JPS585036B2 - グルコ−スイセイカコウソセイセイブツノ セイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素の非可動化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏ
ｎ）に関し、特にグルタルアルデヒドと少なくとも破裂
または融解した細胞の実質的な画分を有する細胞調製物
とを反応させることによって物理的に安定で再使用でき
る微粒子状グルコース異性化酵素生成物の製造に関する
。

所望の酵素反応を行なうために唯一回だけ酵素を使用す
ることがはなはだしく酵素が高価であるために反応を行
なう費用がはなはだ高価になることは従来長い間認めら
れて来たことである。

特に、グルコースは酵素によって異性化されて通常グル
コースとフラクトースとが約５０−５０の混合物からな
る非常に甘味のある生成物に変えることができるが、酵
素の費用が高く、異性化操作を酵素の特性に合うように
しなければならないことは公知である。

再使用できる酵素は低置な方法への望みを与えるので、
酵素を何回も再使用する可能性について注意が向けられ
て来た。

細胞内および細胞のないグルコース異性化酵素を安定化
するための、および／または非可動化するための多数の
提案がなされて来た。

酵素の再使用には反応混合物から酵素を回収することが
必要であるので、可溶性酵素を一般に不溶化しそしであ
る種類のマトリックスに付着させている。

細胞内酵素であるグルコース異性化酵素に関する限り、
グルコース異性化酵素は既に微生物細胞に結合している
かまたはその内側に捕捉されているが、その酵素の溶出
および／または細胞の破壊は通常回避されねばならない
。

また、微生物細胞、特に細菌は比較的小さく、より大き
い粒子状物であればより望ましい。

グルコースの異性化に対する重要性に関係して、グルコ
ース異性化酵素含有細胞を安定化しまたはカプセル化す
るために使用した試薬が最終生成物のグルコース／フラ
クトースシロップに有害となる物質を放出しないことが
確実であることが望ましい。

以前に提案された非可動化技術のうちには、試薬および
反応生成物が非毒性のものとして許容されなかったため
に、工業的実施において全く使用されなかったものもあ
る。

しかしながら、米国特許第３，７７９，８６９号明細書
にはグルタルアルデヒドとの反応によってグルコース異
性化酵素含有細菌細胞を安定化することが開示されてい
る。

また、グルタルアルデヒドとの反応によって各種酵素を
交叉結合させる他の提案がなされている。

グルタルアルデヒドが酵素を含む（アミン）窒素含有物
質と反応することは公知である。

しかしながら、単なるグルコース異性化酵素含有微生物
の破裂していない元のまゝの細胞（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌ
ｌ）とグルタルアルデヒドとの反応性は交叉結合して多
細胞粒子となる程には充分ではない。

酵素を共有結合させるためにグルタルアルデヒドと共に
他の試薬（アルブミンのごとく）を含めて、酵素を交叉
結合させ、不溶化しそして非可動化する提案がなされた
（例えば、英国特許第１，２５７，２６３号明細書を参
照）。

不幸にして、他の試薬を必要とする量で添加すると、グ
ルコース異性化酵素が相当に希釈され、希釈度に比例し
て生成物の単位活性が低下する。

勿論、グルコース異性化酵素を細胞から取出し、非可動
化する前に精製する場合はより高単位活性の非可動化生
成物を製造することができる。

しかしながら、操作の費用および操作による活性の損失
はいずれの高活性生成物の費用も急激に増加させるので
ある。

グルコース異性化酵素の場合にはこの事情が特に厄介で
ある。

工業的規模でグルコースを異性化するにはできるだけ高
単位活性を有する比較的低置な酵素生成物を非常に大量
必要とする。

安定化された細胞がこの必要性に最も良く適するように
認められるが、使用に提供した場合、工業的規模で個々
の細胞を回収しそして再使用することは技術的に困難で
ある。

破裂していない元のまゝの細胞を使用する他の不利益は
基質（グルコースおよびフラクトース）を破裂していな
い元のまゝの（ｉｎｔａｃｔ）細胞壁を通しての移送に
は拡散ということが非常な問題となるということである
。

本発明者の研究により、バチルス・コアギユランス（Ｂ
、 ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の破裂していない元のまゝの
細胞のみが細胞の完全融解の後に見出された活性の約１
４を示すということがわかった。

可成りの再使用回数、例えば５回またはそれ以上の回数
を行なっても、微粒子（微生物細胞よりも大きい）中の
固有の単位活性よりもやや低下した単位活性を認めるこ
とが可能である。

本発明によれば破裂していない元のまゝの微生物細胞を
０−７５％含有し且つ乾燥物質含量３−３０重量／容量
％を有する少なくとも部分的に破裂している微生物細胞
の細胞濃縮物と該細胞濃縮物の乾燥物質含量の１重量部
当り０．０１−１．０重量部のグルタルアルデヒドとを
反応させてゲル状生成物を形成させ、その抜水を除去し
そして酵素的且つ物理的に安定な水不溶性グルコース異
性化酵素生成物を成形することを特徴とする、グルコー
ス異性化酵素活性を示す微生物細胞から酵素的且つ物理
的に安定な水不溶性グルコース異性化酵素生成物の製造
法が提供される。

水の除去は、異なる程度に行なうことができ、通常次の
２工程：１）機械的手段、例えば濾過による脱水、およ
び最終の成形した生成物の乾燥によって行なわれる。

本発明による方法の好適実施態様は８−２０重量／容量
％の乾燥物質含量、好ましくは１０−１６重量／容量％
を有する細胞濃縮物を使用することからなるものである
。

本発明は、また破裂していない元のまゝの微生物細胞を
０−７５％含有し且つ乾燥物質含量３−３０重量／容量
％を有する少なくとも部分的に破裂している微生物細胞
の細胞濃縮物と該細胞濃縮物の乾燥物質含量の１重量部
当り０．０１−１０重量部のグルタルアルデヒドとを反
応させてゲル状生成物を形成させ、その抜水を除去しそ
して酵素的且つ物理的に安定な水不溶性グルコース異性
化酵素生成物を成形することによって製造した、グルコ
ース異性化酵素活性を示す微生物細胞から酵素的且つ物
理的に安定な水不溶性グルコース異性化酵素生成物に関
する。

本発明者の研究により、ゲル状グルコース異性化酵素生
成物が外の非可動化反応体を含めることによって酵素含
量を希釈することなく製造することができることが見出
された。

また、細胞自体はグルタルアルデヒドと反応しゲル状生
成物をつくる含窒素（および他の）構成成分を充分量以
上に含有することが確認された。

かゝる構成成分は先ず微生物細胞から遊離されなければ
ならないが、遊離した場合は中間的に精製する必要がな
く目的に役立つであろう。

含窒素構成成分（例えば蛋白質および核酸）の遊離は機
械的作用または自己融解によって行なうことができる。

遊離は完全である必要はない。細胞の２５％程度を破砕
すると（すなわち細胞の７５％が破裂していない元のま
ゝである）、充分な反応成分を放出させることができ、
ゲル状生成物である凝集固体生成物をつくらしめること
ができる。

凝集反応生成物は脱水しそしてはるかに小さい１０ミク
ロンの粒径までに細分化された形の適当な粒径のものに
成形する。

グルコース異性化酵素の特定の微生物源はグルコース異
性化酵素が細胞内にある限り、本発明には必須ではない
。

グルコース異性化酵素活性を示すものとして多くの微生
物が同定された。

しかしながら、既に公知の殆んどの（多分全ての）グル
コース異性化酵素の微生物源は細胞内に酵素を生産する
。

微生物細胞は任意の適当な方法、好ましくは高グルコー
ス異性化酵素活性細胞を生産するのに最も適した方法で
培養することができる。

細胞を濾過、遠心分離等によって醗酵プロスから適当に
分離し３−３０重量／容量％の乾燥物質を含有する濃縮
物を形成させる。

乾燥物質含量が３重量／容量％未満で少量にすぎる場合
には、グルタルアルデヒドとの交叉結合反応手段によっ
て前記ゲル状生成物を形成し難く、一方、３０重量／容
量％を超えて多量にすぎる場合には、グルタルアルデヒ
ドの添加終了前に、すでに固体塊状物を形成して取扱い
困難となる。

