JPS5853914B2 - 酵素固定化法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素利用反応における酵素の有効利用を図る
ため、連続使用、繰り返し使用の可能な酵素固定化体を
得る方法に関し、特に固定化酵素の活性向上を目的とす
る。

近年、酵素固定化技術の進展に伴い、固定化酵素を利用
したセンサー、あるいは薬品製造など酵素の有する特異
的触媒作用の工業的有効利用が試みられている。

この中で用いられる酵素の固定化法としては、高分子マ
トリックス中に固定化する包括法、固定化担体に直接化
学結合する担体結合法、酵素相互を架橋固定化する架橋
法などが知られている。

具体的には、種々の有機高分子、あるいはガラスピーズ
、カーボンなどをはじめとする無機物を担体として用い
、これらの担体上に上記固定化法を利用して酵素を固定
化する。

担体結合法では酵素と担体を直接結合させるため使用中
に酵素が脱落することはないが、固定化に際しての種々
の反応、操作が複雑であり、適用加能な担体も限定され
る。

また包括法では、３次元樹脂マトリックス中に酵素を閉
じ込めるなどの方法により固定化する。

この固定化法では酵素と担体の結合を伴わないため、固
定化にともなう酵素活性の低下は少ない。

しかし反面、連続使用、繰り返し使用に伴う酵素の脱離
は避けられない。

これに対し架橋法では、例えばグルタルアルデヒドなど
の固定化試薬を用いて酵素相互あるいは酵素と担体の間
に架橋反応を行わしめ、不溶固定化する。

具体的には、使用する固定化担体の表面を塗布あるいは
浸漬法などにより酵素溶液で被覆し、必要ならば乾燥し
、次にグルタルアルデヒドなどの固定化試薬溶液を添加
して架橋反応を行わせ、酵素を架橋不溶化する。

グルタルアルデヒドとしては数饅水溶液が一般に使用さ
れるが、固定化試薬濃度が高いと架橋反応が急激に進み
酵素の活性が失われる。

また逆に固定化試薬濃度が低いと反応速度が遅く、この
間に未反応の酵素が添加した固定化試薬溶液に溶解する
。

固定化においては、酵素はある程度以上の濃度であるこ
とが必要であり、添加した固定化試薬溶液のために酵素
濃度が低下することは反応を進行させる上で大変不利な
ことである。

これらの点からも明らかであるが、この方法により担体
表面を固定化（不溶化）酵素からなる膜で均一に覆うこ
とはほとんど不可能である。

すなわち、固定化反応（架橋反応）を行わせる際に、固
定化試薬を溶液状態で作用させる、つまり固定化試薬を
液相から供給する方法であるため、上記に述べた問題は
避けられない。

そこで、本発明者らは各種固定化法の問題点を解決すべ
く検討を重ねた結果、酵素と架橋反応する固定化試薬を
気相から供給する固定法を見い出した。

その特徴は、グルタルアルデヒドなどの固定化試薬を作
用させて酵素と担体、あるいは酵素相互を架橋固定化す
る際に、固定化試薬を気相から供給しつつ固定化反応を
行わせる点にある。

すなわち、固定化試薬を一度、気体状態にした後、酵素
溶液で被覆し、必要ならばさらに乾燥させた担体表面へ
供給することにより良好に酵素の固定化ができる。

そこでこの固定化法について、固定化酵素の活性向上の
観点からさらに種々検討を試みたところ、非酸素雰囲気
下で固定化反応を行うことにより、優れた酵素活性を有
する酵素固定化体を得ることができることが判明した。

すなわち、アルゴンや窒素などの不活性ガス雰囲気下、
あるいは減圧下において固定化試薬を気相から供給して
固定化を進行させることにより、固定化に伴う酵素の活
性低下を大幅に減することができた。

この様な効果が得られる理由については明らかではない
が、酵素活性に影響を及ぼす固定化反応に反応系中の酸
素が何らかのかたちで関与していることが考えられ、こ
のため反応系雰囲気中の酸素濃度を減じた条件下で上記
効果が得られるものと思われる。

