JPS59126251A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物のｊ）、、
ｉ基配列を決定するためのオートラジオグラフィーにお
ける信号処理方法に関するものである。

支乃奴体」二において少なくとも一次元的方向に分１１
」シて分Ｉｉｉ列を形成している放射性標識物質の位置
情報を得るだめの方法としてオートラジオグラフィーか
既に知られている。

たとえば、蛋白質、核耐などのような生物体由来の高分
子物質に放射性標識を付与したのち、その放射性標識を
伺した高分子物質、その誘導体、あるいはその分解物な
と（以下、放射性標識物質ともいう）をゲル状支持媒体
上で電気泳動なとの分１撃操作にかけて分＃展開を行な
うことにより、該支持媒体上に放射性標識物質の分離展
開列（たたし目には見えない）を形成させ、この分＃展
開列を放射線フィルム」二に転写、可視化させて得たそ
のオートラジオグラフから放射性標識物質の位置情報を
得ている。また、得られた放射性標識物質の位置情報を
基にして、その高分子物質の分離、同定、あるいは高分
子物質の分子量、特性の評ｆ＋ＩＩｉなどを行なう方法
は既に開発され、実際に利用されている。

特に近年においては、オートラジオグラフィー・は、Ｄ
ＮＡ　（もしくはＤＮＡなとの部分分解物、以下同様）
の塩基配列の決定に有効に利用されている。

このオートラジオグラフィーを利用することによりＤＮ
Ａの塩基配列を決定する方法としては、マキサム−キル
ハート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法、およびサン
カー・クールソン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｏｎ）法
が知られている。これらの方法は、ＤＮＡか二本の鎖状
分子からなる二重ラセン構造を有し、かつその二本の鎖
状分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニン（Ａ）
、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）なる
塩基を有する構成単位から構成されていあこと、そして
、この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間の水
素結合にょって架橋されており、しかも各構成単位間の
水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合わせの
み［こおいて実現しているというＤＮＡの特徴的な構造
を工ｌ）妙に利用して、その塩基配列を決定するカノノ
、である。

たとえは、マキサム・キルハート法は、次に述へるよう
な方法により実施される。

まず、ＩｇΔ基配タリを決定しようとしているＤＮＡあ
るいはＤＮＡの部分分解物の鎖状分子の一方の側の端部
に燐ＣＰ）の放射性同位元本を含む基を結合させること
により、その対象物を放射性標識物質としたのち、化学
的な手段を利用して鎖状分子の各構成中位間の結合を特
異的に切断する。次に、この操４！１により得られるＤ
ＮＡあるいはＤＮＡの分解物の多数の塩基特異的ｐノ断
分解物の混合物をケル電気泳動法により分離展開し、多
数の切断分解物かそれぞれ帯状を形成して分離された分
醐展開列（ただし、視覚的には見ることができない）を
得る。そして、この分＃展開列をＸ線フィルム１に１可
視化してオートラジオグラフを得、得られたオートラジ
オグラフと各りの塩基特異的切断手段とから、放射性同
位元素が結合された鎖状分子の端部から一定の位置関係
にある塩基を順次決定し、このようにして対象物のすへ
ての塩基の配列を決定している。

ところで、上述のように従来の放射線写真法を利用する
オートラジオグラフィーでは、放射性標識物質のイサ装
置情報を得るためにはこの位置情報を有するオートラジ
オグラフを放射線写真フィルム−１−に可視化すること
が必須要件となっている。

従って研究者は、その可視化されたオートラジオグラフ
を視覚的にａ察することにより、支持媒体上の放射性標
識物質の分布を判断している。すなわち、ＤＮＡの塩基
配列は、放射性標識の旧年された塩基特異的切断分解物
もしくはその混合物のそれぞれについて、分離、展開位
置を視覚的に判断し、それら塩基特異的切断分解物の分
離展開列を相互に比較することにより決定されている。

しかしながら、従来のオートラジオグラフィーでは、」
一連のようにその解析作業は人間の目に依イｆしている
ため、その可視ｐｌＩｌ像とされたオートラジオグラフ
を解析して？ｌｉちれる放射性標識物質の位置情報が研
究者によって相違する場合か発生するなとの問題かあり
、得られる情報の精度には限界かある。４１に、放射線
フィルム」−に可視化されたオートラジオグラフが良好
な画質（堕鋭度、コンＩ・ラスト）をイＪしていない場
合には、満足できる情報か得られかたく、またその精度
は低下する傾向にある。従来より、求める位置情報の精
度を向りさせるために、たとえば、その可視化ｙれたオ
ートラジオグラフをスキャニングテンシトメーターなと
の沖１疋器共を用いてｆｆ１ｌｌ定する方法も利用され
ている。しかしなから、そのような′Ａ１１ｌ定器共を
中に用いる方法においてｔ士精度の向上に限界かある。

たとえは、試料中に放射性標識か旧年された不純物が含
まれている場合、支持媒体が［Ｉ熱放射能などによって
放射能汚染されている場合、あるいは、分離展ｔ５ｉ！
操作か不充分である場合には、オートラジオグラフ上に
フイスが現れやすくなるため放射性標識物質の位置情報
の解析か困難になり。