細胞濃縮物中に融解且つ破裂した細胞が存在すること、
および遊離の酵素が存在することさえも重要なことであ
り、スラッジ用自己清浄遠心分離機のごとき大規模の工
業用設備の使用によって微生物細胞を濃縮する。

操作遅延による自己融解が起る場合でさえ、通常は、比
較的厳しい取扱い条件が許容できる。

実際、回収および濃縮の過程の間に実質的な程度の細胞
破裂、自己融解等が起らない場合は、濃縮物が７５％以
下、好ましくは６０％以下の破裂していない元の細胞を
含有するようになる点まで細胞の破裂がゆっくりと起る
。

本発明を実施するには細胞壁の拡散問題を避けるために
そして可能な限り物理的に安定な生成物を得るために細
胞の完全な破裂すなわち１００％の破裂が望ましい。

グルタルアルデヒドとの反応を破裂させた細胞の水性懸
濁液中で行なう。

そしてグルコース異性化酵素それ自体を含めて、ある種
の遊離した細胞構成成分は溶液状態にある。

従って、細胞の破裂または破砕は細胞が醗酵培地中の通
常の含量以上に濃縮された後にのみ行なうべきである。

実際条件においては、このことは微生物を増殖培地から
３−約２０％の乾燥物質を含有する細菌細胞濃縮物とし
て一応分離、例えば遠心分離することを意味する。

次いで、濃縮に付随してまたは濃縮に続いて、必要とす
る細胞の破裂を例えば自己融解または均質化によって行
なう。

大規模の細胞の製造で、細胞を濃縮する最も都合のよい
方法は自己清浄分離機、例えばＳＡＭＳ１５０３７また
はＳＡＭＲ〔両者共西ドイツ国エルデ（Ｏｅｌｄｅ）市
、ウエストファリア・セパレータ社（Ｗｅｓｔｆａｌｉ
ａ ５ｅｐａｒａｔｏｒ ＡＧ）から入手できる〕の使
用による。

また、スウーデン国のアルファ・ラバル（Ａｌｆａ Ｌ
ａｖａｌ）からはＢＲＰＸ型の分離機を得ることができ
る。

適当な操作条件のパラメーターの詳細については英国特
許第１，２６１，７１１号明細書（第２頁第９１−１０
０行）を参照。

これらの型の分離機は細胞の破裂の程度が臨界的でない
場合にのみ、その使用が推奨される。

何故ならば、これらの分離機のボールを間褐的に空にす
る間にボール周囲にある孔を通して高物理力がかゝす、
その穴を通して高圧になったボールから１気圧の外側へ
と細胞が出るからである。

細胞破裂の程度は細胞の大きさおよび細胞壁の強さの相
違の故に各々の微生物によって変わるであろう。

バチルス・コアギユランスに関しては、細胞の破裂度は
ＳＡＭＳ１５０３７型分離機を使用した場合通常５０％
より高いことがわかった。

分離機のボール壁にかゝる圧力は式 Ｐ＝Ｇ／２ω２（γ■−γ■）から評価することができ
る。

但し、式中Ｇは供給物の比密度（この場合約１０３０ｋ
ｇ／ｍ３）でありωは分離機の回転速度であり、γ２は
ボールの半径でありそしてγ１は中心から供給物レベル
までの半径（この機械では０に近い）である。

かゝる分離機のボール周囲にかかる圧力は５Ｏ−１００
ｋｐ／ｃｍ２のオーダーであることがわかるであろう。

ＳＡＭＳ１５０３７型分離機のボールは半径２５ｃｍを
有しそして通常５０００ｒｐｍの速度で回転する。

この回転速度はボール壁にかゝる約８０ｋｐ／ｃｍ２の
圧力に対応する。

ある微生物、特にバチルス種は自己融解を受けやすい。

バチルス・コアギユランスについては、細胞濃縮物が上
記自己清浄分離機によって製造された場合、スラッジが
１０−４０℃の温度で数時間維持されると、より多くの
グルコース異性化酵素が遊離することがわかった。

３−６時間貯蔵の後は通常８０％以上の細胞が破裂する
かまたは融解する。

既に述べたように、グルコース異性化酵素生産バチルス
・コアギユランスの破裂していない元のままの細胞懸濁
液のグルコース異性化活性はリゾチーム処理によって得
た完全融解懸濁液の活性の約１／３に過ぎないことがわ
かった。

このことを次表に説明する。

リゾチームは２５０００シグマ単位／ｍｇ（ｓｉｇｍａ
ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を有するシグマ等級（Ｓｉｇｍａ
Ｇｒａｄｅ）Ｉのものであった。

培養ブロスを２０倍に希釈し、そして希釈した懸濁液に
１ｍｌにつき１．５ｍｇのリゾチームを添加した。

次いで、試料を３０分および６０分後に、非可動化グル
コース異性化酵素をつくるための本発明者による標準操
作にしたがって分析した。

ＧＩＮＵはグルコース異性化酵素ノヴオ単位（Ｇｌｕｃ
ｏｓｅＩｓｏｍｅｒａｓｅ Ｎｏｖｏ Ｕｎｉｔｓ）を
表わす。

細胞濃縮物の全活性を測定するための本発明者による標
準操作は１５０−２００倍に希釈した後リゾチームを共
に恒温に維持することからなる操作である。

リゾチーム処理をしない試料の活性を評価する場合は、
破裂していない元のまゝの細胞の活性は最高３５％と仮
定して可溶性酵素の活性のパーセントを計算することが
できる。

例えばスラッジをリゾチーム処理した後の活性が１３５
ＧＩＮＵ／ｇでありそしてリゾチーム処理をしないとき
の活性が１２０ＧＩＮＵ／ｇである場合、可溶性酵素の
パーセントは次の方程式からＸとして算出することがで
きる。

Ｘ×１．３５＋（１００−Ｘ）１．３５×０．３５＝１
２０高度に細胞破裂を確実にする他の利点は細胞（およ
び他の懸濁している物質）が良好に分解されればされる
ほど最終生成物の物理的安定性がますます高まる様に認
められることである。

最適条件を確保するためには、スラッジをポンプで市販
の均質器を通過させることがわかった。

この型の設備は異なった製造メーカーから入手すること
ができ、例えば単一段均質用弁組立部分を有するマント
ン・ゴーリン（Ｍａｎｔｏｎ Ｇａｕｌｉｎ）型ＳＰ１
５Ｍ−８ＴＡは米国マサチュセツツ州エベロット（Ｅｖ
ｅｒｏｔｔ）市のゴーリン（Ｇａｕｌｉｎ）社から得る
ことができる。

この装置は細胞破裂用に広範囲に使用される〔ピー・ジ
エ・ヘザーリングトン（Ｐ。

Ｊ、Ｈｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ）、Ｉｎ５ｔ、Ｃｈｅｍ
、Ｅｎｇｎｓ、第４９巻（１９７１年）、およびターミ
イ（Ｔａｒｍｙ）およびカブラン（Ｋａｐｌａｎ）、Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、第２４３巻第２５７９頁（１９
６８年）を参照〕。

さらにエル・エッチ・リー（Ｌ、Ｈ，Ｒｅｅｓ）、ケミ
カルエンジニアリング（ＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ）、（１９７４年５月１３日発行）に参照記
載がある。

