JPS59175898A

JPS59175898A - グルタミン酸・オキザロ酢酸−トランスアミナ−ゼ測定用試薬

Info

Publication number: JPS59175898A
Application number: JP5220783A
Authority: JP
Inventors: Itoshi Omori; 大森　五十士; Kazunobu Tanno; 和信丹野
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1983-03-28
Filing date: 1983-03-28
Publication date: 1984-10-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、二試薬を組合わせてなるグルタミン酸・オキ
ザロ酢酸−トランスアミナーゼ（以下、ＧＯＴと略す）
測定用試薬に関する。

血中のＧＯＴは肝臓、心臓、腎臓あるいは筋肉の疾患の
場合、これらの臓器の障害度に応じて敏感に変動するの
で、その測定は臨床的に非常に意義の深いものである。

ＧＯＴの測定方法としてはカルメン法、ライトマン−フ
ランケル変法、紫外部測定法などがあるが、現在は紫外
部測定法が標準法として採用されている（日本臨床分析
談話会勧告案、　１９７９年）。

この標準法において使用されるＧＯＴ測定用試薬は共役
酵素であるリンゴ酸脱水素酵素（以下ＭＤＴ（と略す）
、乳酸脱水素酵素（以下Ｌ　Ｄ　Ｉ（と略す）及び補酵
素（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、以
下Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈと略す）を含む第１試楽、α−ケトグ
ルタル酸を含む第２試薬並びにアスパラギン酸を含む第
３試薬を組合わせてなるものがある。

まだ、近時、自動分析機の発展も目ざましく、血中のＧ
ＯＴの測定が効率良く自動分析機で行なわれている。標
準法捷たはそれに準じだ方法でＧＯＴの測定を行なう場
合、通常は共役酵素、補酵素剤およびα−ケトグルタル
酸若しくはＬ−アスパラギン酸を含有する第１試薬並び
にα−ケトグルタル酸またはＬ−アスパラギン酸を含む
第２試薬からなり、検体ＧＯＴと第１試薬を混合し、一
定時間インキュベートしたのち、第２試薬を加え、（）
ＯＴの測定を行なう。

ＧＯＴの測定値のバラツキに及ぼす因子としては測定温
度のバラツキ、光度計の精度、検体および試薬の分注量
のバラツキなどがあるが、試薬の組成の中では、α−ケ
トグルタル酸およびＬ−アスパラギン酸の濃度の変動が
最も大きく影響する。

α−ケトグルタル酸およびＬ−アスパラギン酸の濃度は
、他の測定条件により、その最適濃度があり、この最適
濃度からはずれると測定に誤差を生じやすい。

用手法にしろ、自動分析機にしろ第１試薬と第２試薬が
厳密に正確に分注されれば基質であるＬ−アスパラギン
酸１だばα−ケトグルタル酸の濃度は常に一定であるが
、実際問題としては、試薬分注量にはある程度のバラツ
キがある。そのため、Ｌ−アスパラギン酸捷たはα−ケ
トグルタル酸の濃度が多少変動し、測定値にバラツキを
生む原因となる。

本発明はこのような問題を解決するものである。

すなわち、本発明は、Ｍ　Ｄ　Ｈ、Ｌ　Ｄ　Ｉ−Ｔ　、
　ＮＡＩ）Ｉ−Ｉおよびα−ケトグルタル酸若しくはＬ
−アスパラギン酸を含有する第１試楽並びにα−ケトグ
ルタル酸およびＬ−アスパラギン酸を含有する第２試薬
を組合せてなり、α−ケトグルタル酸まだはＬ−アスパ
ラギン酸の第１試薬および第２試薬における濃度を等し
くしてなるＧＯＴ測定用試薬に関する。

本発明に係るＧＯＴ測定用試薬を用いたＧＯＴの測定は
、下記式で示す原理による。すなわち、Ｎ　Ａ、　Ｄ　
Ｈの減少速度を３４．０．／７ｍの波長の光線による吸
光度の経時変化から求め、これを基礎にして、、ＧＯＴ
の活性単位が決定される。

