JPS59216585A - 耐熱性の低いリパ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は耐熱性の低い９Ａ−ゼの製造法に関するもので
ある。

従来から食品中のｊｊａ肋分の分解にす・クーセが欧州
されており、例えをよ、卵白中に混入した卵黄Ｊｊ旨肪
分の分解にこれを用いて該卵黄脂肪分を分解し、それに
よって卵白の起泡力の向上を計るなどという試みがなさ
れている。しかし、この場合、脂肪分の分解処理をした
卵白を主菜用の食品原料として、例えばクリーム原料の
一部として使ったとき、卵白中に残存し、かつ活性の残
っているリパーゼが、クリーム調製の際に添加した油脂
を二次的に分解してそれにより不快臭を生ぜしめる原因
となることがある、などの問題を含んでいる。ところで
このような場合、加熱によりリパーゼの活性を失わせよ
うとしても一般的にリパーゼは、ｔｇ″Ｃ程度の温度で
数分間という加熱処理では失活せず、他方、加熱温度を
リパーゼの失活温度まで高めようとすると、卵白の凝固
開始温度は通常的ｓｇ”ｃ付近であるところからして卵
白が熱凝固を起こすようになると旨う問題がある。この
問題は延いては混入した卵黄脂肪分を分解して起泡性を
高めた卵白な主菜原料として用い難いものとしている。

このような現状にあって、加熱しても卵白が凝固しない
ｓｔ”ｃ付近の温度での３分間程度の加熱処理でもって
失活してしまう耐熱性の低いリパーゼへの要望が高まっ
ている。

本発明は、正にこのような耐熱性の低いリパーゼを製造
する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記の目的に即して鋭意研究を重ねた結果
、リパーゼ産生量が多いことでよく知られているサツカ
ロミコプシス・リボリティカ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｏｐｓｉａ　　１ｌｐｏｌｙｔｉｃａ、別名キャンディ
ダｅリボリティカＣａｎｄｌｄｓ　　１ｌｐｏｌｙｔｉ
ｃａ　　）に属する酵母菌を一旦約ｉｏ’ｃ以下の低温
に少なくとも約μケ月間保持したのち培養に付すならば
、所望の耐熱性の低いリパーゼを製造することができる
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、サツカロミコプシス・リボリティカに属する
酵母菌を約７０℃以下の低温に少なくとも約Ｖケ月間保
持したのち接菌を一定期間内培養して耐熱性の低いリパ
ーゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
る、耐熱性の低ｂリパーゼの製造法を提供するものであ
る。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で使用するサツカロミコプシス・リボリティカは
リパーゼ産生量が多いことでよく知られた酵母菌種であ
って、その菌学的性質は、例えば、Ｊ、　Ｌｏｄｄｅｒ
編のｒＴｈｅ　ｙｅａｓｔ　Ｊ　　（１９７０年、第タ
タｌ〜タタμ頁）等で詳細に記載されている通りのもの
である。本発明においてはこれに属する酵母菌であれば
いずれの微生物を用いてもよい。代表的なものとしてＩ
Ｆｏ　　０７≠６の寄託番号を有する分譲菌株を挙げる
ことができる。尚、この菌株は例えば、ＡＴＣＣＸＩＦ
Ｏからも容易に人手しうる。

本発明によれば、これら酵母菌は、通常の保存用培地、
例えば、ＹＭ寒天、ポテトデキストロース寒天等の各鍾
寒天培地、に常法に準じて生育させたのちそのまま少な
くとも約≠ケ月間は約７０℃以下の低温で保持しておく
ことが必要である。後述の試験例１によって明らかにさ
れるように、このような栄件下で冷蔵保存した酵母菌を
リパーゼ産生のために培養に付すならば、産生されるリ
パーゼは５６℃付近の温度で３分間程度の加熱処理でも
って失活するものが得られる。

上記のリパーゼ産生培養の除用いる培地は、リパーゼ産
生に通常用いる液体培地でよく、例えば、下記の表／に
示すような培地組成を有する培地ｌおよび培地λ等を代
表なものとして挙げることができる。

表１ 培　地　組　成　　　培地ｌ　　　培地コ酵母エキス　
　　　　　　　３（９）３（ｊ？）マルトエキストラク
ト　　　ｊ　　ｔｔ　　　　ｊ　　ｕバクトベプトン　
　　　　７．ｊｎ　　　　７．ｊｔｔグルコース　　　
　　　　１０　　ｎ　　　　　−大豆油　　　　　　　
　　　−ｊ　〃 水　　　　　　　　　　　　　ｉ、ｏｏθ−１，０００
ｍ１（備考）最終的に、液体培地はｐＨ７，ＯＫ調整す
るとよい。

