JPS59116223A - 膜によるタンパク質混合物の分画分離の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■１発明の背景 技術分野 本ブを明は、膜によるタンパク質混合物の万両分離の方
法に関するものである。

先行技術 製精、濶縮ｄ５よび特定の物質の回収の目的で、Ｗなる
物質の混合物の種々の分離方法が、工業的製法、工学、
生物工学および医療技術において用いられている。この
ような方法の例としては、抽出、蒸留、凍結乾燥、沈澱
Ｊ５よびクロマトグラフ分１３Ｉｌなどのようなよく知
られた方法がある。医療技術、特に血液学においては、
遠心分離法が、血漿力日ら固形の血液成分を分離するの
に用いられてきたが、この方法は一般的に血漿搬出法＜
ｐｌａｓｍａｐｈａｒｅｓｉｓ）と呼ばれ、１９５９年
に、ジエイ・エル”　７　］−リス（Ｊ、　Ｌ、　Ｔｕ
ｌｌｉｓ　）　、ディー・エム・サージエナー＜Ｄ、　
Ｍ、　Ｓｕｒｇｅｎｏｒ　）　、７−ル・ジエイ・ティ
ンク（Ｒ，Ｊ、Ｔｉｎｃｈ）　、エム・ディボンド（Ｍ
、　Ｄ　−１−１ｏｎｔ　）の［ニュー・ブリンシブル
・オブ・クローズド・システム・セントリフコゲ−ジョ
ン（Ｎ　ＱＷ　　ｐ　ｒｉｎｃｉｐｌｅ　　ｏｆＣ１ｏ
ｓｅｄ　　　Ｓｙｓｔｅｍ　　　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａ
ｔｉｏｎ　　＞　　Ｊ　　［５ｃｉｅｎｃｅ　　２４，
７９２．（１９５６）］により明らかにされたものであ
る。１０年経過以内に、血漿搬出法は膜分離法により医
療技術ならびに生物工学において補なわれた。膜分離は
、しばしば非常に感受的な懸濁粒の分離ｆに関する非分
裂法を与える。医療技術にＪ３いて該方法は膜血漿搬出
法（ｍｅｍｂｒａｎｅ　　ｐｌａｓｍａｐｈａｒｅｓｉ
ｓ）と、生物工学においては、クロス−フローミクロ濾
過（ｃｒｏｓｓ　−ｆｌｏｗ−ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａ
ｔｉｏｎ　）とそれぞれ呼ばれている［ニー・ニス・ミ
カエリス（Ａ　、　Ｓ　、　Ｍ　１ｃｈａｅｌｉｓ）の
［）ｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ　３５．３２９．　　（１
９８０）　］　。

血漿搬出法は当分野において格別の進歩をもたらし、限
外濾過および血液濾過による物質のある種類の濃縮が知
られている［アール　シエナベル（Ｒ，５ｃｈｎａｂｅ
ｌ　）　、Ｆｅｔｔ　−３ｅｉｆｅｎ　−Ａｎｓｔｒｉ
ｃｔ＋ｍ１ｔｔｅｌ　　８１　　Ｎｒ、　２．８３　（
１９７９）］が、ある物質の混合物の分画および選択分
離の双方を達成するには今月までのところ至っていない
。