この中には製造メーカーの表が記載されており、細胞を
破裂させるための必要の圧力低下について書かれている
。

細胞破裂のための幾つかの方法は公知であるが二三の方
法のみが工業的使用に適当である。

細胞分解のための他の一般的且つ比較的安価な方法はボ
ール・ミル、例えば該文献にスイス国バーゼル・ダブリ
ュ・ニー・バツホフエン・マシイネンファブリク（Ｗ。

Ａ、Ｂａｃｈｏｆｅｎ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉ
ｋ）から入手でき、ディン・ミル（Ｄｙｎｏ ｍ１１１
）として記載されているボール・ミルを使用することに
よる方法である。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎ、ａｎｄ ｂｉｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ第ＸＶ巻第１２９−１４２頁（１９７３年）を参
照、グルコース異性化酵素活性のノヴオ（Ｎｏｖｏ）測
定法 （測定結果の漂準偏差は一般に５−１０％のオーダーを
有する。

原理 グルコース異性化酵素はグルコースを異性化してフラク
トースにする触媒となる。

生成したフラクトースはケトースを測定するためのシス
ティンカルバゾール法によって測定する。

単位の定義 グルコース異性化酵素ノヴオ単位（ＧＩＮＵ）とは標準
反応条件、すなわち 温 度：６５．０℃ 基質濃度：５％グルコース 緩衝剤濃度：０．２５Ｍマレイン酸塩緩衝剤ｐＨ６，５
０ 反応時間：２０分 の反応条件下に１分間当りフラクトース１ミリモルを生
成させる触媒となる酵素量として定義する。

必要とする装置は磁石式攪拌機、水浴（３００℃および
６５．０℃）、ｐＨ−計器、分光光度計〔流通セル（ｆ
ｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｅｌｌ）を有するベックマ
ンモデルＢ〕、ストップウォッチおよび回転式混合機で
ある。

使用する試薬は次の通りである；− （１）緩衝剤、ｐＨ６，５０（０，２５Ｍマレイン酸塩
緩衝剤、０．１Ｍ硫酸マグネシウム、１．０％塩化カリ
ウム）、マレイン酸〔メルク（Ｍｅｒｃｈ）製品、３８
０）（２９，０ｇ）、Ｎａ０Ｈ（１９，０ｇ）、ＭｇＳ
Ｏ４７Ｈ２Ｏ（２４，７ｇ）、ＫＣｌ（１０，０ｇ）、
そして脱イオン水で１０１００Ｏとする。

全ての試薬を溶解した場合、そのｐＨをｐＨ計器で正確
に制御しそして緩衝剤を１ＮＮａＯＨまたは１ＮＢＣ１
を添加することによって６．５０に調節する。

ＮａＯＨの添加によってＭｇ（ＯＨ）２の沈殿が起るが
、この沈澱を攪拌して再溶解させる。

それ故に、ＮａＯＨは非常にゆっくりと添加すべきであ
る。

（２）グルコース基質−１０％、次のものからなる。

グルコース（無水）（１００ｇ）、ＣＯＣｌ２・６Ｈ２
Ｏ（４７５ｍｇ）そしてｐＨ６，５の緩衝剤で１０１０
０Ｏとする。

試薬を溶解した場合、ｐＨを再度−計器で制御しそして
上記の通り６．５０に調節する。

基質を保存するために、０．１％のクロロホルム（１，
０ｍ１）を添加する。

基質は必要になるまで冷却下に維持する。

（３）過塩素酸−約０．１Ｍ−ＨＣｌＯ４（７０％）（
１０ｍｌ）、そして脱イオン水で１０１００Ｏとする。

（４）Ｌ−システィンＨＣｌ溶液−２，２％−システィ
ンＨＣＩ（−水和物）（２４０ｍｇ）、そして脱イオン
水で１０ｍ１とする。

この溶液は日毎、新たに調製すべきである。

（５）カルバゾール溶液−０，４％−カルバゾール（４
００ｍｇ）、そして９６％エタノールで１００ｍ１とす
る。

この溶液は冷却下に維持すべきである。

（６）硫酸−８０％Ｗ／Ｖ−脱イオン水（３００ｍｌ）
およびＨ２Ｓ０４（９６％）（７７５ｍｌ）。

この水は水浴中で冷却しそして冷却した硫酸を注意深く
添加する。

安全ガラス容器を使用すべきである。

（７）硫酸−カルバゾール試薬−８０Ｗ／Ｗ％硫酸（１
００ｍｌ）およびエタノール（１ｍｌ）中の０．４％カ
ルバゾール溶液。

日毎、新たに調製すべきである。

使用直前まで冷凍庫に維持すべきである。

（８ａ）フラクトース標準液１２０ミリモル（貯蔵溶液
）−フラクトース（３６０ｍｇ）、そして過塩素酸（０
，１Ｍ）で１００ｍ１とする。

この溶液は冷凍庫に維持すべきである。

（８ｂ）フラクトース標準液Ｈ１Ｓリモル溶液−フラク
トース標準液Ｉ（５，０ｍ１）、そして過塩素酸（０，
１Ｍ）で１００ｍ１とする。

日毎、新たに調製すべきであり、そしてフラクトース測
定用標準液として使用する。

操作 分析のための試料は濃度が０．１−０．８ＧＩＮＵ／ｍ
ｌの間にあるように緩衝剤で希釈する。

ａ、異性化 １、希釈した試料から供試試料（Ｓ）および（Ｂ）用の
１ｍ１部分を取出す。

１０×１６０ｍｍの試験管を使用する。

２、ストップウォッチを動かし始め（Ｔ）そしてグルコ
ース基質、試験試料およびブランクを６５℃の水浴中に
入れ、そしてガラス〔キールダール（Ｋ ｊｅｌｄａｈ
ｌ）〕栓を用いて栓をする。

３、Ｔ＝１０分＋０分径０秒後０ｍｌのグルコース基質
を第１番目の供試試料に添加しそして振盪する。

Ｔ＝１０分＋１分秒１分秒１０秒０ｍｌのグルコース基
質を第２番目の供試試料に添加しそして振盪する。

Ｔ＝１０分＋２分秒２分秒２０秒様にして続ける。

４、Ｔ＝３０分＋０秒の後に、１０．０ｍｌの０．１Ｍ
過塩素酸を第１番目の試験試料に添加しそして水浴から
取出す。

Ｔ＝３０分＋１分秒１分秒１０秒０ｍ１の０．１Ｍ過塩
素酸を第２番目の試験試料に添加しそして水浴から取出
す。

Ｔ＝３０分＋２分秒２分秒２０秒様にして続ける。

最後の供試試料を取出したとき、続けて、１０．０ｍｌ
の０．１Ｍ過塩素酸を全てのブランクに添加し、次いで
水浴から取出す。

最後に、１００ｍ１のグルコース基質を全てのブランク
に添加する。

５、確実に、全ての試料およびブランクを徹底的に振盪
する。

ｂ、フラクトースの測定 １、冷却し且つよく振盪した試料からピペットで０．５
０ｍ１を１０×１６０ｍｍの試験管の中に入れる。

２本のフラクトース標準液（ＩＩ）および２本の脱イオ
ン水のブランクを測定用として用いる。

脱イオン水のブランクは吸光度を測定した場合の対照と
して使用する。

２、各試験管に、１００μｌのシスティンＨＣ１溶液を
添加する。

振盪後、全ての試験管を３０．０℃の水浴中に入れる。

３、ストップウォッチ（Ｔ）を動かし始めそしてＴ＝０
秒で、３．０ｍｌの冷却した硫酸・カルバゾール試薬を
第１番目の対照に添加しそして徹底的に混合されるまで
回転式混合機上で混合する。

