JPS5857155B2 - 発酵法によるコエンチ−ムｑ↓１↓０の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるコエンチームＱ１ｏ （以下Ｃ０
Ｑ１ｏ と略称する）の製造法に関するものである。

さらに詳しくはアグロバクテリウム属に属し、植物体に
対する樹皮肥大誘引活性がなくかつＣ０ＱＩＯを生成す
る能力を有する微生物を栄養培地に培養して、培養液お
よび菌体中にＣ０ＱＩＪ）を生成せしめこれを採取する
ことを特徴とする発酵法によるＣ０ＱＩＯの製造法に関
するものである。

その目的とするところは、医薬品として広い使途をもつ
Ｃ０Ｑ１ｏ の新規な製造法を提供することにある。

Ｃ０Ｑ１ｏ は下式で示される化合物であり、比較的多
種類の微生物の菌体中に含まれていることが知られてい
る。

従来、微生物を用いる発酵法によるＣ０ＱＩＯの製造法
としては、各種の酵母類を培養する方法（特公昭４８−
８８３６，４８−２５５１７゜５１−１９０３４．特開
昭５２−１０５２８８ら）あるいはロドシュードモナス
（特公昭４７−７９５４ 、特公昭４８−２１５１９）
、アルカリゲネス（特公昭５ｌ−１９０３４）、シュー
ドモナス（特公昭３６−１４２９３．特開昭５２−４４
２９０．５２−４７９９０ ）、プロテウス（特公昭３
６−１４２９３）らの各属の細菌類を用いる方法が知ら
れている。

しかしながら、これらの方法ではいずれもＣ０ＱＩＯ生
成量が低くまだ満足すべきものではない。

本発明者らは、さらにすぐれた発酵法によるＣ０Ｑ１ｏ
の製造法について種々検討した結果、アグロバクテリ
ウム属に属し、植物体に対する樹皮肥大誘引活性を有し
ないＣＯＱ□。

生成菌を用いることにより工業的に有利にＣ０ＱＩＯを
製造できることを見出した。

従来、アグロバクテリウム属の細菌がＣＯＱ□。

を含むことについては、植物がんの一種である、植物樹
皮の肥大を誘導する活性の強いアグロバクテリウム・ツ
メファシェンスＮ−Ｃ−Ｔ−Ｃ３９７あるいはアグロバ
クテリウム・ツメファシェンスＢ６らの菌株の菌体中に
乾燥重量１ｇ当り６００μｇ程度のＣＯＱ□。

が、Ｃ０Ｑ９およびＣ０Ｑｓと共に含まれることが知ら
れている（ Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｊ 、 １１１巻、４６
１頁、１９６９年： Ａｒｃｈ−Ｂｉｏｃｈｊｍ−Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、。

１１３巻、５４８頁、１９６６年）が、これをＣ０ＱＩ
Ｏの工業生産に利用する試みはなされていない。

その主な理由は、Ｃ０Ｑ１ｏ の生産量が低いこと、他
のＣＯＱ同族体（ＣＯＱ９およびＣ０Ｑｓ）が副生性さ
れてＣ０Ｑ１ｏ との分離が困難であることの他に、こ
の種の植物病理性菌を、大規模に菌体を取扱う工業生産
に使用することによって農作物へ悪影響が生ずる可能性
があるため、菌体の処理に手数がか＼るなどの理由があ
げられる。

本発明者らは、これらの難点を克服するために、植物体
の樹皮肥大誘引活性を有しない微生物の中から高収率に
Ｃ０Ｑ１ｏ を生成する菌株の選択をおこなった結果、
非植物病源菌であるアグロバクテリウム・ラジオバクタ
ーに属する細菌および植物体に対する樹皮肥大誘引活性
をもたない他のアグロバクテリウム属細菌の中に、著量
のＣ０ＱＩＯを生成し、Ｃ０ＱＩＯ以外のＣＯＱ同族体
を副生じない菌株を見出した。

アグロバクテリウム・ラジオバクターに属する微生物が
Ｃ０Ｑ１ｏ を生成することはこれ迄まったく知られて
おらずまた他のアグロバクテリウム属の非植物病源性菌
をＣ０ＱＩＯの発酵生産に使用した例はこれ迄まったく
知られておらず、本発明はか＼る新規な知見にもとづく
ものである。