選択性の問題は、第２膜の形成によるあるいは膜ど分１
１１１１されている物質との相互作用によるいわゆる濃
縮分極効果のゆえ非常に重要であり、孔隙径のために期
待される分離敷居値が変換される「エッチ・グミエル（
１−１、Ｃｈｅｍｉｅｌ　）のＴ　ｈｅｒａｐｅｕｔ　
ｉｃＰ　１ａｓｎｌａ　　ＥＸＣｌｌａｎ（ｌｅ　、エ
ッチ・ジエイ・ガーランド（Ｈ，Ｊ、　Ｇｕｒｌａｎｄ
）　、ブイ・ヘインセ（Ｖ、　ｌ−１ｃｉｎｚｅ　）お
よびエッヂ・ニー・リ−（１−１゜Ａ、Ｌｅｅ）編集、
５Ｉ）ｒｉｎ（ｌｅｒ　、　１５．　　（１９８１）］
、ケミエルの論文は医学的血漿搬出法に関する５６０の
引用例を掲げている。カスケード濾過法（ｃａｓｃａｄ
ｅ　　ｆ　ｉ目１ｒａｔｉＯｎ　）　、分画膜血漿搬出
法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ　　ｍｅｍｂｒａｎｅ　　ｐ
ｌａｓｍａｐｌＴａｒＯ３ｉｓ）および特殊膜血漿搬出
法（５ｐｅｃｉｆｉｃ　　ｍｅｍｂｒａｎｅ　　ｐｌａ
ｓｍａｐｈａｒｅｓｉｓ）による異なる分子量の成分の
分離が論議されている。エッチ・ストラスマン（Ｈ，Ｓ
ｔｒａｓｍａｎｎ）のＣｈｃｍｉｅ　　Ｔｅｃｈｎｉｃ
　　１１　　Ｎｒ　。

７．８１３．（１９８２）を参照のこと。ミクロ濾過膜
、限外濾過膜および超濾過膜（ｈｙｐｅｒｆ　ｉ　ｌ　
ｉ　ｔｒａｔｉｏｎ　　ｍｅｍｂｒａｎｅ）に関連させ
て、比較的低分子♀の物質から高分子を分離することが
可能である。

このような濾過方法に適した空洞ガラス毛管膜が西独特
許法箱２４５４１１１号に述べられていおり、血液の透
析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａＮｏｎ　）に関するこれら
の膜の使用が西独特許法第２７５７６７３号に述べられ
ている。述べられた装置において異なる膜の組み合せの
使用がエッチ・ジー・シ１バース（Ｈ，Ｇ、　５ｉｅｂ
ｅｒｔｈ　）　（７）　ｒプラズマ・エクスチェンジ・
シンポジムバンド（Ｐ　ｌａｓｕｍａ　　Ｅ　ｘｃｂａ
ｎｇｅ　　Ｓ　ｙｍｐｏｓｉｍｂａｎｄ　Ｊ　［エッヂ
−ジー・シエバース編集、５ｃｈａｔｔａｕｅｒ　　Ｖ
ｅｒｌａｏ　２９．　　（１９８０）］に述べられてい
る。しかしながら、試験された形体にあけるこれらに述
べられた装置は実用的でないものとして示されていた。

それはいくつかの重要な点に８５いて十分満足できない
ものである。第１に、生体内にぼりける膜は試験管内に
おいて測定された評価と比較して総合的に異なる態様を
示した。第２に、アルブミン回収は、アルブミンが交替
されなければならず、また電解質溶液（ａ液）が血漿の
タンパク質漉度定数を保持覆るように血漿に加えなけれ
ばならないために、非常に低かった。シエイ・タケダ（
Ｊ、王ａｋｅｄａ　）、ワイ・オノ（Ｙ、　０ｎｔｏ）
　、ケイ・ヤギタ（Ｋ、　Ｙａｇｉｔａ　）　、ワ−ｒ
’　・ス？　（Ｙ、　Ｓｕｍａ　）　、ケイ・カトカ（
Ｋ　、　Ｋ　ａｔｏｋａ　）のＡ　ｒｔｉｆｉｃａｌ　
　○ｌ’　Ｊ（ａ　１１　Ｓ　。

Ｖｏ、５　（ｓｕｐｐｌ、）１６８．（１９８１）１．
ｔｃｍの交替をダイリューション（ｄｉ　１ｕｔｉｏｎ
）と称する。

しかしながら、このダイリューションはせいぜい３倍の
希釈でしかない。

それ自体が技術的に楽観的である膜での低分子物質の不
充分な希釈は、４０％までの濾過率が用いられるという
結果となる。これらの物質が膜によっであるいは膜状に
形成される第２層によって保持されるとすると、全く低
い回収率にしか到達できない。