従って得られる情報の精度を低下させることになる。

以」−のような場合においては、放射性標識物質の位置
情報の解析が特に困難になり、前記のような測定器具を
利用しても分離展開された放射性標識物質の位置情報、
すなわちＤＮＡもしくはＤＮＡ　ｊ’ｊＢ分分解物の塩
基配列を充分な精度で得ることは困難である。

本発明渚は、従来のオートラジオグラフィーにおいて利
用ごれている放射線フィルムを用いる放射線写真法の代
りに、蓄積性蛍光体シートを用いる放身４線像変換方法
を利用することにより、放射＋１標識物質の位置情報を
有するオートラジオグラフを４４に画像化することなく
、その位置情報をデジタル信呂として得、そして得られ
たテシクル信号に好適な信号処理を施すことによりＤＮ
ＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を簡易かつ高精
度に決定することを実現し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物
の塩基配列を決定するだめのオートラジオグラフィーに
おける信号処理方法であって、放射性標識が伺与された
ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の話Ａ基特異的切断分
解により得られた、１）グアニン特異的切断分解物、 ２）アデニン特異的切断分解物、 ３）チミン特１ノ４的切断分解物、 ４）シトシン特異的切断分解物、 を含む少なくとも四本の塩基特異的切断分解物のそれぞ
れが、支持奴体上に平行関係を以って一次元的に分離Ｊ
ｒｌｃ開されて形成された分＃展開列の放射性標識物質
群から放出される放射線エネルギーをｌｉ植性蛍光体シ
ートに吸収させることによって、この蓄積性蛍光体シー
トに該放射性標識物質群の位置情報を有するオートラジ
オグラフを蓄積記録したのち、該蓄積性蛍光体シートを
電磁波で走査して該オートラジオグラフを輝尽光として
放出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すことに
より得られるそれぞれの分子４展開列のオートチジオグ
ラフに対応するデシクル信号についてｉ）該複数の分離
展開列より内部標準列を合成し、諸内部標準郊について
基本サンプリング点を決定する工程、 西）ｊ核基本すンプリング点に基づいて設定されたサン
プリング点ス、り内に分布している各分離展開列の放射
性物質の信号を互いに比較し各分＃展開列間の便宜サン
プリング点の排他性を利用して各分＃、展開列における
サンプリング点を検出する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法を
提供するものである。

また、本発明は、試料として放射性標識か伺与されたＤ
ＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基特異的切断分解に
より得られた、 １）グアニン特異的切断分解物、 ２）アデニン特異的切断分解物、 ３）チミン特異的切断分解物、 ４）シトシン特異的切断分解物、および５）グアニン特
異的切断分解物、アデニン特異的切断分解物、チミン特
異的切断分解物、およびシＩ・シン特異的切断分解物を
含む１１；ｊ合物を含む少なくとも五本の塩基特異的切
断分解物のそれぞれが、支持媒体上に平’ｔｊ関係を以
って一次元的に分＃展開されて形成された分離展開列を
利用し、それぞれの分＃展開列のオーＩ・ラジオグラフ
に対＋５するデジタル信号について、１）該４２合物の
分間Ｅ展間外を内部標準列として、この該内部標準列に
ついて基本サンプリング点を決定する工程、 ＋１）４Ａ＋Ｊｉ’：木サンプリング点に基ついて設定
されたサンプリングマスク内に分；／ｉｊ　している各
分離展開列の放射性物質の信号をＶいに比較し、考方＃
　Ｉｉ（間外間の想定サンプリング点のり１他性を利用
して各分離展開列におけるサンプリング点を検出する工
程、 を含むオートラジオグラフィーにおけるイ、）じ処押方
法をも提供するものである。

本発明は、試料と蓄積性蛍光体シートとを重ね合わせる
ことによって試料から放出される放射線エネルギーを蓄
積性蛍光体シートに吸収させたのち、この蓄積性蛍光体
シートをＩＩＪ視光線および赤外線などの電磁波、（励
起光）で走査することにより、蓄積性蛍光体シートに蓄
積されている放射線二才ルキ、−をイハ゛光（１１′１
ｉ尽発光）として放出させ、この蛍光を光電的に読み取
って電急信号を得、この電気信号をＡ／Ｄ変換してデシ
クル信号として得ることからなる放射線像変換方法を利
用するものである。

４−記数射線像変換方法については、たとえば米国特許
第３．８５９．５２７号明細書および特開ｔ−ＩＩ′１
５５−１２１４５号公報等に記載されている。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、たとえば、
二価のユーロピウム賦活アルカリ土類金属弗化ハロゲン
化物系蛍光体なとの輝尽性蛍光体を含有するものである
。この輝尽性蛍光体は、Ｘ線、α線、β線、γ線、紫外
線なとの放射線の照射を受けてその放射線エネルキー〇
一部を蓄積したのち、可視光線および赤外線などの電磁
波（励起光）の照射を受けるとその蓄積エネルギーに范
じて輝尽発光を示す性質を有している。

そして、本発明は、上記の蓄積性蛍光体シートを用いる
放射線像変換方法により、放射性標識物質の位置情報を
特に画像化を経由することなく直接に、デジタル信号と
して得るものである。

なお１本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位置を中心とす
る各種の情報、たとえば、支持媒体中に存在する放射性
物質の集合体の存在位置と形状、その位置における放射
性物質の濃度、分布などからなる情報の一つもしくは任
意の組合わせとして得られる各種の情報を意味する。

