JPS5865218A - 組織プラスミノーゲンアクチベーターの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組織ブラスミノーグンアクチベーター（以下ｒ
　ＴＰＡ　Ｊと称する）の製造法およびその安定な組成
物に関する。更に詳細には、アルブミンを添加すること
によってＴＰＡの安定化をはかり、　ＴＰＡを有利に製
造する方法、並びに長期間の保存においても活性が低下
しないＴＰＡ組成物全提供するものである。

従来、ブラスミノーゲンアクチベーターとしては、人尿
又は’！ｉｆ臓細胞の組織培養液より抽出精製したウロ
キナーゼが使用されている。

しかし、ウロキナーゼは、そのブラスミノーゲンアクチ
ベーター活性によって血栓溶解作用を示す以外に、血中
のフィブリノーゲン、α２−プラスミンインヒビタ−、
プラスミノーゲンを低下させるために、こｆ１全血中に
投与すると、出血や過耐性（ｔａｃｈｙｐｈｙｌａｘｉ
ｓ　）　ｋ起す欠点がある。

近年、ウロキナーゼの貼る欠点を有さないプラスミノー
ケンアクチベーターとして、人又は動物の臓器、血管壁
、体液、更にこれら細胞又Ｖｉ癌細胞の組織培養液中に
存在するＴＰＡが見出され、こわの医薬品としての開発
が期待されている。

ＴＰＡは免疫学的活性及びフィブリンに対する親和性の
点でウロキナーゼと相違している。

そして、ＴＰＡはウロキナーゼに対する抗体とは反応せ
ず、フィブリンと強固に結合し、また血中においてフィ
ブリンの存在下でアクチベーターとしての強い活性を発
現するものである。従って、ＴＰＡはウロキナーゼと異
なり、上述の如き副作用がなく、小倉で光分な血栓溶解
活性を有する、ウロキナーゼに代わる医薬品としての期
待が大きいものである。

現在、ＴＰＡｔ’ｌ’人又は動物の卸１胞等から分離す
る方法によって製造きわており、その分離精製法として
は、塩析、イオン交換、ゲルｆ過、疎水性クロマト、ア
フィニティクロマト等による方法が報告されている。就
中、アフイニテイクロマト法が優ねており、このリガン
ドとしては、フィブリン（ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａＢｉｏ
ｐｈ７ｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　６２１　、２４１　（１
９Ｂ（１）〕、アルギニンＣＴｈｒｏｂｏｓｉｓ　Ｈａ
ｅｍｏｓｔａｓｉｓｅ　４２　ｓ４１４　（１９７９）
）６るいはりジン［Ａｒｃｈ　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈ７ｓ−＋　１８９
　＊　１８５（１９７８）Ｅ等が使用されている。

しかしながら、　ＴＰＡはｌｉｌ製が進むにっわて活性
が低下し、高度に精製されたものの活性低下は特に著し
い。従って、こｉ′１を防止する　３− ための安定化剤の研究が行われており、アルギニン［Ｊ
、Ｂ、Ｃ，２５４，１９９８（１９７９）：］、ゼラチ
ンＣＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　８　＊　７９　（１
９６９）］あるいはフィブリンＣＴｈｒｏｍｂａｓ　：
ｔ（ａｅｍｏｓｔａｓ。

４５　、４３　、　（１９８１）Ｅ等が報告されている
。

しかし、アルギニン及びセラチンはその効果が不充分で
あり、またフィブリンは安定化効果は優わているが、医
薬品に添加できないという理由で、何名も実用に供され
ていない。

斯カる実情において、本発明者は、’ｒＰＡ−ｅ安定に
保持する方法について鋭意研究を行った。すなわち、Ｔ
ＰＡは高純度では不安定であるが、純度の低い粗酵素液
中では安定であることに看目し、血管潅流液より分離し
たＴＰＡ含有粗酵素液中でＴＰＡの安定化に寄与してい
　４− る物置全検討した結果、こねが血清アルプミ７　テｆｐ
ることを見出した。そして、更にアルブミンのＴＰＡに
対する安定化効果について検討を行ったところ、こわの
当該効果はフィブリンのそわと同程度であり、従来ウロ
キナーゼの優れた安定化剤として知ら引ているゼラチン
、プロタミン硫酸に比較し１００倍以上であることを見
出し、本発明を充放した。

