JPS5863395A - アルフア・ネオ・エンドルフインの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子工学の方法によりアルファ・ネオ・エン
ドルフィンを製造する方法に関する。

エビエイトホルモン（アルファ・ネオ・エンドルフィン
、以下α−Ｎ　、に、と略称）は１９７９年寒川、松用
らによりブタ視床下部から発見された新しい脳内ホルモ
ンであり、その構造はＨ２Ｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−
Ｌｙｓ−ＣＯＯＨであることが報告されている。

本発明者らはα−Ｎ、ＦＸ、をブタ視床下部のような入
手困難な天然物を原料とすることなく量産すること意図
して本発明を完成するに至った。

本発明は、α−Ｎ、　Ｌ遺伝子を合成し、他方プラスミ
ドベクターを造成し、その遺伝子とベクターを連結して
それを用いて受容菌を形質転換し、次いで形質転換した
菌を培養して培養物中にα−Ｎ、Ｊ　　を含むたんばく
を生成させ、これを採取、分解し、α−Ｎ、Ｊを分別す
る一連の工程、その部分工程、中間物に関する。

以下と記工程の順に本発明を説明する。

α−Ｎ、Ｊ遺伝子の合成 α−Ｎ、　Ｂ、を直接コードする遺伝子は次のヌクレオ
チド配列で表わしうる。

ユΔＫｌ　工肋２旦ＧＩ、３工■４三工５ヨ上６止７男
８工旦瓦９差人ＪＩＯ （Ａはデオキシアデニル酸、Ｇはデオキシグアニル酸、
Ｃはデオキシシチジル酸、Ｔはチミジル酸、の残基を表
わし、ＪはＡまたはＧ、にはＴまたはＣ，ＬはＡ、Ｃ，
ＴまたはＧを表わし、ＣＴＬはＴＴＪで、ＣＧＬはＡＧ
Ｊでそれぞれ置換してもよい） 上記配列中、各アミノ酸に対応するトリブレンド（コド
ン）として望ましいものを選べば、たとえば、ＴＡＴ　
　ＧＧＣＧ−ＧＴ　　ＴＴＣＣＴＴＣＧＴ　　ＡＡＧ　
　ユＡＴ　　旦立土　ム人ｌが挙げられる。

また、α−Ｎ、　Ｅ、遺伝子を組み込んだベクターによ
り形質転換した菌を培養した場合α−ＮＥは培養物中に
雑種たんばくとして発現すると考えられ、そのたんばく
からＣＮＢｒ処理によりα−Ｎ、　Ｅ、を分離できるよ
うにα−Ｎ、Ｅ、のＮ末端の先にメチオニンを付加する
のが好ましく、４そのためには遺伝子の５末端にメチオ
ニンのコドン（ＡＴＧ）を付加する。また、遺伝子の３
′末端には転写を終止させるための転写終止コドン（Ｔ
ＡＡ、ＴＡＧ）を付加する。

さらに、ベクターにα−Ｎ、　Ｆｉ、遺伝子を組み込め
るように５′末端（上記メチオニンのコドンの外端）に
制限酵素ＢＯＯＲ工認織部位を形成するようにＡＡＴＴ
Ｃを付加する。また、８′末端にはＢａｍＨＩ認織部位
を形成するようにＣＣＴＡＧを付加する。

このようにデザインしたヌクレオチド配列を二重鎖とし
て示せば次の通りである。

ＡＡＫＺ　　ＧＡＬ’　　（）ＣＬ／　　ＴＴ：ＩＩ　
　ＡＴＫＩ　　（）ＧＩ／（配列中、、Ｔ、に、Ｌは前
記と同義、Ｊ’　、　Ｋ’　、　ＴＩ／はそれぞれ相対
するＪ、に、、Ｉ、と塩基対を形成するヌクレオチドを
表わす） 上記二重鎖ヌクレオチドの望ましい態様は次のようであ
る。

ＧＴＡＣＡＴＡ　　ＣＧＧ　　ＣＣＡ　　ＡＡＧ上記の
ようにデザインしたポリヌクレオチドは文献上公知の方
法り例、化学同人発行「核酸有機化学Ｊ　（１９７９年
）、東京化学同人発行「生化学実験講座、核酸の化学１
１１Ｊ　Ｐ、３３８（１９７９）］により、上方ストラ
ンドと下方ストランドのポリヌクレオチドを合成し１次
いでリガーゼ反応により二重鎖を形成させることができ
る。

本発明者らの研究により、下記のように、Ｌ方ストラン
ドをｆｌ）〜（４）、下方ストランドを（５）〜（８）
の各４個のオリゴヌクレチドに分割して合成し、５′−
末端のリン酸化されたＦ−２〜４右よびＦ−（３〜８と
、５′−末端のリン酸化されていないＦ−１および？−
５とをリガーゼの存在下に反応させると一挙に上記の二
重鎖ポリヌクレオチドの得られることが判った。

（上方ストランド） Ｆｉ　　　　”ＡＡＴ’Ｉ’ＣＡＴＧＴ”Ｆｉｌ　　　
　　　ｐＡＫＧＧＬＧＧＬＴＴＫＣＦ　′ｍｐ　Ｔ　Ｌ
　ＣＧ　Ｌ　Ａ　Ａ　Ｊ　Ｔ　Ａ　Ｋ　ＣＦ　Ｉｉ　　
　　　　ｐ　ＣＬ　Ａ　Ａ　Ｊ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ａ　
Ｇ（下方ストランド） ＦＶ　　　　”ＧＡＴＯＣＴＡＴＴ” ＦＷ　　　　　　　　　ｐＡＪノＴ　　Ｔ　　Ｌ’Ｇ　
　Ｇ　　Ｋ’Ｔ　　Ａ　　ＪＩＴＦＶＩ　　　　　ｐＴ
ＡＩ／ＧＬ’ＡＧＫ’ＡＡＬＣＦｖ１　　　　ｐＣＬ’
ＣＣＫ’ＴＡＣＡＴＧ（上記配列中、Ｔ　、　Ｋ　、　
Ｌ　、　Ｊｌ　、　Ｋ／　、　ＩＩは前記と同義） そして、前記の望ましい二重鎖ヌクレオチドの態様に対
応する８個のオリゴヌクレオチドは次のＦ１〜Ｆ８であ
る。

（１方ストランド） Ｆｌ　　　　”ＡＡＴＴＣＡＴＧＴ” Ｆ’２　　　　　ｐＡＴＧＧＣ（）ＧＴ、ＴＴＣＣＦ３
　　　　　ｐＴＴＣＧＴＡＡＧＴＡＴＣＦ４　　　　　
ｐＣＧＡＡＧＴＡＡＴＡＧ（下方ストランド） ｙ　５　　　　”ａ　Ａ　Ｔ　Ｃｉ、　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｔ
　”Ｆ（Ｊ　　　　　　　ＡＣＴＴＣＧＧＡＴＡＣＴＦ
７　　　　　　ＴＡ℃ＧＡＡＧＧＡＡＡＣ７８Ｃ−Ｇ　
ＣＣＡ　’Ｉ’　Ａ　ＣＡ　Ｔ　Ｇ本発明は、上記の各
オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびそれらを用いて
リガーゼ反応により一挙に所望の二重鎖ポリデオキシリ
ボヌクレオチドを製造する方法を包含する。

これらのオリゴデオキシリボヌクレオチドはＢｒ０ｋ＆
およびＣｒｅａらの方法［Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ
、旦５４６１　　（１９５Ｑ）、Ｐｒ０ｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ。

ＳＣ１，：１ｉ５７６５　　（１９７８）］に準じて合
成することができる。その反応式は第２図に示される。

すなわち、完全保護した２官能性ダイマー（社）をたと
えば、ピリジン−トリエチルアミン−水のような加水分
解剤で部分的に水解して３′末端のリン酸ジエステル基
をモノエステル基に変え（２）′、次いでこれに５’−
ＯＨを有し、８′末端・がシリン酸エステル化されたモ
ノマー（Ｉ）を、たとえばメチレンスルホニクムテトラ
ゾリドのような縮合剤の存在下に反応させて完全保護さ
れた２官能性トリマー（２）を得る。