（安全ガラス容器を使用）。

Ｔ＝３０秒で、３．０ｍｌの硫酸−カルバゾールを第２
番目の対照等に添加する。

３０秒間隔で、試料を次の順序ニブランク、供試試料、
フラクトース標準液を処理しつゞける。

４、Ｔ＝３０分＋０秒で、第１番目の対照を用いて５６
０ｎｍにおける１００％透過率に対する分光光度計の目
盛を調べる。

Ｔ＝３０分＋３分秒３０秒２番目の対照を用いて分光光
度計の調節度を制御する。

Ｔ＝３０分＋６分秒６０秒番目のブランク等の吸光度を
読む。

ｃ、計算 活性は次の式から計算する： 式中 Ｓ＝供試試料の吸光度 Ｂ＝ニブランク吸光度 １２＝異性化後の試料のｍｌ ｓｔｄ＝フラクトース標準液の吸光度 ２０＝２０分を１分に換算するための係数Ｗ＝使用した
試料のｇ数 Ｖ＝ｗが溶解している容量（ｍｌ） ｆ＝希釈係数 ｄ、実施例 １．００ｇの酵素を緩衝剤に溶解し、１００ｍ１とする
。

この溶液の１．０ｍｌをとり、緩衝液で１００ｍ１とす
る。

上記の通り、分析を行なう。読み：Ｓ＝０．３６５ Ｂ＝０．１２８ Ｓ−Ｂ＝０．２３７ ｓｔｄ＝１．１６２ ＝ １２２４ＧＩＮＵ／ｇ Ｊ、 Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、第１９２巻第５８３頁（１
９５１年）（Ｚ、Ｄｉｓｃｈｅ及びＢｏｈｒｅｎ ｆｒ
ｅｕｎｄ）を参照のこと。

グルタルアルデヒドとの反応によって非可動化され且つ
交叉結合された細胞濃縮は破裂していないもとのまゝの
細胞（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ）を０−７５％有しそして
乾燥物質含量３−３０重量％有する。

可溶形で遊離したどのグルコース異性化酵素も酵素生成
物中に配合されるように細胞濃縮物中に留める。

本発明に関しては、乾燥物質は１０５℃で１６時間、乾
燥して後に残った残渣である。

真空下に６０℃で２４時間、乾燥すると、別の乾燥物質
含量測定値が得られるであろう。

細胞濃縮物と反応させるグルタルアルデヒドの量は重要
であり、乾燥物質含量に基づいて１−１００重量％とい
う広範囲のグルタルアルデヒドの割合が考えられる。

あまりにもグルタルアルデヒドの量が少ないと工業的使
用には不適当な生成物となりそしてあまりにもその量が
多すぎると最終酵素生成物の単位活性が減少する傾向と
なる。

グルタルアルデヒドの乾燥重量対原料物質における乾燥
物質の好都合な割合範囲は０．０１−１、好ましくは０
．０４−０．４、特に０．０５−０．３であることがわ
かった。

使用されるグルタルアルデヒドの相対割合は、微生物に
よってよく変わることがあり、異なる工業的規模のグル
コース変換装置に適合させるのに必要である。

グルタルアルデヒドは市販の濃グルタルアルデヒド溶液
（例えば２５％）の形で細胞濃縮物に添加することがで
きそして混合物を徹底的に攪拌してグルタルアルデヒド
の均一分散を確実にすることができる。

本発明の交叉結合反応および生成物回収操作は広範囲に
変えることができる。

一好適実施態様においては、原料物質は濃縮した自己融
解醗酵ブロスかまたは均質化濃縮物であり、そしてグル
タルアルデヒドは上記量において添加し、添加時温度は
混合物を１時間以内にゲル化できるように選ばれる。

もう一つの好適実施態様においては、原料物質は自己融
解濃縮物または均質物であってもよく、凝集物を形成し
そして交叉結合反応を高めるように、グルタルアルデヒ
ドの添加前に凝集化剤（ｆｌｏｃｃｕｌａｎｔ）で処理
する。

更にもう一つの好適実施態様においては、交叉結合混合
物はさらに多孔性生成物に導く不均質ゲル状物を形成す
るように凍結させる。

原料物質としては、いずれの形の酵素も使用することが
できそして交叉結合工程のための条件は凍結させる前に
ゲル化するように選ぶ必要はない。

凍結後、ゲル状物を凍結点を越える温度で凍結を解かす
。

このことにより、交叉結合反応を続けさせることができ
そして多孔性生成物が形成する。

したがって、本発明の実施方法は多くの別法を含む。

このことは、例えば、基本的方法をいかに変えて本発明
の異なる方式にすることができるかを図式的に表わして
いる添付図面の図に記載されている。

図面を参照すれば、細胞の培養プロス１０は、望ましく
は、実質的に必要とした程度の細胞破裂、好ましくは５
０％以上の細胞破裂を越す条件下に、適当には、１２％
の乾燥物質に遠心分離（工程１２）することによって常
に濃縮されることがわかるであろう。

細胞の破裂の程度は通常、６時間の自己融解によって高
められる。

一つの（そして好適な）方法においては、細胞は１００
％の細胞破裂状態にまで完全な均質化操作（工程１４）
に付してもよい。

既に指摘したように、細胞の破裂はグルタルアルデヒド
と反応する細胞の構成成分を遊離させそして完全に分解
するとさらに交叉結合架橋の分布を広める可能性さえあ
り且つ交叉結合剤を節約すると共により均質なスラッジ
が得られる。

一つの好適態様においては、均質物または自己融解物を
グルタルアルデヒドで処理しく工程１６）そして混合物
を全体の塊状物がゲル化するまで周囲温度で静止状態の
まＮに放置する。

ゲル状物が未だ軟らかい間に（やゝマスタードまたはク
リームチーズに似る）粒状化しく工程１８）そして所望
により洗浄する。

その後に、ゲル状物を、望ましくは唯一の緩和な昇温下
、例えば３０−５０℃で乾燥しく工程２０）、例えば乾
燥物質８８％にする。

次いで、生成物を洗浄し且つ再度乾燥してもよい（工程
２２）。

得られる粒状の高活性生成物は本発明の一好適生成物を
構成する。

本発明の方法の好適実施態様においては、グルコース異
性化酵素生成物の粒状化は押出しによって行なう。

粒状生成物の硬度はグルタルアルデヒド反応成分の初期
量を調節することによっておよび／または行なう洗浄の
程度によって制御することができる。

洗浄により未反応のグルタルアルデヒドが除去されその
結果、やゝ軟質の生成物が得られる。

反応が継続し、そして乾燥するにつれて生成物が硬くな
ることは明らかである。

最後の洗浄工程２２は原理的には非常に微細な粒子を除
去する意図の工程である。

生成物の乾燥粒子は微生物細胞に存在する高率の元酵素
活性を留保しながら、例外的な寸法安定性および構造強
度を有する。

本発明の微粒子状グルコース異性化酵素生成物はバッチ
型またはカラム型反応器中でグルコースをフラクトース
に多数回再使用することができる。

操作上の利点は細胞濃縮物を、好ましくは自己融解工程
の後に、凝集化剤で処理して細胞または細胞残層を凝集
し、次いでグルタルアルデヒド２４と反応させる、別の
処理順序で行なうことによって得られる。