従って、第１の発明は、ＴＰＡの精製工程又は粉末化工
程の任意の段階においてアルブミンを添加するＴＰＡの
製造方法を提供するものである。

第２の発明は、ＴＰＡとアルブミンを含有する安定なＴ
ＰＡの組成物を提供するものである。

本発明において安定化剤として使用す釣るアルブミンと
しては神々のものが用いらｈるが、人血清あるいは胎盤
由来のアルブミンが特に好捷しい。

第１の発明は種々の原料から調製さｈる粗酵素液力）ら
ＴＰＡを分離精製する何れの方法にも適用することがで
きる。一般に分離精製には上記手段及び透析、限外濾過
等の操作を単独あるいは組合せて使用されるが、特にア
フイニテイクロマト法が好ましい。アルブミンの添加は
当該粗酵素液は勿論、何りの段階で行ってもよい。

また、ＴＰＡの由来が正常細胞及び癌細胞の組織培養液
、ブタ等の臓器抽出液等である場合には、脱ウィルス処
理のために６０℃で約１０時間加熱する必要があるが、
こねによってＴＰＡが失活されるので、この処理前にア
ルブミンを添加するのが好ましく、アルブミン全添加す
るとこの処理によってもＴＰＡ活性は殆んど損われない
。

以上のよう彦精製工程で添加されるアルブミンの量は、
その処理によっても異なるが、一般には粗酵素液を基準
として、そのｏ、ｏｏｉ〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲が奸
才しい。

斯くして分離精製さｈ、たＴＰＡは凍結乾燥、噴霧乾燥
等によって粉末化して製品とされるが、この工程におい
てもＴＩ）Ａけ失活する。この場合においても、アルブ
ミンを添加しておくと当該活性の低下は殆んどみらｈな
い。この場合のアルブミンの添加量は、最終製品への混
入を考慮して選択されるが、通常０．（１０３７− 〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。

なお精製工程において添加したアルブミンが過剰に製品
中に混入するような場合には、公知の方法によって除去
して至適濃度に調整した後粉末化する。

更にまた、高純度に精製さｈたＴＰＡは長期間保存する
とその活性が低下する。しかし、こわにアルブミン全添
加配合しておくと活性の低下は殆んどみられない。この
場合のアルブミンの量は０．００３〜１％（ｗ／ｖ）で
充分であり、とｆ′Ｉは、上記精製工程又は粉末化工程
で調節しても、また最終製品にｉｆｒたに配合してもよ
い。

液上の如くして得られたＴＰＡとアルブミンを含有する
本発明組成物は、他の安定化剤を　８− 添加したものに比較し極めて安定であり、アルブミンの
添加量も極めて少ないので医薬品として特に優れたもの
である。

次に実施例を挙げて説明する。

実施例１ ＴＰＡの安定性試験 （１）溶液中の安定性 ＴＰＡの生理食塩水溶液（６（ＩＵ／ｍ／）に第１表の
安定化側全添加し、室温にて１日又は２日放置した後、
　ＴＰＡの残存活性を測定し友。

尚力価測定は次の方法で行った（以下の実験についても
同じ）。

７５％凝固フィブリノーゲン（Ｍｉｌｅｓ社製：プラス
ミノーゲン含量約１４０カゼイン単位／？凝固蛋白）？
原料として、作製した寒天加フィブリン平板を用い、ウ
ロキナーー＋ｉヲ標準品とするプレート法で測定した。