次いで、これらの化合物群を原料として、プロンク縮合
法により一定の塩基配列で縮合させて、前記のオリゴデ
オキシリボヌクレオチドＦ４〜Ｆ■、たとえばＦｌ、Ｆ
８を完全保護の形で得、続いて脱保護剤またとえば濃ア
ンモニア水、８０％酢酸などを作用させて完全に脱保護
し、所望のオリゴデオキシヌクレオチドを得る。

かくして得られた８個のオリゴヌクレオチド・フラグメ
ントをα−Ｎ、　Ｅ、遺伝子の塩基配列に従って結合す
る。その結合は、たとえば、各７ラグメントの５’−Ｏ
Ｈ末端番リン酸化したのち、各等量の７ラグメント混合
物をリガーゼの存在Ｔｉ反応させることによって行うこ
とができる。これらの反応自体は知られている。このラ
イゲーション反応の過程で目的の遺伝子がその５′末端
粘着部位（ＥｃｏＲ工およびＢａＪＩ　）で２個以上互
に結合しないようにするのがよ≧、そのために（よ、た
とえば、Ｆｌ、Ｆ８の７ラグメントを用いる場合はＦｌ
とＦ５の５’−ＯＨ末端はリン酸化せずに用いるのがよ
い。

５／−ＯＨ末端のリン酸化は、たとえばＡＴＰとＴ４　
　ポリヌクレオチドキナーセ°を用いて行われる。

ライゲーション反応は、たとえばＴ４ＤＮＡリガーセ゛
を用いて行うことができ゛る。

かくしてα−Ｎ、に、遺伝子（４４量体）を合成するこ
とができる。

組換えプラスミツドの構成と形質転換 光スλｐ／ａｃ　　５　　ＤＮＡラクトースオペロンの
プロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域を持った
プラスミツドを造成するために、ｐＢＲ３２２ＤＮＡと
λｐ／ａｃ　　５　　ＤＮＡ　　を制限エンドヌクレア
ーゼで消化し、反応物をライゲーション反応に付する。

制限エンドヌクレアーゼとしてはＦｃ。

Ｒ工を用いるのがよく、また、ライゲーションの酵素と
してはＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるのがよい。

かくして得られたＤＮＡを用いてニジセリシア属の株に
形質転換する。好ましい株は、たとえばＥ、Ｃｏ／ｉ、
に１２Ｗ３１１０である。形質転換株からプラスミドを
分離し、Ｈｌｎｄｌｌにより消化したのちアガロースゲ
ル電気泳動法でプロモーターβ−ガラクトシダーゼの方
向性を調べ、望ましい方向性を有するプラスミドを選択
する。

このプラスミドにはＥｃｏＲ工により切断される部位が
２ケ所ある。ので、そのうちβ−ガラクトシダーゼプロ
モーターに近い部位を除去する。そのためにはプラスミ
ドをＩｅｃｏＲ工で部分消化し、反応物からアガロース
ゲル電気泳動法で目的とするＤＮＡフラグメントを分離
する。このフラグメントは末端にｇｃｏＲ工による切断
によって生じた一本鎖部分を有するので、これにＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを作用させてその一本鎖部分を二本鎖
とし、次いでＴ４ＤＮＡリガーゼを作用きせて閉環し、
ＥＣｏＲ工による切断部位が１ケ所のプラスミドを得る
。このプラスミドを用いて前記のようにに、ＣＯ／１Ｋ
１２Ｗ８１１０に形質転換し、テトラサイクリン耐性株
を選び、その株のコロニーからプラスミドＤＮＡを分離
し、ｇｃｏＲ工とＨｌｎｄｌｌ　　で消化し、生成する
ＤＮＡフラグメントの大きさをアガロースゲル電気泳動
法で調べて、２ケ所あったＥｃＯＲ工切断部位のどちら
が消失しているかを決定し、所望の１ケ所が消失したプ
ラスミドを選択する。

次に、上記のプラスミドをＥｃｏＲ工とＢａｍＨＩで完
全消化し、アガロースゲル電気泳動で大きいＤＮＡ断片
を分取する。−万、前記の方法で得たα−Ｎ、に、Ｄ　
Ｎ　Ａの５′−〇Ｈ末端を、たとえばＡＴＰとＴ４ボリ
ヌクレオチドキナーセ°を用いて、リン酸化し、これを
上記のＤＮＡ断片と共にライゲーション反応をする。反
応はＴ４ＤＮＡリガーゼとＡＴＰを用いて行うのが好ま
しい。

この反応により得られたＤＮＡを、たとえばＥ。

Ｃｏ／１Ｋ１２ＷＡ８０２のようなニジエリシア属の菌
株を受容菌として形質転換し、形質転換株をアンピシリ
ン含有培地、次いでテトラサイクリン含有培地を用いて
スクリーニングし、アンピシリン非感受性、テトラサイ
クリン感受性のコロニーを選択する。これらのコロニー
の一部を任意に選んでそれらから得られたプラスミドＤ
ＮＡをＷｃ。

Ｒ工とＢａｍＨＩで消化し、生成した小さなりＮＡフラ
グメントのサイズと塩基配列を調べたところ、試験した
金側についてα−Ｎ、に、　Ｄ　Ｎ　Ａに一致すること
が判った。そして、ＷＡ８０２株の形質転換により得ら
れた株はＪ−Ｃｏ／ｉ　ｘ１２ｓＥＩＭ１０２　と命名
された。

上記のように形質転換した菌株を培養すればα−Ｎ、に
、が菌体内に生成する。前述した態様でプラスミドを構
成すると、α−Ｎ、に、遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ
構造遺伝子内に挿入されているためα−Ｎ、に、はβ−
ガラクトシダーゼとの雑種たん白として発現すると思わ
れるが、α−Ｎ、Ｅ、遺伝子のデザインにおいて述べた
ように５′端にＡＴＧが付加されていることにより発現
するα−Ｎ、　Ｅ、のアミノ末端部位にはメチオニンが
挿入されており。

したがってこの雑種たん白を、たとえば臭化シアンで開
裂してα−Ｎ、　Ｅ、を分離できるのではないかと期待
される。そしてその期待通りα−Ｎ−乙を分離できるこ
とが判った。

上記の形質転換した菌株を、たとえばＬ−プロス（グル
コースを除き、アンピリシリンを添加〕中で培養し、培
養物から遠心分離で得た菌体に臭化シアンを作用させ、
反応液の凍結乾燥物を、たとえば希酢酸に溶解して吸着
クロマトグラフィを行うことによりα−Ｎ、　Ｂ、を分
離することができる。

かくして得られるα−Ｎ、乙は逆相ＨＰ　ＬＣＩコおけ
る溶出パターン、放射免疫分析法、アミノ酸分析法、ア
ミノ酸配列の解析および生物学的活性各こおいてすべて
天然品と一致するデータを示し、またその収率は従来遺
伝子工学的方法の分野で報告されているものにくらべて
格段に優れている。

実施例 １、　α−Ｎ　、Ｆｉ、遺伝子フラグメントの化学合成
本文に示した、それぞれＦｌ、Ｆｇと名付けた８個のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドの化学合成のための方法
及び原料については、以下番と述べる変更を除いては、
基本的にはブロン力及びフレア等により報告されている
方法（Ｂｒｏｌｃａ、Ｃ，。

ｅｔ　ａｌ　（１９５Ｑ）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅ
ｓ、Ｑ５４６１　およびＣｒｅａ、Ｒ１，ｅｔ　ａｌ　
（１９７８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ／、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、ヱ５　５７６５］を用いた。