本発明によれば、ノイズを含むオートラジオグラフに対
して、デジタル画像データ上で信号処理を行なうことに
より、ノイズを含まない真の位置情報を容易に得ること
ができる。すなわち、たとえば、試料中に含まれる放射
性標識が付与された不純物によって発生するノイズ、あ
るいは、分離１１（開条件が悪いために発生するノイズ
に影響されることなぐ、高精度でＤＮＡもしくはＤＮＡ
部分分解物の塩基配列が得られるものである。

特に、放射性標識が付与されたＤＮＡもしくはＤＮＡの
部分分解物の塩基特異的切断分解物は、従来の放射線写
真法を利用するオートラジオグラフィーでは、可視化さ
れたオートラジオグラフを視覚的に解析してその塩基配
列を決定しているため、視覚的にその位置を照合しやす
いように一般に次のような組合わせで用いられることが
多い。

１）グアニン特異的切断分解物 ２）グアニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的切断分解物 ３）チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物 ４）シトシン特異的切断分解物 本発明にわいては、試料のオートラジオグラフに対応す
るデジタル信号を信号処理することによりＤＮＡの塩基
配列を自動的に決定するため１次のような最も単純な組
合わせを利用することができる。

１）グアニン特異的切断分解物、 ２）アデニン特異的切断分解物。

３）チミン特異的切断分解物、 ４）シトシン特異的切断分解物、 すなわち、上記四本が互いに排他的な組合わせであるこ
とから、放射性標識物質群の分離展開方向にＩＴｉ：直
な方向には常に一群の塩基特異的切断分解物しか存在し
えないという排他性を利用して、得られたデジタル信号
を合理的に多数決判定することにより各塩基の位置を決
定する・−とができる。従って、人間の視覚判定よりも
正確にその塩基配列を得ることができるものである。

また、」二足のようにデジタル画像データ上で合理的に
放射性標識物質の分離展開部位（サンプリンク点）を検
出することができることから、放射性標識物質の一つ一
つの分離展開操作を縮小しても高精度にその分離展開部
位（サンプリング点）を判定することが可能となる。す
なわち、−回のオートラジオグラフィーにおいて用いる
放射性標識物質の絶対量を減少させることができる。あ
るいは、分離展開操作における分離展開列の数を支持媒
体の幅を拡張させることなく増加することが可能となり
、−回のオートラジオグラフィー操作によって従来より
多くの情報を得ることが可能となる。

本発明において用いられる試料の例としては、放射性標
識が旧年されたＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物をその
構成単位である塩基間で特異的に切断分解することによ
り得られる各塩基特異的切断分解物および／またはそれ
らの混合物か、−次元的方向に分＃展開されて分離展開
列を形成している支持媒体を挙げることができる。

十記放射性標識物質を支持媒体を用いて分離展開するた
めの方法としては、たとえば、ケル状支持媒体（形状は
層状、柱状など任意）、アセテートなとのポリマー成形
体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる電気泳
動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる薄層クロ
マトグラフィーかその代表的な方法として挙げられる。

このうちで、ゲル状支持媒体を用いる電気泳動法が代表
的な分離展開方法であり、本発明の実施にとって好まし
い。

Ａ、発明にＩｆｉいられる蓄積性蛍光体シートは、基本
構造と、１７て、支持体、蛍光体層および透明保護１１
；ｊとからなるものである。蛍光体層は、輝尽性蛍光体
を分散状態で含有支持する結合剤からなり、たとえは、
二価のユーロピウム賦活弗化臭化ノ＜リウム（Ｂ’ａ　
Ｆ　Ｂ　ｒ　：　Ｅ　ｕ”）イｉ？光体粒子をニトロセ
ルロースと線状ポリエステルとの混合物中に分散含有さ
せて得られる。蓄積性蛍光体シートは、たとえば、支り
体としてポリエチレンテレフタレ−１・なとのシートを
用い、このシート上に北記伴光体層を設け、さらに蛍光
体層上に保護膜としてポリエチレンテレフタレートシー
トなとを設けたものである。

なお１本発明に用いられる支持媒体および蓄積性蛍光体
シートの詳細については、本出願人による特願昭５７−
１９３４１９号明細書に記載されている。

本発明において、放射性標識物質を含有する支持りｖ体
から放出される放射線工）ルキーの蓄積性蛍光体シート
への転写蓄積操作（露光操作）は、支持媒体と蓄積性蛍
光体シートとを一定詩間重ね合わせることにより、その
支持媒体上の放射性標識物質から放出される放射線の少
なくとも一部を蓄積性蛍光体シートに吸収させて実施す
る。この露光操作は、支持媒体と蓄積性蛍光体シートと
が、近接した状態で配置されていればよく、たとえば、
常温もしくは低温で少なくとも数秒間この状態に置くこ
とにより行なうことができる。

なお、露光操作の詳細については、本出願人による特願
１１４Ｊ　５７−１９３４１８号明細書に記載されてい
る。

次に、一本発明において、蓄積性蛍光体シートに転写蓄
積された支持媒体上の放射性標識物質の一次元的な位置
情報を読み出してデジタル信号に変換するための方法に
ついて、添付図面の第１図に示した読出装置（あるいは
読取装置）の例を参照しながら略述する。