組織アクチベーター溶液全１％ゼラチン、０．１　Ｍ塩
化ナトリウム及び０．１％窒化ナトリウムを含む０．０
６７Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で希釈し、フィ
ブリン平板上で１．ｓＩＵ／−のウロキナーゼと同じ溶
解窓を示す組織アクチペーター溶液の濃度を１．５Ｕ／
−とした。

その結果全第１表に示す。

以下余白 第１表 １１− （１１）　　凍結乾燥時の安定性 ＴＰＡの生理食塩水溶液（６ｏＵ／ｓｄ）に第２表の安
定化剤を添加し、ｐＨｆ７．Ｏに調整する。こね全一４
０〜−５０℃で３時間予備凍結し、−４０〜＋３０℃、
真空度０．４Ｘ１０”〜０．６　Ｘ　１０−”　ｍｍＨ
Ｐで２０時間−次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．ｌ
Ｘ１０−ｉ〜０．２×１０−”　ｍｍＨＰで３時間二次
乾燥する。得られた粉末の残存活性により安定化作用を
比較した。

結果を第２表に示す。

以下ｇ；白 １２− 第２表 （ＩＩ）　　脱ウィルス処理時の安定性ＴＰＡの生理食
塩水溶液（６０Ｕ　／　ｍｅ　）に第３表の安定化剤を
添加し、ｐＨを７．０に調整する。こわ、全６０℃で１
０時間加熱処理し、残存活性を測定し安定化作用を比較
した。

結果を第３表に示す。

第３表 実施例２ ブタの耳をタイロイド液で潅流し、アセチルコリン（約
１μ？）を間欠的に加えて、血管壁アクチベーターを遊
離させる。潅流液はフラクションコレクーター゛で分画
し、線溶活性の高い両分を集める。ブタの耳１個当り５
０〇−程度の溶液が得られる。

ブタの耳１００個（平均４００７７個）を潅流して、約
５ｏｚ（ａＵ／ｍｚ）の溶液を得、こねに硫酸アンモニ
ウム’ｅ　３００　ｔ／１（ｒＪＷｉｌ１合で加え、Ｐ
Ｉ−ｉを７．０に調整して、−晩装置する。生じた沈澱
全セライトで１遇した後、セライトごとカラム（４Ｘ　
２５　ｃｍ　）に充填する。２Ｍ硫酸アンモニウム、１
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，２）でカラムを洗浄した後、同緩衝液から１Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．０　］、　ＭリＭリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７，２）までの濃度勾配でアクチベーターを浴出させ
る。得られた溶出液は液量２１゜活性５０Ｕ／ｍ／、比
活性１２５Ｕ／Ａ２８０であった。この液をオクチルセ
ファロースの　１５− カラム（２，５ｘｌＯｍ）に吸着させた後、エチレング
リコ−シフ５０％程度捷で濃度勾配法で増加させ、アク
チペーターを溶出する。

溶出液は液量３１．活性２５　Ｕ／ｄ、比活性９００Ｕ
／Ａ２８０であった。

得られた溶液１を全用い、こわにヒト血清アルブミンを
１００μノ／ｄ（０，０１％）の割合で加え、フィブリ
ンセファロースカラム（２Ｘ　２　（１ｃｍ　）に吸着
させた後、１Ｍ塩化ナトリウム浴液で充分洗浄し、０．
０１％ヒト血清アルブミン、０．５Ｍアルギニンを含む
０．００５Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で溶出し
た。この溶液は渡世２３０−５活性１１０ＩＵ／ｍであ
った。これをダイアフィルターＡ　−１５Ｔで濃縮後、
１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ１６− ＥＤＴＡ　、　０．０１％ヒト血血清アルブミン全科０
、　（１１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化した
セファデックスＧ−１５０のカラム（３Ｘ　１　（ｌ　
Ｏｔ：ｍ　）でゲルｆ過して得られるアクチベーター活
性画分を集め生８！穴塩液に対して透析した。この溶液
は液量７０−１活性３０ＱＩＵ／−であった。同、添加
し、たアルブミン？除いた時の比活性は１７．（１００
Ｕ／Ａ２８０　（収率４２％）であつ友。

