JPS58500366A - 単一クロ−ン抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 単一クローン抗体 発明の分野 本発明はバイオテクノロジーの分野に対し、特に単一クローン抗体の血液型分類 試薬としての使用に関する。

発明の背景 脊椎動物の体内に異物（抗原物質）が入ると免疫反応が生じる。この免疫反応の 目的は、抗原物質が動物の体に損害を与えることを防ぎこのような抗原物質を体 から除去することである。免疫系は、抗原物質を選択的に１緻し抗原壷賞の籍定 の複数の部位に結合する骨性を有する免役／ロブダン分子（以優抗体と−う］を 生産することによってこの目的を達成する。これらの部位は決定基として知られ 、１つの抗原はこのような決定基を１な−し複数前することができる。免役系に よって産生された抗体はそれぞれ単一の決定基に対してのみ今異性を有してｉる が、抗体か産生される源となる抗原臀質か＊ａｆ）決定基を有して−る場合は複 数の異る抗体が産生される。

抗体の主な懺禮は、有１ｆｔＳ会を凝集することによってこの１買を除去する正 常な体の慎能を助け、これによって体を有害な異物から保噛する仁とである。

抗体による抗原−Ｗ＊の凝集は、血液型分類の分野では、体外にお−ても実用８ ９に杓用されている。

赤血球はその表面に多くの異る、かつ特色のある抗Ｈ決定基を有しており、これ らの決定基の性質にもとすき、血液をい（りかの１１（たとえばム、Ｓ、Ｏ。

ム１Ｂ、ム、ｌ、畠＊ｅｒｄ　）に分類する仁とかで１１４．血液供与者から皇 液値供与者への輸血ｊ’ｃｌｉしては検車される血液が皇Ｉ［Ｉ［供与者の血液 と同盟であることが必要である。もシ同皇でなりと、血＊ａ供与看の免役系は輸 血された赤血球の表向のなじみのなりｈ決定基に対して抗体を生成する。外米の 赤皇ＲＫ対するこのような抗体の反応は血液型合！ＩＡ技術の基礎をなすもので ある。

広−意味では、血液試料の分電は、その試料の厘の赤血球の表ＩｉＫある複数の 決定基に対する抗血清を添加したと自に生じる賦書中の赤血球の＃！栗等を検出 することに依存する。ａ１県は内置で容易に見られまたは機械で１論的に検出が 可能な巨視的な効果である。

従来血液１分ｍ試薬の主ｌｌＩな供給源は被術者（ｈ賎ａ１ＨｂＪ＠ａ％）の趙 免役化（ｋｙｐ＠ｒ１閣−ｔｉｓａｔｉａｍ　）による−のであった、ＣれはＩ Ｉ誓者の血液型と異る盤の血清を致死１ｋＫ至らなｉ相当量だけ豪術者の体内に 入れることによって行われる。これは正′Ｎな免役反応を生起し、七の結果Ｉ［ 誓書の血液中に抗体か産生される０次ｉでこの車載の試料をと９．それから抗体 ｌｌｃ薬を作る。このような試薬は、未知の血液試料か竣［Ｋ人体血清供ｔ１ｍ ａｔｌ・ｍ）を生じるので、未知の血液試料の分類に使用することかできる。

実−には、２つの壁の血液型分類テストが行われて−る（エフ％メンスフオーｒ およびシー、Ａ９ダー「血１ｇｌ１１分譲技膚」第２版１９６７年）、纂１の型 のテストでは、まず分類すべき血液の試料を血液型分類タイル（ｂｌｅｅｄ　ｇ ｒａｓｐｉｎｇ　ｔ１１＊　）上に＠せる（英ｉｉ１薬局方、「Ａｌ１ｏ供与考 の決定」の項参雇）０次に仁の血液試料をタイル上で抗血清試料と混合する。そ の優凝果か起れば、それは分類すべき血液の未知試料か抗血清か生成した血液型 と同型の血液Ｉｌ＃Ｃ属することを示すものである。実際にこのようなタイル凝 集分類テストは救急処置の場合に日常的に行われてｉる。

第２の鳳のテストに訃−ては、分類すべき血液試料を抗血清とともに試験管内で 生理食塩水中に置き標準時１１４（２時間）静置する。＃集の存在は標準時閣内 に生じた沈降によって［１１することができる。緊急な場合にはテストを促遵す るため遠心分離が行われる。

時定の血液型分＃ｉ＃ｃ！Ｉ＆の効き目はそれが凝集体（ａｇ−ｇｌｍｔｉｍａ ｍｔ　）を生成する速ｊ［ｊ！−よびその−巣素（ｍｇｇ−１＠ｔｉｍ１ｍ　） としての話力と一度との比例の仕方とによって刊斯される。

これらの基準中前省はこの分野にお−て通ｘ　ｒｉｉ合活注」と呼ばれている。

４！ｌ定の血液型分譲試薬の結合活性時開は血液試料を試薬と１合してから試料 の４鐵しうる凝集か起る時宜″′Ｃに費する時間として定義される。

血液型分類試薬の希釈骨性を決定するため、生１食塩水参警凝集力儒を一定する 。この一定には、試験すべ龜皇液Ｉ分儂試薬の生理食塩水２倍希釈爵液を等量ず つ複数員豊する０次−で各希釈浴液に既知の量の適当な赤血球懸濁液を加える。

この場合すべての希釈導液＃ＩＣ同量の懸濁液を肩える。各希釈導液試料を標準 時間（通常２時間）静置し、その時閣鏝過優願黴偶下でＩｌｉ集カタカクン（ａ ｇｇｌｓｔ１ｍａｔｌ＊ｍ　ＳＥＡＭＳ　）を行う、相鳴量の凝集が生じる最大 希釈の試料を決定し、この希釈を［生理食塩水番業凝集力価Ｊ　（ｓａｌ１ｍ＊ 　ａｇｇｌｓ＋ｔ１ｍｍ−１ｌ＠ｎ　ｔ口ｒ・）と名＋ｆける。したがって、高 −生理食塩水中卓１集カーを有する試薬は強力な＃集票である。