■０発明の目的 膜により血液、乳２発酵液などのようなタンパク質混合
物の分離のための改善された方法を提供することが一つ
の目的である。

本発明の他の目的は、６０％以上の低分子物質の回収率
と一方同時に液状混合物中の高分子物質の完全な分離を
達成するだめの連続的な方法での操作に適する方法を提
供することにある。

これらの開目的は、分離されるべきタンパク質混合物を
少なくとも１０倍まで希釈させ、この希釈タンパク質混
合物を少なくとも７０％の濾過率で高分子量物質を分離
する第１膜濾過段階に導入し、この濾液を少なくとも７
０％の濾過率で希釈媒体を分離し低分子量物質を濃縮す
る第２膜濾過段階に通すことを特徴とする膜によるタン
パク質混合物の分画分離により達成される。

驚くへきことに、分離される液状混合物が少なくとも１
０倍、好ましくは２０倍に希釈されると、７０％以上の
濾過率が達成できることが見出された。このような希釈
液においては、本質的に第２ｍは形成されず、耳１一種
の溶液での体内中で得られる膜の分離敷居値［阻止特性
（ｃｕｔ　−ｏｆｆ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
　）→は本質的に不変である。該希釈溶液はまた、時間
に関しであるいは分離希釈媒体の量に関して本質的に一
定であるように膜の態様を達成するための膜の逆洗浄に
用いることができる。血漿分離膜の高い濾過能は、ヒト
タンパク質の６０％以上の再循環を可能とし、異質タン
パク賀の添加を何ら必要としないという結果を導く。

■１発明の詳細な説明 本発明の全般にわたる方法は、次の実施例にて説明する
。本方法の個々の段階を別個に特別の適用に用いられる
ことは本発明の範囲内である。本発明は物質平衡を含む
方法を概略的に示す第１図でさらに図解される。

本方法は次の段階により構成Ｎされる。

■、ココロイド状溶解あるいは懸濁している微粒子成分
の分離（前処理段階）。

１Ｆ　、第１段階で得られた溶液の少なくとも１０倍希
釈。

■、高分子成分の濃縮あるいは７０パーセントより高い
濾過率での希釈媒体の低分子成分を伴なう分離。

■６もどすための成分の濃縮あるいは電解質を含む希釈
媒体の分離あるいは第１段階へもどすための物質より小
さい大きさへの分子低下。

なお、第１段階（前処理段階）は、分離されるべきタン
パク質混合物の種類により必要に応じて挿入されるもの
である。

本発明のざら進めた局面によると、分離される混合物の
さらに進めた分画を達成するため第■段階のあとに付加
段階を編込むことができる。

使用されたフィルターの膜設針は、分離される分子の種
類の大ぎさに依存する。膜の細孔ザイズは、流通孔路に
おいて次々と大、きいものから小さいものへと減少して
いく。正しい細孔サイズの選択は本質的に達成される最
適な分離のためである。