同様に、溶液ｌｔを用いアルブミン無添加で処理した場
合には、液量１３０ｍ／、活性８０Ｕ／１１ｔ、比活性
１２，０ＯＱＵ／Ａ　２８０　（収率２１％）であった
。

実施例３ ブタ心ｐｍ、ｓＫｙｗ肉挽器でミンチにし、アセトン（
−２０℃）を２１−／Ｋｙの割合で加え、ブレンダーで
攪拌した後、１過をする。この脱脂操作を数回繰り返し
てアセトン処理粉末７００１を得る。この粉末１００ｙ
当り８０〇−の０，３Ｍ酢酸カリウム溶液（ｐＨ４，２
）を加え、ブレンダーで攪拌後４℃下で３時間組織アク
チベーター全抽出する。この抽出液を遠心分離で集め、
残渣には０．３　Ｍ酢酸カリウム浴液（１）Ｈ４，２）
４（１０ｍ／１００）を加えて再抽出する。これらの抽
出液に倣酸アンモニウム′（ｉｌ−３００１１／ｌの割
合で加えた後、ｐＨｉ　７．０に調歪し、４℃下で一晩
放置する。

生じた沈澱を遠心して集め、０．３Ｍ酢酸カリウム溶液
（ｐＨ４，２）に俗解した後、ｐＨを７．０に調整し、
粗酵素液を得る。この液は液量２　ｔｓ活性３００　Ｕ
／ｍｌであった。これ全実施例２に従ってアルブミンを
添加し、フィブリンセファロースのアフィニティーカラ
ムクロマトグラフィーで精製し０９％地化ナトリウムを
含む０．００１Ｎ塩酸溶液で透析した後、水酸化す）　
ＩＪウム水溶液で中和し、液量１ｔ、活性３５０　Ｕ／
＊、比活性８，０ＯＯＵ／Ａ２８０の浴液全得た。

実施例４ 血圧＃Ｆ’ｅ用いた血管圧迫処置直後の健康人ボランテ
ィアから、抗凝固剤としてクエン酸ナトリウム溶液を用
いて採血し、直ちに３．０００ｒｐｍ、１０分間遠心し
て、血漿を合計１を調製した。この血漿にベンツアミジ
ン及びＥＤＴＡを各々５　ｍＭとなるよう加え′ｆＣ，
後、−１９− ３回に分けてリジンセファロースカラム（３ｘ　２５　
ｃｍ　）に吸着させる。カラムを０．６Ｍ塩化ナトリウ
ムケ含む０．００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で充
分洗浄後、１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．００５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で溶出する。これらの溶出
液を水で３倍に希釈して実施例２に従ってアルブミンを
添加し、フィブリンセファロースのアフィニティーカラ
ムクロマトグラフィーで精製した後、限外ｆ’過で濃縮
する。この溶液は液量４−１活性３０Ｕ／ｍ、比活性３
，０ＯＯＵ／Ａ２８０であった。

実施例５ 人）座瘍細胞より分離した細胞を、ペニシリン−〇１０
０Ｕ／−及びストレプトマイシン２０− １００γ／　ｍｅ　ｆ＆加したＤＭＥ培地に、更にＦ”
Ｃ８を２０％添加した培地で十分発育させた後、培養液
をＦＣ８無添加の培地で更に３７℃で３０時間培養した
。この時の組織アクチベーター活性は、約ｉ　０　Ｕ／
ｍｇであった。得られた培養液１ｔを５，０００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離して得られる上清を用い、以下実施
例２と同様に処理して、液量８０ゴ、活性５０Ｕ／−の
組織アクチペーターを得た。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　組織プラスミノーゲンアクチペーターの精製工程
   又は粉末化工程の任意の段階においてアルブミンを添加
   することを特徴とする組織ブラスミノーゲンアクチベー
   ターの製造方法。 ２、組織ブラスミノーゲンアクチベーターとアルブミン
   を含有する安定な組成物。