第１図は、蓄積性蛍光体シート（以下においては、蛍光
体シートと略記することもある）■に蓄積記憶されてい
る放射性標識物質の一次元的な位置情＋Ｕを仮に１読み
出すための先読み用読山部２．と放射性標識物質の位置
情報を出力するために蛍光体ンーＩ・１（こ蓄積記憶さ
れているオートラジオグラフを読み出す機能を有する本
読み用読出部３から構成される装置 る。

先読み用読出部２においては次のような先読み操作か行
なわれる。

レーザー光源４から発生したレーザー光５はフィルター
６を通過することにより、このレーザー光５による励起
にＩｇ　シて蛍光体シー１−　１から発生する輝尽発光
の波長領域に該当する波長領域の部分がカントされる。

次いでレーザー光は、ガル／人ノミラー等の光偏向器７
により偏向処理され、平面反射鏡８により反射されたの
ち蛍光体シ一ト１−１−に一次元的に偏向して入射する
。ここで用いるレーザー光源４は、そのレーザー光５の
波長領域か、蛍光体シート１から発する輝尽発光の主要
波長領域と重複しないように選択される。

１１゛光休シート１は，上記の偏向レーザー光の照射下
において、矢印９の方向に移送される。従って、イケ光
体シー１・１の全面にわたって偏向レーザー光が照射さ
れるようになる。なお、レーザー光源４の．出力、レー
ザー光５のビーム径、レーザー光５の走査速度、蛍光体
シー１・１め移送速度については、先読み操作のレーザ
ー光５のエネルギーが本読み操作に用いられるエネルギ
−よりも小さくなるように調整される。

蛍光体シ−１・ｌは、上記のようなレーザー光の照射を
受けると、蓄積記録されている放射線エネルギーに比例
する光量の輝尽発光を示し、この光は先読み用導光性シ
ーｌ・１０に入射する。この導光性シート１０はその入
射面が直線状で、蛍光体シートエ上の走査線に対向する
ように近接して配置されており、その射出面は円環を形
成し、フォトマルなどの光検出器ｌ１の受光面に連絡し
ている。この導光性シート１０は、たとえばアクリル系
合成樹脂などの透明な熱可塑性樹脂シーＩ・を加工して
つくられたもので、入射面より入射した光がその内部に
おいて全反射しながら射出面へ伝達されるように構成さ
れている。蛍光体シート１からの輝尽発光はこの導光性
シートＩＯ内を導かれて射出面に到達し、その射出面か
ら射出されて光検出器１１に受光される。

光検出器１１の受光面には、輝尽発光の波長領域の光の
みを透過し、励起光（レーザー光）の波長領域の光をカ
ントするフィルターか貼着され、輝尽発光のみを検出し
うるようにされている。光検出器１１により検出された
輝尽発光は電気信号に変換され、さらに増幅器１２によ
り増幅され出力される。増幅器１２から出力された蓄積
記録情報は、本読み用読出部３の制御回路１３に入力さ
れる。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に応じて
、適正レベルの信号が得られるように、増幅率設定値ａ
および収録スケールファクターｂを出力する。

以上のようにして先読み操作が終了した蛍光体シート１
は本読み用読出部３へ移送される。

本読み用読出部３においては次のような本読み操作が行
なわれる。

本読み用レーザー光源１４がら発せられたレーザー光１
５は、前述のフィルター６と同様な機能を有するフィル
ター１６を通過したのちビーム・エクスパンダ−１７に
よりビーム径の大きさが厳密に調整される。次いでレー
ザー光は、カルハノミラー等の光偏向器１８により偏向
処理され、平面反射鏡１９により反射されたのち蛍光体
シート１上に一次元的に偏向して入射する。なお、光偏
向器１８と平面反射鏡１９との間にはｆθレンズ２０等
が配置され、蛍光体シート１の上を偏向レーザー光が走
査した場合に、常に均一なビーム速度を維持するように
されている。

蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照射下にお
いて、矢印２１の方向に移送される。従って、先読み操
作におけると同様に蛍光体シート１の全面にわたって偏
向レーザー光が照射されるようになる。

蛍光体シート１は、上記のようにしてレーザー光の照射
を受けると、先読み操作におけると同様に、蓄積記録さ
れている放射線エネルギーに比例する光量の輝尽発光を
発し、この光は本読み用導光性シート２２に入射する。

この本読み用導光性シート２２は先読み用導光性シート
１ｏと同様の材質、構造を有しており、本読み用導光性
シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれた輝尽発
光はその射出面から射出されて、光検出器２３に受光さ
れる。なお、光検出器２３の受光面には輝尽発光の波長
領域のみを選択的に透過するフ１゛ルターが貼着され、
光検出器２３が輝尽発光のみを検出するようにされてい
る。

光検出器２３により検出された輝尽発光は電気信号に変
換され、前記の増幅率設定値ａに従って感度設定された
増幅器２４において適正レベルの電気信号に増幅された
のち、Ａ／Ｄ変換器２５に入力される。Ａ／Ｄ変換器２
５は、収録スケールファクター設定値すに従い信号変動
幅に適したスケールファクターでデジタル信号に変換さ
れる。

なお、本発明における蓄積性蛍光体シートに転写蓄積さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための方法について、上記においては先読み操作と本読
み操作とからなる読出し操作を説明したが、本発明にお
いて利用することができる読出し操作は、上記の例に限
られるものではない。たとえば、支持媒体上の放射性標
識物質の量、およびその支持媒体についての蓄積性蛍光
体シートの露光時間が予めわがっていれば、上記の例に
おいて先読み操作を省略することも可〜能である。

また、本発明における蓄積性蛍光体シートに転写蓄積さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための方法としては、上記に例示した以外の任意な方法
を利用することも当然可能である。

このようにして得られた放射性標識物質のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号は、次に、第１図に示さ
れる信号処理回路２６に入力される。信号処理回路２６
では、放射性標識物質の一次元的位置情報を記号および
／または数値化することにより、目的のＤＮＡの塩基配
列の決定が行なわれる。

以下、本発明の信５′ｊ処理方法を用いたＤＮＡの塩基
配列決定のだめのオートラジオクラフィ一番こおける信
号処理の実施態様を、１）（ｊ記のマキサム・キルハー
ト法を利用した場合を例にとり、次の四種類の塩基特異
的切断分解物の組合わせにより形成された泳動列（分離
展開列）を用いた場合について説明する。

ｌ）クアニン特異的切断分解物 ２）アデニン特異的切断分解物 ３）チミン特異的切断分解物 ４）シトシン特異的切断分解物 ます、放射性標識（３′２Ｐ）が付与されたＤＮＡを常
法により各塩基単位でりＪ断することにより、１−記１
）〜４）の四本の塩基特異的切断分解物をイする。

次に１：記四本の塩基特異的切断分解物を、ゲル支持Ｉ
Ｗ体上で電気泳動により分離展開させてそれぞれの分離
展開列を得る。

次いで、この試料（分離展開列が形成されたケル状支持
媒体）と蓄積性蛍光体シートとを室温で数分間重ね合わ
せることにより露光操作を行ない、試料のオートラジオ
グラフを蓄積性蛍光体シートに転写蓄積する。上記の露
光操作の詳細については、前記の特願昭５７−１９３４
１８号明細書に記載されている。

第２図は、放射性標識の付与されたＤ’ＮＡの各塩基特
異的切断分解物が分離展開されている分離展開列（泳動
列）のオートラジオグラフの例を示す。

すなわち、第２図の第１列から第４列は順に、（１）ｒ
（Ｇ）特異的切断分解物 （２）−（Ａ）特異的切断分解物 （３）−（Ｔ）特異的切断分解物 （４）−（Ｃ）特異的切断分解物 の各分離展開列を示す。

蓄積性蛍光体シートに転写蓄積されたオートラジオグラ
フを第１図に示した読出装置に装填して読み出すことに
より、信号処理回路２６に入力されたデジタル信号は、
Ｍ積性蛍光体シートに固定された座標系で表わされた番
地（ｘ、ｙ）とその？！１ｒＪｌ！！における信号のレ
ベル（２）とを有しており、その信けのレベルは輝尽光
の光１Ｂ二に対応している。すなわち、デジタル信号は
第２図のオートラジオグラフに対応している。従って、
信号処理回路２６には」二足放用性標識物賀の位置情報
を有するデジタル画像データが入力されることになる。

本明細書において、デジタル画像データとは、放射性標
識物質のオートラジオグラフに対応するテシタル信℃の
集合、体を意味する。

まず、内部標準（基準）列は、たとえば、以下のような
信し処理により得ることができる。すなわち、デジタル
画像データ上で、上記凹刻の分離Ｄ’＜間外のそれぞれ
について信号処理のための走査方向を決定する。すなわ
ち、」−記デシタル信可−に対して、放射性標識物質の
一次元的分布方向（分１等展開方向）を横断するように
デジタル画像データーにの異なる位置を二回走査するこ
とによって、各走査領域上で各列の放射性標識物質の分
布点を検出しくこの分布点検出するための走査を”ｆ　
’Ｈ＋走査という）、各分離展開列についてそれぞれ二
分布点を結んで四本の直線をギしイｌ）られた直線をそ
れぞれ各列におけるサンプリング点検出のだめの走査方
向とする。

なお、本発明の信号処理方法において、蓄積性イｉ？光
体シー！・を読み出して得られたデジタル信号は、信号
処理回路２６において−ｑメモリーに記憶される（すな
わち、バッファーメモリーあるいは磁気ディスク等の不
揮発性メモリーに記憶される）。信号処理において、デ
ジタル画像データ上を走査するとは、この走査箇所のデ
ジタル信号のみをメモリーから選択的に取り出すことを
意味する。

次いで、デジタル画像データ上を各走査方向に沿って走
査することにより、仮想的に各列についてそれぞれ横軸
に走査方向上の位置（Ｗ）をとり、縦軸に信号のせベル
（Ｚ）をとったグラフを得る。ここで、走査方向上の位
置は、たとえば各列の泳動開始位置（Ｗｋｏ）をマーカ
ーにより検出することにより、泳動開始位置からの泳動
距離で表わすのが好ましい。ただし、ｋは正の整数であ
リ、各タリの番じを表わす。

ｔＵられた第１夕１ｊ−第４列のグラフについて、各走
査方向Ｊ−の同−位１ξ（Ｗ）においてその信号のレベ
ル（Ｚ）か最大値を示す列の信号のレベルイ１＾を取り
出して合成することにより、（Ｇ）特５％　１１’Ｊ切
断分解物、−（Ａ）特異的切断分解物、（Ｔ　）特異的
切断分解物、および（Ｃ）特異的切断分解物の四種類の
塩基特異的切断分解物の全てを含むグラフか得られる。

得られたグラフは、すなわち内部標準（基準）列とも呼
ぶべき列についてのグラフである。

なお、内部標準列を上記のように各塩基特異的切断分解
物の分離展開列から合成することなく、予め上記四種類
の各塩基特異的切断分解物の全てを含む泳動列を実際に
設け、これを内部標準列としてもよい。

次に、七記内部標外型についての基本サンプリング点は
、たとえば、以下のような信号処理により決定すること
ができる。すなわち、上記の内部槽ぷ２列に相応するグ
ラフを関数ｆ（ｗ）［ｗは走査方向」−の位置を表わす
］で表わすと、この関数ｆ（ｗ）、４こ、たとえば適当
なフィルター関数を用いてコンボリューションを行なう
ことによりスムージング処理を施し、関数ｇ（ｗ）を得
る。次に、この関数ｇ　（ｗ）に閾値処理を行なう。す
なわち、１ツ１値（α０）に対し、 ｇ　（ｗ）≧α０のとき、ｇ（ｗ）−１ｇ　（ｗ）　＜
α０のとき、ｇ（ｗ）＝０とする処理を施すことにより
、ｌｕｌ数ｇ　（ｗ）を１またはＯの連続関数に変換す
る。サンプリングの候補点ＳＯｎは、ｇ（ｗ）＝１の領
域の各中点とすることにより検出される。ただし、０は
内部標僧列を表わし、ｎは正の整数であって、その候補
点に対応するサンプリング点の番号を表わす。なお、上
記の閾値処理における閾値（α０）は、たとえば、走査
領域上のデジタル信号について、信号のレベルと、その
頻度との関係、すなわちヒスＩ・ダラムから決定するこ
とができる。

次いで、得られたサンプリングの候補点Ｓｏｎに対し、
統計処理を行なう。すなわち、内部標準列ｌ−のサンプ
リングの候補点に存在する放射性標識物質には、泳動距
離が小さくなる順に、すなわちサンプリング点の番号が
大きくなる順に四種類のｊ’ａ、Ａ基のいずれかを含む
構成単位が１つずつ多く結合しているとみなすことかで
き、かつ、それらの放射性標識物質の泳動距離と放射性
標識物質の分子ｊ４の対数をとった値とが直線関係にあ
ることか実験的に判明しているので、サンプリングの候
補点に対して次のような関数で近似することにより統計
処理をイｊなうことができる。

ＷＯｎ＝　ａ−ｂｌｏｇ（Ａ＋Ｍｎ）　　　　（１）（
ただし、ａおよびｂは電気泳動条件により実験的に求め
られる数値であり、ＡおよびＭはＤＮＡの塩基特異的切
断分解物の分子酸に関係する数イ直である。） 各サンプリングの候補点Ｓｏｎの泳動距離Ｗｏｎと各々
に対応するサンプリング点の番号ｎとを（１）式に代入
して統計処理を行なうことにより、最確値ａ□およびｂ
ｏを算出し、そしてこのａ。およびす。を（１）式に再
び代入することより、最確泳動距離（Ｗｏｎ’）で表わ
される基本サンプリング点Ｓｏｎ°を決定することがで
きる。

この基本サンプリング点Ｓｏｎ゛を基にして、」−記凹
刻のそれぞれの各走査方向上において、各ノ、（本サン
プリング点ごとに基本サンプリング点を中心とする一定
幅内に存在するデジタル信号のうちで、前記の閾値処理
で決定された閾値以上の信可レベルを示すデジタル信号
の数を算出する。すなわち、基本サンプリング点のそれ
ぞれについてその位置（Ｗｏｎ’）を中心とする一定幅
（サンプリングマスク）を設定し、上記凹刻の各走査方
向」−において各々のサンプリングマスクでの閾値以上
のデジタル信号の数を算出する。

第３図は、本発明の信号処理方法により検出されたＤＮ
Ａの塩基特異的切断分解物の分離展開列−Ｈのサンプリ
ングマスクおよびサンプリング点の一部分を模式的に示
す図である。この第３図において四角で囲まれた領域が
サンプリングマスクである。

本発明において、」−記凹刻のそれぞれに含まれる各塩
特異的切断分解物は相互に排他的であることから、基本
サンプリング点の数は、上記四列のそれぞれにおけるサ
ンプリング点を合計した数に一致する。このことは、一
つ１１７）基本サンプリング点に対応する一つのサンプ
リング点が四列のうちのいずれか一列において検出され
ることを意味する。従って、同一サンプリングマスクに
おいては、検知対象のサンプリング点は、四列のうち一
列においてでのみ検出されなければならない。

上記の各列間における排他性を利用することにより、サ
ンプリングマスクのそれぞれについて、同一サンプリン
グマスク内の信号のレベルの評価値の最も高い一列を選
出し、この列にサンプリング点があるものと決定し、他
の三列にはないものと決定する。ここで、信号のレベル
の評価値とは、マスク内に含まれる信号のレベルの積分
値、あるいは閾値処理を行なった場合には信号のレベル
が閾値を越えるものの数のことをいう。このようにして
、全てのサンプリングマスクについて、四泳動列のうち
いずれか一列においてサンプリング点をそれぞれ検出す
る。従って、内部標準列の基本サンプリング点に対応し
て、上記四列のいずれかにおいてサンプリング点が検出
される。

従って、」二足の処理により、各々の列は最確泳動距離
（ｗｏｎ’）を有する基本サンプリング点Ｓｏｎ″の集
合（Ｓｏｎ’）ｖで表わされることになる。ここで、ｋ
は列の番号を表わす。

基本サンプリング点ＳＯｎ°について、１）（Ｓｏｎ’
　）ｒに属するサンプリング点をＧ目）（Ｓｏｎ’）ａ
に属するサンプリング点をＣ１１ｉ）　（Ｓ　ｏ　ｎ’
　ｌ　５に属するサンプリング点をＡｉＶ）（Ｓｏｎ’
　）ｓに属するサンプリング点をＴと置き換えたのちサ
ンプリング番号順に並べると、次のような図式が得られ
る。

Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・こ
のようにして、ＤＮＡ（あるいはその部分分解物）の片
方の鎖状分子についての塩基配列を決定することができ
る。なお、得られたＤＮＡの塩基配列についての情報の
表示は、上記の表示形態に限られるものではなく、各種
の任意の表示形態が可能である。たとえは、所望により
、さらに各列の走査方向上における信号のレベルを任意
に演算処理することにより、分離展開された各塩基特異
的切断分解物の相対量をも表示することが可能である。

あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち、上記の
記号で表わされた図式において各塩基に対応する組合わ
せとして、Ａ→Ｔ、ｃ＋ｃ、Ｃ−Ｇ、Ｔ＋Ａなる情報を
与えることにより、次のような図式で表わされるＤＮＡ
の塩基配列を得る。

Ｇ　−Ｃ−Ｇ　−Ｃ−Ａ　−Ａ　−Ｔ　−Ｇ　−Ｃ−・
＝−＝−Ｃ−Ｇ　−Ｃ−Ｇ−Ｔ　−Ｔ　−Ａ　−Ｃ−Ｇ
　−−・−川また、上記の例においては、支持奴体上で
一次元的方向に分離展開している四列の放射性標識物質
群を用いて説明したが、分離展開列は四列に限定される
ものではなく、四列より多くてもよく、また四列より少
なくてもよい。あるいは、一つの支持媒体を用いて同時
に二種類以上のＤＮＡの塩基配列を決定することも可能
である。

上記のような信号処理方法により決定されたＤＮＡの塩
基配列についての情報は、信号処理回路２６から出力さ
れたのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁気
テープなどの保存手段を介して記録装置（図示なし）へ
伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電子的
に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された記号・数値をビ
デオ・プリンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱
記録材料上に記録するものなど種々の原理に基づいた記
録装置を用いることができる。

なお、上記のようにして得られた情報は、このほかにも
、たとえば、既に記録保存されている他のＤＮＡの塩基
配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行なうこ
とも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において蓄積性蛍光体シートに転写蓄
積された試料中の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための読出装置（あるいは読取装置）の例を示すもので
ある。 １：蓄積性蛍光体シート、２：先読み用読出部、３：本
読み用読出部、４：レーザー光源、５・レーザー光、６
・フィルター、７：光偏向器、８：平面反射鏡、９：移
送方向、１０：先読み用導光性シート、１１：光検出器
、１２：増幅器、１３・制御回路、１４：レーザー光源
、１５：レーザー光、１６．フィルター、１７：ビーム
−エクスパンター、１８：光偏向器、１９：平面反射鏡
、２０：ｆθレンズ、２１・移送方向、２２二本読み用
導光性シート、２３：光検出器、２４゜増幅器、２５：
Ａ／Ｄ変換器、２６：信号処理回路 第２図は、ＤＮＡの塩基特異的切断分解物がゲル支持奴
体上で分離展開された試料のオートラジオグラフの例を
示す図である。 第３図は、本発明の信号処理方法により検出されたＤＮ
Ａの塩基特異的切断分解物の分離展開列］−のサンプリ
ングマスクおよびサンプリング点の一部分を模式的に示
す図である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代理人　　　弁
理士　　　柳川泰男 第２図 １　２　３４ １　２　３４ Ｔ”−ｆｉ−；Ｌ”ｉ’甫ｊＪ”−’−＋’＝’−τ−
１１？（和５８年１月２５１」 特許庁長官　　）１杉和夫　１ｔｌジ ２゜発明の名称 オートラジオクラフィーにおけるイ、７号−処理力法３
゜補正をする表 ・ＩＧイ１１との関係　　　　特１１１出願人イ」〜１
９ｉ　　　　　（５２０）富士写４°Ｌフィルム株式会
社氏名　　　　　代表沼　大　西　　實 ４゜代理人 ６゜補正番こより増加する発明の数　　　　　　なし手
続補正書 特許庁長官　　若杉和夫殿 １　事件の表示 昭和５８≦１　　特許願１！　　１３３４号２　発明の
名称　　　オートラジオグラフィーにおける信号処理力
法３　補正をする者 ４１イ４藷の［ｙ−１係　　特許出願入賞（３５８）　
１７Ｊ、！３　、、／９氏　名　　（７４６７）弁理士
　柳　川　泰　〒パ。 ５　補正命令の日付　　　　　　　　（自　発　）ｒ４
５、　補正ンこより増力口する発明の数　　　な　し７
、補正の対象 別紙の通り　　　　　　　　　方式　ｒ璽＼記 一ユ俳Ｕ１□　　　　　−二側Ｈ［− （１）７頁１３行目　　特異的にすＪ断する　→　塩基
笠異偵ぢ見指ｊ擾（２）１４頁８行目　　米国４９詐第
３，８　→　削除から同頁１０行目　　５９．５２７月
明細書および （３）２０頁２０行目　　記憶　　　　　　　→　記録
（４）２＋頁３行目　　記憶　　　　　　　→　四（５
）３４頁１７行目　　の一部分　　　　　→　削除から
同頁１８８行 目　６）３５頁２行目　　各塩特異的切断分　→　芥塩
基特異的辺逝分に解物　　　　　　　　物 （７）４０頁１行目　　の一部分　　　　　→　削除か
ら同頁２行目 以　　　上 ３２３−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■。ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定
   するためのオートラジオグラフィーにおける（ｉｉ号無
   処理方法あって、放射性標識が旧年されたＤＮＡもしく
   はＤＮＡ部分分解物の塩基特異的切断分解により得られ
   た、 １）グアニン特異的切断分解物、 ２〕アデニン特異的切断分解物、 ３）チミン特異的切断分解物、 ４）シトンン特異的切断分解物、 を含む少なくとも四本の塩基特異的切断分解物のそれぞ
   れか、支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離展
   開されて形成された分離展開列の放射性標識物質群から
   放出される放射線エネルギーを蓄積性゛蛍光体シートに
   吸収させることによって、この蓄積性蛍光体シートに該
   放射性標識物質群の位１δ情報を有するオートラジオグ
   ラフを蓄積記録したのち、８ｊＪ蓄積性蛍光体シートを
   電磁波で走査して該オートラジオグラフを輝尽光として
   放出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すことに
   より得られるそれぞれの分離展開列のオートラジオグラ
   フに対応するデジタル信号について、ｌ）該複数の分離
   展開列より内部標準列を合成し、該内部標準列について
   基本サンプリング点を決定する工程、 目）該２（本サンプリング点に基ついて設定されたサン
   プリングマスク内に分、布している各分＃展開列の放射
   性物質の信号を互いに比較し、各分ｌｉｅ開列間の想定
   す９ンプリング点の排他性を利用して各分１１１１Ｋ開
   列におけるサンプリング点を検出する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法。 ２゜基本サンプリング点が、デジタル画像データに対し
   て、スムージング、閾値処理および統計処理を行なうこ
   とにより決定されることを特徴とする’ｌ’ｌ’　ｉ！
   ’１１ｊｌ’ｌ求の範囲第１項記載のオートラジオグラ
   フィーにおける信５ン処理方ｌ、！。 ３゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決′
   ）ｊ！するためのオーＩ・ラジオグラフィーにおける信
   じ処岬方法であって、放射性標識が旧年・さ与たＤＮＡ
   もしくはＤＮＡ部分分解物の塩基特異的切断分解により
   得られた、 １）グアニン特異的切断分解物、 ２）アデニン特異的切断分解物、 ３）チミン特異的切断分解物、 ４）シトシン特異的切断分解物、および５）グアニン特
   異的切断分解物、アデニン特異的切断分解物、チミン特
   異的切断分解物、およびシ］・シン特異的切断分解物を
   含む混合物を含む少なくとも五本の塩基特異的切断分解
   物のそれぞれか、支持媒体」二に平行関係を以って一次
   元的に分子４展開されて形成された分離展開列の放射性
   標識物質群から放出される放射線エネルギーを蓄積性蛍
   光体シートに吸収させることによって、二の蓄積性蛍光
   体シートに該放射性標識物質群の位置情報を有するオー
   トラジオグラフを蓄積記録したのち、該蓄積性蛍光体シ
   ートを電磁波で走査して該オーセラジオグラフを輝尽光
   として放出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出す
   ことにより得られるそれぞれの分離展開列のオートラジ
   オグラフに対応するデジタル信号について、’　）　＋
   ’＋Ａ　１ｍ合物の分離展開列を内部標準列として、こ
   の該内部標準列について基本サンプリング点を決定する
   工程、 １１）該基本サンプリング点に基づいて設定されたサン
   プリングマスク内に分／［５している各分離ｊｌ＜間外
   の放射性物質の信号を互いに比較し、各分離展開列間の
   想定サンプリング点の排他性を利用して各分離展開列に
   おけるサンプリング点を検出する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法。 ４゜基本サンプリング点が、デジタル画像データに対し
   て、スムージング、閾値処理および統計処理を行なうこ
   とにより決定されることを特徴とする’ＪＹ　＋’＋’
   ！、；１’ｊ求の範囲第３項記載のオートラジオグラフ
   ィーにおける信号処理方法。