JPS5925363A - チロシン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は式（１）で示されるチロシン誘導体、その製造
法、及びその化合物を基質として酵素活性を測定する方
法に関する。

式中、Ｒはフェニル基ヲ示ス。

本発明物質（Ｉ）は新規な化合物であり、酵素活性を測
定する為の試験薬として有用な化合物である。

本発明〜物質（Ｉ）はアセチルチロシン（ＩＩ）ＯＨ ０Ｈ３０ＯＮＨ−ＯＨ−０００Ｈ とフェノールとの通常の脱水縮合反応にょっ”ｃａ造す
ることかで−ざる。

本発明を実施するに当っては、上記アセチルチロシン叩
とフェノールとの通常の脱水縮合反応によって発明物質
（Ｉ）を得ることができる。本法においてアセチルチロ
シンの水酸基はカルボペンシルオキシ基等の通常使用さ
れる水酸基保護基で保役してもよ（、その場合には脱水
縮合反応後、適尚な保護基脱離反応、すなわち、例えば
水酸基保護基かカルボベンシルオキシ基の場合にはバラ
ゾウム炭素等による接触還元、または臭化水素酸酢酸溶
液による分解反応等船行うことにより本発明物質（１）
を得ること力匁できる。

脱水縮合反応を行うにあたっては原料物質を適”４な溶
媒に溶解し、ＤＯＯ（ジシクロヘキシルカーポジイミド
）　、ＤＰＰＡ　（ジンエール。フォスフォリルアシト
）、クロル炭酸アルキル等のエステル活性化剤を加え、
これにフェノールを加え、必要ニ応じトリエチルアミン
等の塩基を加え、攪拌することにより製造することがで
きる。又、良く知られた酸クロライド法やフェノールの
スルフイツト体としてよく知られたフェニル化剤（Ｂｅ
ｒ、４９　。

２３３９．１９１６）を用いることによっても製造する
ことができるが、上記縮合剤によるものが好ましい。使
用し得る溶媒は、クロロホルム、ジクロルメタン、ジメ
チルホルムアミド、テトラヒドロフラン等通常使用され
るもので、原料物質を溶解するものであれば良い。反応
温度は００〜４０℃で良い。反応終了後、通常行われる
処理方法により、反応液より目的化合物を得ることがで
きる。すなわち、例えばＤＯＯを縮合剤として製造した
場合、析出するジシクロヘキシル尿素を１取して除き、
塩酸水溶液、ＮａＯＨ水溶液、及び飽和食塩水で洗浄し
、無水硫酸マグ坏シウム等の乾燥剤で乾燥後、溶媒を留
去することによυ待ることかできる。目的化合物は、所
望によシ、再結晶、クロマトグラフィー等により精製す
ることができる。

本発明物質（１）は、酵素と接触させろことにより基質
として働き、一定時間抜酵素によシ氷解されて遊離した
フェノールを測定することにより、酵素の活性を測定す
ることが出来る。＃索の活性を測定するという事は酵素
製剤の規格、血中酵素パターンの測定による診断、血中
酵素濃度の測定等の為に非常に重要な事である。従来、
酵素活性を測定するためには種々の方法が知られている
。その一つの方法として、アミノ酸のアルキルエステル
を基質として、酵素と接触させ、そのエステルの氷解の
程度により活性を測定するという方法がある。例えば、
ヘステリン法として良く知られている方法がその一つで
ある。これは、酵素とアミノ酸のアルキルエステルを接
触させ、一定時間後に残存するエステル部分をヒドロキ
シルアミンによジヒドロキサム酸とし、過りロル鉄と反
応させ発色させ、その発色を吸光度として測定し、その
結果よｐ１酵素のエステル氷解能、すなわち酵素の活性
を測定するという方法である。その他、基質を用いエス
テルの氷解能な指標とする方法には、クロモトロブ酸法
などがあるが、これらの方法では、ある程度の酵素量を
必要とし、＃累が低濃度である場合、又は低活性の酵素
の測定には難があった。そこで、発明者は、酵素に対し
てアフイニテイを持ち、更に定量法が簡便であシかつ検
出感度の良い、という三つの条件を兼ね備えた基質とし
ての化合物を検索することによｐ１従来よりも、非常に
優れた化合物、及びその方法を見出すことができた。

