JPS5926266B2 - けい藻類の増殖方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、耐着性けい藻（Ｐｈａｅ ｏｄａｃ ｔｙ
ｌ ｕｍｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）のようなけい藻類を
増殖させる方法に関するものである。

けい藻類は、ＮａＮＯ３およびに２ＨＰＯ４を主体とす
る培養液中で光を与えることによって増殖させることが
でき、この培養液中にある種の物質、たとえば土壌浸出
液、あるいはサイトカイニンと呼ばれている植物ホルモ
ンを添加しておくことによって増殖が促進されるととが
知られている。

しかしながら土壌浸出液の場合には、増殖促進効果が不
充分であり、また植物ホルモンは、添加量などの条件に
よって促進効果を示したり、逆に増殖抑制効果を示した
りするために確実な効果が期待できないという欠点があ
った。

この発明の目的は、常に良好で安定した増殖効果が得ら
れるようなけい藻類の増殖力法を提供することである。

本発明者等が行った数多くの実験の結果によれば、土壌
、堆肥、ヘドロなどの物質から通常の熱水抽出によって
得られた一般の土壌浸出液は、その捷まの形態で培養液
中に添加した場合の増殖促進効果は顕著ではないが、モ
レキュラーシーブを用いて濾過を繰り返すことにより、
増殖促進効果の顕著なフラクションと、逆に増殖抑制効
果を示すフラクションとに分離することができることが
判明した。

すなわち土壌進出液は、けい藻の増殖に対して促進効果
を有する成分と抑匍拗果を有する成分との両方を含有し
ていることが明らかである。

本発明者等は、増殖促進効果を有するフラクション中の
有効成分がどのような物質であるかについて追究した結
果、主要な有効成分の一つが２′−デオキシアデノシン
であることを見出し、この発明を完成するに至った。

この実験の概要はつぎのとおりである。

増殖促進物質の検索 標準土壌進出液として、イネワラ完熟堆肥の熱湯抽出濃
縮液を選び、これを凍結乾燥して得た固形物１４４ｍ９
（堆肥２２０ｇに相当する）を蒸留水１．５ｍｌに懸濁
されたのち、不溶物（２５ｍＩ？）を遠心分離（１００
００ｒｐｍ、３０ｍ１ｎ）によって除去した。

得られた上澄をゲル濾過クロマトグラフィ（担体：セフ
ァデックスＧｌ ５ 、１６闘Ｘ８４７ｍｍ、溶出溶媒
：０．０３Ｍ酢酸アンモニウム水溶液、ｐＨ６，７）に
かけた。

溶出液は、■フジ２フ３フ５０ け，各フラクションを凍結乾燥により乾固した。

以上の精製操作の結果、増殖促進活性はゲル濾過クロマ
トグラフィの第９フラクシヨンに認められた。

ついで、この第９フラクシヨンから活性物質をさらに精
製するために、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）
で分取を行い、２５４ｍ１ｎの検出ピークにより、１３
フラクシヨン（Ａ−Ｍ）に分けた。

ＨＰＬＣの詳細はつぎのとおりである。

カラム：マイクロホンダパックＣＩ８ ｌ離ｉ：５％アセトニトリル−酢酸アンモニウム水溶液
（０，ＯＬＭ、 ｐＨ４，０） 検出法：２５４ｍｍおよび２８０７ＩＬｒ／Ｌにおける
紫外部吸収 生物試験の結果、フラクションＣおよびＥに顕著な増殖
促進活性が認められた。

フラクションＣおよびＥは、ＨＰＬＣの特性のうえでは
ほぼ単一の化合物（以下「化合物ＣおよびＥ」という）
のみを含んでいることがわかったので、この化合物Ｃお
よびＥを構造決定が可能な量だけ単離するために、大量
の堆肥から抽出を行った。

増殖促進物質の単離 堆肥２２．５ｋｙの熱湯抽出液１．６７１を凍結乾燥し
て得た固形物１８．２ｇを蒸留水１２０ｍ１に懸濁させ
、遠心分離（１００００回転、４０ｍ１ｎ）によシネ溶
物（４，１０ｇ）を除去した。

上澄を２回に分けてイオン交換クロマトグラフィ（担体
：ＳＰセファデックス、２６ｍｒｎ×９１７ｍｍ）にか
けた。

最初に酢酸アンモニウム水溶液（０，ＯＬＭ、ｐｎ４．
０ ） ７２０ｍ１．で下部分の不純物を溶出除去した
。

つぎに酢酸アンモニウム水溶１（０，０１Ｍ、ｐＨ６，
５） ７２０ｒａｌで溶出したフラクションのうち、化
合物ＣおよびＥを含有するフラクションをまとめた。

この合一フラクションの重量は、凍結乾燥後、堆肥３７
ｋｇに対して７９■であった。

さらは精製する目的で、ゲル濾過クロマトグラフィ（担
体：セファデツクスＧ１５，１０ｍｍ１０ｍｍＸ５７０
出溶媒：０．０３Ｍ酢酸７７モ＝ウム水溶液、ｐＨ６，
５）にかけ、最初の溶出液６８ｍ１を除いたのち、化合
物ＣおよびＥを含む１２ｍ１を乾固して１■弱の組物質
を得た。

最終的に化合物ＣおよびＥを単離するために、ＨＰＬＣ
（カラム：ラジアルパックＣ１８、溶離液：８％アセト
ニトリル−酢酸アンモニウム水溶液（０，ＯＬＭ、 ｐ
Ｈ４，０）、検出法：前述の場合と同じ）で分取を繰返
し行った。

その結果、ＨＰＬＣ的に単一な化合物ＣおよびＥを得る
ことができた。

化合物Ｃの物理化学的データ １）紫外部吸収スペクトル ２）質量分析スペクトル ＋ ｒｎ／ｅ ：２６７ （Ｍ ） 、２５０．２３７．
１７８ ＋１６４．１４８，１３６．１３５（ベースヒ
ーりＬ １１９，１０８ ３）核磁気共鳴スペクトル （２７０ＭＨｚ 、 ＤＭＳＯ−ｄ６．δ）３．５６
（ＬＨ２ｄａ ｔ ５’ａ ）３．６７ （ＬＨ，ｄｄ
、 ５’ｂ ） ３．９６ （ＬＨ，ｄ’ｄ 、 ４’） ４．１４ （ｔＨ，ｔ 、 ３’） ４．６０ （ＬＨ，ｔ 、 ２’） ５．８７ （ＬＨ，ｔ 、 １’） ８．１５ （ＬＨ，’Ｓ、２ｏｒ８） ８．３７ （ＬＨ２Ｓ ５８ｏｒ２） Ｊ５ｔ、 、５ｂ＝１２．２Ｈ２ Ｊ４′、５′８−Ｊ４′、５′１）−３゜６Ｊ３，４−
４１ Ｊ２′、３′−５４ Ｊ１’＋２′−５，５ 化合物Ｅの物理化学的データ （１）紫外部吸収スペクトル （２）質量分析スベク１ヘル ｍ／ｅ：２５１ （Ｍ＋） 、 ２３４．２２１ 、１
６４゜１６２．１３６，１３５（ベースピーク）。

１１９．１０８ （３）核磁気共鳴スペクトル （２７０Ｉ１１７ＩＥ（Ｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６．δ）２．
２５ （ＩＨ，ｍ、 ２’ａ ） ２．７２ （ＬＨ，ｍ、 ２’ｂ ） ３．５０ （ＩＩ（＋ ｄｄ 、５’ａ ）３．６１
（ＬＨ，ｄｄ 、 ５’ｂ ）３．８８ （ＩＨｔｒｎ
、”） ４．４０ （ＬＨ，ｍ、 ３’） ６．３３ （ＬＨ＋ｒｎ、 ］−’） ８．１２ （ＬＨ，Ｓ、２ｏｒ８） ８．３２ （ＬＨ，Ｓ、８ｏｒ２） Ｊ５’ａ＋５’ｌ）＝ １．１９）（Ｚ Ｊ４’ 、５’ａ ＝ Ｊ４’＋ ５’ｌ） ＝ ４
．０Ｊ３′、４′−２，６ Ｊ２ ａ＋３ ＝２．８ Ｊ２′ｂ、３′−５，６ Ｊ２ ａ＋２ ｂ＝１３．３ Ｊｌ、２ａ−６，３ Ｊｔｔ２１）＝７．６ 化合物Ｃおよび化合物Ｅの構造 化合物Ｃおよび化合物Ｅは、上記のような物理化学的デ
ータおよびクロマトグラフ上の挙動から、それぞれアデ
ノシンおよび２′−デオキシアデノシンであると推定さ
れた。

そこでアデノシンおよび２′−チオキシアデノシンの標
準品と物理化学的データを比較したととる、両者はそれ
ぞれよく一致した。

またＨＰＬＣにおいても、化合物Ｃおよび化合物Ｅは標
準品とそれぞれ同一の保持時間を示した。

なお３７ｋｇの堆肥から単離された化合物Ｃおよび化合
物Ｅは、微量のため秤量不可能であったが、標準品のア
デノシンおよび２′−デオキシアデノシンを用いてＨＰ
ＬＣで定量したところ、それぞれ約０．ＩＴｎＩ？であ
った。

以上の結果から、土壌浸出液中の増殖促進物質は、アデ
ノシンのほかに、下記の構造式で表わされる２′−デオ
キシアデノシンであることが化学的に確定された。

本発明者は、土壌浸出液中の増殖促進物質がアデノシン
であることを確認し、アデノシンを添加［７た培養液中
でけい藻類の増殖を行う方法を先に出願した（特願昭５
７−２９９９１号）。

したがってこの発明は、土壌浸出液中に含まれているこ
とが新たに確認された２′−デオキシアデノシンを添加
した培養液中でけい藻類を増殖させるととを４１として
いる。

また２仁デオキシアデノシンの場合にも、アデノシンの
場合と同様に、増殖促進効果は２′−デオキシアデノシ
ンの添加量によって大幅に変化する。

実験の結果によれば、２′−デオキシアデノシンの添加
量が少ない場合には著るしい増殖促進効果が得られるが
、添加量がある限界以上に増加すると増殖抑制作用が現
われ、この限界は約０． ＯＯ０ｌｐｐｍであるととが
確認された。

なお２′−デオキシアデノシンは、酵母核酸を酵素また
は加圧加水分解して得られたものでも、合成されたもの
でもその増殖促進効果は変わらない。

この発明方法で使用される好ましい培養液は、たとえば
つぎのような基本組成を有する。

培養液の基本組成 ＮａＮＯ３３２０ｍｇ Ｋ２ＨＰＯ４８５■ ＦｅＣ１３０，７８〜 ＭｎＣ１２０，０６ｍ９ ＥＤＴＡ ８■ 海水 ６００ｍ１ 純水 ２００ｍ１ このような基本組成に約０．０００ ｌｐｐｍ以下の２
７−チオキシアデノシンを添加した培養液を用いて常法
にしたがってけい藻類の増殖を行わせることによって、
個体数の増加率では大きい差は認められないが、乾燥重
量では著るしい増加が確認された。

実施例 １ 前記の基本組成を有する培養液８００ｍ１をそれぞれ収
容した培養瓶を用意し、その各々に所定量の２′−デオ
キシアデノシンを添加したのち、耐着性けい藻（Ｐｈａ
ｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）の所
定量を接種して培養を行った。

この培養は、約１８．０００ルツクスの人工光を連続的
に照射しながら、ＣＯ２の供給のために空気を約１．２
５１．７ｍ１ｎの流量で導入し、２０℃で１０日間にわ
たって行われた。

培養の終了後、けい藻の個体数、圧縮量および乾燥重量
が測定された。

また同様の条件で、□ ２′−デオキシアデノシンを添
加しないもの、および２仁デオキシアデノシンの代シに
土壌進出液４ｍｌを加えたものについて培養を行った。

これらの結果をまとめて第１表に示す。

なお、個体数は、培養液１ ｒｎｌ当りのＣｏｕｌｔｅ
ｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ値で表わす。

実施例 ２ 実施例１と同様の培養実験を行い、第２表に示す結果を
得た。

実施例 ３ 実施例１と同様の条件で培養実験を繰シ返し、第３表に
示す結果が得られた。

上記の実施例１〜３で得られた結果にもとづいて、基本
組成のみの培養液を用いて得られたけい藻の乾勲重量を
１００として、他の培養液の場合の乾燥重量を計算した
結果を第４表に示す。

以上の結果から明らかなように、培養液中に約０、００
０１ ｐｐｍ以下の割合で２′−デオキシアデノシンを
添加した場合には、基本組成のみの場合、土壌浸出液を
添加した場合、および２′−デオキシアデノシンを０．
０００１以上の割合で添加した場合と比較して、乾燥重
量が著るしく増加していることがわかる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 約０．０００ ｌｐｐｍ以下の割合で２７−デオキ
   シアデノシンを添加した培養液中でけい藻類を増殖させ
   ることを特徴とするけい藻類の増殖方法。