先ず、グルタルアルデヒドを添加し次いでグルタルアル
デヒドの添加直後または破壊したゲル状物を濾過する直
前に凝集化剤を添加するのがよい。

ゲル化の後、ゲル状物を洗浄しそして濾過していくらか
の水、凝集化剤および／または未反応のグルタルアルデ
ヒドを除去する。

濾過剤として、殆んどどの型の沖過器も使用することが
できる。

通常真空濾過と共に使用する実験室的規模の製造にはブ
フナー漏斗が有用であることがわかった。

大規模の製造には濾板濾枠型加圧式濾過機が有用である
ことがわかった。

使用した炉板濾枠型加圧式濾過機は西ドイツ国ハンブル
グ市のジュール社（Ｓｈｕｌｅ ＧｍｂＨ）から入手で
きる濾枠の深さが１．５ｃｍを有するものである。

また使用した濾布は全く臨界的ではない。

実際に使用した濾布は英国ランカシア−州にあるピー・
アンド・ニス・テックスタイルス（Ｐ＆Ｓ Ｔｅｘｔｉ
ｌｅｓ）社から入手できるプロペックス（Ｐｒｏｐｅｘ
）２３であった。

懸濁液を加圧式濾過機に移すために、使用したポンプの
型は当技術分野で公知のように、臨界的であろう。

モノポンプ（Ｍｏｈｎｏｐｕｍｐｓ）は通常、供給物を
破壊しない故に適当であることがわかった。

この段階で、ゲル化した塊状物の乾燥物質含量は例えば
１１％から３０％まで増加した。

その後に、フィルターケーキを粒状化し〔工程２８〕し
、そして例えば乾燥物質８８％に乾燥した（工程３０）
。

高酵素活性を有するかたい粒子が得られた。

細胞濃縮物を凝集する主な利益はより脱水しうるゲル状
物が得られ、乾燥機装置への負担を減すということであ
る。

適当な凝集化剤はトリュ・ケミカル（Ｄｒｅｗ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）から入手できるＥＣ２５およびサイアナ
ミツド・インターナショナル（Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）から入手できるスーパーフロ
ック（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ）Ｃ５２１であることがわか
った。

濾過工程を使用する物理的脱水を行なう他の利益は乾燥
前に不規則状の塊状物に砕くことができるに過ぎないゲ
ル状物よりもより低水分含量の方が、より好都合に粒状
化されるということである。

フィルターケーキは幾つかの会社、例えばデンマーク国
コペンハーゲン市のジアノ（Ｄｉａｆ）Ａ／Ｓ、および
英国リバプール市にあるマノステイ（Ｍａｎｏｓｔｙ）
から得られる型の振動式造粒機で粒状化することができ
る。

フィルターケーキから粒子をつくる他の方法は所望の直
径の孔を有する板を通してケーキを押出すことである。

これに関連して、オランダ国バックステル（Ｂａｘｔｅ
ｌ）にあるシモン・ヒーセン（Ｓｉｍｏｎ Ｈｅｅｓｅ
ｎ）から入手できる軸方向押出機のモノロール（Ｍｏｎ
ｏｒｏｌｌ）および日本国大阪市にある富士電機工業で
製作された軸方向押出機が適当であるが、主として正し
い寸法の孔を有する押出機であればいずれも使用できる
ことがわかった。

押出機の網目の孔の直径は約２００μｍ２ｍｍまたは場
合によってはそれ以上あってもよい。

その直径があまりにも太きいと散布の問題のためにあま
り好ましくない。

一方、その直径があまりにも小さいと、固定床型反応器
中で使用した場合、大規模のカラムにおいて過度の圧力
下を与える粒子が得られるであろう。

操作および生成物上の両方の利益はグルタルアルデヒド
−処理細胞濃縮物を凍結する（工程３２）を含む別の処
理順序で得られる。

細胞濃縮物およびグルグルアルデヒドを混合した直後に
、ゲル化後またはゲル化前に、凍結を行なうことができ
、この場合、溶融（工程３４）して反応を完結させる。

いずれの場合においても、離液が起こる。

水で洗浄しそして水を除去すると、乾燥物質がやゝ濃縮
した生成物、例えば乾燥物質が３０％の生成物が残る。

その後に、生成物を、例えば乾燥物質８８％に乾燥させ
る。

凍結すると性質上、いくらか弾力性のある繊維状および
／またはスポンジ状の薄片状またはフレーク状の生成物
が製造される。

粒状生成物に比較して、凍結操作から得られた生成物は
過度の微小粒子の殆んどないものである。

凍結操作を含めた場合、全酵素活性がより多く回収され
ることが信じられ、そして凍結工程の存在は本発明の全
体の方法にとって好ましい。

本発明のさらに他の実施態様は凍結させた反応生成物を
凍結乾燥（工程４０）させることを含めることである。

しかしながら、凍結乾燥は高価な真空設備、および比較
的高価につく操作を含むものである。

蒸発乾燥のどの操作も操作費が高価につくので、凍結且
つ凝集操作によって容易にした脱水はある利益を提供す
る。

略示図に認められる通り、交叉結合した洗浄生成物は（
濾過器上で）加圧され元の水分含量のいくらかを除去し
て少なくとも３０％の乾燥物質の生成物にすることがで
きる。

必要に応じ、このような生成物をグルコース異性化酵素
に使用することができる。

しかしながら、ある程度乾燥することが好ましく、好適
な生成物は少なくとも８０％の乾燥物質を含有している
。

本発明の実施に使用したグルコース異性化酵素の微生物
源は臨界的であるとは信じられない。

しかしながら好ましいグルコース異性化酵素源は、この
酵素の公知生産微生物であるバチルス・コアギユランス
である。

特に好ましいのは１９７３年１２月２７日付で出願した
現在出願係属中の米国特許出願第４２８６８２号に記載
されている異型性バチルス・コアギユランスである。

この微性物は容易に細胞が破裂し、可溶型の酵素および
蛋白質や核酸のごとき反応性構成成分を放出する。

実際、必要に応じ、細胞層は均質濃縮物から除去するこ
とができ、その結果濾液または遠心分離液に溶解した可
溶性酵素えよび可溶性の反応性細胞構成成分と反応させ
て交叉結合生成物を生成させることができる。

本発明で使用される典型的な具体的菌株はＮＲＲＬＢ−
５６４９〜Ｂ−５６６６およびＢ−５３５１であり、Ｎ
ＲＲＬから第三者に自由分譲可能である。

次の実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例 １ 細胞濃縮物およびその非可動化 バルチス属の菌株ＮＲＲＬＢ５６５６のグルコース異性
化酵素含有細胞を培養し、次いで自己清浄ボールを有す
るウエストファリア（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ）ＳＡＭＳで
遠心分離することによって細胞を醗酵ブロスから回収し
そしてｐＨを６．３に調節した。