上記のいずれかの培地に予定した酵母菌を接種−，２０
〜３０″Ｃで好気的に培養（振盪培養）する。尚、培養
期間は２０日程度を限度とするとよい（後述の試験例コ
を参照）。培養期間が４０日〜６０日と長くなるにつれ
培養菌の菌数はあまり増えなりのに菌に耐熱性がつき、
延いては産生されるリパーゼに耐熱性がつく傾向がある
からである。即ち、培養期間は、培養菌に耐熱性が伺与
されない期間内であってしかも産生されるリパーゼの蓄
積量の観点からはなるべく長目にした方がよいといえる
。

こうして得られた耐熱性の低いリパーゼを含む培養液は
、その！！まあるいは速結保存後、例えば、卵白中に混
入した卵黄脂肪分の分解等のために使用に供し、次いで
分解処理後残存リパーゼを失活させるために５６℃付近
の温度で３分間程度の加熱処理をしてもよいが、通常は
、取扱い上あるいは保存上の観点から培養液中に蓄積さ
れた耐熱性の低いリーク−ゼを採取し、好ましくは精製
して、あるいは更に乾燥して耐熱性の低込リパーゼ製品
とする。尚、本発明の方法において採取、精製および乾
燥の手段は特に限定的ではなく、リパーゼの製造法にお
いて通常行なわれるいかなる手段も採用しうる。一般的
には下記の具体例の通りに行えばよい。

産生された耐熱性の低いリーシーゼを含む培養液を、２
多水酸化す）ＩＪウム水溶液でｐＨ７に調整１次いで！
　”Ｃ，、！；、０００　ｒｐｍの条件下遠心分離に付
して菌体とオリを主として含む固形層と澄明液とに分離
する。こうして得られた澄明液に硫安を３５チ飽和度と
なるまで加えて塩析し、生じた沈澱物をデ別あるいは遠
心分離によって回収する。こうして耐熱性の低い粗リパ
ーゼが採取される。この粗リパーゼをｐＨ７０Ｍ／ｌＯ
Ｏリン酸バッファーに溶解して半透膜に収容し、同じバ
ッファー溶液を用いて透析して耐熱性の低いリパーゼ酵
素液とする。

この酵素液に冷アセトン（Ｏ−ｔ″Ｃ）を加え、生じた
沈澱を沢別して回収し、好ましくは回収沈澱物を更に冷
アセトンで洗浄して脱脂、脱水したのち減圧デシケータ
〜で乾燥して耐熱性の低いリパーゼ粉末として得る。上
記のような採取、精製および乾燥手段によって得られた
粗すハーゼ、酵素液およびリパーゼ粉末は、いずれも本
発明による耐熱性の低いリパーゼ製品としてそれぞれ目
的に応じて適宜使用に供することができる。尚、上記の
粗リパーゼの採取の際分離した菌体とオリとを主として
含む固形層中にも、通常、活性量の耐熱性の低いリパー
ゼが残存しているので、この固形層を水洗後遠心分離に
付し、得られた沈澱物を更に冷アセトン（Ｏ−４”Ｃ）
で洗浄して脱脂、脱水したのち減圧デシケータ−で乾燥
して菌体含有の耐熱性の低いリパーゼとすることもでき
る。このものも、目的にもよるが、食品中の脂肪分の分
解に充分に供し得る。

以下の試験例１は、サツカロミコプシス・リボリティ力
に属するリパーゼ生産菌は、低温での保持期間が一定に
及ぶと耐熱性の低いリパーゼを産生ずるように１よるこ
とを証明するものである。尚、用いた酵母菌はＩＦｏ　
　０７≠６の分譲菌株であった（後述の試験例２および
実施例／および２におじでも同様）０ 試験例１ Ａ、試験方法： ３０℃′でざＯ日間（Ｊ日毎に新し−液体培地に植えつ
ぎ）という耐熱性の比較的強いリパーゼを産生する培養
条件下で培養した酵母菌をＹＭ斜面寒天培地に移植して
３０℃でλ日間培養し、生育させた菌をそれぞれｓ”ｃ
、ｉｏｏｃ、ｉｓ”ｃおよび３℃の温度下でｖケガ間保
持した。その際、これらをそれぞれ種菌としてｌケ月毎
に液体培地にそれぞれ接種していずれも３０℃で、２０
日間振盪培養し、産生されたリパーゼの耐熱性を調べる
ために各培養液からその一部を取り、５６°Ｃ１３分間
の加熱処理後の残存リパーゼ活性の測定に供した。尚、
７３℃と刀°Ｃの温度条件下で保持したものは、菌株が
弱まらないようにするためにｌケ月毎に新たなＹＭ斜面
寒天培地に植えついだ。