完全に保護された２官能性トリマー（第２図参照）は、
以下に述べる改良法を用いて８〜５ミリモルスケールで
合成した。すなわち、完全保護した２官能性ダイマー１
１（１モル当量）をピリジンートリエチルアトンー水（
８：　１　：　Ｉ　Ｖ／Ｖ　）混合液によって相当する
８′−燐酸ジエステル成分前に変換し、これに５′−水
酸基成分工、（１，５モル当量）を加え、縮合剤、メシ
チレンスルホニルテトラゾリド（ＭｓＴｅ、９〜８モル
当量）を用いて縮合反応を行なった。生成物はシリカゲ
ルを用いたクロマトグラフィー及びＣ１８を用いた逆相
りロマトグラフイーにより単離精製した０この改良技術
で製造した１６種の２官能性トナ→マーの収率及び３′
−水酸基をベンゾイル基で保護した２個の３′末端グイ
マー、４個の３′末端ト←マーの合成収率を表１に示す
。

表　　　　ｌ 辛　完全保ＩＩＩれたトリヌクレ薯チド＊＊３′末端ダ
イマー、トリマーブロックｎ・−１または２ この化合物群から出発して、一定の塩基配列を持った８
個のオリゴデオキシリボヌクレオチド、即ちＦ１〜Ｆ８
をグロック縮合法を用いて合成した。

その縮合法の態様の例をＦＢについて示せば次の通りで
ある。

（−）　　前記の方法で得た完全保護ＡＧＴＱ、９５ｍ
ｍ０！をトリエチルアミンで処理した後□、０．３７５
ｍｍｏｊＦ（７）ｆ！　ＯＡ　Ｔ　Ｃ４０Ｂ　Ｚを加Ｌ
、ピリジンヲ加えて共沸後、Ｍ　８　Ｔ　ｅ　Ｑ、５　
ｍ！ｎｏ／を加えて室温で１時間反応させ、次いで水を
加えて反応を止めた。溶媒を減圧下に留去し、トルエン
を加えて共沸を三回繰り返し、残留物をベンゼンスルホ
ン酸２チ含有クロＯホルム：メタノール（７：　８　Ｖ
／Ｖ）ｇＯ１ｎＩ！に溶解し、０℃で１０分間反応させ
た後５％ＮａＨＣＯＢ　を加えて中和し、クロロホルム
層を減圧濃縮し、シリカゲル・クロマトグラフィでＡＧ
Ｔ・ＡＴＣ−ＯＢＺを精製分離した（収率９３チ）。

（ｂ）完全保護ＴＡと完全保護Ｇとから合成した完全保
護（）ＴＡＯＪ１５ｍｍＯ／をトリエチルアミンで処理
した後、上記のＡＧＴ＠ＡＴＣ−ＯＢＺ　　０．２１ｍ
ｍ０／を加え、ピリジンを加えて共沸後、ＭＢＴｅＱ、
４２ｍｍｏｌ　を加えて室温で１．２時間反応させ、以
下（ａ）と同様に処理してＨＯＧＴＡ＠ＡＧＴ＊ＡＴＣ
−ＯＢＺを得た（収率８０％）。

（Ｃ）次に完全保護ＴＴＣＱ、３ｍｍｏ／　　をトリエ
チルアミンで処理した後、上記のＨＯＧＴＡ＠ＡＧＴＩ
ＩＡＴＣ−ＯＢＺＱ、ｌ　５ｍｍｏ／を加え、ピリジン
を加えて共沸を繰り返した後、ＭｓＴｅ　Ｑ、Ｑｍｍｏ
／　　を加えて室温で１時間反応させた。水を加えて反
応を中止させ、溶媒を減圧下に留去し、残渣をクロロホ
ルムで抽出し、クロロホルム層を５９１．ＮａＨＣＯｇ
　で洗浄した後減圧濃縮し、残留物をシリカゲル拳りロ
マトクリフイで分離、精製して完全保護”ＴＴ３′ ＣＧＴＡＡＧＴＡＴＣを得た（収率６０チ）。

Ｆｌ　＊　’２　ｍ　Ｆ４〜Ｆ８の各７ラグメントもヌ
クレオチドの組み合せを変えるほかは上記と同様にして
製造された。この様にして得た完全保護した８個の７ラ
グメントは各々、濃ＮＨ４ＯＨで５５’ＣＩＯ時間、次
いで８０％酢酸で室温１０分処理することにより全ての
保護基を除去した。最終産物の精製は高速液体クロマト
グラフィー（１’１ＰＬＣ）を用いて行なった。コノＨ
ＰＴ、＋Ｃは、ＡＬＴＥＸ　ｎｏｄ１３ｒＩＩＯＡ液体
クロマトグラフを使肛して行なった。溶媒Ａ（０，００
５Ｍ、ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ４０）と、溶媒Ｂ　（Ｑ、Ｑ
５Ｍ、　ＫＨ２ＰＯ４−１，ＱＭ　ＫＣ／　；ｐＨＨＯ
２による直線濃度勾配法を用い、ノで一マフエ４、ｌ”
ＡＡＸ（ジｘホン）　カニ７　Ａ　（０，２１Ｘ５０（
！ＩＩ＋）で化合物を分離、精製した。溶媒Ａから開始
し、１分毎に８チの溶媒Ｂを加えることにより、勾配を
つけた。溶出は５８℃で、１分当たり２ｍｅの流速で行
なった。目的とするピークのものを集め、透析により脱
塩し、凍結乾燥した。この様にして得た８個の完全脱保
護したオリゴデオキシリボヌクレオチドの均一性は（ｈ
ｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）は、前記ＨＰＬＣを用いた２種
の、即ちイオン交換〔パーマフェイズＡＡＸ　（シュボ
ン〕ゴ、及び逆相〔μ−Ｂｏｎｄａｐａｋ　　Ｃ＋ａ（
クオーターズ）〕カラムクロマトグラフィーで各々単一
ピークが得られることより確認した０表２参照）。

表　　　　２ 合成オリゴヌクレオチドの保持時間 保持時間０分） ＦＩ　　　ＡＡＴＴＣＡＴＧＴ　　　　　６．２　　　
１１．８Ｆ２　　　ＡＴＧＧＣＧＧＴＴＴＣＣ８，０１
１，２Ｆ３　　　ＴＴＣ（）ＴＡＡＧＴＡＴＣｇ、９　
　　１１゜２Ｆ４　　　ＣＧＡＡＧＴＡＡＴＡＧ　　　
　８．６　　　１１．１７５　　　（）ＡＴＣＣＴＡＴ
Ｔ　　　　　６，８　　　１１．４Ｆ１３　　　ＡＣＴ
ＴＣＧＧＡＴＡＣＴ　　　９．０　　　１１．６Ｆ７　
　　ＴＡＣＧＡＡＧＧＡＡＡＣ８，９１０，４充填物　
Ｐｅｒｍａｐｈａｓｅ　　ＡＡＸ　ＭＢＯｎｄａｐａｋ
ＣＩＢカラＡ　　Ｏ，２１Ｘ５０ＣＩＩｌ　　　　　　
Ｏ，４Ｘ２５ｃ＋＋＋流速　　２Ｃ分　　　　　　　　
２崎の温度　　５８℃　　　　　　　　室温 さらに８個のオリゴデオキシリボヌクレオチドの塩基配
列は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い、〔γ−Ｐ
ｌ−ＡＴＰで５′−末端を標識した後、ヌクレアーゼを
用いて部分氷解したものをセルローズアセテート番用い
るｐａａ：′５の電気泳動と、ＤＥＡＦ−セルローズに
よるホモクロマドグａ／（１９７４）ＮｕＣ！、ＡＣ１
ｄ８　　ＲｅＢ、１　８３１３９、　　ａ−Ｎ、！！、
ＤＮＡの　Δ１１ａｔ１０ｎ前記のようにして塩基配列
を確認したＦｌ、Ｆ８からなる８個のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドをＴ４Ｉ）ＮＡリガーゼを用いて以下に
述べる方法で結合させた。

Ｆ２＃Ｆ’！３＃Ｆ４ｔＦ６．Ｆ７．Ｆ８　の各７２グ
メントについてその５／−０）（末端を各々Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼで別々にリン酸化した。