濃縮物には約１０Ｗ／Ｖ％乾燥物質および約４０％の破
裂していない元のまゝの細胞が含有されていると見積っ
た。

濃縮物１ｋｇに、３８ｍ１の市販の５０％グルタルアル
デヒドを添加しながら、充分に攪拌して徹底的にグルタ
ルアルデヒドと細胞濃縮物とを混合した。

その後に、反応の塊状物を周囲条件で静止状態になるま
で放置した。

１時間後、反応混合物はゲル化してはゞチーズカードの
堅さの凝集塊状物になった。

塊状物を緩和に攪拌することによって砕き、そして２容
量の脱水イオン水で洗浄しそして排水した。

次いでゲル状片を真空乾燥器に移し、そこで約１ｋｇの
重量を５０℃で脱水して約１３０ｇの重量にした。

脱水の過程の間に、軟質のゲル状片をかたく且つ寸法的
に安定な物質に変えた。

次いで、脱水した小片を粉砕して直径１ｍｍ以下の粒子
にした。

酵素の回収率はバッチによって変わり、初期活性の５０
〜６０％であった。

しかしながら、生成物の約１５重量％は極端に微細な物
質（粒径が１−７０ミクロンの範囲にある）から構成さ
れていた。

実施例 ２ 凍結による非可動化 実施例１における通りにして、１ ｋｇの細胞スラッジ
（破裂していない元のまゝの細胞が４０％）を製造した
。

次いで、グルタルアルデヒド−細胞濃縮物混合物の製造
工程およびゲル化塊状物の製造工程に対して実施例１を
繰返した。

その後に（その容器中の）ゲル状物は奥深い冷蔵庫に移
しそして一夜放置した。

次の出凍結したゲル状物を周囲温度までの温度で解かし
、水分の多い塊状物を得た。

攪拌しながら、さらに水を添加し、次いで排水した。

次いで、生成物を回転式乾燥器で乾燥させ、重量を約１
３０ｇにした。

最終の生成物は外観かやゝフレーク状をしたスポンジ状
粒子からなっていた。

見かけの活性の回収率はバッチによって変わり、６０−
７０％であった。

しかしながら、実際上、微細な物質は製造されなかった
。

実施例 ３ 凝集化剤による非可動化 グルコース異性化酵素生産バチルス・コアギユランス（
ＮＲＲＬＢ５６５６）の醗酵から得られた培養ブロス１
５５０１を１０℃でウエストファリアＳＡＭＳ１５０３
７で遠心分離して濃縮し、濃縮物１００ｍ１当り１２ｇ
の乾燥重量（１０５℃）を含有するスラッジを得た。

この濃縮物（ｐＨ７，９）１１ｋｇを２０℃で３時間放
置し、室温で緩和に撹拌しながらバチルス・コアギユラ
ンスの細胞を自己融解させた（破裂してない元のまゝの
細胞が１７％）。

次いで、ｐＨを希酢酸で６．５に調節した。

可溶形で元の活性の８３％を含有するスラッジに、３３
０ｍ１の５０％グルタルアルデヒド溶液を添加して反応
混合物中の約１．５Ｗ／Ｖ％のグルタルアルデヒド濃度
とした。

１時間の後に、部分的に交叉結合したゲル状物を、脱イ
オン水２０１を添加した後に激しく攪拌した。

かくして得られた懸濁液にトリユフロック（Ｄｒｅｗｆ
ｌｏｃ）ＥＣ２５の３０％溶液８０ｍ１を添加して澄明
な溶液をつくった。

語「ドリュフロック（Ｄｒｅｗｆｌｏｃ）」は商標であ
る。

懸濁液を濾過して可能な限りの多くの水を除去した。

フィルターケーキを真空中３５℃で乾燥させ、次いで磨
砕して３００μ以下の粒径にした。

対照として細胞濃縮物からつくった噴霧乾燥粉末を用い
てバッチ毎に異性化してその活性を測定した。

条件は次の通りであった：ｐＨ７，０，６５℃、１１当
りＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０，１ｇ、１１当りＭｇＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ２，０ｇグルコース４０Ｗ／Ｗ％。

供給物を窒素で満した非可動化した酵素の見かけの活性
は対照の７０％以上であった。

使用後、非可動化した酵素を濾過して戸数しそして再使
用した。

このことを５回行ない、５回の連続使用の後に、その活
性には認むべき低下が示されなかった。

自己融解細胞濃縮物の２つ目の部分をスラッジ１ｋｇ当
り３０％トリユフロックＥＣ２５の２０ｍ１で処理し、
続いて１．４Ｗ／Ｖ％のグルタルアルデヒドと反応させ
た。

本質的に同じ生成分が得られた。

実施例 ４ 均質物（交叉結合されている） 細胞の破裂による遊離酵素および他の細胞内蛋白質をつ
くるために、実施例３における通りにして製造したスラ
ッジ１２１を均質化した。

ｐＨ約７．５で、均質化された細胞濃縮物をポンプで、
第一段均質用弁組立部分を有するマントン・コーリン（
Ｍａｎｔｏｎ Ｃａｕｌｉｎ）式均質器ＳＰ１５Ｍ−８
ＴＡに通した。

圧力低下は４００ｋｇ／ｃｍ２であった。均質物は、可
溶形で９５％以上の活性を含有し、これを４０ｍ１／ｌ
の５０Ｗ／Ｗ％グルタルアルデヒド溶液と反応させて溶
液巾約２．０Ｗ／Ｗ％のグルタルアルデヒド濃度とした
。

周囲温度で１時間の後に生成したゲル状物を機械的に砕
き、脱イオン水２０１で希釈しそしてさらに実施例１に
したがって処理加工した。

満足する生成物が得られた。実施例 ５ グルタルアルデヒド反応後の均質物への凝集物添加 実施例３で記載した通りに製造したスラッジ１２１を実
施例４で使用した条件下に均質化した。

９５％以上の活性が可溶性であることが見出された。

ｐＨ７，０および温度１５℃の均質物に５０Ｗ／Ｗ％グ
ルタルアルデヒド溶液を添加して溶液中２．０Ｗ／Ｗ％
グルタルアルデヒド濃度とした。

１時間の反応時間の後へゲル状物を機械的に砕き、２容
量の水で希釈しそしてｐＨを７．５に調節し、１５０ｍ
１の３０Ｗ／Ｗ％トリユフロックＥＣ２５を添加して懸
濁液中澄明な水層をつくった。

混合物を濾板濾枠型加圧式濾過機〔西ドイツ国ハンブル
グ市のジュール社（Ｓｃｈｕｌｅ ＧｍｂＨ）から入手
。

濾枠の深さは１５ｍｍであり、使用した濾布は英国ラン
カシア州のピー・アンド・ニス・テックスタイルス社（
Ｐ＆Ｓ Ｔｅｘｔｉｌｅｓ Ｌｔｄ）から入手できるプ
ロペックス（Ｐｒｏｐｅｘ）２３であった。

フィルターケーキに圧縮空気を通して遊離した水のいく
らかの量を除去した。

圧縮空気を通したフィルターケーキを軸方向押出機のモ
ノロール（Ｍｏｎｏｒｏｌｌ）で押出した。

モノロールはオランダ国バックステルのシモン・ピーセ
ン（Ｓｉｍｏｎ、 Ｈｅｅｓｅｎ）社から入手でき、０
．８ｍｍの孔を有する網目を備えた軸方向押出機であっ
た。

生成物は５０℃の空気入口温度を有する流動床用乾燥器
中で乾燥させた。

１１のジャケットのついたカラム中に３００ｇを充填し
、そして温度６０℃、且つｐＨ７，２で、４０Ｗ／Ｗ％
グルコース溶液をポンプで１時間につき１１の速度でカ
ラムに通した。

変換率は４３％であった。

グルコース溶液は１１当りＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０，１
ｇおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２，０ｇを含有していた
。

実施例 ６ 醗酵ブロスの濃縮物の製造およびその非可動化グルコー
ス異性化酵素含有バチルス・コアギユランスＮＲＲＵＢ
５６５６の醗酵から得た醗酵ブロス１０００１をウエス
トファリアＳＡＭＳ１５０３７型自己清浄分離器で１０
℃で遠心分離して濃縮して濃縮物１００ｍ１当り乾燥重
量１２１および５６％の可溶性酵素を有するスラッジを
得た（破裂していない元のまゝの細胞が４４％）。

細胞濃縮物２０１を、緩衝剤を添加したｐＨ３，５の２
０Ｗ／Ｖ％酢酸水溶液で処理して濃縮物のｐＨを６．３
に低めた。

次いで、５０Ｗ／Ｗ％グルタルアルデヒド水溶液８００
ｍ１を添加し、混合物を徹底的に攪拌し、次いで２０℃
で４５分間放置してゲル化した。

このようにして生成させたゲル状物を脱イオン水４０１
に懸濁し、加圧式濾過機で濾過し、加圧式濾過機におい
て圧縮空気を用いて濾過ケーキに空気を通し過剰の空気
を除去した。