第１図は血液の膜カスケード血漿搬出法（ｍｅｍｂｒａ
ｎｅ　　ｃａｓｃａｄｅ　　ｐｌａｓｍａｐｈａｒｅｓ
ｉｓ）を図解する。

なお、第１図中の数値は、物質収支を表わす。

処理の間、血液は４０ｍ１／分の速度で患者から採取さ
れる。ここに示された血液回収の速度はほんの一例であ
り、これは高くも低くもできる。

一般的に、血液には約４０％の微粒子成分と約６０％の
血漿で構成される。血漿の全容積の約４０％は、１：２
０に希釈された後に、第１フィルり−（血漿分離器）１
から第２フイルター２へ通過ゴる１、第２フイルター２
において、高分子タンパク質（よ一定容積で、９５％の
濾過率でｉＩＰ！縮される。そのタンパク質はＩＩＭ＠
孔径により決められる敷居（ｌ「［による分離敷居値（
阻止特性）以上の覆−べでの微粒子を含む。示された実
施例においては、これは１５０，０００分子量以上の分
子を含む（この分画ｔよグロブリン分画と呼ばれる。）
、息石の病気の症状に応じて、この分画は放棄すること
もまた希釈と分離を繰り返してさらに分離することも可
能である。第■段階の限外濾過液は、この特殊な場合に
おいては白液濾過膜である次の膜３へ通される。この第
■段階分離では希釈サイクル（第■段階）へ限外濾過液
がもどされる間に、６０．０００以上の分子量部分が一
定容積で高い濾過率で濃縮される。ヒトアルブミンおよ
び凝固因子の大部分を含む６０，０００から１５０，０
００ドルトンの間の分画物は第１段階の濃縮物と共に患
者７にもどさる。実施例の物質収支は、この過程が一定
容積で作動していることおよび、電解質溶液の受部分の
以外は何ら異種の物質を患者にもどさないことを示して
いる。変更可能な本実施例のために選ばれた条件下で、
２〜３Ｍ間の処理は、血液の６〜７リツトルを濾過づる
のに充分である。

分画の経過中、一定容積は液体のあらかじめ決められた
量の添加と濾過液のあらかじめ決められた量の除去によ
り達成される。系内の圧ツノは膜抵抗の増大のため増加
するが、前もって決められた最大圧力（ここに図解され
た実施例においては５００１−リヂエリ）　　［Ｔｏｒ
ｒ　］　Ｆある。）に達でると直ちに、希釈媒体を用い
ての逆洗浄段階が行なわれる。従って、操作圧力は最初
の値にもどる。

なお、段階的分離と逆洗浄は、それぞれ圧力調節法およ
び容積調節法で置き換えることも可能である。

以下の実施例は、本発明の範囲を限定づることなしにさ
らに該方法を説明するものである。この実施例は特に有
用な刀ラス膜を用いて行なわれた。

しかしながら、プラスチックのような他の物質で作られ
た股もまた使用可能である。

実施例　１ ０．３％の脂肪を含む脱脂乳は異なる成分に分離された
。５７μｍの肉厚で２８２μｍの内径を持゛つ毛細管膜
のフィルターが使われた。膜の細孔容積は０．６ｍｌ／
ｇで好ましい細孔半径は１２゜４％ｍでｄ６った。処理
−された乳は第２図のｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ−ク【］ン］
ヘゲラムに示される組成物を持つ。コロイド状の高分子
成分（６８０００ダルトン）が分離された後、第３図に
示される分布が１９られた。

結果は以下の通りである。

通過　１１１Ｗ　　６８．８００：　　６．８％４５．
０００：１８．８％ ２９．０００：５３．５％ ２０．０００ニア１．４％ 濃縮段階に用いられた浸透物は第４図に示されるような
次の量を持っていた。

通過　ｍＷ　　６８．８００ニア９．２％４５．０００
：８５．４％ ２９．０００：９３．５％ ２０．０００：９４．７％ すべての分離段階が単一種の膜で行なわれたことは価値
ある点である。分離効果にお（ブる相違は、関係する物
質の濃度の相違によってのみ達した。

実施例　２ 皮膚筋炎の患者の血液が分画された。微粒子成分の分離
、および１：２０の希釈率（第１図で示された方法の概
要の第■段階により図解されｌｃもの）としノ〔のち、
希釈された血漿は、次の分離のためのに第■段階へ移さ
れ、次に第■段階で濃縮された。

次の分布が個々の物質に基づいて得られた。

投　　入　　　　　回　　収　　収　　吊物　　　　　
質　　　　［ｍ（１／分］　　　　［ｍｇ／分］　１　
％１アルブミン　　　　６６．９４　　　４５，１２　
６７．４免疫グロブリンＧ　　８．４５　　　　５．２
１　６２免疫グロブリンＡ　　１．１７　　　　０．４
６　３９免疫グロブリンＭ　　　Ｌｉ２　　　−４て　
　　　０＊ｗｌ量のため計測不可能 実施例　３ ＩＧ△−形質細胞種の患者の血液が実施例２に従い処理
された。希釈率は１：１４であった。