本発明に使用する微生物としてはアグロバクテリウム属
に属し、植物体に対して樹皮肥大誘引活性をもたないＣ
０Ｑ１ｏ 生産菌ならば野生株、変異株のいずれもが使
用でき、代表例としてアグロバクテリウム・ラジオバク
ターＡＴＣＣ４７１８゜ＡＴＣＣ６４６６、アグロバク
テリウム５ｐ−０３６３、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシェンスＩＰＯ４１７、ＩＣＰＢ ＴＲ６、ＮＣＰＰ
Ｂ１６４１をあげることができる。

また、植物体に対し樹皮肥大誘引活性を持つアグロバク
テリウム・ツメファシェンスから誘導される非植物病源
性の変異株も本発明に利用できる。

また、上記のアグロバクテリウム属の、植物体に対する
樹皮肥大誘引活性のないＣ０ＱＩＯ生産菌を親株として
誘導される各種の薬剤（抗生物質。

アミノ酸アナログ、核酸アナログ、ビタミンアナログ、
サルファ剤、呼吸阻害剤、ステロール合成阻害剤ら）に
対する耐性あるいは感受性の性質を持った変異株、各種
の栄養要求性変異株（アミノ酸要求性、核酸要求性、ビ
タミン要求性ら）、形態変異株、高分子物質合成能欠失
変異株、カタボライトレプレツション耐性変異株、温度
感受性株らも本発明に使用することができる。

なお、上記のアグロバクテリウム属細菌の菌学的性質に
ついてはバージエイス・マニュアル・オブ・デターミナ
テイブ・バクテリオロジー第８版（１９７４）に記載さ
れて公知であり、本発明はこの記載に準じておこなわれ
たものである。

た！し、このマニュアルの分類法にしたがえば、前述の
アグロバクテリウム・ツメファシェンスｌＰＯ４１７、
ＩＣＰＢＴＲ６，ＮＣＰＰＢ １６４１らは非植物病源
菌であるために、１アグロバクテリウム・ツメファシェ
ンス“に分類するのは適当ではなく、アグロバクテリウ
ム属の他の種に属せしめるべきであるが、これらの菌株
に限り本発明の記載は分離者の命名に準じたものである
。

また、これらの菌株が植物体の樹皮肥大誘引活性をもた
ないことは文献（例えば、Ｊ、Ｇｅｎ、］！１４ｒｏｂ
ｉｃｌ 。

７８巻、２２７頁、１９７３年）に記載されて公知であ
る。

さらに、植物体に対する樹皮肥大誘引活性を持つ菌株か
ら、樹皮肥大誘引活性をもたない変異株の誘導は公知の
方法−例えばアクリジン色素処理、加熱処理らの方法に
より容易におこなうことができる。

本発明に使用する微生物の培養培地としては、炭素源、
窒素源、無機物、その他の栄養物を程よく含有する培地
ならば合成培地、天然培地のいずれもが使用できる。

培地に使用する炭素源は、使用菌が利用可能なものなら
ばいずれの種類を用いてもよい。

すなわち、グルコース、フラクトース。シュークロース
、廃糖蜜、でんぷん、でんぷん加水分解物などの炭水化
物、グリセリン、ソルビトールなどの糖アルコール、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アラニン、グリ
シンらのアミノ酸類、乳酸、ピルビン酸、酢酸、リンゴ
酸、ギ酸、コハク酸、フマール酸、クエン酸′、脂肪酸
らの酸類、ｎ−パラフィンらの炭化水素類、メタノール
、エタノール、プロパツール、ブタノールらのアルコー
ル類を単独あるいは組合せて使用できる０ 使用菌が栄養要求性を示す場合にはその要求物質が培地
に添加される。

また、培地あるいは培養液中に各種の物質例えば核酸関
連物質、アミノ酸類、ビタミン類、有機酸類、脂肪酸類
、アルコール類、ステロール類、その他Ｃ０Ｑ１ｏ 生
合成の前駆物質およびその関連化合物を培地に添加する
ことによりＣ０Ｑ１ｏ 生成量が増加する場合がある。

培養は振盪培養２通気攪拌培養などの好気的条件下でお
こなわれる。

培養中、培養液のｐＨは５〜９程度が好適である。

中和剤としてはアンモニア水、水酸化ナトリウム、水酸
化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸マグネシウム、
水酸化カリウム、尿素らが用いられる。

培養期間は通常３〜７日間で、培養液中および菌体中の
両方にＣ０Ｑ１゜が蓄積するが、大部分は菌体中に蓄積
する。

培養物からのＣ０ＱＩＯの単離は常法により溶媒抽出そ
の他の操作によっておこなうことができる。

以下に実施例を示す。

実施例 ｌ グルコース２ ｇ ／ｃｉｌ ｔペプトン１ ｇ ／ｄ
ｌ 、酵母エキス１ ｇ ／ｄ、ｌ＞食塩０−５ ｇ
／ｄｌの組成よりなるＰＨ７，２の種培地３００ＴＬｌ
を２１容三角フラスコに入れて殺菌する。