ある程度乾燥したケーキ（１１，６ｋｇ）を第１８号メ
ツシュを有する振動式造粒機で粒状化し、そして乾燥オ
ーブン中温度３５℃で乾燥させて、非常に堅い粒子２．
３に９を得た。

この粒子は４０Ｗ／Ｖグルコ一スシロツプ中６０℃で数
日間攪拌した後でさえもその物理的性質を保持していた
。

次いで、粒状の試料（８８−３００μの粒径範囲にある
）を、４０Ｗ／Ｖ％グルコース、０．１Ｗ／Ｖ％のＭｇ
ＳＯ４・７Ｈ２０および０．０１Ｗ／Ｖ％のＣｏＳＯ４
・７Ｈ２Ｏからなり且つｐＨ６，６の水性媒体中６５℃
で２０時間、攪拌して、同一条件下で試験した元の濃縮
物の噴霧乾燥粉末の６３％の見かけの活性を得た。

上記のようにして同じスラッジから製造した交叉結合フ
ィルターケーキを０．５ｍｍの網目寸法を有する軸方向
モノロール（Ｍｏｎｏｒｏｌｌ）押出機によって押出し
そして入口空気温度６０℃の流動床中で乾燥させて非常
に狭い粒径分布を有する円筒状の形をした粒子を得た。

上記の通りに試験した場合上記粒子は噴霧乾燥対照粉末
に比較して５２％の見かけの活性を示した。

いくらかの同じ細胞濃縮物をグルタルアルデヒドとｐＨ
６，３で混合して濃度１．２％としそして皿中に注ぎ、
その皿を空気を循環させた乾燥オーブン中５０℃の温度
に放置した。

得られるケーキを乳鉢中で磨砕し、上記の通り試験した
。

対照の噴霧乾燥粉末と比較して４８％の見かけの活性を
得た。

同じ細胞濃縮物１０１をマントン−ボウリン式均質器を
用いて４００気圧で均質化して可溶形の９５％以上の活
性の均質物を得た。

均質物１００ｍ１を２０Ｗ／Ｖ％グルタルアルデヒド溶
液５ｍｌと共にｐＨ６，８で２０分間攪拌し、表面上に
拡げて１ｃｍの層とし、温度２０℃で乾燥させそして乳
鉢中で磨砕して１１．６ｇの粒子を得た。

粒子を脱イオン水２００ｍ１中２０分間攪拌しそして乾
燥させて９．７ｇの堅い粒子を得た。

その堅い粒子を温度６５℃に維持したジャケットのつい
たカラムに充填しそして４０Ｗ／Ｖ％のグルコースおよ
び０．１Ｗ／Ｖ％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２ＯからなるｐＨ
７，８の供給物を４５ｍ１／時間で供給した。

４４時間後、変換率が４５．２％であることがわかった
。

実施例 ７ 濃縮物、凍結 グルコース異性化酵素含有バチルス・コアギユランスの
醗酵から得たプロス１０００１をウエストファリアＳＡ
ＭＳ１５０３７型分離機で１０℃で遠心分離して濃縮し
てスラッジ濃縮物１００ｍ１当り１２ｇの乾燥重量を含
有するスラッジを得た。

このスラッジを温度１５℃で８時間、ｐＨ７，２におい
て自己融解させた。

可溶性の酵素活性は８４％であることがわかった。

（破裂していない元のままの細胞が１６％） 自己溶融スラッジ濃縮物１０１を５℃に冷却し、５０Ｗ
／Ｖ％グルタルアルデヒド溶液３００ｍ１と共に徹底的
に混合し、皿の中に注ぎそして温度−２０℃に置いて凍
結させた。

凍結が完了した後、凍結した濃縮物を温度２０℃で解か
し、形成したスポンジ状塊状物を脱イオン水２０１に分
散し、粗い濾布を備えた液形遠心分離機で濾過し、７メ
ツシユの網目を有する振動式造粒機中で粒状化しそして
空気入口温度６０℃で流動床乾燥機中で乾燥させ、繊維
状の多孔性粒状物を得た。

粒状物（８８−３００μの粒径範囲にある）試料を、次
いで、４０Ｗ／Ｖ％のグルコース、０．２Ｗ／Ｖ％のＭ
ｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび０．０１Ｗ／Ｖ％のＣ０ＳＯ
４・７Ｈ２Ｏからなり且つｐＨ６，６の水性媒体中、温
度６５℃で２０時間攪拌して同一条件下に試験した元の
濃縮物の噴霧乾燥粉末の７９％の見かけの活性を得た。

乾燥工程を省略したこと以外は、上記の通り製造した粒
状物は硬さにおいて劣っていたが未だかなり堅かった。

その粒状物は８１％の見かけの活性を示した。

実施例 ８ 異なる酵素濃縮物 ９５％以上の可溶性酵素を有する実施例６の均質物者１
００ｍ１３部分を次の通りに処理した＝（ａ）２０Ｗ／
Ｖ％のグルタルアルデヒド１０−とｐＨ６，８において
混合した、 （ｂ）先ず脱イオン水１００ｍで希釈したこと以外は（
ａ）の通り処理した、 （ｃ）先ず脱イオン水２００−で希釈したこと以外は（
ａ）の通りに処理した。

全てを温度−１８℃で凍結し、次いで温度２０℃で凍結
を解かし、各々形成したスポンジ状物質を脱イオン水３
００ｍ１に分散させ、濾過し、温度２０℃で乾燥させそ
して粒状化した。

次いで、２０時間後に、各々の５ｇをジャケットのつい
たカラム中６５℃、ｐＨ７，８で、０．１Ｗ／Ｖ％のＭ
ｇＳＯ４・７Ｈ２０および０．０１Ｗ／Ｖ％（７）ＣＯ
８Ｏ４・７Ｈ２Ｏを含有する４０Ｗ／Ｖグルコース溶液
を３０ｍ１／時間の流速で試験をした。

次の結果が得られた： 変換率（％） （ａ） ４６．４ （ｂ） ４５．８ （ｃ） ４７．４ 実施例 ９ 異なる細胞破裂度間の比較 濃縮物（細胞破裂度６０％）および均質物（９５％以上
の細胞破裂度）を実施例６に記載の通りに製造した。

次いで、各々の２００−と５０Ｗ／Ｗ％グルタルアルデ
ヒド溶液８ｍｌとを２０分間混合し、温度−２０℃で凍
結し、温度２０℃で解かしそして、形成したスポンジ状
生成物を押しつぶし、砕き、脱イオン水１１中で２０分
間撹拌し、ブフナー漏斗上で濾過し、濾過器上で加圧し
、脱イオン水１１中で再度分散させ、再度濾過し、温度
２０℃で乾燥させ、そして粒状化した。

各粒状物５ｇを実施例６で記載した通りのカラム中、３
０ｍ１／時間の流速で試験し、２０時間後に、次の結果
が得られた。

変換率（％） 濃縮物 ４０．０ 均質物 ４５．１ 実験の後、堅さを検査すると、濃縮物の粒子は軟かくな
ることがわかり、一方均質物の粒子は堅かった。

実質的に破裂していないアルテロバクター（Ａｒｔｈｒ
ｏｂａｃｔｅｒ）Ｂ３７２６の細胞を同じ方法で処理し
たが、安定な形をした物体としてつくることができなか
ったので、満足な方法で非可動化することが不可能であ
ることがわかった。

実施例 １０ 異なる細胞破裂度間の比較 実施例６に記載の通りにして５６％の破裂度を有する濃
縮物「ａ」を製造しそしてその半分を、実施例６に記載
の通りにして９５％以上の破裂度を有する「ｂ」を製造
した。