α−ケトグルタル酸＋アスパラギン酸０Ｔ −−−→グルタミン酸士オキザロ酢酸ＤＨオキザロ酢酸十ＮＡＤＩ−Ｉ−−→リンゴ酸十ＮＡＤＬ
ｌ）Ｈピルビン酸十ＮＡＤＨ−一一→乳酸十ＮＡＤ（ただし、
上記式中、ＮＡＤはニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドである）なお、ＮＡＤＨの減少速度に対応するΔＡ　／　ｍ１ｎ
（１分間当りの吸光度変化量）から検体１を当シのＧＯ
Ｔの活性単位を求める次の式による。ただし、ＧＯＴ　
ＩＵ（Ｕは国際単位を意味する。以下同様）とは、１分
間に１μモルのＮＡＤＨを生成する量の酵素量と定義さ
れる。

ただし、ＮＡＤＨの波長３４Ｑｎｍの光線におけるμモ
ル吸光係数は６．２２　Ｘ　１０−３（ｔ／μモル・ｃ
ｍ）であり、検体の希釈倍率とは（反応液の総量）／（
検体量）である。

第１試薬および第２試薬は、緩衝溶液として使用される
。このとき、使用される緩衝液としては、リン酸塩（−
水素リン酸塩と二水素リン酸塩の組合せ、塩としてはＮ
ａ塩、に塩等がある）、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンと塩酸の組合せ、ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビ
ス−（２−エタンスルホン酸）と水酸化ナトリウムの組
合せ、バルビタール酸とバルビタール酸塩（Ｎａ塩、に
塩等）の組合せなどの緩衝剤の水溶液であり、ｐＩ−（
が７〜８に調整されるのが好ましい。

第１試薬には、α−ケトグルタル酸かアスパラギン酸の
どちらかが含有される。これらが同時に存在すると第１
試薬の保存安定性が低下する。

α−ケトグルタル酸またはＬ−アスパラギン酸は、第１
試薬および第２試薬において、同濃度にされる。これに
より、第１試薬と第２試薬の使用量にバラツキが生じて
も、第１試薬と第２試薬の合計に対するα−ケトグルタ
ル酸捷たはＬ−アスパラギン酸の濃度が一定になり、Ｇ
ＯＴの測定が正確になる。α−ケトグルタル酸の濃度よ
シもＬ−アスパラギン酸の濃度の方がＧＯＴの測定結果
に対し、大きな影響を及ぼすため、第１試薬にはＬ−ア
スパラギン酸を含有させるのが好ましい。

第１試薬および第２試薬の各成分は、該二試薬の合計使
用量に対して次のような濃度になるように使用されるの
が好ましい。

Ｔ、ＤＩ（−−−−−−０，２〜５Ｕ／ｍ１ＭＤＨ・・
・・・・０，２〜５Ｕ／ｍ７１゜ＮＡＤＩ−Ｉ　　・−
・−０，１〜０．２５ｍＭα−ケトグルタル酸・・・・
・５〜２０ｍＭＬ−アスハラキン酸・・・・・・１００
〜４００ｍＭＬＤＩ（まだはＭＤＨが少なすぎると反応
が遅すぎ、多すぎるとこれらに含まれる不純物が影響し
、正確なＧＯＴの測定ができなくなる。Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ
が少なすぎるとその減少速度が直線にならず、多すぎる
と吸収スペクトルに影響し、ＧｏＴの測定が正確にでき
ない。α−ケトグルタル酸またはＬ　−アスパラギン酸
が少なすぎるとＮ　Ａ　Ｄ　Ｈの減少速度が小さくなり
、多すぎると反応を阻害するためＧＯＴの測定が正確に
ならない。