上記の試験におりで用すた液体培地の組成は下記の表２
に示す通りのものであった。

表２ 培地組成 酵母エキス　　　　　　　　３　　Ｃ，９＞マルトエキ
ストラクト　　　！　〃 パクトベプトン　　　　　　７．ｊ〃 グルコース　　　　　　　　１０　　ｔｔ清水　　　　
　　　　　　１，０００ｍ１（備考）、２チ水酸化ナト
リウム水溶液でｐＨ７に調整した。

Ｂ、試験結果 結果は下記の表３に示す通りであった。尚、本発明にお
けるリパーゼ活性の測定は小崎道雄著「酵素利用−・ン
ドブック」（昭和お年発行、地人書館）に記載されてい
る「オリーブ油を分解する能力の測定法」によシ行なっ
た。

表３ 上記の結果より、３０℃でとＯ日間という耐熱性の比較
的強いリパーゼを産生ずる培養条件下で培養した酵母菌
でも約１０℃以下の低温に少なくとも約ｖケ月間保持し
たのち接菌を培養に付すならば１．８６℃付近の温度で
３分間程度の加熱処理でもって失活してしまう耐熱性の
低いリパーゼを産生ずるようになることがわかる。尚、
加熱処理する前の酵素の活性は通當３／−３Ａ□１位で
ある。

このような特徴を有する本発明の方法における培養期間
は、：ｌＯ日程度を限度とすればよいことを以下の試験
例コにおいて示す。

試験例λ Ａ、試験方法： ３０℃、２日間の培養条件下でＹＭ斜面寒天培地に生育
させそのまま５℃の温度条件下にμケガ間保持しておい
た酵母菌を、試験例１の表λに示した通りの組成を有す
る液体培地に接種し、３０″Ｃの榮件下、２０日毎に新
しい液体培゛地に植えつぎをしながら延べｔｒｏ日間振
盪培養を行なった。その際２０日毎に、産生されたリパ
ーゼの耐熱性を調べるために、培養液を１．タロ°（：
、、ｌ、０″Ｃ１およびＡＪ℃でそれぞれ３分間の加熱
処理後の残存リパーゼ活性の測定に供した。

Ｂ、試験結果： 結果は下記の表グに示す通シでありだ。

表≠ 上記の結果より、本発明の方法における培養期間は、好
ましくは、２０日程度を限度とすればよいが、グＯ日間
ぐらいまでは耐熱性の強いリパーゼはほとんど産生され
ないことがわかる。

以下、本発明を実施例および応用例でもって更に詳しく
説明する。尚、本発明において係はすべて重量−である
。

実施例１ ３０℃、２日間の培養条件下でＹＭ斜面寒天培地に生育
させそのまま５℃の温度条件下に６ケ月間保持しておい
た酵母菌を、予めＪＯＯｍｌ容の肩付フラスコに下記の
表！に示した通シの組成を有する液体培地１００ｖｒｌ
を入れて滅菌してお−だものにｌ白金耳接種し、３０℃
で２０日間振盪培養に付した。

表！ 培地組成 酵母エキス　　　　タ　ψ） ペプトン　　　　　７．ｊ〃 大豆油　　　　　　！　〃 蒸留水　　　　　／、０００πノ （備考）−２９６水酸化す）ＩＪウム水溶液でｐＨ７に
調整した。

この培養液１００ｍ１をコチ水酸化ナトリウム水溶液で
ｐＨ７に調整し、次いで５℃、ｊ、０００　ｒｐｍの条
件下遠心分離に付して菌体とオリを主として含む固形層
を除°去し、♂Ｏｍｌの澄明液を得た。この澄明液に硫
安り、／〃を加え１．２６％飽和度として塩析し、生じ
た沈澱物（リパーゼ以外の蛋白の多い区分）をｊ　℃、
ｊ、０００　ｒｐｍの条件で遠心分離に付して除去し、
上澄液１（７ｍｌに更に硫安７．３１を加え、約３Ｓ％
飽和度として塩析し、生じた沈澱物を同様に遠心分離に
付して回収し、／、３９の粗リパーゼを採取した。この
粗リパーゼをｐＨ７のＭ／１００リン酸バッファーに溶
解（て半透膜に収容し、同じバッファー溶液を用いて５
℃の冷蔵庫内で、！弘時間透析し、７０ｔｎｌのリパー
ゼ酵素液を得た。この液のリパーゼ活性はＱＶ−であっ
た。