［７−ＰＩＡＴＰ（７４００Ｃ１／ｍｆｎｏ／）２００
ｐ”をエンペンドルフチスーブ中で蒸発乾固し、フラグ
メント１０μ２を、Ｔ４ポリヌクレオヂドキナーゼ　ｌ
Ｏ単位と　全量６０μｌの５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ８，０）、　１０ｍＭ　　Ｍｙ　Ｃ／２，１０ｍＭ
ジチオスレトー／ｌ／（ＤＴＴ）中で２０分間８７℃で
反応した。次にすべての５７−ＯＫ末端をリン酸化する
ために前記反応液にｌ　Ｑ　ｎ　ｎｏ／のＡＴＰおよび
ｌＯ単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを添加し、３
７℃で１時間さらに反応させ、次いで９０℃で５分間加
熱することにより反応を停止させた。リン酸化の遂行は
一次元ホモクロマトグラフイー後、ラジオオートグラフ
ィーで確認した。

ＦｌとＦ５のフラグメントは次のライダージョン反応の
過程で目的の遺伝子からの５′末端粘着部位（ＥｃｏＲ
工およびＢａｎ　Ｈ工）で２個以上結合しないように５
／−ｏｇ末端のリン酸化は行わなかった。かくして得た
リン酸化されたフラグメン）Ｆ２゜Ｆ８１　Ｆ４　、Ｆ
６　、　Ｆ７１　ＱとＦｌ、Ｆ５を各々２．５μ２づつ
透析チューブに入れ％　ｌ／水に対して４℃で一夜透析
することにより未反応ＡＴＰを除いた。

次々透析内液を最終濃度２０ｍＭ）ＩＪス塩酸緩衝液（
１）Ｈ７，６）、１０ｍＭ　ＭＰＣ１２となるように調
製し、９５℃で２分間加熱し、次いて８０℃で２分、３
７℃で１０分、２５℃で２分間放置後、下記のライゲー
ション反応を行った。反応液を全量８０ｆｉｔの２０ｍ
Ｍ）リス塩酸緩衝液（１））（７，６）　、７０ｍＭ　
ＭｇＣｌ２　　、ｌＱｍＭ　ＤＴＴ、Ｑ、４ｍＭ　ＡＴ
Ｐ　　に調製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２５単位を用いて
１１℃で行った。反応開始後、１時間、３時間、７時間
、２０時間ごとに反応液の一部をとり、７Ｍ尿素を含む
１５％ポリアクリルアミドゲルを用い、９０ｍＭトリス
ーホク酸緩衝液（１）Ｈ８）４ｍＭ　　ＥＤＴＡ、を用
いて電気泳動し１次いてオートラジオグラフィーで反応
の進行を検討した。サイズマーカーとしては、ＦＸ１７
４１Ｆ　ＤＮＡをＨｔｎｆＩで分解し、バクテリアのア
ルカリフォスファターゼにより脱リン酸したものを〔γ
−ＰＩＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーセ゛を用い
てラベルしたＤＮＡフラグメントを用いライゲーション
反応開始から２４時間後、反応液を６５℃で５分間加熱
して反応を停止させた。反応液を前記１５％ポリアクリ
ル＾ゲル電気泳動にかけ、目的とするα−Ｎ、１！：、
ＤＮＡ遺伝子（４４量体ヌクレオチド）と未反応フラグ
メントとを分離した。４４量体ヌクレオチドに相当する
部分をゲルより切り出し、下端を透析用チューブで受け
たポリプロピレンエコノカラム（バイオラドラボラトリ
−）に入れ、１／１０濃度の前記電気泳動用緩衝液中で
電気泳動させてこのＤＮＡを溶出させた、溶出後、透析
チューブを力２ムから取り出し％２それを水に対して透
析し脱塩した。目的とするＤＮＡはエラフール３倍容量
を加えて沈殿させ、遠心分離孝、２０μｌの蒸留水に溶
解した。収量は１．４μ２であった。

３、組換えプラスミドの構成 第３図はα−Ｎ、　Ｅ、遺伝子を含む組換えプラスミド
を構成する方法を示したものであり、これについて以下
に詳述する。

Ａ、プラスミドｐＫＯ３の構成 λｐ／ａｃ５　ＤＮＡ　ラクト、−スオペロンのプロモ
ー：・ ター、β−がラクトシダーゼ領域を持ったプラスミドを
以下のようにして造成した。プラスミドｐＢＲ８２２Ｉ
）ＮＡ　０．５μＰとλｐｌａｃ　５　ＤＪ！ＪＡ　Ｌ
ＯＩＩＩ’を各々８０１１１０１００ｍＭ　　）リス塩
酸！１７液（ｐＨ７゜３）、５ｍＭ　Ｍ９Ｃ！２および
５ＱｍＭ　ＮａＣ／溶液中で制限エンドヌクレアーセ゛
ｌｉ：ｃｏ　Ｒ工　４単位を用い、８７℃で６０分間消
化した。反応液を６５℃で３０分間加熱して酵素を不活
性化し、各反応液に２．５倍容量のエタノールを加えて
ｐｌＮ　Ａを沈殿させた。各々の沈殿を’］”４ＤＮＡ
リガーセ゛緩衝液［２，０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（１）
Ｈ７，６）、１０ｍＭＭｙｃ１２］２０μｌに溶解した
後、各々の溶解液ヲ混ぜ合せＡＴＰとＤＴＴをそれぞれ
最終濃度０．４ｍＭ、１０ｍＭになるように加え、Ｔ４
ＤＮＡ１ノガーゼ２単位を用いて、１４℃で２０時間反
応した。次いで２．５倍容量のエタノールをガロえてＤ
ＮＡを沈澱させ、得られたＤＮＡ沈澱を１００ｍＭトＩ
Ｊ　スｔｆｌｆｌ［衝液（Ｉ）Ｈ７，８）　Ｉ　５０　
ｍ　Ｍ　ＩＪａＣｌ　。

５ｍＭ　Ｍ？Ｃ１２よりなる溶液１０２μ／ｌこ　溶解
したのち、その溶液１００μｌを菌株　Ｅ、Ｃｏ／１Ｗ
８１１０への形質転換（註月ご用（、Ｎだ。形質転換株
はテトラサイクリンｌＯμ９７ｍｅを含有するＥＭＢ−
ラクトース培地（ポリペプトン８２．酵母エキス１．Ｏ
ｙ　、ＩＪａＣｌ　５ｙ＋　Ｋ２Ｈ”０４２．５ｙ＋エ
オシン３６０ｙ、メチノンプル−６０ツ、ラクトース１
０９．水１０００ｄ）”上で培養し、濃い金属色のコロ
ニーを６個選びｐＫＯｌ−ｐＫｏ（ｌと命名した。これ
らのコロニーからプラスミドＤＮＡを分離し、プロモー
ターβ−ガラクトシダーゼの方向性を調べた。すなわち
、約０，５μ２のプラスミドＤＮＡをｌ　ＯｍＭ　トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ’７．０）。

５　ＱｍＭ　　Ｎａ（：／、ｌ　ＱｍＭ　　ＭｇＣｌ２
　　を含有する水溶液、２０μｊに溶解し、制限酵素Ｈ
ｉ　ｎ　ｄ■を５単位加えＤＮＡを消化した。得られた
ＤＮＡフラグメントを０．７％アガロースゲル電気泳動
法で解析することによりｐＢＲ８２２プラスミドのＥｃ
ｏＲＩ部位に挿入されたλｐ／ａｃ　５のプロモーター
β−ガラクトシダーゼの方向性を調べた。その結果、望
まれる方向性すなわち、βガラクトシダーゼのトランス
クリプションがテトラサイクリン耐性遺伝子方向へ進む
ものはｐＫｏ　ｌ　、　ｐＫｏ　８　＋ｐＫＯ５である
ことが判った。このうちｐＫｏ３を以後の実験に用いた
。