これに、アグロバクテリウム・ラジオバクターＡＴＣＣ
４７１８を接種し、３０℃で２４時間振盪培養する。

該種培養液２５０ｍ１を下記の組成の発酵培地３１を含
む５１容ジャーファーメンタ−に接種し、６００ｒｐｍ
の回転数、１分間当り３１の通気、温度３０℃の培養条
件下で３０時間通気攪拌培養した時培養液１１当す２６
■のＣＯＱ□。

が生成しＣ０ＱｓとＣ０Ｑ９の副生産量は０．２ｍ９以
下であった。

発酵培地の組成ニゲルコース５ ｇ ／ｄｌ 、硫酸ア
ンモニウム１． ｇ ／ｄｌ。

リン酸−カリウム０．０５ ｇ ／ｄｌ 、リン酸二カ
リウムＯ−０’ ５ ｇ ／ｄｌ 、硫酸マグネシウム
・７水塩０．０２５ ｇ ／ｄｌ 、コーン・スチーブ
・リカー２ｇ／ｄｌ 、炭酸カルシウム２ｇ／ｄｌ（ｐ
Ｈは殺菌前にアンモニア水で７．２に調整する）。

培養液２１を遠心分離して乾燥重量として４１ｇに相当
する湿菌体をえた。

これを１５０ｍ１の水に懸濁後、メタノール４００ｍ１
．水酸化ナトリウム８０ｇ、ピロガロール１５ｇを加え
８５℃で４０分間還元ケン化後放冷し、ｌｌづつのｎ−
ヘキサンを加えて２回抽出操作をおこなう。

ｎ−へキサン層を集めてこれに無水芒硝を加えて脱水後
減圧下で濃縮し残渣を４０１ｒＬｌのアセトンに溶解し
、不溶物を沢別除去した後、再び濃縮し、残渣を１０ｍ
１のアセトンに溶解後シリカゲルカラムに流しベンゼン
にて溶出する０ＣＯＱＩＯを含む分画を集めて濃縮し残
渣を５Ｔｎｌのエタノールに溶解した後冷却することに
より黄色のＣ０ＱＩＯの粗結晶１３■を得た。

本品からさらにエタノールで再結して得た結晶は逆相薄
層クロマトグラフィーのＲｆ値、高速液体クロマトグラ
フィーのりテンションタイム、融点、核磁気共鳴スペク
トル、元素分析値、赤外線吸収スペクトル、紫外線吸収
スペクトル曲線がＣ０Ｑ１ｏ のそれと一致した。

実施例 ２ 実施例１と同一組成の種培地２０ＴＩｌｌを含む３００
献容三角フラスコに、第１表に示すアグロバクテリウム
・ラジオバクターの菌株を接種し、２１０ｒｐｍの回転
数、３０℃の培養温度条件下でロータリーシェーカー上
で２４時間振盪培養する。

えられた種培養液２ｍｌを実施例１で用いたと同一組成
の発酵培地２０ｍ１を含む３００１７１１容三角フラス
コに接種して、種培養と同様に３０時間振盪培養した。

各菌株のＣ０Ｑ１ｏ 生成量は第１表に示すとおりであ
る。

実施例 ３ 使用菌として、第２表のアグロバクテリウム・ツメファ
シェンスの植物体に対する樹皮肥大誘引活性のない菌株
を用いた他は実施例２と同様に実施した結果は第２表の
とおりのＣＯＱ １０ が生成した。

実施例 ４ 使用菌として、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
ＡＴＣＣ４４５２（植物体に対する樹皮肥大誘引活性の
ある菌株）から誘導した非植物病源性菌ＮＰ−１を用い
る他は実施例２と同様に実施した結果２６ｍ１；／／ｌ
のＣ０Ｑ１ｏ が生成した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アグロバクテリウム属に属し、植物体に対する樹皮
   肥大誘引活性がなくかつコエンチー”Ｑ□。 を生成する能力を有する微生物を、炭素源、窒素源、無
   機物、その他の栄養物を程よく含む培地に培養して培養
   物中にコエンチームＱ１ｏを蓄積せしめ、該培養物から
   コエンチームＱ１ｏを採取することを特徴とするコエン
   チームＱ１ｏの製造法。