本発明を実施するに当っては、酵素と一定量の化合物（
Ｉ）を、適当な緩衝液中で接触させ、一定温度で、一定
時間後に遊離したフェノールを測定することにより、酵
素の活性を迎］定することができる。緩衝液はその酵素
の至ａｐｌ（を有する：ｉＭ鮨な緩衝液でよい。又、反
応温度、反応時間ともに適白な一定条件でよいが、２５
〜３７℃で３０分後に測定するのが望ましい。フェノー
ルを測定する方法は従来、良く知られたガスクロマトグ
ラフィーまたはに層クロマトグラフィー等の物理化学的
方法、過りロル鉄反応、ジアゾカップリング反応、ＦＶ
Ｂ　（ファーストバイオレットＢソルト〕法または４−
アミノアンチピリン法等の化学的方法のいずれの方法を
使用してもよいか、フェノールの測定の場合、反応液に
４−アミノアンチピリン法え発色させ分光光度計により
吸光度として測定する方法がその簡便さおよび検出感度
においてより好ましい方法である。本床は単−酵素系に
おける測定のみならず、種々の＃累が含まれた場合の測
定にも使用できる。すなわち、例えば血清中に含まれる
酵素活性を測定する場合、血清を適当なプレパラートに
添加し、これを電気泳動等によシ酵素を分離し、これを
本発明物質の溶液に浸し適当な時間後、更に上記発色試
薬を加えることにより、従来見ることができなかった血
中酵素パターンを見ることができる。この方法によれば
、種々の病態に起因する酵素パターンの変動を見ること
ができる。

本発明物質は、種々の酵素のうち、特に、炎症系の酵素
として良く知られた、０１エステラーゼ、又はキモトリ
プシンの優れた基質として作用し、アセチルチロシンフ
ェニルエステルヲ基質として、Ｃ１エステラーゼを測定
した場合、従来、酵素基質として知られたアセチルチロ
シンエチルエステル、又はトシルアルイニンメチルエス
テルを用い、ヘステリン法によｐ測定した場合に比べ、
高い検出感度を有していた。

次に本発明の実施例をあげ、更に詳細に説明する。

実施例１ Ｎ−アセチルチロシンフェニルエステルの合成Ｎ−アセ
チルチロシン２２．３　、！９をＮ　、　Ｎ’−ジメチ
ルホルムアミド１２５ｍ１に溶かしフェノールｉｏ、ｏ
！；／、トリエチルアミン１６ｍ１を加え氷冷攪拌下Ｎ
、Ｎ’−ゾシクロヘキシルカーボゾイミド２６．７　、
！ｉ’を刃口え、１時間攪拌した後室温にもどしさらに
一昼夜攪拌する。反応後析出するＮ　、　Ｎ’　−ジシ
クロヘキシル尿素をろ過し℃除ぎ、母液に酢酸エチルを
加え、１０％クエン酸、飽和重そう水、飽和食塩水で洗
浄した後、無水硫酸マグ坏シウムで乾燥した後、躊媒を
留去、残渣をシリカケゞルに吸着させ６％メタノール含
有クロロホルムにて溶出して（るフラクションを集め、
エーテルをカロえて析出する結晶を集める。