（註）形質転換の方法 ニジエリシア・コリの菌株をＬ−グロス（ポリペプトン
ｌＯｙ、酵母エキス５ｙ＊Ｎｅ、Ｃ１５ｙ＋グルコース
５ｙ、水１，０００ｍｅ、ｐＨ７，２）３０ｖｔｅニ接
種し、８７℃テＯＤ　（３（３Ｑ−０，７まで培養し、
６．０００ｒｐｍｔｌＯ分間０℃で遠心集菌した。菌体
を０．１ＭＭｙＣ／２８０ｍｅに懸濁し、６゜０００ｒ
ｐｍ、１０分間０℃でさらに遠心し、集めた菌体を０．
ＩＭＣａＣ／２１５ｍｅに懸濁し、水中に１時間放置し
た。その後、６，０００ｒｐｍ。

１０分間θ℃で遠心を行い、集めた菌体を０．　Ｉ　Ｍ
ＣａＣ１２Ｌ５ｍｅに懸濁した。このＣａＣｌ２処理菌
液０．２　ｍｅに適当量のＤＮＡを加えたＦｉｃｏＲ工
反応緩衝液（１００ｍＭトリス−塩酸、５ＱｍＭＮａＣ
／、５ｍＭ　Ｍ７Ｃ／２．ｐＨ７，３）１００ｔｔｌを
加え、０℃で６０分間放置した。このＣａＣ／２処理菌
体とＤＮＡを含有する混合物０．８　ｍｅを前記のＬ−
グロス２．５　ｍｅに加え、３７℃、９０分間振とう培
養を行った。得られた培養物を希釈し′て選択培地上に
プレコーティングし、３７℃、１日間培養を行い形質転
換コロニーを得た。

選択培地は、特に記載しない限り、ＢＢＬ栄養寒天培地
１．５　％にアンピシリンおよびテトラサイクリンを最
終濃度がそれぞれ４ｏμｙ／−およびｌＯμ？　／　ｍ
ｅとなるように加えたものを用い、アンピシリン耐性株
、テトラサイクリン耐性株を選択した。

ニー乙とＬ口］」ユニ１Ω且区 ｐＫｏ３プラスミドの２ケ所あるＲｃｏ　　Ｒ工部位の
一方、すなわちβ−ガラクトシダーゼプロモーターに近
いＥｃｏ　Ｒ工部位を除去するために以下の実験を行っ
た。ｐＫＯ３プラスミドＤＮＡＩ　Ｏμノを制限酵素Ｅ
ｃｏ　　Ｒ工　１．６単位を用いて部分消化した後、反
応液を０．７％アガロースゲル電気泳動を用いて部分消
化したＤＮＡフラグメントを分離した。ＤＮＡフラグメ
ントはエチジウム・ブロマイド（０，５μ？／ｄ）で染
、、苧することにより確認した。グルから目的とするＤ
・ＮＡフラグメントを電気泳動法で溶出し、フェノール
を用いてエチジクムプロマイドを抽出除去した。水相よ
りエタノール沈澱法を用いて目的とするＤＮＡフラグメ
ントを沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱にＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼ緩衝液［１００ｍ　Ｍ　）　ＩＪス塩酸緩衝
液（ｐＨ８，８）、ｌＯｍＭＭｙｃ／２，２５ｍＭ（Ｎ
Ｈ４）２　８０４　、ｌＱｍＭ　ＢＤＴＡ　　２５．０
ｆｉ９／ｍｅ牛血清アルグミ＞）４．Ｏｐｌを加えて溶
解させたのち、ａＡＴＰ　、　ｄ丁ＴＰ　、　ｄｃＴＰ
　、　ｄＧＴＰ　、各々４ｍＭ溶液より各々５μｌずつ
と１００ｍＭβ−メルカプトエタノール５μｊを加えた
後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１単位を用いて、３７℃８０
分間反応させた。次いて反応液を６５℃で１０分間加熱
し、２．５倍容量のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱さ
せた。得られたＤＮＡ沈澱をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液
（２ＱｍＭ　　）、リス塩酸（１）Ｈ７，６）　、　１
０　ｍ　Ｍ　　Ｍ　？　Ｃ／２）４０μｌに溶解し、Ａ
ＴＰ、ＤＴＴを各々最終濃度０．４ｍＭＩｌＯｍＭｅに
なるよう添加し、Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ２単位を加え１
４℃で２０時間反応した。エタノールでＤＮＡを沈澱さ
せた後Ｅ。

Ｃｏ／ｉ菌株Ｗ３１１０への形質転換に用いた。テトラ
サイクリン１０μｆ／ｍｅ　　を加えた栄養寒天培地で
培養してテトラサイクリン耐性コロニーヲ選択した。出
現したコロニーからプラスミドＤＮＡを分離し、制限酵
素Ｂ’ＱＯＲ工とＨｌｎｄｉｌｌで消化した後、得られ
たＤＮＡフラグメントの大きさをアガロース電気泳動法
で調べることにより、プラスミドｐＫＯ３中２ケ所あっ
たＥｃｏＲ工部位のどちらの部位が消失しているかを明
らかにすることができた。その結果プラスミド１）ＫＯ
１８が期待するＥｃ　ｏ　ｔ’ｔ、　Ｉ部位すなわち／
ａｃ−プロモーターに近接するＦｉｃｏＲ工部位が−ケ
所消失していることが確認された。このプラスミドを次
のアルファ・ネオ・エンドルフィン遺伝子ククローニン
グに用いた。

プラスミド１）ＫＯ１３はＥＣＯＲ工、ＢａｍＨ工制限
酵素切断部位をそれぞれ一ケ所有しており、化学的に又
はプラスミドより得たＥｃＯＲ工、ＢａｍＨ工の粘着部
位（ｃｏｈθ５ｉｖｅ　　ｅｎｄ）をもつ遺伝子を２イ
ゲ一シヨン反応を用いてプラスミツド１）ＫＯ１８に容
易に導入するこ、とができる。さらにこのプラスミドを
菌株Ｊｃｏ／１Ｋ１２に形質転換すると目的とするクロ
ーンをアンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性菌と
して容易に選択することができる。

“　　Ｃプラスミド　ＰαＮＦＸ２の構成前記方法によ
り得たα−Ｎ、Ｅ！、Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｑ、　７μ２を２Ｑ
ｍＭ　）リス塩酸緩衝液１）Ｈ７，６，ｌＱｍＭ　Ｍ９
ＣＩ２゜溶液２８μ！中で９５℃、２分間加熱し、氷水
中で冷却後、ＡＴＰｌ、ｊ３ｎｍｏ／、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ５単位、ＤＴＴ　Ｉ　ＱｍＭを加え、３
７℃で２０分間反応させてＤＮＡの５′−０）ｉ末端を
リン酸化した。すべての５７−ＯＨ末端をリン酸化する
ために、反応液を９５℃で２分間再度加熱し、水中で冷
却後、反応液量の１／１０容量の１０ＱｍＭ　ＤＴＴお
よび５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加え、８
ヶ℃で２０分間さらに反応させ、次いて９５℃で２分間
加熱した後ゆっくりと室温にもどした。次にプラスミド
ｐＫＯ１３ＤＮＡ５μ２を制限酵素ＦｉｃｏＲ工とＢａ
ｍＨ工各々１０単位用いて完全に消化したものを０．７
チアガロースゲル電気泳動で分離し、大きいＤＮＡ断片
を電気泳動法により回収した。このようにして得たｐＫ
Ｏ１８のＫｇＯＲ工、ＢａｍＨ工の断片ＤＮｋｉｐ９と
先に得た５’−ＯＨ末端をリン酸化したα−Ｎ、　Ｌ遺
伝子ＤｔＪＡ２５ｎｙを２０ｍＭトリス塩酸紗衝液緩衝
液、６　＋　１０ｍＭ　ＭｒＣ／２ｔｌｏｍＭ　ＤＴＴ
、０．４ｍＭＡＴＰからなる溶液３０μｌに溶かし、Ｔ
４　ＤＮＡリガーゼｌ単位を、用いて５℃１６時間反応
させた。