１＋ｎｌｌの趨免疫化の技術を用−ることにより赤血球決定基に対する抗体を産 生ずる場合は２つの問題が生じる。第一に、血清は供＃に限界があり、現在大き な外科手償のひん度が増大するにりれて血液型分類の必要性が着るしくＡまって −る。このため他の医療上の用途に％ｌ！ｐＨな人体血清の供給かひっ迫して− る。その”上、自然に生成した赤血球に対する抗体の凝集効果はある４！ばらつ きを生じる塙同が心る。その理由の一つを裏、免役応答は、各構成抗体が上記の ように各々か一つの決定４に対して奇禍的作用４を有する複数の抗体の「カクテ ル」（混合窃）を生じさぜる、と−うことである、ｃ、のカクテルの中の各機抗 体を分離することはできな−ので、従来の抗血清はＩＩａの杭体の混合物を含み 、この混合物は鋤−によって異る（さらに−樵の麹物内にお−て−１また日によ っても）、同一の血液型のすべての赤血球につ−て同一の決定基のセットが存在 することがないので、免役応答は多くの場合非常Ｋまちまちである。

豐約すると、血液置分頌に過当な試薬は次の条件を備えてｖｈなければならな− 。

１）　ｊｌｍな！Ｉｃ臘に対し今異性を有すること。

２）比較ＢｇＫ弱−血液ｔＪ１に対し、日常の血液屋分類法によっても緊急時の 血液型分Ｊｌｆｆｉによっても、良好な巨視的反応を示すために充分に強力であ る仁と。

３）　使用−条件下にお−て安定であること。

４）比較的に安−で容易にλ手可艙であること。

最近の分子生物学の発達は、抗体を産生ずる牌繻胞とイエローマ１１４ｄ麿から 鑵檀−胞（ハイプリドーマ］を産生することによりＡｆＫ今異性を有する抗体を 生産する技術をＩＩ＆供した。コーラ−とミルスティンの東横で６るこの技１１ 　（ｍａｒ、　Ｊ、　Ｉ■ｓ＋ｎｏｌ　６２９２−２９５（Ｉｓ７ｓ　）、　Ｎ ａｔｕｒｅ　、２１ＪＬ」ｉ　４９５　−　４９７（１９７５）　、Ｅａｒ、　 Ｊ、　Ｉ＋ｗｎｔｏｌ　６５１１−５１９　（１９７６）参照】は、抗体のｊｌ ｌ限の供給量を生産する方法を提供するものである。抗体な産生する鑵８１＃Ｉ Ｉｌ＠はただ１橿の免役グロブリン分子、即ち−クの決定基に対し′＃異性を有 する免役グープリンのみを産生ずるので％産生された抗体は単一クローン抗体と 命名されて−る。鑵橿噛麿は（エローマａ龜とす／Ａ１麿の２つの望まし一脣黴 な結合する。即ち電工ａ−−ｆｊｌｌ麿は不死の性質な有し試験管の中で目己債 擬することができる一方９７Ａ−１は抗体を表現する孟ましめ特性を有する。し たかって、このような鑵６１ｓ扇は、純粋で明確な免役グロブリンの恒久的な供 給線でみる。鑵橿＃１１胞を産生するために使用される方法は、通常マウスに適 １な抗原で免疫を与え、免疫反応か起るのに充分なｄ＃閣をかけた嫌マクスを犠 牲にしてその綽繊を環９出すことである０次−で牌城からｌ１ｌｌ麿懸濁液を作 り、この懸濁液をマウスのンエローマｍ胞の一滴液と１合する。これら２樵嬌の ａｉｕｉの融合を促進するためＫｌｖエチレンダリコールを用−る仁とかできる 。その結果１つの’ｊ７Ａｉａｍから得られる＾イプリドーマ培盪ｍ体はｌ橿讃 の抗体即ち１つの特定の決定基（対し特異的な抗体を産生ずるこの技誓はボーク 等によってム型亦血潔の決足Ｓに対する単一クローン抗体を産生ずるために使用 され（−Ｖｅｘ　８ａｎｇｓ＋１ｍム（ｌ　１３４−１４０　（１９８０））、 このような単一クローン抗ム抗％　（ｍ＠ｍｏ＠１＠ｎａｌ　ａｉｉｔｌ　−ム １）は有益な皇液型分電賦薬であることが示されてｉる。

しかしながら、今までは、マウスなヒトのＢｌｌＡ球で免疫化してもイエローマ ｌ１４Ｊｌｌと融合して抗烏兎疫！ロブリンを作るバイブ９Ｆ”−ｆｆＪｉｉｌ 砲を形成しうるような屏ｌｌ１ｌｌ１１はできなｎ％のと一紋に考えられて−た 。

われわれは、罵くべ龜ことに、実際にはそうではなく、融合は容易＃Ｃ４られ、 その耐釆単−！ローン抗Ｓ抗体を高能軍で表現するハイプリドーマ＃扇を形成す ることにより、有益な生理食塩水凝集カー特性を有する高結合活性の脅異的皇液 舗分＠試礪を生産することができることを発見した。さらに、尚該単一クローン 抗Ｂ抗体とｌ！！１厘球の閾に形成される免疫複合体に関する平衡定数と解蟻逮 度定叙とを足義できることが判った。従来知られて％ｆｈに血液型分類試薬は異 る％異性を有する免役グロブリンの混合物を含むものであったから従来は血液型 分！ｌＩ試薬と赤血球の閥に形成された免疫複合体の力のこのような定量分析は 不ａＴ＄１！であった。したかって従来達成できた蟻善の故事でも槽々平均ＩＩ ＩＫすぎなかった。

ＡＪμＡ」 本発明によれｄ％Ｂ型血球の抗凍決足基に対し特異性を奪する率−クローン抗体 か提供される。

＊＠ｍ＊ｔｆｃお−ては、Ｂ菫血球はＢ型血球上にのみ見出される１以上の抗ぷ 決定基を有するすべての赤血球を含む−のとする。このような決定基をＭする血 液型の例はＢ、ム、Ｂ、ム２ＢおよびＢ６゜１．である。

単一クローン抗体はマウス、ＩｇＭ、単一クローン抗１免疫グログ啼ンでｈるこ とかＷｌましｉ。

単一クローン抗体は＃ｉ記の決定基を有する勝星血液の試料ｔａ果さゼ４能力な 有するものである仁とか望まし−、単−クローン抗体とｌ麿皇球との閾の相互作 用の平衡定数か１．３Ｘ１０　Ｍ　より大Ｉ−単−クローン抗体、骨にこの平向 定数が１．２Ｘ１ＧＭ　より大き一単一クローン抗体の場合には特に有益な上記 の特性が得られることが判った０本明細臀におｉて言及する平衡定数の価はファ ンククヨナルアフイニディ−（ｆｍ壷ｔｌｅｍｌ　ａｆｆｌｍｉｔｉ・Ｓ）＃ち 多価の抗体（ＩｇＭ）と赤血球との閾の相互作用について行われる醐定値である 。