応用例１ 上記の実施例で得られたリパーゼ酵素液を卵白中に混入
した卵黄脂肪分の分解に実際に用いた場合の例を以下説
明する。

卵白液：ｔＯＫ９（生卵を割卵分離して得たもので混入
卵黄的ｏ、ｉチ）を１０％クエン酸でｐＨ７に調整し、
これをｌ０Ｋｙずつに分けてその一つを２３℃に加温し
、これに上記の実施例で得られたリパーゼ酵素液１Ｏ１
ｎｌを添加して時々攪拌しながら５時間酵素処理を行な
った。その後この卵白液をｓｇ”ｃで３分間加熱殺菌し
、これによって酵素も同時に失活させた。次いでこの卵
白液を３．５℃まで冷却し、グルコースオキシダーゼで
脱糖処理をしたのち噴霧乾燥して乾燥卵白的ＩＫｐを得
た。

他の卵白液１０Ｋ９は、ｓｇ”ｃで３分間加熱殺菌した
のちグルコースオキシダーゼによる脱糖処理を行なった
だけで直ちに噴霧乾燥し、対照の乾燥卵白駒／　Ｋｙを
得た。

上記のようにして得られた両乾燥卵白の性状は下記の表
ｔに示す通シであった。尚、リパーゼ活性を除いた他の
性状は両乾燥卵白とも７０％の水戻し品とした場合のも
のである。

表を 上記の結果より、本発明の方法で得られた耐熱性の低い
リパーゼを用いてリパーゼ処理した乾燥卵白は、リパー
ゼ処理をしないものに比べて泡立ち性が極めて良好で、
しかもリパーゼ活性の残って旨ないものであることがわ
かる。

実施例λ 実施例／と同様にして得たリパーゼ活性桔ｕ／ｍＡ’の
酵素液１００１ｄに冷アセトｙ　（ｓ”ｃ　）　！ｏｏ
ｍｌを加えて充分に攪拌し、生じた沈澱物をｒ別して回
収した。この回収沈澱物を更に冷アセトンｊｏｏｍｌで
洗浄して脱脂、脱水を充分に行なった。このものを減圧
デシケータ−で乾燥してアセトンを除去１リパーゼ粉末
ｏ、ｒｐを得た。尚、この粉末のリパーゼ活性はＪ、Ｉ
　００　ｕ／’、９であった。

応用例２ 上記の実施例コで得られたリパーゼ粉末を乳脂肪を含有
する殺菌済クリームに実際用いた場合の例を以下説明す
る。

乳脂肪Δ係を含有する殺菌済クリーム、ｔＫｐに、上記
の実施例λで得られたリパーゼ粉末０．３１１をｉｏｍ
ｌの滅菌水で溶解して加え、均一に混合して５℃の温度
条件下でｉｏ日間リパーゼ処理を行なっｔｓ。

この処理後同クリームをＡＯ″Ｃで３分間加熱処理して
リパーゼを失活させ、香気が極めて良好なバターフレー
バーを得た。

上記のようなバターフレーバーを製造する際従来のリパ
ーゼを周込た場合の酵素失活には通常７２℃以上の温度
で１０分間以上の加熱処理をしなければならなかったが
、本発明の方法で得られた耐熱性の低イリパーゼを周込
た場合には上記のようにかなり処理温度並びに処理時間
を低下することができ、それ故、最終製品に及ぼす加熱
処理の影響、特に香気性への影響、をかなシ低減するこ
とができ、従来のものに比べて香気の豊かな、しかも残
存リパーゼ活性のないバターフレーバーを製造すること
ができる。

出願人代理人　　　猪　股　　　　清

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ／、　ザッカロミコプシス・リボリテイカ（Ｓａｃｃｈ
   ａｒｏｍｙｅｏｐｓｌａ　　１ｉｐｏｌｙｔｌｃａ　）
   　　に属する酵母菌を約７０℃以［の低温に少なくとも
   約ｌケ月間保持したのち接菌を一定期間内培養して耐熱
   性の低いリパーゼを生成蓄積せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とする、耐熱性の低いリパーゼの製造法。 λ、培養ＪＩＪＪ間が約２０日以内である、ｊ持許請求
   の範囲第１項記載の１ｌｌＩＩ熱性の低いリノ（−ゼの
   製造法。