反応液に２倍容量のエタノールを加えＤＮＡを沈澱とし
て得た。このＤＮＡ沈澱を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７，（１）、ＱｍＭ　Ｍ７Ｃ／２．６６ｍＭＮａ
Ｃ１よりなる溶液１００／Ｚ／に溶解し、Ｋ、ｃｏ／１
菌株ＷＡ８０２への形質転換をした。形質転換株はアン
ピシリン４０μｆｉ！／ｍｅおよびグルコース０．５チ
を含む栄養寒天培地に８７℃で一夜培養後生じたコロニ
ーを１５μｆ　／　ｍｅのテトラサイクリンを含む栄養
寒天培地にレプリカして、テトラサイクリン感受性コロ
ニーを選択した。１１８個のアンピシリン非感受性コロ
ニーのうち１００個のコロニーがテトラサイクリイ、、
感受性株であった。ここで得られた１００個のアンピシ
リン非感受性、テトラサイクリン感受性株よりそれぞれ
独立に単離した８個のコロニーを照合のため、これらを
ＷＡ８０２／ＰαＮＥｌ・・・・・・・・・ＷＡ８０２
／ＰαＮＥ１３と命名した。これらのコロニーから得ら
れたプラスミドＩ）ＮＡを制限酵素ＥｃＯＲＴ及びＢａ
ｍＨ工で消化しｊこところ、これらの組換え型プラスミ
ドの小さなＥｃＯＲＴ、ＢａｍＨエフラグメントのサイ
ズは８例全てにおいて、試験管内で製造したα−Ｎ、Ｅ
、　Ｄ　ＮＡのサイズと同様であった。このうち菌株Ｗ
Ａ８０２／ｐαＮＫ２のプラスミドより、得られた小さ
なＥｃＯＲＴ・ＢａｍＨエフラグメントのＩ）ＮＡＷ基
配列配列、＼すＡ（Ｍａｘａｍ）およびギ／Ｉ／バー　
）　（Ｇｉｌｂｅｒｔ）［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、（１９７７）７４５６０〕の方法で
分析した結果、ｐαＮＥ２プラスミドは所望のα−Ｎ、
ＴＬＤＮＡ塩基配列を持っていることを確認した（第７
図参照）。このＷＡ８０２／１）αＮＫ２菌株は、Ｅｉ
、Ｃｏ／１Ｋ１２　ＳＢＭ１０２と命名し、工業技術院
微生物工業研究所に寄託した（寄託番号ＦＢＲＭＰ−ａ
ｏｓｉ）。

前記方法で得た大腸菌株に１２ＳＢＭ１０２中でα−Ｎ
、　Ｒ遺伝子はβ−ガラクトシグーゼ構造遺伝子内に挿
入されている。このためα−Ｎ、瓦は最初にβ−ガラク
トシダーゼとα−Ｎ、　Ｅ、とのノ１イブリッドプロテ
ィンとして発現されるはずである。しかしながら最初の
α−，Ｎ、Ｅ−遺伝子のデザインで述べたごとく、α−
Ｎ、Ｅ、のアミノ末端部位にメチオニンを挿入すること
により、この発現されたβ−ガラクトシダーゼとα−Ｎ
ルの７１イブリツドプロテインを臭化シアンで開裂する
ことによりα−Ｎ、Ｆ−を得ることが出来ると期待され
る。そこで以下に詳述する方法により大腸菌株に１２Ｂ
ＢＭ１０２内でのα−Ｎ、　Ｆｉ、の発現及びその同定
をおこなった。

Ａ、ＨＰＬＣ＠用いてのα−Ｎ、Ｂ・の同定菌株　Ｅ、
ｃｏ／ｉＫ１２ｓＢＭＩＱ９とその対照としてａ−ＮＪ
、遺伝子を持たないＥ、ｃｏ／ｉ　ＷＡ８０２／ｐＫｏ
１３とを各々、グルコースを除きアンピシリン４０μ９
７ｍｅを添加したＬ−プロス（Ｌｕｒｉａ−ｂｒｏｔｈ
）　ｚｍｅ中、３７℃で４×１０　細胞／　ｍｅまで増
殖させた。次にイソプロピルβ−Ｄ−チオカリクトビラ
ノシド（工ＰＴＧ　）を１ｍＭになるように加え、さら
に増殖を２時間続けた。その培養液１　ｍｅをエンベン
ドルフ遠心分離機中で遠心分離し、得れたペレットを臭
化シアン５”ｔ／ｍｅを含有する７０チギ酸５００μｊ
に懸濁し、室温で２４時間暗所に放置した。反応液を凍
結乾燥後、残渣を１Ｍ酢酸２００μｊに溶解した。この
うち１５０ｆｉｔをＳＥＰ−ｐａｋＣｌｇ（クオーター
ズ）カラムにかけ、１Ｍ酢酸２ｍｅと水２−でカラムを
洗った後、カラムに吸着した物質をｌＱｍＭＨｃＯＯＮ
Ｈ４とアセトナイトリル（５０：　５０　ｖＡ）の混液
２、５　ｍｅで溶出した。この溶出液を濃縮乾固後、残
舟を１Ｍ酢酸２００μｌに溶かした。このうち１００　
ｔｔｌをｐ−Ｂｏｎｄａｐａｋ’Ｃ−１ｆ３　（クオー
ターズ）カラム（０，４Ｘ２５ｃｍ）を用いたＨＰＬＣ
にかけ分析した。溶出は５　Ｑ　ｍ　Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４
（ＴＩＨ２，０）中でＣＨＢＣＮを１０チから９０チま
での直線濃度勾配をかけることにより行った。溶出パタ
ーンは２１０ｎｍのＵＶ吸収でモニターＣた′。

第ｑ図ａ、ｂより明らかなように、菌株Ｅ、Ｃｏ７１に
１２８ＢＭ１０２より得られたＨＰＩＩＣ溶出パターン
には図中矢印に示された位置に菌株Ｅ、Ｃｏ／１ＷＡ８
０２／ｐＫＯ１８では見られない新たなピークが存在し
ていることが判った。なおこのピークの溶出位置は化学
合成より得たα−Ｎ、Ｆ−の同一条件下での溶出位置と
完全に一致した。さらに以下に述る放射免疫分析の結果
からもこのピークがα−Ｎ。

Ｅ、であることが容易に理解できる。

Ｂ、放射免疫分析法を用いるα−Ｎ、Ｆ−の同定α−Ｎ
、凡の標準的放射免疫分析法（ＲＩＡ）についてはＮ、
Ｍｉｎａｍｉｎｏ、ｅｔ　　ａ／［Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、ｉｎ　　ｐｒ
ｅｓｓ］の方法を用いた。

第ｑ図ａ、ｂのＨＰＬＣフラクションを１ｒＩｄ！づつ
分取し、このうちの一部２０μｌを採り、バシトラシン
４μノを加え減圧乾燥した。残冬コｐＨｓ、　。

の１　Ｍ　）　ＩＪス塩酸２０μｌとＲ工Ａ標準緩衝液
（ｐＨ７，４リン酸絖衝液５０ｍＭ、０．２５％牛血清
アルゾミン、ＮａＣ／　　８．ＱｍＭ、ＥＤＴＡｇ５ｍ
１４３８０μｌを加えて攪拌した。次いでその一部１０
μｌにＲ工Ａ標準緩衝液９０μｌを加えて１００μｌと
し、α−Ｌ　Ｆｌｉ、抗体を用いてＲＩＡを行った。

第φ図Ｃより明らかなように菌株Ｉ　Ｃｏ／ｉＫ１２Ｓ
ＢＭ１０２より得られたＨＰＬＣ溶出）ぐターン番こお
いて、図中矢印に示された位置に対応してα−Ｎ、Ｅ、
の放射免疫活性が現われた。なお対照として用いた菌株
Ｆｉ、Ｃｏ１Ｉ　ＷＡ８０２／ｐＫＯ１３番こつ０ては
まったくα−Ｎ、Ｅ、に対する放射免疫活性は見られな
かった。