この点で、この偵は１価の抗体（ＩｇＧ）と抗原との閾の相互作用につ−て慢ら れるインドダン７ツタアフイニデイー（１ｍｔｒ１ａｓｌ＠ａｆｆ１ｎ口１・烏 ）とは異る。インドダンシックアフィニティーは７ア／タシヨナルアフイエテイ ーと１１畳比較することはできなめ０本発明の単一クローン抗体について計算し うる蹟愉は使用される償定法に−従う−のであって、単一クローン抗体の待機ず けに関する以下の紀ａにおｉて拌−に巡べ０ることにする・ 本発明の慣の特徴は、単一クローン抗体が、尚該抗体と血液！ＢＩＦ）ＩＩ盤血 球とを含む免疫複合体の解離反応の速度足故が２．２Ｘ１０　−・電　より小さ く、望ましくは７．６Ｘ１０　ｓ＠ｅ　より小６１のであることである。

本発明の倫の骨倣は、単一クローン抗体が、轟咳抗体と皇液型ム１１ｆ）１型車 球を含む免疫複合体のＳ噛反応の速度定款が５．０Ｘ１０−”−會・−１より小 さく、ｉｉましくは３．４Ｘ１０””ｓ・・−１より小さ−ものであることであ る。

本ｗＡｍ　４１　Ｋ　ｓｐ　ｖｈてぎ及する鱗蟻定叙の直は上記のと１ｉＰ９７ アンクシヨナルアフイニデイーテアル。

本発明は、さらに％マウスｔｃｓａｗ賞を注射し、このマクスを犠牲にし、その ｊＩＦ城を填９出ＬＮｊｌ胞の懸濁液を形成し、このＦＩＩＩＴ／５ＪＩＫをマ ウスのイエロー−Ｖ粛砲と一合して鑵橿ｉａ胞を杉成し、該一槽１胞をクローン 化し、該クローン化した鑵檀−ｍＫ単−クローン抗体を分易させるよう和した単 一クローン抗体の産生方法を提供する。

肩記鑵橿ａｈａはクローン化の＠ＶＣ選択されることが望まし−。

鵠ｆｆ１ｔ　！　Ｏ−−ｖｍｇｔｔｓ　８１　＋１４［”ｔ’あ４Ｃと＄望まし −、さらに、本発明は、上記の方法によって雄牛された単一クローン抗体、該単 一クローン抗体を分泌することができるハイプリドー−ｒ＠扇および該単−りａ −”ン抗体を含む血液型分類試薬を包含するものである。

図面の簡単な説明 第１図はｌ４ｉ１纜抗Ｂ抗体と烏瑠赤慮球の平角結合を示す図で奉る。

第２図は　Ｉ４１ｉ＃ａ抗Ｂ抗体と８皇赤血球の千両結合を示す修正スカツチャ ーＦｌ　（８＠ｙａｔ＊ｋａｒｄ　ｐｌｏｔ　）である。

ＩＩ３■は４℃訃よびｍｆｉＫおけるＢｉｔ赤皇球からの１う４ル抗１抗体の解 層遍度を示すｒｅある。

第４ａ！Ｊは室温における２　Ｘ　１０＠赤血球またはム、Ｓ赤血球からのＸ４ ＩＲ抗３抗体の解噛逮直な示す図である。

＾　プダドー！−のｌＩ！にクーての一般的説明！Ｉｃ榎抗体（ａｍ＊１−５ｐ ｅｅｊ＊ａ　ａｍｔｊｂｅｓｌｙ）を取出すためＯ１ｌ皇球で吸収した優血清試 料を抗ｌ活性につｉて慣定することにより過歯なマウスを見出した。吸ｌ１Ｌｆ ｌｋの抗Ｂ＃巣力価ｌ：８のマウスに対し完全フロイントアジｓ−Ａ；／　）　 （Ｄｌｆ＊＠Ｉｌａ＠ｔ＋ｅ　）　０．１　ｍＬ中のＩｌｌ物質１００ＰＩＰを ｍｔｓＰｇＫ注射した。Ｓ遍関優同じ操作を繰返し、さら［９週＠ｆＩｅｌＩＩ Ｊ１物質の０．１１１生理食塩水水尋液２Ｇ０７ＩＪＰを静脈注射により追加投 与した。３日後＃Ｃ騨城を填り出し牌ｌ１ｌＩ砲曽濁液を講壷した。

胛ｊｌｌ砲（１Ｇ）をＩリエチレンダダコールを便って（コツト７曲Ｋｓｒ、Ｊ 、Ｉ■−ｍｇ１３１３５−１４０　（１９７３人ダ°ノス７オードおよびノウリ −（上褐）、ガルツレ他Ｎａｔｕｒｅ　２二６６　５５Ｇ　−５５２（１９７７ ））＠成長する鑵櫨ｊａｍをその時定の抗Ｂ活注慮生胤力によって選択した。こ れはヒトのム、Ｂ％Ｏ＃血球を用いる凌３１１膚定によって培養上清中Ｗｃ′ｆ ！Ｉｌ出された。抗Ｂ分ｇｌｌＩｉ徨−１は軟寒天培地上で２回！−−ン化し、 蟻ｌ１１８ｇに５慢マ／マ　の子牛１児の血清（Ｆｅ２．８ａｒｓ　−Ｌ息ｂ） を補光したが二ルベツコ、毫ディファイＦ、（−１ルス、建ディアム（Ｄｓｌｂ ＊＊ｏＪ　＠　Ｍａｄ目１＊ｄ　Ｉａｇｌ＠’　ｓ　Ｍｅｄｉａｍ（ＤＭＩ！： Ｍ、Ｇｌｋｍ＠組５ａｌｔ　）　）　中のスピナ培−Ｊｌ　（５ｔ−ｊａｉｈ・ ｒ　−ｓｏｌ龜柵ｒｅ−ン１リットルに培Ｊした。り鑓−）化したｍ櫨肩胞は液 体窒息中に貯蔵した。