次に、本発明の実施例を示す。

実施例ＩＭＤＨ６３Ｕ、　ＬＤＨ６３ＵおよびＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ１
６ｍｇを含んだ凍結乾燥品を用時に、Ｌ−アスパラギン
酸０．２０６７Ｍを含んだ０．０８３Ｍ）リス（ヒドロ
キンメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）
１００ｍｔに溶解して第１試薬とし、Ｌ−アスパラギン
酸０．２０６７Ｍ及びα−ケトグルタル酸０．０６２Ｍ
を含んだ０．０８３Ｍ）リス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン−塩酸緩衝１（ｐＨ７，８）を第２試薬とした
。日立７０５形自動分析装置（検体量２０μｌ、第１試
液５００μｔ、第２試薬１００μｔ）を使い、管理血清
（ベックマン社製］）ｅｃｉｓｉｏｎ　Ｌｅｖｅ’　３
）中のＧＯＴを４０回連続して測定した。その結果平均
値は１２８Ｕ／ｌ、標準偏差０．６３　、変動係数は０
．４９％と良好であった。なお比較としてＬ−アスパラ
ギン酸を０．２４８Ｍ、第１試薬に含有させ、第２試楽
としてα−ケトグルタル酸０．０６２Ｍを含んだ０．０
８３Ｍ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸
緩衝液を使用して、」二記と同様に管理血清の分析を行
なったところ、４０回の平均値は１２８　Ｕ／４゜標準
偏差１．４５．変動係数は１．１３％であった。

実施例２ＭＤＭ　６３Ｕ、ＬＤＨ６３Ｕ、ＮＡＤＨＩ　６ｍｇを
含んだ凍結乾燥品を用時に、Ｌ−アスパラギン酸０．２
Ｍを含んだ０．０８　Ｍ　）リス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン−塩酸ＭＪｄｌ　（ｐＨ７，８）６０ｍｌ
に溶解して第１試薬とし、Ｌ−アスパラギン酸０．２Ｍ
及びα−ケトグルタル酸０．１６Ｍを含んだ０．０８　
Ｍ　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩
衝液（ｐ　Ｉ−Ｉ　７．　ｓ　）を第２試薬とした。流
路系のフローインジェクション分析装置（試料注入量３
５μｌ、第１試薬の流速１．０　ｍ　ｔ／　ｍａｎ　、
第２試薬の流速１．０　ｍ　ｔ　／　ｍｉｎ　、反応コ
イル０．５胴径×８ｍ）でストップド・フロー法で、管
理血清（デート社、　ＭＯｎｉ−ＴｒＯＩ　ＩＩＸ）を
２０回連続して測定したところ、平均１３５　Ｕ／ｌ、
標準偏差０．８２　、変動係数０．７３％と良好であっ
た。

なお、第１図に、上記測定に用いたフローイン（９）ジエクション分析装置の模式図を示す。送液ポンプ（ピ
ストンポンプ）１により導管２にキャリアとしての水が
送液される。導管２は途中に、サンプル添加装置３を有
する導管４および試薬添加装置５を有する導管６に分か
れ、これらの導管は反応管７に合流する。反応管１３は
分光光度計８に導かれ、ここで試薬と試料の反応状態が
三波長（主波長５４６ｎｍと副波長６６０ｎｍ）により
吸光度として測定される。なお、図示しないが反応管７
は恒温槽内に保持され、分光光度計８には、溶出時間に
対する吸光度（主波長の吸光度から副波長の吸光度を差
し引いた値）が記録される記録計が連結される。

本発明に係るＧＯＴ測定用試薬を用いることにより、第
１試薬および第２試薬の分注量または混合比率が多少変
動しても、Ｌ−アスパラギン酸まだはα−ケトグルタル
酸の濃度は変動せず一定であるため、再現性の高いＧＯ
Ｔ測定値が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図はフローインジェクション分析装置の模（１０）弐図である。符号の説明 ■・・・送液ポンプ、２・・・導管、３・・・サンプル
添加装置、４・・・導管、訃・・試薬添加装置、６・・
・導管、７・・・反応管、８・・・分光光度計（１１） χ　１　　図

Claims

【特許請求の範囲】１　リンゴ酸脱水素酵素乳酸脱水素酵素還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび α−ケトグルタル酸若しくはＬ−アスパラギン酸を含有する第１試薬並びに α−ケトグルタル酸およびＬ−アスパラギン酸を含有す
る第２試楽を組合わせてなり、α−ケトグルタル酸また
はＬ−アスパラギン酸の第■試薬および第２試薬におけ
る濃度を等しくしてなるグルタミン酸・オキザロ酢酸−
トランスアミナーゼ測定用試薬。