アンピシリン４０μｙ／ｒｕｔ！を添加したＬ−グロス
５１中で菌株に、ｃｏ／ｉ　　Ｋ１２８ＢＭ１０２を０
Ｄ６６〇−〇、７まで培養し、工ＰＴＧを東経濃度１ｍ
Ｍ加え、さらに２時間培養した。この培養液より集菌を
行い、湿菌体として１０．９ｙを得た。これを１゜５２
の臭化シアンを含む７０％ギ酸溶液８０ｍｅｌこ懸濁し
、室温で２４時間反応させた。この反応液に蒸留水を加
えて５６００ｍｅとし、ＢＰ−セファディックＣ−２５
のカラムにかけた。カラムを０゜１Ｍ酢酸１１．水５０
０ｍｅ、２Ｍピリジン水２ｊで洗ツタ後、吸着物質をｌ
　Ｍ　　ＮＨ４ＯＨ８００ｍｅテ溶出した。この１ＭＮ
Ｈ４ＯＨ分画を凍結乾燥後、残渣を１Ｍ酢酸１５ＷＬｅ
に溶かし、セファテックスＧ−２５をつめた３Ｘ１５１
ｃｍのカラムにかけた。

溶出液は１Ｍ酢酸を用い、１５ｍｅづつ分取した。

各分画を２８０ｎｍのＵＶでモニターし、ざらに各分画
の一部２０μｌを適当に希釈して各分画ごとに含まれて
いるα−Ｎ、Ｆ−の量をＲ７ＩＡ法を用いて分析した（
第７図参照）。第７図において、分画番号４７〜５１ま
で計７５ｍｅを集め、凍結乾燥した。残４１０ｍＭ　　
ＨＣＯＯＮＨ４８ｍｅに溶解し、カルボキシメチルセル
ロース カラム　０．９Ｘ４８Ｃ＋ｌ＋にかけた。カラムからの
溶出はｌ　Ｑ　ｍ　Ｍ　　ＨＣＯＯＮＨ４　　ＱＱＱｍ
ｅと５００ｍＭＨＣＯＯＮＨ４　　２００ｍｅを用いた
直線濃度勾配で行なった。溶出液はｂｍｅずつ分画し、
２８０ｎｍのＵＶでモニターした。ざらに各分画より一
部１０μｊを取り、適当に希釈後、各分画に含まれるα
−Ｎ。

Ｅ．の量をＲＩＡ法を用いて測定した。その結果を第７
図＆　ニ示す。Ｑ，３５Ｍ　　ＨＣＯＯＮＨ４で溶出さ
れる分画にイムツリアクティビティがあり、単一のピー
クとしてα−Ｎ。Ｗ、が溶出されていると考えられた。

そこで、この活性のある分画、フラクション６６〜６９
を集めて、凍結乾燥することにより化学的に純粋な４ツ
のα−Ｎ、　Ｌを得ることができた。表３に、菌株、Ｋ
、ｃｏｊｉ　　Ｋ１２ＳＢＭ１０２の５１培養から得ら
れたα−Ｎ。Ｅ、の各精製段階での収率を示す。これら
の結果より計算すると、菌株Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｂ
ＢＭ１０２は少なくとも一個の細胞あたり５Ｘ１０　分
子のα−Ｎ。Ｅ、を生産していることが判った０表３参
照）。

表　　　８ Ｅ、Ｃｏ／ｉ　ｗＡｓｏ２／ｐαＮＥｉ２からのα−Ｎ
、　Ｆｉ、の精製 １、ＣＮＢｒ処ａ　　　　　　　１２７１　　　６．６
　　　１００（註）　Ｅ、ｃｏｊｉの菌株ｗＡ８０２／
ｐαＮ］１Ｔｈ９　　の培養液５１から湿菌体１０．１
１１を得、その菌体から抽出した総たんばく質１２７１
１ｔを臭化シアンで処理してα−Ｎ、　Ｅ、の精製に用
いた。

米　アミノ酸分析データから計算 ＋　ラジオイムヅアンセイから計算 第７図ａで分離精製した、α−Ｎ、Ｆ−分画、フラクシ
ョン６６〜６９を混合して、その一部２０μｌに１Ｍ酢
酸１８０μｌを加え混合し、その一部４゜ｔｔｌをｐ　
−Ｂｏｎｄａｐａｋ　ＣＨＢ（クオーターズ〕０．４Ｘ
２５ｃｍカラムを用いたＨＰＬＣで分析し、ヘフチドは
２１０ｎｍのＵＶ波長でモニターした。

第８図すで明らかなように、分析したα−Ｎ、　Ｋ、は
単一のピークを示した。しかもこの溶出位置は化学。ッ
より得え。−Ｎ、Ｆ、（７）溶出位置よ完全８．一致し
た。さらにＨＰＬＣより得られた各分画をα−Ｎ−Ｌ抗
体を用いたＲ工Ａで測定した結果、２１０ｎｍのＵＶ波
長でモニターして得られるピークと完全に一致した位置
にα−Ｎ、　Ｅ、のイムツリアクティビティが現われた Ｂ、アミノ酸組成及びアミノ酸配列の決定前記方法で構
成したα−Ｎ、１１！、４μ２を０．１　’％フェノー
ル、０．０２％２−メルカプトエタノールを含む６Ｎ　
塩酸１００μｌに溶かし１１０℃で２０時間加水分解し
たのち、各アミノ酸を、アミノ酸分析器（日立≠８３５
）を用いて分析した結果、Ｐｒｏ　　ｌ、Ｑ、Ｇｌｙ　
　２．■、Ｌｅｖ　　１．Ｑ、Ｔｙｒ　　２．Ｑ、Ｐｈ
ｅｌ、０．Ｌ７８　２．ｌ、Ａｒｙ　１．０　の結果を
得、天然品とよく一致した。次いてアミノ酸配列をダン
シル−エドマン法（４ａｎｅｙ／−１ａｍａｎ）［Ｇｌ
ａｙ、Ｗ、Ｒ。

（１９７２）Ｍｅｔｈｏｄ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｙｙ、２５゜３８３〕を用いて解析したところ、）（
−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−０１７−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ｋｒｆ−
Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−〇Ｈなる配列が得
られ、完全に天然より得られたα−Ｎ、乙と一致した。

前記方法で精製したα−Ｎ。Ｅ、のモルヒネ活性を、モ
ルモット回腸従走筋電気刺激収縮の抑制効果を用いる、
Ｗ、Ｄ、Ｈ，ｚ＜７トンらの方法［Ｐａｔｏｎ。

Ｗ、Ｄ、Ｈｅｔ　ａ／　　（１９Ｑ１３）Ｊ、Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ。

１９４、Ｇ３〕に従い測定した。収縮の５０％抑制時濃
度（工Ｃ３０）を求めたところ、’　　Ｗ、Ｃｏ１１　
　Ｋ１２ＳＢＭ１０２より精製したα−Ｎ、Ｆｌ！、は
工Ｃ５０カ５．２ｎＭであったっこの直は標準α−Ｎ、
Ｅ、の値工Ｃｏ。