ルターで一過し、１０ｍＭｆ）ｆｌＫＰｆｆｉ８１１備液、？、０．１暢アジ化 ナトリクムを添加することによって単一クローン抗体を含むｌ１１威培聾上清を Ａ奎した。各Ａツチの７リプートを日常の使用のために４℃を貯蔵し、かつ貯蔵 用として一２０℃で貯蔵した。

鑵攬ＩＩＡ胞のＡ壷に使用する材料と方法につめての詳細マウスとラット Ｂ１０．ＢＲ，Ｃ３Ｈ／Ｈａ−ｍｇその他のマウスをｊＩｌ！初オーエルエイン ー１９７６リイテツド（０ＬＡＣ，１９７６Ｌｔｄ）（英ｋｉｉ　Ｂｉ＠＊ｓｔ ＠ｒ）から優、久いで０ＬＡＣマクスから育生Ｌｒメゾ（＊ル、ｖｆ−？、カ’ ）　ン？　＃　＊　（Ｍ＊ｄ１ｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃ＊ａｍｅｌｌ　５ｔ ｏｅｋｓ　）から潜た・」１マウスはＡ／ティング（Ｂａｍｔｌｎｇ　）および キンｌマン（Ｋｌｍｇ−ｗａ＊ｍ　）　（英１．ＩｉＹ＠ｒｋ）から得た＊　（ Ｃ３ＨＸ　ＢＡＬＢ　／　Ｃ）Ｆ＊ｉウスおよびＬ＊ａ、Ｄ＾、ムロラットはメ ディカル、すす−チ、カラ／シル動物舎で育生した。ウィスター（Ｗｌ＠ｔａｒ ）　、　ｐｖｏ　、ＷＡＧおよびスプレイダｒ−ツー（８ｐｒａｇｍｓ　−Ｄａ ｖｌ＠ｙ）ラットはＡノテイン！シよびキンｌマンから慢た。　ＥＩＩ［および 免役用のマウスは生後６〜８週関の−のであった。

免疫化 イ（使用　るヒトｉｔｉＪ１ｍ貞 ダプリエ、ワトキンス博士（りνニカル、リサーチ、センター、英１ハロー）は フェノール（９５鴫）Ｋ不溶、１ｌｌｌｌアン七ニクム（Ｚｏｏ憾）Ｋ不辱、エ タノール（４５〜５５憾）Ｋ不溶、かつ水（可１１！な、モー！ｙ法（１９６５ 年）Ｋよって優られる凍結乾燥した卵巣嚢（・マａｒｌａｍ　＠ｙ亀ｔ）液の抽 出物であるヒト■Ｌおよびム型）物質を提供した。これらは炭水化物８０〜８５ 鳴（′Ｌ、−ダルコース、０−１ラクト一ス％Ｎ−アセチルーＤ−フルコナンン 、Ｎ−アセチル−〇−ブックトースン、アミノ＃！１５〜２０１６Ｌ主としてＬ −スレオニｙ、１．−−に９ｙ、Ｌ−ゾａｖｙ）ｈよＣＦ’／７ｋｒｌ１１−璽 りとし、−２０℃で貯蔵した。

・　フロ　／ドア？ユＡント　ＣＦＡ）甲でのＢｆＪ１吻質工マルシ゛ヨンり１ 壷 ０．９憾生理負塩水中の２Ｎｆ／鳳を纜藏のＢ櫨智貞ｌ＋ａ４をＣＦＡ（Ｄ１ｆ ｓ＋ｅ　Ｋｌｍｇｔｏ、即ちＢａｙｅｌＦ、油およびｉンニットオレインｉ１１ ！抗剤の混合−でＢａ砿−（Ｍｙ＊ｅ−ｂａＩｔ＠ｒ１ｍｍ　ｌａｂ＠ｒｅｗｌ ｅｓｉｓ）を含有する混合書）ＩＷｒｔＫ皐加した。混合物を２方向タツプで直 角に遅緒した２儒のＳａｔ注射湯中で強く攪拌しく英１チャンス、ワーダー）、 白−クダーム拭書買ｉｌＬ屡成される！で（ｌＧ分〜２０分肯）＠欠円に氷で冷 却した。このタリー五伏虐賞は水上＃ＣＣ上下て一拭歓りなかった・ＣＦＡは％ ／−ｈ筐Ｉｅ＃Ｃ最夷の免役応答補助哨の一つである（ボン７オー）”１９８０ 年参１１ｋ）、肉芽腫が形成されることがあるのでＪ％なった場虐でＭＡＬ注射 を行った。

スケ　エール １鳴なマクスを見出すため、免役化してＶｓｔｉマウスの尾から採血し、抗檜抗 体を除去するため０星赤處球で徴収を行った鏝、皇清を１１赤朧球で試験管凝集 により横定した。

高ｉ抗慕力偵を有する先優６〜８週間のメスの３１１０゜１鼠　マウスおよびＣ ３Ｈ／Ｉ（・−ｍｇ！ウスに対し久の３つの調剤の１つを履−内に注射した。ｊ ｌｌＩらＣＦＡ０．１菖を中のＢ１１１１Ｉ貞Ｉ　Ｇｏ　１１１１．　ＣＦＡ　 Ｏ、Ｉｌｌ中の１型物貞ｌＯ声？、またはＡツタしたＢ城赤血球（４−洗浄］０ ．１富ｔの−ずれか１つでめる。２４閾優マウスの尾から採°血を行った。

高いｍ渭カ歯な有する８１Ｇ、ＢＲマウスに対し５週間ごとにＢ１１１書ｊｌｊ １０Ｇ声？もしくはｉｏ声ｔの腹−注射を諜返し行うか、また・工戚初の注射の 酸３過１４酸、４過閾俄シよび５週閲渣に亦鳳球０．１ｔ４ｔ−繰返し注射した 。最嫌の注射畿１遍閲嫌、３週Ｍ畿および６遍閥畿にマウスの尾から採血した。

朧清の４Ｌ渠 マウス尾部からの採血ｏ、ｓｍｚ・を合成樹１１１貞チエーグに収果し、３７℃ で１ｗ＃閣靜置装置凝塊とし、この凝塊の収舗を助けるためデエープから解放し た０分離した朧清を０．９憾生理食塩水で希釈し、５６℃の水浴中で２０分閣僚 温し、必Ｉ！に応じＯ朧球または人□血球で吸　、収した。アダコートを一２０ ℃で貯蔵した。

血液ｊｌｌＫ対する単一クローン抗体の１優この段階での処理の一紋的アウドラ インは所望の反応性を有する単一クローン抗体を産生ずるためのコーラ−と建ル ステインによって書かれた基本ｊ［！ｌ（上記参考文献参照）に従う。

胛　ａｌｌ　と４中ｆンチン　ダアニＺ　本ス本すボンル　トランス７エラーぜ （ｍｌＰト丁ａｓ＠）　＋マー 峙異的ｘｇ　＋マ會 末端で分化（ｔ＠ｒｍｉｌＩａｌｌｙ　＃１ｆｆ＠ｒ＠ｍｔ−鳳ａｔ・ｄ　） ′ン工Ｅ”−ｆｆｄｉｆｉＨＧＰＩＴａｓ＊　−Ｖ＠籍Ａａ９Ｉｇ　−マ・ 不死 １１１撞４＠　５）ｉ　）ｉＧＰＲＴａｓｅ　＋　ｗｅ脣異のＩｇ　＋マ・ 不死 融合されなＶｓｉ工ａ−マ秦麿はＢＩＪＰＲＴ＊＊＊を欠損してお９、したかっ て選択された媒体中では死んでＬ筐う（Ｖ）６フイー＃　Ｆ、ｌ＊１＊ｍ＊＊　 １４！Ｓ、７０９−７１０゜１９６４年）、ｔ’に融合されｚｈ＊ａｔｓは岨執 培養中で生８ｆｉることができない、屏幽胞とミニローツー麿の雑種細胞のみが １ｌＧＰＲＴ畠ｌと不死性をとｔに博えており、したかって生き残ることができ る。そこで所要の特異性を有する抗体を分必するＪＩＩ砲を選択することかでき る。Ｊ４１ち、鑵橿−麿は両方の鷹鑵虐のそれぞれの長所を備えて−る。

株導液 ５０暢Ｉリエチレン／リコール（Ｐ、ｌＧ、）Ｉｌｌ液１０　ＰＩＦ）ＰＪ、Ｇ 、１５００（１ｌＤｉｌＬ・＊　＠５７３３７０　）を高圧ｍ１ｌＬ、直ちに４ ５℃の水浴に移した険３７℃で直騙を１０　ＴＩＬＬ龜加した。

アゝノ！ニリン　１０００ＪＣ アンノグデリノ（シダマンをわずか＃Ｃ緩めたｏ、　ｏｏｓＭＮｓＯＭ中でｏ、 ｌｒｔｓｍｙ／＊ｔ　ｔｃｔｔｘ解し、−２０℃で暗虐中に貯蔵した。

Ｈ？株１ＧＧ！ ヒＩキすンテン（タダマ）１３６．１１１ｊ’とデミジン（ｔｈｙｎａｉｄ１ｍ ＠）　３８．７５凰ｔをＤＩＭ　１００　ｍｌ中にふっとうにより溶解し一２０ ｔ：　で５ｏｆｔアリコートとして貯蔵した。

６０ｍＬ　Ｄ麓鳶誠 ５６５ｍ１　ｌｆｆ１ＯＯ！ 関笹したＳ＊は一過しく（Ｉｌｌ、Ｉ１７、孔の大会１０．２！ｐ諺）−！Ｏ℃ で１３鴇Ｌアダーートとして貯蔵した。Ｓａｒｍを６０〜７０℃で加熱して再尋 解した。

１１ＡＴ媒体５Ｇ！ ＤＭＩＩＩＪＩ　４５　ｖｎ　Ｌ ＢＴｌｏｏＸ　ＳＯＮｔ ＤＭＥＭ　４００１１ｔ ＰＣＩ（Ｊｙ？９０１１１２３　１００ｍＡＰ／１１　８寛ｔ グルタミノ　Ｓａｔ ピＶｔジン（Ｐｙｒ）　６ｗｒ１ ｉＩＡ’ｒ　４体５Ｇ！　１０．６１１４（１，０ｘｌＯ−’Ｍ　ｅ　ｄキｆ　 ン？　７．４．０Ｘ１０−’ｉｌｌアζノブゾリン、１．６Ｘ１０−−チンジン ］２Ｇ１１１ＦＣＢ−ＤＭＭ中ノＩＩＩＴ　（ＨＴｍ体）　ＩＸ上ｃノ、ｉｉｅ ｗ流やＨＡＴ　５０　ＸをＨＴ５Ｇ！１０．６１１４で直ｒ遺えた。Ｃたかつて 久の用語を便う。

ＭｆｆＤ剥１ｇＭ　（ｓｅｒｗｍ　ｆ　ｒ＋＋＋ｅ　ＤＭＩＭ　）　ｘ　Ｄ＆ｌ ＥＭ＋Ｐ８　＋Ｉシレタミ／＋ピリンジノ ２０　暢ｌＰｃ１ｉ　−ＤＭｇＭ　−黒ａｌｆＤＭｇＭ　＋　２０　優ＦＣ８１ １ＡＴ媒体冨２０暢ＦＣ８−庫腹＋ムＴＷｒ感体−ｔｏ　ｓｒｃｓ−ｍ＋ｌｆｆ １建エローマ横１の生　期 コーラ−等虻よって配遣された方法に従って１處―合を行った（上記文献参照） 、準備として、次のａｍ体を空気中の５憾ｃｏ８雰ｌ気で３７℃で一晩かけて平 ＊さぜた。

１）５０暢Ｐ昶尋液 ２）　無皇清庫膓 ３）　２０１ＦＣＩｌ−ＤＭｋ 上記感体は４８の１　ｙ　／　ａ　−９ニル（Ｌｌｍｂｒｅ　ｖａｌｌ）に分配 されたｊｍｓｓｊＴ￥コートを含む。

一合を行う日の朝、ＵＳを無ｌｌＩ吠霧で填出し、ｌ１ｌＩ自を無血清Ｄ１ｇ１ ｇ　ｌ　Ｑ　ｍｌ、中に縮分して入れ、次−で１０重を遠心管に移した。Ｉａａ ｌＩＡを沈降させるため５〜１０分時閾をかけ、次−で麺ＩＩＩＩｊｌｌｌｊｉ ｉをビ（ットで礒出し無血溜直腹中で２［洗浄した。１１ｍ１の膵−から１．４ Ｘ１Ｇ”の−濁ｌｌ１ＩＩ麿が優られた。これらの爾扇の中１０”　は５〜１０ １１４１ｊ）ＪｌｌＪｌ＆Ｗ　中で採果された。同時に、スピナ培養中で２．６ Ｘ１０／１ｌｌｒｔで培養した１０ミエローマＮ８１−麿を２度洗浄し無産＃　 ＤＭＩＭ　５藁を中に再麺漕ｒし＝。

騨＃ａ（１０）とイエローマａ胞（１０）を含む媒体を５０ｗｒＬコーニノダ′ ｔＩＫ貯え、４００Ｐで５分間室温で遠心分離することによってｊＭｌ胞を沈慮 させ、久−でアスピレータＩンプ付属パスツールピペットを使って媒体をで自る ｆｉｅｋｔ完＊にアスピレートした。管を３７℃の水の入ったビーカー中に支持 し、５０憾ｐ加ｓ＊（３７℃で平向さぜたｔの）１　ｍｌを１分間にわたりゆっ くりと添加した最さらに１分間この添加に用−たピペットの端で静かに攪拌した ０次ｉで！１ｉＰＩＩ液に対し無血Ｉ　ＤＭｇＭ　（３７℃で平向させたもの） を最初２分間は毎分１寓ｔ１次の４分間は毎分２翼１０Ｈ合で１次に１０＋１ｔ を＃吠で％名らにその酸は自由に５０ａＬまでゆっくりとＩＩＩＪｌすることに よりｌ！濁液を希釈した。各添加ごとに管を靜かに攪拌した。遠心分離（４００ ＪＦで５分間）優、顧慮をｆＩＩ紀龜加添加−た２４１１１．ｔピペットで静か Ｋ　２０　憾ＰＣＢ−Ｄ１４ＸＭ　（平ＩＩ４させた％ＩＩ））２ＳｗｒＬ中に 注入することによりこの巷液中Ｋｉｉ濁させた０次−で２０憾ＦＣｊｉ　−ＤＭ Ｕｇ中の一合混合物を、予備させた２０嘔ＦＣ８−Ｄ爾冨１．５冨ｔを含む４８ のりングローウエル［０，５ｍｔア智コートとして分配した。

供ｍ−麿として、残りの胛−扇を希釈し、およそ４ＸＩＯ’／ウエルの一合で調 下することにより添加しヘス−で培養トレイを空気中ＣＯ，Ｓ僑、湿度４５暢の 雰１ｇＬ中で３７℃でインキュベートした。

°翌日（゛第１日ンおよびｊｓｊｍ１１１合畿第２日、第３日、８７日、１１１ １日に′４！！一層盪媒体の上半分を峨９除き（起９うるタロスコンタミネーシ ョンを避けるため各ウェルどとｌＩｃ８１Ｉ−のパスクールピペットを使った） 、空気中５慢ＣＯ□で平向さゼた４＃各菫のａＡＴ遇択選択（ダトに７４−ｋ　 Ｉ”１９６４年）”ｅｌｌｌ僕した。

鑵橿ａｍの成長および起９うる酵母■オたは微生物による汚染を横車するため培 養を毎Ｅｉｌｉ＊した。その際培養基をインキュベータの外に置（時間は極力短 かくするようにした。ａａ単層の成長か＊―成長に近くなった時（−麿融合優約 １４〜２１日、それは媒体が（フェノール）赤色から黄色に変色する時とほぼ同 時である）、培養上清をはじめて試験した（ム誠、ＩｌｌおよびＯＩｌ赤嵐球を 用−る凝集により］、その日１８１ピペットでａ麿を１ｌｌｓさぜ、１ｍＡの１ 麿噛浦液を１冨ｔ　Ｉ）ＭＡＴ　１１体く３７℃で子嚢させたもの）に移す仁と により陽性の培養を下部公債した。太の培ＩＩＫはｈ丁媒体を補充した。インキ ュベータの＆＃に対する安全対策として分割した層梼を別個のインキュベータで 成長さぜ、凝集により足期的に横走し、できるえけ早く１０　憾ＤＭ８０　ｋ含 むＦＣｇ中の液体Ｎ、中でｌ［＃した。陰性の１＠譬は媒体か黄色を呈したと′ ＠再横横車た。＃母−または倣生書による汚染に対しては、４５慢ｇｔＯＨを添 加した優５分＠培譬をアスピレートし、壁のウェルなｚｔｏｎ　で洗浄すること によって対処した。５１１養トレイ上の分割した感体なＮＫＩＬちにアスピレー トした。

−合ウエルの戚初の横ｆ犠４〜１０日畿に一代培養を今喫査し、陽性培養のアリ コー）を直結するかまたはクロー７化用にまわしだ。

抗罵分易鑵櫨纏龜の単一 コットｙ等によりて記這されたように（上記文献参照）１選択した培養からのｊ ｌｌＩａのタロー７化を軟寒天上で行った。Ｏ０會暢生暑食塩水中の１嘔寒天（ Ｄｌｆ・参ｌａ＠ｔ＠）　ＳＯｍＡ（４！ｉ℃）を［Ａ？−ＤＭＩＭ　２　Ｘ　 （２Ｘ　ＤＭＩＩＩ１１００＊ｔ＋Ｐ／１１４Ｎｔ＋ダルタ建ン４＠ｔ＋ピ窄ジ ン４１１１１４＋ＦＣ８７ＳＮｔ＋５０　ＸＨＡＴ　７．８１１４　）　（４５ １１：）Ｋ螢した。この寒天１合物を曾１ベト智鳳（真ン夕（Ｎ−―聰＠］）に 台皿１ＳＩＩＩＬずつピペットで注入し１層ＲｉｊＬ繊培養ｙ−ｆ内（ふたをと った状態で５分１１４１固させた後パスを入れたインキュベータ中で３０分間千 Ｉ１１さゼた。

ダンプローウェルで作った６　０３倍尋導液杯中の１ｉｓｊ＃）ｊｌｌｌｌ［Ｇ 、５暢寒天ＨＡ？　−ＤＭＩＭ　１　ｍｌを添加した。２富りの混合物をｓ＠ｔ 　した寒天上に均一に重ね、ＩＩ記と同１１に空気乾燥し、空気中５＊ＣＯ□の 雰−気中で３７℃でインキュベートした。