次いで、各々の２００ｍ１を５０Ｗ／Ｗ％グルタルアル
デヒド溶液８ｍｌと２０分間混合し、温度−２０℃で凍
結させ、温度２０℃で溶かし、かくして形成したスポン
ジ状生成物を押しつぶし、砕き、脱イオン水１１中で２
０分間攪拌し、ブフナー漏斗で濾過し、濾過器上で加圧
し、脱イオン水１１中で再度分散させ、再度濾過し、温
度２０℃で乾燥させ、そして粒状化した。

各々の粒状物５ｇを実施例６に記載の通りにしてカラム
中で４０Ｗ／Ｗ％のグルコースを用いて、３０ｍ１／時
間の流速で試験し、２０時間後に次の結果を得た；変換
率（％） （ａ） ４０．９ （ｂ） ４５．１ 実験後その堅さを検査すると、（ａ）は軟かいことがわ
かり、一方（ｂ）は堅かった。

実施例 １１ グルタルアルデヒドの必要要件、濃縮物および均質物 実施例１０に記載の通りにして、但し異なるグルタルア
ルデヒド濃縮物を使用して濃縮物（５５％の細胞破裂度
）および均質物（９６％の細胞破裂度）から粒状物を製
造し、脱イオン水中温度６０℃で２０時間攪拌し、そし
て次の方法にしたがって堅さを検査した：すなわち、粒
状物を２本の指の間で出来るだけ硬く加圧しそしてその
結果を次の等級にしたがって表わしたニー 等級 詳 細 １ 完全に「ペースト状になった」 ２ 実質的な程度に「ペースト状になった」３ 少しの
程度だけ「ペースト状になった」４ 「ペースト状にな
らず」、堅い ５ 非常に堅い ６ 極めて堅い 工業的使用に適すると信じられる最初の堅さは３または
４であると考えられる。

上記粒状物については次の結果が得られた；実施例 １
２ 凍結を解かす効果 実施例６に記載の通りにして製造した５６％の可溶性酵
素を有する未均質化濃縮物を２つに分けた。

一方の半分を濃縮物１００ｍ１当り２０Ｗ／Ｗ％グルタ
ルアルデヒド溶液１０ｍ１と共にｐＨ６，８、温度３℃
で２分間攪拌し、エタノール／ドライアイス浴中で凍結
させ、温度２０℃で放置して解かし、脱イオン水中に分
散させ、ブフナー漏斗上で濾過し、濾過器上で加圧し、
そして温度２０℃で乾燥させた。

他の半分を、凍結を解かさずその代わりに凍結乾燥する
こと以外は、同様にして処理した。

次いで、各操作から得られた粒子５ｇを実施例６に記載
した通りに３０ｍ１／時間の流速を使用して試験した。

２０時間に次の結果が得られた；操 作
変換率（％） （ａ）凍結、凍結を解かす ３７．８（ｂ）凍結
乾燥 ３５．６実施例６に記載の通り
に製造した９５％以上の可溶性酵素を有する均質化した
濃縮物（２００ｍｌ）を同じ方法で処理し、次いで凍結
させそして凍結を解かして堅い粒子１９．１ｇを製造し
た。

この堅い粒子を試験すると、２４ｍ１／時間の供給速度
で２０時間後には４０Ｗ／Ｗ％グルコースシップの変換
率４２．４％を示した。

実施例 １３ 凍結状況 実施例１２に記載の通りに９３％の可溶性酵素を有する
均質化した濃縮物をグルタルアルデヒドと反応させ、次
いでエタノール／ドライアイス浴中攪拌しながら凍結さ
せ、次いで凍結を解かした。

得られた粒子は実施例１２にしたがってつくった比較し
うる均質粒子と類似していた。

類似の調製物が交叉結合混合物にドライアイスを添加す
ることによって凍結させた。

この混合は丁度数分で凍結した。

得られた粒子はあまり繊維状ではなく、より多孔性であ
った。

本発明の実施態様および関連事項を要約すれば次の通り
である。

１、破裂していない元のまゝの微生物細胞を０−７５％
含有し且つ乾燥物質含量３−３０重量／容量％を有する
少なくとも部分的に破裂している微生物細胞の細胞濃縮
物と該細胞濃縮物の乾燥物質含量の１重量部当り０．０
１−１．０重量部のグルタルアルデヒドとを反応させて
ゲル状生成物を形成させ、その抜水を除去しそして酵素
的且つ物理的に安定な水不溶性グルコース異性化酵素生
成物を成形することを特徴とする、グルコース異性化酵
素活性を示す微生物細胞から酵素的且つ物理的に安定な
水不溶性グルコース異性化酵素生成物の製造法。

２、微生物細胞がグラム陽性菌細胞である上記１による
方法。

３、微生物細胞がバチルス種の醗酵生成物である上記１
による方法。

４、バチルス種がバチルス・コアギユランスである上記
３による方法。

５、細胞濃縮物が８−２０重量／容量％の範囲の乾燥物
質含量を有する上記１−４のいずれかによる方法。

６、細胞濃縮物が１０−１６重量／容量％の範囲の乾燥
物質含量を有する上記５による方法。

７、細胞濃縮物の乾燥物質１重量部当り０．０５−０．
３部のグルタルアルデヒドを使用する上記いずれかによ
る方法。

８、グルコース異性化酵素生成物を乾燥させて少なくと
も８０重量％の乾燥物質含量を得る上記いずれかによる
方法。

９、さらに、細胞濃縮物を自己融解することによって細
胞を破裂させる工程を含む上記いずれかによる方法。

１０、さらに、細胞濃縮物を均質化することによって細
胞を破裂させる工程を含む上記１−８のいずれかによる
方法。

１１、水の除去および成形することがゲル状生成物を水
で洗浄し、洗浄した生成物を濾過し、粒状化し、次いで
乾燥して少なくとも８０重量％の乾燥物質含量を得るこ
とからなる上記いずれかによる方法。

１２、粒状化を押出にしたがって行なう上記１１による
方法。

１３、細胞濃縮物が凝集される上記いずれかによる方法
。

１４、凝集化グルタルアルデヒド固体生成物を洗浄し、
濾過し、粒状化しそして乾燥させ、その洗浄、濾過、粒
状化および乾燥が水を除去しそして反応生成物を成形す
ることに役立つ上記１〜１０のいずれか、および上記１
３による方法。

１５．ゲル状生成物を凍結し、次いで水の除去および成
形する前に凍結を解かす上記いずれかによる方法。

１６、凍結し、次いで凍結を解かした生成物を水の除去
の前に洗浄する上記１５による方法。

１７、破裂していない元のまゝの微生物細胞を０−７５
％含有し且つ乾燥物質含量３−３０重量／容量％を有す
る少なくとも部分的に破裂している微生物細胞の細胞濃
縮物と該細胞濃縮物の乾燥物質含量の１重量部当り０．
０１−１．０重量部のグルタルアルデヒドとを反応させ
てゲル状生成物を形成させ、その抜水を除去しそして酵
素的且つ物理的に安定な水不溶性グリコース異性化酵素
生成物を成形することによって製造した、グルコース異
性化酵素活性を示す微生物細胞から酵素的且つ物理的に
安定な水不溶性グルコース異性化酵素生成物。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の詳細な説明する図式図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 破裂していない元のま５の微生物細胞を０−７５％
   含有し且つ乾燥物質含量３−３０重量／容量％を有する
   少なくとも部分的に破裂している微生物細胞の細胞濃縮
   物と該細胞濃縮物の乾燥物質含量の１重量部当り０．０
   １−１．０重量部のグルタルアルデヒドとを反応させて
   ゲル状生成物を形成させ、その抜水を除去しそして酵素
   的且つ物理的に安定な水不溶性グルコース異性化酵素生
   成物を成形することを特徴とする、グルコース異性化酵
   素活性を示す微生物細胞から酵素的且つ物理的に安定な
   水不溶性グルコース異性化酵素生成物の製造法。