＝　５．　（ｌ　ｎ　Ｍとよく一致した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明において用いられるα−Ｎ、　Ｌ遺伝子
を含む二重鎖ポリデオキシリボヌクレオチドの一態様と
その合成に用いられるオリゴデオキシヌクレオチドＣＦ
′１〜Ｆ′８）を、第２図は完全に保護された２官能性
トリマーデオキシリポヌタレオチドの合成反応式を、第
８図はα−Ｎ、　Ｅ、遺伝子を含む組み換えプラスミド
の構成法を、第４図ａおよびｂはそれぞれＢ、Ｃｏ／ｉ
　　Ｋ１２ＷＡ８０２／１）Ｋ０１３　　およびＢ、Ｃ
Ｏ／ｉ　　Ｋ１２ＢＢＭ１０２菌体を臭化シアンで分解
し、吸着法で精製したもの−ＨＰＬＣによる溶出パター
ンを、同図Ｃはｂの矢印のフラクションについての標準
的放射免疫分析法（Ｒ工Ａ）によるパターンを、第５図
はｗ、ｃｏｚＩ　Ｋ１２８ＢＭ１０２の菌体を臭化シア
ンで分解後ｓｐ−セファディックＣ−２５のカラムに吸
着させ、１ＭＮＨ４０Ｈで溶出する分画をさらにセファ
デックスＧ−２５のカラムにかけｌ　ＭＨＡｃで溶出す
るング写真を、第７図はｍ、ｃｏ／ｉ　　Ｋ１２ＳＢＭ
ＩＱ　２から分離したプラスミドを制限酵素で分解して
得られた小さなフラグメントの塩基配列をマキサム・ギ
ルバート法で解析した写真を示す。 出　願人　サントリー株式会社 ； （ａｑｎ１／６ｕ）　ｕＨｌ、ＩｄＪｏｐｕａ−ｏｉｕ
−ｃヤ→ １　・　　　　゛ 山 ＣＤ、　、、、　、　、　、、、　’ｌ’、ｊ：）傘 １“　　。 一 一 第１頁の続き ０発　明　者　大島武博 高槻市別所中の町３番４号 ０発　明　者　田中正治 吹田市南金田町１丁目８番４６号 ０発　明　者　大末和広 茨木市稲葉町１幡７号 ０発　明　者　松尾壽之　、′ 宮崎県宮崎郡清武町大字木７６６ １： ３ １、　事件の表示　　昭和５６年特許願第４６３３０３
号２、発明の名称 アルファ・ネオ・エンドルフィンの製造法３、補正をす
る者 事件との関係　　特許出願人 住　所　大阪府大阪市北区堂島浜２丁目１番４０号４、
代理人 住　所　〒５４１大阪市東区北浜４丁目４６番地８、補
正の内容 （１）明細書第３７頁下から７行目の「（第７図参照）
」を削除し、同第４２頁第９行「た（第７図参照）。第
７図傾おいて」を削除し、同頁下から２行目「その結果
−を」を１その結果、」に訂正し、同頁末行「第７図ａ
に示す。 」を削除し、同第４４頁第１０行「第７図ａで」を「前
記のように」に訂正し、同頁下から５行目「第８図すで
明かなように、」を削除し、第４７頁１０行〜１３行「
写真を、第７図は・・・・・・解析した写真」を削除す
る。 （２）図面の第６図−１〜８の浄書（内容に変更々し）
　別紙のとおり Ａ ！Ｔ の （’Ｊ ■ Ｏ − 寓− ９１６図−６ ■ ｇｓｍ−ａ　　Ｆ８ Ｇ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のヌクレオチド配列 Ｖ喝ｌ且免と２３且Ｌ８１■４当５三匹６人巨７シ咀８
   −二εと９３人ｙｘｏ　　（配列中、Ａはデオキシアデ
   ニル酸、Ｇはデオキシグアニル酸、Ｃはデオキシシチジ
   ル酸、Ｔはチミジル酸の、残基を表わし、ＪはＡ−ｉた
   はＧ、にはＴまたはＣ１ＬはＡ、Ｃ，ＴまたはＧを表わ
   し、ヨ１は二二で、ヨ上はＡＧＪ　でそれぞれ置換しう
   るものとする）を有するポリデオキシリボヌクレオチド
   を組み込んだプラスミドにより形質転換したエシエ゛リ
   シア属の菌株を水性栄養媒体中で培養し、培養物中にた
   んばくの成分としてα−ネオエンドルフィンを生成させ
   ることを特徴とするがファ・ネオ・エンドルフィンの製
   造方法 ２、培養物からアルファ・ネオ・エンドルフィンを含む
   雑種たんばくを採取し、これを分解し１分解物からアル
   ファ・ネオ・エンドルフィンを分別する特許請求の範囲
   第１項記載の方法 ３、形質転換の営容菌がニジエリシア・コリに属する特
   許請求の範囲第１項記載の方法 生　形質転換の受容菌がニジエリシア・コリＫ１．２で
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法５、形質転換した
   菌がニジエリシア・コリに１２ＳＢＭ１０２である特許
   請求の範囲第１項記載の方法 ６、　ポリデオキシオリゴヌクレオチドが次のヌクレオ
   チド配列 工ｌシ匹２但二８」工４二二５ヨユ６ −悼別７シユ８Ｐ刈９２Δ１１Ｏ を有する特許請求の範囲第１項記載の方法７、　ポリデ
   オキシヌクレオチドを組み込むためのプラスミドが、ｐ
   ＢＲ８２２とλｐｌａｃ５　（７）各ＤＮＡに制限酵素
   ＫｃｏＲ工を作用させたのちライゲーションして造成し
   たプラスミドの２ケ所あるＷｃＯＲ工切断細切断部位所
   を消失させたものである特許請求の範囲第１項記載の方
   法 ８、ニジエリＥ／７　ｅ　：ｌ　！Ｊ　Ｋ１２ＳＢＭ１
   ０２９１次のヌクレオチド配列 ＴＡＴＩ　　ＧｅＯ２ＧＧＴＢ　　ＴＴＣ４ＣＣＴ５　
   　ＣＧＴ６ＡＡＧ７　　ＴＡＴＢ　　ＣＣＧｇ　　ＡＡ
   Ｇ１６を有するポリデオキシリボヌクレオチド１０、次
   の各配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド ５′ （１１ＡＡＴＴＣＡＴＧＴ” ５′ （２）　　ｐＡＫＧＧＬＧＧＬＴＴＫｃｓ：５′ ＋３）　　ｐＴ　ＩＪ　ＣＧ　Ｌ　Ａ　Ａ　、ｒ　Ｔ　
   Ａ　Ｋ　Ｃ”５′ １４１　　　ｐＣＬＡＡ、ＴＴＡＡＴＡＧ”６′ （５１Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＣＴ　Ａ　Ｔ　Ｔ　”５′ ＋６１　　１）ＡＪ／ＴＴＩ／（）ＧＫ／ＴＡＪ／Ｔ”
   ５／　　　、　　　　　　　　　５１ （７）　　ｐＴｖｃＧｖＡＧＫ／ＡＡｖｃ　および５′ （８１ｐＣＩ／ＣＣＫ’ＴＡＣＡＴＧ”をリガーゼの存
   在下に反応させることを特徴とする次のヌクレオチド配
   列 Ａ　Ａ　Ｊ　Ｔ、　Ａ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｇ　”ＴＴ、Ｔ／
   ＡＴＴＡＴＣＣＴＡＧ” （上記配列中、ＪはＡまたはＧを、Ｊ′は上記の二重鎖
   配列において相対するＪと塩基対を形成するようにＴま
   たはＣを表わし、以下同様にして、Ｋは丁またはＣをに
   ′はＡまたはＧを表わし、ＬはＡ。 Ｃ，ＴまたＧをＵはＴ、Ｇ、ＡまたはＣを表わす）を有
   する二重鎖ポリデオキシリボヌクレオチドの製造法 １１、次のヌクレオチド配列 ”ＡＡＴＴＣＡＴＧＴ” を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド１２、吹のヌ
   クオチド配列 ”ＡＴａａｔｏａｒｒＴｃｃ” を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを有するオリ
   ゴデオキシリボヌクレオチド１４次のヌクレオチド配列 ５′ ＣＧＡＡＧＴＡＡＴＡＧ” を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド１５、次のヌ
   クレオチド配列 ”Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＣＴ　Ａ　Ｔ　Ｔ　”を有するオリゴ
   デオキシリボヌクレオチド１６、次のヌクレオチド配列 ”ＡＣＴＴＣＧＧＡＴＡＣＴ” を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド１７、次のヌ
   クレオチド配列 ５′ＴＡｏＧＡＡＧＧＡＡｃ３′ を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド１８、次のヌ
   クレオチド配列 ”ＣＧＣＣＡＴＡＣＡＴＣ” を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド