセイにおいて試薬調製を容易に することである。

本発明は、テストサンプルと、リガンド受容体と、そして未標識示差結合リガン ド類縁体とを混合し、該リガンド類縁体を識別する該リガンド受容体に対し遊離 リガンドと未標識示差結合リガンド類縁体とが競合することを許容するようにイ ンキュベートし、該リガンドまたはりガント類縁体へ結合したりガント受容体の 量を定量し、そして結合したりガント受容体の量をテストサンプル中に存在する 遊離リガンドの量と相関させることよりなる、該リガンドが一種またはそれ以上 の内因性受容体へ結合した状態でも存在するテストサンプル中の遊離リガンドの 定量方法を提供する。

本発明はまた、実質上水不溶性の基質へもしくは実質上水不溶性の基質へ物理的 に吸着された水溶性物質へ、共有結合により結合したりガントであって、該テス トサンプル中に存在するそのようなりガントに・対する受容体のそのような不溶 性リガンドへの結合を実質上排除するように結合されたりガントよりなる、遊離 リガンドおよ２びそのようなりガントに対する内因性受容体を含んでいるテスト サンプルのアッセイに使用する組成物に存在する。

本発明は従って、前記欧州特許出願で必要とする標識した示差結合リガンド類縁 体を必要としない。その代わり、テスト受容体が直接または間接に標識される。

後で説明する！うに、今や多目的または万能トレーサー、すなわちすべての遊離 リガンドアッセイに共通用途を持つトレーサーを口論むことが可能である。

本発明のアッセイ方法は二種の主要試薬、すなわち第１に、不溶化された、また は分析操作の一部として不溶化できる示差結合リガンド類縁体と、第２に、標識 し゛たリガンド抗体かごまたは標識した抗−（リガンド抗体）へ結合した未標識 リガンド抗体を使用する。

示差結合リガンド類縁体は、内因性受容体を相対的に排除しつつ抗リガンド抗体 または他の抗リガンド受容体を結合し得る、リガンドの残部であって、実質上水 不溶性物質へ共有結合した、またはもっと好都合には、（ａｌ不溶性物質へ物理 的に吸着された、または（ｂｌｌ実質上水水溶性物質形成するようにさらに反応 せしめられた、実質上水溶性成分へ共有結合した該リガンド残部よりなる。

このアッセイは、テストサンプルと、リガンド抗体と、そして標識してない示差 結合リガンド類縁体とを混合し、遊離リガンドと未標識示差結合類縁体とが該リ ガント抗体に対し競合することを許容するようにインキュベートし、該リガンド へ、または該リガンド類縁体へ結合したりガント抗体の量を定量し、そして捨金 したリガンド抗体の量をテストサンプル中に存在する遊離リガンドの量に相関さ せることによって実施される。

本　の；４な；■ こ＼で使用する示差結合リガンドを製造するための出発物質は、抗体のような企 図するテストリガンド受容体を結合するが、しかし内因性リガンド受容体を比較 的結合しない、この分野で既知のりガント類縁体である。適当な実例は前述の欧 州特許出願およびそれに引用されている参考文献に開示されている。

適当な出発物質を裂、造する鍵は、リガンド上のどの部位が予期される内因性受 容体へ結合するために比較的に必要であるかを決定することと、そしてそれらの 部位を変性剤への結合基と使用することである。この決定は、リガンドの各種の 位置においてリガンドの電荷、極性まはた立体的アウトラインを変性し、そして 例えばりガントの炭未吸着により好ましくはりガントを分離した受容体への変性 したリガンドの吸収の程度を測定することによって通常達成される。

吸収程度の決定は当業者の伎關範囲内であろう。倒木ば、１４　’Ｃまたは３Ｈ のような放射性原子を含有するりガントは各種の位置で一般に前記のように変性 し得る。受容体とりガントとの混合物をインキュベートし、その後未結合リガン ドを除去するために透析する。もし透析物中に放射能が全くもしくは少ししか発 見されなければ、その時変性したリガンドは適当な出発物質の良い候補である。

リガンドはその内因性受容体への結合に影響することが予期できる任意の数の方 法で変性することができる。そのような結合はリガンドの電荷および立体像の関 数であるので、これら像特性の変性は該リガンドのその内因性受容体に対する親 和性をしばしば変えるであろう。この変性は該親和性を増加または減少させるこ ともあるし、またはそれを大部分変えないこともある。このため多くの場合親和 力の変化を前記またはこの分野で既知の他の方法で実際にテストすることが望ま しい。

適当な例示的リガンド変性は、前に引用した欧州特許出願に記載されている。例 として、リガンドはタンパクまたは合成ポリマーのような大分子上へ置換される ことができる。このかさ高の置換は内因性受容体のりガント類縁体への結合を立 体的に（そして多分電荷効果によって）妨害する。

その代わりに、内因性受容体を結合しない光学異性体を使用してもよい。

その他の立替法は、内因性受容体への結合に関与する基の電荷または極性を変性 することである。例えば、カルボキシル基はエステルまたはアミドを生成するよ うに反応させることができ、アミノ基はアミド化することができ、そして帯電し た部位は−メチル化するこ上記変性の一つまたは二辺上のどれもが一度に実施さ れることができるが、しかし一般に一時に一つだけの変性をすることが好ましい 。

チロキシンの場合、適当な出発物質は、タンパクへチロキシンカルボキシルもし くはアミノ基におけるアミド結合により共有結合したＤ−チロキシンまたはチロ キシンを含む。

一旦適当な非結合性変性リガンドが発見されたならば、サンプルリガンドと企図 したりガント類縁体の両方を結合し得るテスト受容体を得なければならない。

タンパクを不溶化する技術は広く普及しており、そしてイムノアッセイ技術にお いては普通の使用であるため、水溶性タンパク置換リガンドが水不溶性示差結合 リガンド類縁体を製造するための出発物質として使用するのに好ましい。リガン ド類縁体のタンパク成分は、アッセイの操作の間標識したりガント受容体とのイ ンキュベーションの前または後で不溶性化することができるが、リガンド置換タ ンパクをアッセイ実施前に不溶性化することが好ましい。これは、好ましくはそ れを公知方法に従ってポリオレフィン試験管内壁へ吸着させるだけを含む１１種 々の方法によって達成することができる。

タンパクはその代わりにグルタルアルデヒドのような試薬で架橋し、そして試験 管壁へ吸着させることができる。

リガンド置換タンパクは、アッセイ操作後ポリエチレングリコールの存在下抗タ ンパクによる免疫沈澱によって不溶性化することがかあらかじめ判明している基 を通じ、不溶性基質へ直接共有結合させることができる。適当な手法はアフィニ テイーク口マトグラフイ−技術から良く知られている。

タンパク置換リガンドは、それらは当該テストにおいて受容体として作用する抗 体をつくるための免疫原としても使用できるので好ましい。タンパク置換リガン ドは、治療および診断技術における抗血清製造の慣用操作に使用するための免疫 原として一般に良く知られている。それらの合成および使用は通常の当業者の伎 橢範囲内である。しかしながら、内因性受容体へ少ししがもしくは全く結合しな いタンパク置換リガンドのみが本発明において使用価値があることが明らかでな ければならない。

リガンドはタンパクへ結合すること以外の方法で変性することができる。そのよ うな場合、テスキ受容体（抗体）は、前に引用した欧州特許出願中に示された態 様で、すなわち示差結合リガンド類縁体と少な（とも構造的に同族である免疫原 に対する抗血清を産生させることによって製造することができる。

抗リガンド抗体は好ましくは収穫した血清から精製される。これは慣用であり、 そして免疫グロブリンを分離するためエタノールもしくはポリエチレングリコー ルによる沈澱と、続いて不溶性示差結合リガンド類縁体上のアフィニティクロマ トグラフィーのような手法を一般に伴うであろう。その代わりに、該抗体を生産 するクローンの細胞からハイブリドーマを製造することができる。該抗体はＩＱ ｌｌリットル１モルのオーダーの平衡定数を持っていなければならない。

次に精製した抗体は、酵素、螢光基、化学発光基、または放射性原子のよう検出 できる基で標識することができる。しかしながら、抗リガンド抗体を上昇させた 動物種の血清に対し上昇させた原料抗血清もしくは抗体を標識することが好まし い。この標識した第２の抗血清は、それを任意の遊離リガンドアッセイに使用で きる点で万能トレーサー試薬である。そのような試薬は、抗体は不溶性受容体に よって既に結合されている小分子リガンドを有効に結合できないので、英国特許 出願第２，０３０，２９０号の方法には使用できなかったであろう。同じ理由に より、そのような試薬は、開示されているリガンド類縁体の大部分が小分子であ るので、欧州特許出願第００２６１０３号の方法において普遍的に使用できなか った。開示されたタンパク置換リガンドに関してさえも、置換の部位はりガント に応じて変わり、そのため一種の抗血清を普遍的に使用できなかった。

アッセイに使用される抗リガンド抗体の量は、定置すべきサンプル中に予期され る遊離リガンドと、不溶性示差結合リガンド類縁体としてのリガンドの見掛は濃 度との合計よりも少なくなければならない。これは、もっとも満足なドースレス ポンス曲線が得られるま度の広範囲を有するテス）＋ンプルのパネルをアッセイ することにより、最善に決定される。

示差結合リガンド類縁体の量、標識した受容体の能力および親和力、インキュベ ーションの温度、および時間、それにこの方法の他のパラメーターはケース毎に この技術で慣用のルーチンな実験によって決定すべきである。簡単にいえば、こ れはテストサンプル中に予期される遊離リガンド濃度範囲にわたって適当なドー スレスポンス曲線が得られるまで、パラメーターを調節することを伴う。

ケース毎にアッセイ・を最適化するのに要する仕事量は、以下の式ニ従っていく つかのパラメータの事前推計を実施することによって減らすことができる。

式中（ｆＨ）＝平衡（平衡透析によって決定できるような）時の遊離リガンド濃 度 ＫＲ＝受容体結合部位の平衡定数 ｂ＝不溶性示差結合リガンド類縁体へ結合した標識抗体の分数レスポンス曲線は この式から決定できるが、しかしこれは抗体結合部位の単一オーダーと、そして 遊離リガンドとそして不溶性リガンドに対し標識受容体の同じ結合力を仮定して いる。特に後者は大部分の場合あり得ようもなく、そのため上の式は時間と実験 を節約するガイドと考えるべきである。諸パラメーターは実験的努力によって最 適アッセイ成績のために最適化されなけれ−ばならないであろう。

災胤皿上 この実施例は代表通な遊罵りガンドアソセイを記載する。定量される遊離リガン ドはＬ−チロキシンである。

した　゛　チロキシン　の　゛ それ自体公知の方法を使用して、Ｌ−チロキシンメチルエステルをカルボジイミ ドによってウシ血清アルブミンへ結合した。免疫グロブリン分画抗血清を以下の 操作によってＤＥＡＥ　（ジエチルアミノエチル）セルロースへの結合からの除 外により、該免疫グロブリン分画へ精製した。抗血清１ｍｌを水３ｍｌで希釈し 、湿った水洗したＤＥＡＥセルロース８ｇへ加えた。３７℃で１時間インキュベ ーション後、上滑液を口過によって除去し、１０ｍＭリン酸経衝液ｐ　Ｈ８，０ の５ｍｌづつによるＤＥＡＥセルロースの４洗液の上滑と合した。合併した上清 は圧力限外口過によって最終濃度８ｍｇ／ｍｊ！へ濃縮した。

精製用および粗製抗体のヨード他用アフィニティーカラムは以下のように調製し た。洗浄し、パンクしたアミノ誘導体化セファローズ（ＡＨ−セファローズ４Ｂ 、ファルマシア、スウェーデン国つプサラ）１０ｍＪを、あらがしめチロキシン 遊離酸５２■を加えた５０％水性ジメチルホルムアミド（５ｏ゛％ＤＭＦ）１０ ｍｊ！へ加えた。

希ＨＣｌを加えてＩ）Ｈを４．５へ調節した。これへ、あらかじめ１−エチル− ３−（３−ジエチルアミノ）プロピルカルボジイミド５゜Ｏ■を加えた水３　ｍ 　Ｉｌを５分間にわたり滴下した。室温で２０時間振とう後、誘導体化セファロ ーズを５ｏ％ＤＭＦおよび水の十分な量で洗い、最後に２５ｍＭリン酸緩衝液ｐ 　Ｈ７，４中に懸濁した。

抗チロキシン抗体の精製およびヨード化は以下のように実施した。

パックしたチロキシン誘導体化セファローズ２ｍｌへ２５ｍＭｌ７７酸緩衝化食 塩水（ｐＨ７，４）４ｍｌと、精製したウサギ免疫グロブリン含有抗チロキシン ２００Ｉ！Ａを加えた。混合物を室温で４８時間振とうし、１０ｍＭリンＭ緩衝 液ｐ　Ｈ７，４の１２ｍｊｌづつで２回洗った。セファローズ１ｍｌを後で使用 するため残した。２．０　ｍ　ｌの０．５　ｍ　Ｍ　＋Ｊン酸緩衝液ｐ　Ｈ７， ４を湿ったゲルの他の１ｍｌへ加え、そして水酸化ナトリウム１０ｔｔｌ中の　 １２５Ｉ（アマージャム社、英国）１μＣｉを加えた。次に新しいクロラミンＴ 　７　ｍ　ｌ　／　ｍ　ｌ水溶液４０ｍｊ！を加えた。室温で６０秒混合した後 、新しいメタ重亜硫酸ナトリウム水溶液８０μｌを加えた。ヨード化したゲルを ガラスカラムに充填したビオゲルＰ２（ビオラッド社、カリフォルニア州すソチ モンド）３ｍＪのトップへ加えた。別に取っておいたヨード化していないゲル１ ｍＡも同様にカラム中に入れた。両方のカラムを同じ手法を使用して溶離した。

カラムを２５ｍｌ１の１０ｍＭリン酸緩衝液ｐ　Ｈ７，４と、次に２０ｍｔｌの ０．１　Ｍクエン酸二ナトリウムで洗った。０．１Ｍクエン酸二ナトリウム（５ ０ｍｌりと０．１　Ｍ塩酸（５０ｍ１）との比例混液よりなる勾配液１００ｍＡ を加えた。分画は０．５　Ｍリン酸緩衝液ｐ　Ｈ７，４中へ直接集めた。ヨード 化したゲルカラムに関しては、ｐ　Ｈ２−、５および１．５の間で溶離する分画 がピーク放射能を含有し、そしてプールした。放射標識しない抗体からの分画の 分析は平衡会合定数３．０　Ｘ　１０”　Ｍ−”を有する高い特異性抗体を示し た。放射標識した抗体の比活性は２．８５　ｘ　１０’　ｍｃｉ／　ｍモルであ った。

゛パ　只薫′±へチロキシンリガンド　０−　の　゛Ｌ−チロキシン１．０ｇを ジメチルスルホキシド２０ｍＪに溶解し、これへＮ−メチルモルホリン２当量を 加えた。ジスクシニミジルスへレート（Ｄ　Ｓ　Ｓ、ピアース・ケミカル・カン パニー、ニューシャーシー州）をこの溶液へ加え、そして混合物を室温で３０分 間混合した。この溶液を水酸化ナトリウム溶液の添加によってｐＨを１０゜０へ 調節した５０％ＤＭＦ４００ｍｊ！に溶がしたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２ ｇの溶液へ加えた。この混合物を室温で２時間かきまぜ、そしてｐＨを水酸化ナ トリウム溶液の滴下によって１０．０に保った。次に溶液を５０％ＤＭＦ　２　 Ｉｌに対し２回４℃で４８時間透析し、次に０．１ｍＭ水酸化ナトリウム溶液６ １に対し４℃で一夜、そして最後に水６１で８時間間隔で５回４℃で透析した。

生成する透析物は凍結乾燥した。

セファデックスＧ１００（ファルマシア、スウェーデン国つプサラ）を２５ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ７，４中に平衡化し、ガラスカラム中に注ぎ、ＰＨ０３中の１ ％ＢＳＡｆ４液２００ｍｌで洗い、そして最後にそれ以上タンパクが溶離しなく なるまでＰＨ０３で洗った。

Ｌ−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳＡ複合体１０■をＰＨＯＳｌｍｆに溶かし、ＰＨ ０３で溶離した。４つのタンパクピークが観察された。

溶離する最後のピークをプールし、そして凍結乾燥によって濃縮した。この物質 の一部のヨード化はクロラミンＴ法によって実施され、そして前もって甲状腺ホ ルモンを除去するため炭末で処理した血清中の血清タンパクへ結合しないことが 見出された。この物質は、標゛準の第２抗体分離ラジオイムノアッセイ法によっ て示されるように精製した抗チロキシン抗体から１２５Ｉ−チロキシンを冒換し ない。

固相抗原はＬ−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳＡ複合体から以下のよ↓５，３０５９ 　（１９７０）　）によって臭化シアンで活性化した。

活性化したセファローズ１ｍＡへ０．１　Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，５の１０ｍ１ に溶かした凍結乾燥し一チロキシンーＤ　Ｓ　Ｓ　−Ｂ　Ｓ　Ａ　０．１１１１ ｇを加えた。室温で１６時間°反応後、セファローズへ結合したし一チロキシン ーＤＳＳ−ＢＳＡ複合体を５０％ＤＭＦおよび水でよく洗い、そして最後に２５ ｍＭリン酸経衝液ｐ　Ｈ７，４のｌＱｍＡ’へ再懸濁した。

セファローズへ結合した複合体の逓倍希釈は２５ｍＭリン酸緩衝液ｐ　Ｈ７，５ 中の未反応セファローズの１０　ｖ／ｖ％懸濁液を用いて行われた。このアッセ イ系は以下の手法を用いて最適化された。セファローズ／セファローズ複合体１ ００１１／、炭未処理ヒト血清５０ｔｔｌ、および９００．ｃｒｊ？の２５ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ７，４中の１２５１−抗チロキシン抗体１５０．０００ｃｐｍ を混合した。この混合物を３７℃で４時間振とうしながらインキュベートした。

インキュベーション後、セファローズを遠心により沈降させ、上清を捨て、次に ２５ｍＭリン酸緩衝液を加えた。ポルチック混合後、セファローズを再沈降させ 、上滑を除去し、固相中の放射能を測定した。固相へ接合した放射能約６０．０ ００を得たセファローズ希釈液、典型的には１　：　１００゜０００を選択した 。既に平衡透析法で測定された遊離Ｔ４値を有するヒト血清サンプルを上のセフ ァローズ組成物希釈液を使用して最適化されたアッセイ系においてアッセイした 。本発明方法と平衡透析との間に満足な相関関係が観察された。

実施±１ この実施例においては、不溶性示差結合リガンド類縁体は、セファローズ複合体 の代わりに被覆されたプラスチック試験管である。

実施例１からの精製したし一チロキシンーＤＳＳ−ＢＳＡは北用および金丸の方 法（北用、金丸、ハＵと」袂虹ｌｅｄハ懸皿…旦り虹Ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ａｎｄ 　Ｄｒｕ　ｓ、　Ｗ、　ｄｅ　Ｇｒｊｙｔｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＢＴ＝ ｒｌｉｎ、　１９７ＥＬｐａｇｅ　５９　）の変法によって正常マウスイムノグ ロブリンへ結合された。実施例１からの純し−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳＡＩ■ ）ｌｒ　５　ｍｌの５０ｍＭリン酸腹衝液ｐ　Ｈ７，０へ溶かした。これへｍ− マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ、ピアース ・ケミカル・カンパニー）のテトラヒドロフラン中１０■／ｍ　ｌ　ｆ４液７５ μｌを加えた。室温で３０時間反応後９、混合物をセファデックスＧｌＯカラム を通過させ、５０ｍＭリン酸緩衝液で溶離した。溶離する最初のタンパク分画を 採取し、プールし、そして真空脱気し、そして窒素で平衡化した。実施例１のＤ ＥＡＥ法によって正常マウス血清から製造した正常マウスイムノグロブリンＧ２ ．θ■を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー ）０．５■を含有する、脱気しそして窒素平衡化した２００ｍ　ＭＴＲＩＳ　− ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８，６中の８Ｍ尿素２ｍｆに溶かした。この混合物を窒素中で 室温で２時間かきまぜた。インキュベーション後、混合物をＤＴＴを除去するた めセファデックス０１００カラムを通し、脱気しそして窒素で平衡化した２’Ｏ Ｏｍ　ＭＴＲＩＳ−ＩＣｊ！で平衡化し、溶離した。タンパク性のボイドボリュ ーム分画をプールじた。ＭＢＳ活性化抗原溶液を尿素中８Ｍとし、そして次に還 元したＩｇＧ溶液と混合し、室温で窒素中２時間かきまぜた。得られる溶液を毎 回６１の２５　ｍ　？ｖｆ　’Ｊン酸覆面液ｐ　Ｈ７，４で１２時間４回遇透析 た。透析物を限外口過により最終容積２．０　ｍ　ｌへ濃縮した。

この溶液１ｍｌ１をり′ン酸緩衝液で１０倍逓倍希釈し、希釈液１ｍ試験管を吸 引乾燥し、１４μｇ　／　ｍ　Ｉｌ正常マウス抗体溶液１．０　ｍ　７！をすべ での試験管へ加えた。２時間静置後、試験管を吸引し、リン酸経衡液で洗い、乾 燥した。逓倍希釈したし一チロキシンーＤＳＳ−ＢＳＡ複合体を含有する被覆試 験管のめいめいへ、炭未処理ヒト血清５０μｌと、実施例１で製造した１２５Ｉ 標識抗チロキシンＩｇＧ　（１５’０．０００ｃｐｎ＋）とを加えた。

３７℃で４時間インキュベーション後、溶液を吸引し、試験管へ結合した放射能 を測定した。　１２５　■抗チロキシン抗体の１５０　、　ＯＯＯｃｐｍの約４ ０％を被覆時結合した複合体希釈液を選び、上の方法で十分な数の試験管をこの 希釈液で被覆した。これら試験管を使用し、上と同じ方法でヒト血清遊離チロキ シン標準液と、次に　１２５■抗チロキシンを添加することによって、標準曲線 が得られた。

実施例１と同じく、遊離チロキシン濃度増加とともに、トレーサー結合の満足な 抑制曲線が観察された。既知遊離チロキシン濃度のヒトサンプルを測定するため この標準曲線の使用は、既知方法との良い相関関係を与えた。

災見皿主 この実施例は実施例２と似ているが、しかし万能な第２の抗体、すなわち前の実 施例で製造された抗チロキシン抗体に特異的な種によって発生する放射能が供給 される。

この実施例のトレーサーは１２５Ｉ標識ヤギ騒ウサギＩｇＧ抗体である。これは 以下の方法で製造された。実施例１からの精製したウサギＩ　ｇＧｌ　０ｃｒｇ をＣｕａｔｒｅｃａｓｓａｓ　（前出Ｃｕａｒｅｃａｓｓａｓ＋　Ｐ、　）の方 法を使用して臭化シアン活性化セファローズ４８１ｇを加えた。反応生成物を１ ０ｍＡの２５ｍＭリン酸緩衝波緩衝液　７．４へ懸濁した。標準的方法によって ヤギから引き出したヤギ抗つ号ギＩｇＧ抗血清１００μｌを反応生成物懸濁液へ 加えた。７２時間インキュベート後、ヤギ抗つサギＩｇＧ抗血清をヨード化し、 実施例１に記載した抗チロキシンと同じ方法で精製した。

このトレーサーを使用するアッセイは以下のように構成した。最適し一チロキシ ンーＤＳＳ−ＢＳＡ−Ｉ　ｇＧ希釈液（実施例２２）で被覆した被覆試験管へ、 炭未処理したヒト血清５０μｌと、そして２５ｍＭ’Ｊン酸緩衝液中の、実施例 １と同様に精製した非標識特異抗チロキシン抗体の種々の希釈液９００μ！を加 えた。試験管を３２℃で４時間平衡化させた後、溶液を吸引によって除去した。

リン酸緩衝液中１２５Ｉヤギ抗ウサギＩ　ｇ　Ｇ５００，０００ｃｐｍを加えた 。３７°Ｃで２時間インキュベーション後、液体を吸引し、そして固相へ結合し た放射能を測定した。ヤギ抗つサギＩｇＧ放射能の１０％結合を与えた非標識特 異抗チロキシン抗体希釈液を探した。

炭未処理ヒト血清を遊離チロキシン濃度既知の正常ヒト血清標準液で置換するこ とにより、遊離ホルモン濃度が増加するにつれてヤギ１２５Ｉ抗ウサギＩｇＧの 結合が減少した標準曲線が得られた。患者のサンプルを測定するために使用した 時、この方法は再び遊離チロキシン測定のための証明された参照方法とよく相関 した。

１際調査報昏

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．テストサンプルと、リガンド受容体と、標識しない示差結合リガンド類縁体 とを混合することと、遊離リガンドと標識しない示差結合リガンド類縁体とが該 リガンド類縁体を識別するりガント受容体に対して競合することを許容するよう にインキュベートすることと、該リガ〉・ドまたは該リガンド類縁体へ結合した りガント受容体の量を測定することと、そして結合したりガント受容体の量をテ ストサンプル中に存在する遊離リガンドの量と相関させることを特徴とする一種 または二種以上の内因性受容体もまた存在するテストサンプル中の遊離リガンド の量の測定方法。 ２、該リガンド類縁体は不溶性である請求の範囲第１項の方法。 ３、該リガンド受容体は抗体である請求の範囲第２項の方法。 ４、該リガンド類縁体はそれがリガンドへ結合した後不溶性化される請求の範囲 第３項の方法。 ５、該リガンドはテストサンプルと混合され、そして遊離リガンドの実質量を結 合するのに十分な時間インキュベートされ、その後インキュベートした混合物が 不溶１生リガンド類縁体と混合される請求の範囲第３項の方法。 ６、該リガンド、テストサンプルおよびリガンド類縁体は実質上同時に混合され る請求の範囲第３項の方法。 ７、リガンドの量はそれをリガンドを結合し得る、標識した受容体と接触させる ことによって測定される請求の範囲第３項の方法。 ８、標識した受容体はＳ、　ａｕｒｅｕｓ　がらのタンパクＡもしくは抗体であ る請求の範囲第７項の方法。 ９、リガンド受容体はトレーサーによる共有結合置換により標識され、そしてリ ガンド受容体の量はトレーサーの量を測定することによって測定される請求の範 囲第１項の方法。 １０、トレーサーはラジオアイソトープである請求の範囲第９項の方法。 １１、テストサンプルと、抗チロキシン抗体と、抗チロキシン抗体に対する標識 した抗体と、そして抗チロキシン抗体を結合するがしかし内因性受容体を比較的 結合しないような態様でタンパクへ共有結合したチロキシンよりなりかつプラス チック容器の壁へ吸着された標識しないチロキシン類縁体とを混合することと、 チロキシンとチロキシン類縁体とが抗チロキシン抗体の限られた量に対して競合 することを許容するようにインキュベートすることと、チロキシン類縁体を残り のサンプルおよび可溶性試薬から分離することと、チロキシン類縁体へ結合した トレーサーの活性を測定することと、トレーサーの活性をテストサンプル中に存 在する遊離チロキシンの量と相関させることを特徴とする内因性受容体もまた存 在するテストサンプル中の遊離チロキシンの量の測定方法。 １２、実質上水不溶性基質へ、または実質上水不溶性物質上に物理的に吸着され た水溶性物質へ共有結合されたリガンドよりなり、該リガンドは、テストサンプ ル中に存在するそのようなリガンドのための受容体がそのような不溶性リガンド へ結合することを実質上排除するように結合されていることを特徴とする遊離リ ガンドおよび該リガンドに対する内因性受容体を含有しているテストサンプルの アッセイに使用する′ための組成物。 １３、水溶性物質はタンパクよりなる請求の範囲第１２項の組成物。 １４　リガンドはホルモンまたは薬剤である請求の範囲第１２項の組″　酸物。 １５、リガンドはチロキシンである請求の範囲第１４項の組成物。 １６、基質はポリオレフィン表面である請求の範囲第１３項の組成物。