収量９．０ｇ、収率３０％、融点１１６〜１１８８Ｃ工
Ｒ（ＫＢｒ）　ａｍ−’　：　３２５０．１７５Ｄ、１
６４０Ｍ５；　　　　ｍ／ｅ２９９Ｍ＋ 元素分析　０１７Ｈ１７ＮＯ４（２９９，３１）として
理論値　０．６８．２１　　Ｈ，５，７３Ｎ、　４．６
８実測値　０．６８．３３　　Ｈ，５，８８Ｎ、　４．
６６実施例２ Ｎ−アセチルチロシンフェニルエステルを基質とした０
１エステラーゼの活性測定法 Ｃ１エステラーゼの希釈液０．５ｍ１ＶＣＮ−アセチル
チロシンフェニル・エステル溶ｉ　（１４，９ｍ９／１
０　”　Ｈ２Ｏ）　０．５　ｍｌ　ｓ及び４−アミノア
ンチピリン溶液（１３４７Ｖ／２０　ＣＪｍｌリン酸緩
衝液）２ｍｌを加え３７°Ｃで６０分反応させる。更に
フェリシアン化カリウム溶液（５００ｍ９／　２００ｍ
ｌクエン酸緩衝液）２ｍｌを加え３７°Ｃで６０分イン
キュベーションし、発色を分光光度計にょシ吸光度（５
００ｎｍ　）として測定し酵素により水解されて遊離し
たフェノールを定量する。この遊離したフェノール量が
酵素の活性度を示す。

参考例１ Ｎ−アセチルチロシンエチルエステルを基質としたＣ１
エステラーゼの活性測定法。（ヘステリン法） Ｃ１エステラーゼの希釈液０．５ｍｌにＮ−アセチルチ
ロシンエチルエステルｉ液（１０μｍｏｌｅｓ　７０．
４　ｍｌ　５％ＤＭＳＯ）　Ｑ、４　ｍｌ、及びリン酸
緩衝液（ｐＨ７，４）　０．１　ｍｌを加える。３７°
Ｃで３０分間インキュベーションした後、ヒドロキフル
アミン溶液（２Ｍ−ＮＨ２ＯＨ−ＨＯＩおよび３．５Ｍ
ＮａＯＨの等量混会物）１．５ｍｌ力口え室温で１５分
間放置する。これに１８％トリクロル酢酸１ｍｌ、４Ｎ
塩酸１ｍｌ、及び１０％塩化第二鉄１ｍｌを加え充分に
か（はんした後３０００　ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心
分離する。上澄液の発色を分光光度計によシ吸元度（５
３０ｎｍ）とし℃測定する。この値はＣ１エステラーゼ
によって水解されずに残った基質の童に相関するもので
酵素の活性は基質のみの値（対照）がら酵素反応を行な
った後に得られる値を引いた値に相当する。実施例２及
び参考例１でｎａ＋定したＣ１エステラーゼの各濃度段
階における結果を図面に示すが前者の方法は後者の方法
に比べ約１０倍の感度を有していることが分る。図面中
Ｏ印は実施例２の方法による標準曲線を、Ｘ印は参考例
１の方法による標準曲線を示す。

【図面の簡単な説明】

図面は０１ニスラーゼ活性の標準曲線を示す。 代理人　浅　村　　　皓 Ｃ１ニスプラーじ“（７，ｆり

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）式（Ｉ） ０■ （式中Ｒはフェニル基を示ｊ） で示されるアセチルチロシン誘導体。
2. （２）弐０１） ＯＨ の脱水縮合反応Ｙることを特徴とする式（Ｉ）する式（
   Ｉ） ＯＨ３０ＯＮＨ＝ＯＨ−００ＯＲ （式中Ｒはフェニル基を示す）で示されるアセチルチロ
   シン誘導体の製造方法。 ３、式（１） ％式％ （式中Ｒはフェニル基を示す）で示されるアセチルチロ
   シン誘導体を基質として酵素と接触させることを特徴と
   する酵素活性の測定方法。 ４、式（１）で示されるアセチルチロシン誘導体を基質
   として酵素と接触させ、一定時間後、酵素により水解さ
   れて遊離したフェノールを測定することを特徴とする特
   許請求の範囲第３項に記載の酵素活性の測定方法。