そして、さらに本発明の固定化法においては、固定化反
応に関与する固定化試薬の濃度を容易にその蒸気圧で制
御できるため、酵素の微妙な活性変化に重大な影響を及
ぼす固定化反応の進行度合いを容易に調節できる。

以上のごとく、本発明の酵素固定化法においては、非酸
素雰囲気と固定化試薬の気相からの供給の２つの反応条
件を組み合わせることにより、高い酵素活性を有する酵
素固定化体を得ることができるものである。

以下、本発明をその実施例により説明する。

第１図は、ネサガラス電極表面に本発明の方法により酵
素を固定化し、基質濃度測定用の酵素電極を構成した一
例を断面膜弐図で示したものである。

図中１はアルコール脱水素酵素からなる固定化酵素膜、
２はネサ膜、３はガラス層である。

この酵素電極の製法は以下の通りである。

まず、アルコール脱水素酵素を１００ｍ９／−の割合い
で溶解したリン酸緩衝液を、前述のネサガラス電極（直
径１０ｍ、厚さ１ｍπ）の表面に塗布展開した。

次に、少し乾燥させた後、以下に示す種々の雰囲気条件
下で、グルタルアルデヒド蒸気中において２５℃で６０
分間固定化反応を行わせた。

反応終了後、リン酸緩衝液で洗浄した。

こうして得られた固定化酵素膜は十分な密着強度を有す
るものであった。

反応雰囲気条件として、減圧下（３０ｉｍＨｇ以下）で
得られた電極をＡ、同様にアルゴンガスの場合をＢ、窒
素ガスの場合をＣ１空気の場合をＤ、酸素ガスの場合を
Ｅとする。

上記アルコール脱水素酵素固定化電極を用いてエタノー
ル濃度を以下の方法で測定した。

Ｈ型セルを用い、前述の電極を樹脂製電極ホルダーに装
着し、補酵素としてｌ×１０−３モル／ｌのニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドを含むｐＨ７，０のリン酸
緩衝液に浸漬した。

次にポテンショスタットを用いて電極電位を補酵素の十
分な酸化電位に設定した後、エタノールを注入して所定
の濃度とし、酵素反応で還元された補酵素の酸化電流値
を測定した。

第２図にエタノール濃度変化に伴う電流値の増加を示す
。

図から明らかなごとく、空気あるいは酵素の雰囲気下で
得られた電極り、Ｈに比較して、本発明による電極Ａ、
Ｂ、Ｃの電流増加が大きく、電極に固定化されているア
ルコール脱水素酵素の活性が高いことを示している。

このような活性向上効果は、上記アルコール脱水素酵素
に限られることはない。

種々の酵素に本発明の固定化法を用いたところ同様の効
果が得られた。

また、本発明の固定化法で使用可能な固定化試薬として
は、実施例で示したグルタルアルデヒド以外に、２−オ
キシアシボアルデヒド、クロトンアルデヒド、アクロレ
イン、グリオキザール、プロピオンアルデヒド、パラホ
ルムアルデヒドなどのアルデヒドあるいはアルデヒド重
合物をはじめとして、気相から供給することのできる固
定化試薬であればいずれも使用することができる。

以上述べたごとく、本発明の酵素固定化法によれば、高
い酵素活性を有する酵素固定化体を容易に得ることがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図はネサガラス電極とこれを覆う固定化酵素膜を示
す断面模式図、第２図は各種酵素電極を用いて測定した
エタノール濃度と電流増加量の関係を示す。 １・・・・・・固定化酵素膜、 ラス層。 ２・・・・・・ネサ膜、 ３・・・・・・ガ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵素と架橋反応する固定化試薬で酵素を固定化する
   酵素固定化法であって、減圧下あるいは不活性ガス雰囲
   気下において前記固定化試薬を気相から供給して固定化
   反応を行わせることを特徴とする酵素固定化法。 ２ 固定化試薬がアルデヒドあるいはアルデヒドの重合
   物から選ばれる特許請求の範囲第１項記載の酵素固定化
   法。