投　　入　　　　　回　　収　　収　　景物　　　　　
質　　　　［ｍす／分］　　　　［ｍｇ／分］　［％］
α１抗１ヘリプシン　１．７８　　　　１，０８　６１
アルブミン　　　　２１．１２　　　１２．６７　６０
１ヘランスフエリン　　１，４８　　　　０．３８　２
６免疫グロブリンＧ　　　１．４２　　　　０．４５　
５３免疫グロブリンＡ　　３２，９９　　　１２．４７
　３８力エルロフ゛ラジミン　０，１５　　　＊　　　
　０（ｃａｅｒｕｌｏｐｌａｓｉｍｉｎ　）補体Ｃ４０
，１７０，０５２９ 補体Ｃ３０，４３０，１４３３ 免疫グロブリンＭ　　Ｏ，１３＊　　　　０＝１？　　
微量のため計測不可能 処理の全時間にわたって計算された６０％のアルブミン
回収率における６２％までの免疫グロブリンの還元は、
先行技術の方法以上の本発明の方法の有利性を明らかに
示すものである。

本発明の方法は、いかなる種類のタンパク質混合物の分
離にも適用でさるものである。これは、Ｒ終生産物が酵
素から、他の高分子物質からおよび微粒子成分から分離
されるべき発酵汁の加工工程に使用可能である。例えば
本方法による分離系は、直接的に酵素反応器に接続可能
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は膜カスケード濾過の物質平衡を含む概略ブロッ
ク線図であり、第２図は、０．３％の脂肪を含む脱脂乳
のｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ−クロマトグラムであり、第３図
は乳の限外濾過液のｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ−クロマトグラ
ムであり、第４図は二度分離の乳の限外濾過液のＨＰＬ
Ｃ−クロマトグラムである。 １・・・第１フィルタ一部、２・・・第２フィルタ一部
、３・・・第３フィルタ一部、４・・・溶液希釈部、５
・・・希釈媒体混合部、６・・・濃縮物混合部、７，８
・・・患者、９・・・希釈媒体注入部。 特許出願人　　　　　ショット　グラスヴエルケドイツ
連邦共和国１０００ベルリン １９スパンダウア・ダム１３０ １４３−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）分離されるべきタンパク質混合物を少なくとも１
   ０倍まで希釈させ、この希釈タンパク質混合物を少なく
   とも７０％濾過率で高分子量物質を分離する第１膜濾過
   段階に導入し、この濾液を少なくとも７０％の濾過率で
   希釈媒体を分離し低分子物質を濃縮する第２膜濾過段階
   に通すことを特徴とする膜によるタンパク質混合物の分
   画分離方法。 （２）希釈液が２０倍希釈液である特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 （３）タンパク質混合物の希釈液を用いることなしに６
   ０％以下の濾過率で非溶解成分を分離する前処理段階が
   挿入されている特許請求の範囲第１〜２項に記載の方法
   。 （４）希釈媒体が、時間あるいは分離希釈媒体の量の点
   であらかじめ決められな間隔で膜を通して逆洗浄される
   ものである特許請求の範囲第１〜３項に記載の方法。 （５）段階的分離が圧力調節法により行なわれるもので
   ある特許請求の範囲第１〜４項に記載の方法。 （６）段階的分離が容積調節法により行なわれるもので
   ある特許請求の範囲第１〜４項に記載の方法。 （７）逆洗浄が圧力調節法により行なわれるものである
   特許請求の範囲第４〜６項に記載の方法。 〈８）逆洗浄が容積調節法により行なわれるものである
   特許請求の範囲第４〜６頂に記載の方法。 （９）分画膜血漿搬出法に用いられるものである特許請
   求の範囲第１〜８項に記載の方法。 （１０）タンパク質混合物が発酵液である特許請求の範
   囲第１〜８項に記載の方法。 （１１）膜がガラス膜である特許請求の範囲第１〜１０
   項に記載の方法。