１４〜２０日畿、複数の分離した肉眼で見えるａｍコロニーが形成された。その 中の多くは単一の細胞から４長して＾た。これらのコロニーは―ｖｈＡスツール ピペットｋｆつて歳小奴のコロニー（ＡＮ１０〜２０）を含む皿から採鷹し、パ スを入れたインキュベータ中で平向させたＨＡＴ　−ＤＭ膓１鳳ｔを含むリンズ ローウェルＫｌＫえつけた。

培養成長のＪ＆ぷりナイ／ｋＫ促つ′Ｌ−岨ＩＪｋメＪ有無を検査し、培養を診 ′＠し、その中のある啄イ゛耳を液体Ｎ、中でＪＩＩ［ａＩした。久−で場嚢の 半分な等ＩｒのＢＴ感体に鵬次移して！、　Ａｌｌ；５Ｌｖｃ＆ｌ’！Ｏａｒｃ ｓ　園１１１　Ｋ４ｒｔ、これらの操〜に全体７５−６日かけることによって選 択り一一ンをシａかち引−した。

ａＩをｍ巡の方法で、たにし０．５（東大を含む２０暢ｔｃ８−　ＤＭＩＭ中で 、島タａ−〕化し？：、ｃうして２度すこと°を条件とＬ″ＣＣ遇択、：日ｔ！ Ｕ９Ｋｍ養の半量を１１１次１０１、Ｓ憾、２　、５１　ＦＣｌｌを含む媒体に それぞれ移す仁とによって選択したクローンを低ＦＣｓ中で成長させるようＫし た。

＊＊ｔｌｌ東＄６４　Ｂ、處ｊｌヱニ７化　′仁の方法はｇｋｗ毅で覧天土に移 した場合にはうまく３２まで希釈し、これを鎖列早備した。各列に対して久のも のの１つを供ｌｌ１１繻４としてそれぞれ含む成長感体１００ｐ４ｔｉｌｉ２１ した。

（１）　４ｘｌＯｌｉｏ、ｌ虱＃Ｉｌ−砲（２）　４Ｘ１０　ＢｌＧ、ｉｌ’ｌ ＃輔處（３）　４ｘＩＱ’Ｘ＃ｔＮ３ｔ３−ｖ？ｘ＊確茅１胞（１ｒａｍ／ｓｅ ｅで２　’Ｏｓ　Ｏ（ｊ　Ｏｒａｍｇ　）Ｉ４）　４Ｘ１０　ｆｆイ）ｗイｙｙ 処１１”ｔｊｌした１１０゜鵬飄胸ｍｍａ 四　４Ｘ１Ｇ’　マイトマイシン処場＊セ施した１１０゜ｌ虱騨覇鹿 （旬　なし 単層コ廖−−ｔ’＊＊するのＫｊ轟かどうかを員べるため線種１喝を低希釈で比 較した。

ネ　１１８ｇ中で９，５ａｙ／ａｔのマイトマイｋｙｃ（Ｖ／マ）０．１１　を 鑵麿３Ｇ’を含む媒体ＪｍＩＣ厳加り１コ７′ｃで３０分分間ンキエペーＶＭン を行ｖ−ｈ、ｉｍｌ洗浄した。

（増加する＃Ｉ１ｍからａｌｌｌｌした。培養上清１０ｍから沈１ｉ１したＩｍ ｍｋ＊Ｑ畳ＦＣｆｌ−１０４１）Ｉｇｇｏ２ａｌｌｔ再曽濁Ｌ（すなわち約１０ ／１１１４３．久−で２つの５ｆ１１の凍結びん（分けた（１びんあた９１Ｇ） ＠各びんを２〜４時鴎氷の上で冷却した鏝ダンプ（Ｌｌｍ−・）液体Ｎ２タンク の１１１気楢中で一晩冷却し、最優に液体Ｎ、に浸漬した。この操作によりｓｇ は約Ｉ　ＩＣ／　ａｔ＠に９却される。

］１した株からａＩ麿を成長さぜるため、＊緒びんを３７℃水浴中で解ａｌＬ、 内容書を１ｉｔｉｋ縄体１０−中でゆっくりと希釈した。沈毅した一ａ（４Ｇ（ １，Ｓ分］を５〜１０暢ＰＣＩ　−ＤＭＩＭ　５　ｍ中で再−滴した。

５Ｇ−の培−を１５に１始するため、スピナｊｌ養から１１Ｊ１１１Ｇ　のａＩ 数のびんを１懺した。

分　１１１ｍ１−麿の命名 例　Ｋ　ｌ　ｊ１匁？　ロー／　Ｎ１１／１１１．１１１２８各雑檀ｍＩｌは一 鳳畝合夷噴に関する呼称で命扇する。

上記の場合Ｎｚ１ＯＮは１１イエーーマＮｌｊを示し、ｌは抗１胛ａ患を示す。

嬉１ｆ）６字（上記の例では１９）はクローンが得られたＲ初の未タローｙ化培 養ウニ＆（＠−ローｒ・曾・ｌυを示す。

その酸の数字（１１２シよび２８）は、選択されたクローンがａｌｌｌｌ訃よび ｓ２の寒天クロー二ノ／にしたかって成長したそれぞれの培養ウェルな示す、１ 傭のダｙグ四−トレイの培養ウニには１〜２４の数字を付け、またはム１〜ＩＤ ６の文字を付ける。したがって、５個リドレイを使用した場合はウェルは１〜１ ２０　またはｌム１〜ＳＤ・となる。

呼称全体は−躍りａ−ノ、産生された皐−！ローン抗体またはその抗原時異性を 示す。

−クローン　農の　嶺づ タロー／化した抗ＢＩＮ生−４ｍ麿の３つの安定な磁戯培番系列（ＮＢＩ／１９ ，１１２．２ｇ、Ｎｉ１ｌ　／Ｇ、３６゜３６およびＮｊｌｌ／４８．３０．４ ０３をＩＩ抗鳳を投与したマウスのａ１１１ｍ扇とマクスのン二−−マ系列との 閾の一合によって慢だ０分易された単一クローン抗体を含む朧繊培梼上信を上記 ３つの系列にクーて別々＃Ｃ機々 査した。

同一のＡｙｔから取ったグラフｒ・ダル−！・し７エレンス・ツボラトダー（ｍ ｌ・・−Ｑｒ＊＊ｐ　Ｂ＠ｔ・ｒ・１・・Ｌａｂｓｒｓｔ＠ｒＦ　）からのｒ− −抗Ｂ試料（ＩＧＵ、Ａ７ｊｆｆｉ７　）および市販の区ト抗鳳試料を！Ｉ４ｖ ＊て＾イノシｒ−マ膳胞によって産生された単一クローノ攬脇抗体の隠事を査定 した。

Ｉンス７オーｒおよびバク９−１１１褐）の方法により赤皇球凝集テストを行っ た。赤血球はＡＣＤまたは７８以円の血餅試料（讐−ジ目ナル・プツツｒ・トツ ンス７エージョノ−センター（鼠・ｇｔ・論ａｌ　ｉｌｌ・・纏？ｒａ鳳ｌ−ｆ ｓｓｉｅｍ　Ｃｈａｔ＠ｒ　）、ケｙｆリツがからの−の）で使用＠ｃ４回洗紗 した。生垣食塩水中の２０畳赤血球−濁箪をタイルテスト用に使用し、２４噛濁 液を一単２ｍＩ鴎試験管重力沈峰テスト用に使用した。エン＾−７スメントテス ト（・論ｈａｍ・・謝１ｔｔ・ｍ％）　Ｋは２参モ処環ｉａｗ１ｍｍｇまたは２ ０饅クンアルノ（ンを使用した。抗体希釈＠１裏生湯食塩水中で作った。

櫨準２時閲賦鏡・Ｃ沈降デス）ＩＣおｉて、完全に成長した４１Ｊ：ａは表ＩＫ 示す抗ＩＩＩ＆系力価を示した。

上記３つの単一タローｙ杭体−の１違・ｉ上配沈眸タストおよび上記倫のテスト にお−て反復可能なｔｏ″Ｔ！ｈ９、杭体ｍａｌ／１１１１１！Ｉは一貫してす ぐれた艙釆を示した。

予想しうるとおり、ム、ｌ成人皇球と藤・・ｔ４嵐球は成人ム、ｌ血球および成 人藤皇耀より１１分低−力愉を示した。これはム□謬成人皇球Ｂｅｅｒ櫨皇球が 一一一厘であるためでＴｏ４゜ テストしたすべての試薬はＡ本身上のすべての血液ｊｌＫ’）−で充分な凝集を 示したが、Ｎ１１１／１１１．１１１２８の活性は表に示す６櫨頌の１ｌＮｌ・ ・ｒ−嵐液履に対しては顕著なものであったｅ５１１１＠の異るム、ｌ血液（１ ！には示して−な−）に対する１１１／１１１．１１１２８　ノ＠１！１１１８ ０’！、ＩＧＩＩ、抗１／）１６．３！　（平均３２）に対しｔＳ＠−１０２４ （平増力１１５１２）で６つた。１５らに行った１１１１ｍで、Ｎｌｌ／４８と Ｎｉｌ／１＊＃）槽員生虞物の生態食塩水Ｊｌ襲力価を２藝ｍ５１ｍ球および２ 唾ム、ＩＩＪｌｆＩＬＲにつ−て調定した。稽剃したＮｌｌ／１９およびＮｌｌ ／１９の各分画をマイタｇ　７３−−ジ（鳳１−１藝 ・ｒ・ｆｓｇ＠）　Ｌ、ム１ａａ、　２８Ｇ−ｌＯとしてム８８．肩１．００（ −ｆ　なｈち］　ＯＯｐｌＰ／ｍ）　Ｉｃなるｔで各分画をｐ、ｍ、ｇ。

（ｐｍ＠５ｐｋａｔ＠ｉｕ＋ｆｆ５ｒ＠ｄ　ｍａｌｌｍｓ　）中〒注意深（希釈 した。培養土ｆｆ（それから分−か椙ａされたｔの）の硫酸アンモニウムカット をマイクｏ７３−−ジしＰ、Ｂ、８．中で１／１６＃Ｃ希釈した。１１１戚２ｔ Ｊ１希釈＃鑞は、ハ建ルトン注射器でピペットを行−１各ビ（ットー作の＠にそ がＰ、１．１．中に＃ＩＡ濁した試層で、ｉＩツス管中でｐｉ１７．４、富鳳で ２時間イン中ユベートした。ｌａ砲沈戚物を注意深くガラススライＩＰ＃ｃ参し 凝集の歇を敏えた１本実−におｉで使用した培襲上渭は上掲の表１の−のである 。

値釆を表２に示す。

１１！２における記号の１瞭 Ｃ：完全＃渠 Ｖ：非常に強ｖｈ凝泉 ｇｗ：中子−ｉ Ｗ：＃− 抗体結合活性を反映するタイル凝集テストでは、成人ｌｌ＠・ｒ−血球と成人ム １１Ｂ血球の比砿的弱ｉ反応は、成人層血球と成人ム８Ｓ皇球に比べて樵々の異 る試薬の抗ｌ活性の差をより１ｊｉ　ａ　Ｋ　＊　した、その１１１乗を表３に 示す働 ム、ａｍｍシよび島ｔｅｒｍ皇球に対して単一！ローン杭Ｉｆ）Ｎ１１１／１９ ．１１１１８を勇−せずかつ―珈燭を使用ゼずに使用した場合はＩＩＲ秒内に重 置の＃ｃＪｌｉに見られるものと１似の１１Ｉ−凝集反応を生じた。１ＧＩＬＬ 賦檗は肉視的に充分なＮ１果を生じたが、凝集の遮板と範−は劣って−た。

さらに行われた実験＃Ｃシいて、２０４８１１赤血球）よび２０４ム１■Ｉ血球 のＮ墨ｌ／４８およびＮ畠１／１９による一イＪｈ凝系時闘を一定した。使用さ れた試薬は赤血球が２０唾で１１！用された以外は表２（１１達してｆｆｉ成し た−のと一一である。８希釈物の２声ｔアリコートを不透明のガラスタイル上で 赤血球２０ｓＬと混合し％規南的に１１９１１かした。Ｓ合の１ｌｌＩｆＩａＫ べ／＆操作式ｘトｙゾウオッチをスタートした０表４はａｓｐ生じる時１１４１ （秒〕と５分優り＃巣の横置を示す、＃栗の種度は表３に＠遅して定−したもの と同じである。たとえば、】３ｖは十凝集が１３秒＊に起り、５分優に＃常に強 −凝集かあったことを示す。

異る試薬の２倍希釈ＩＩＩ液（クーて優た結果およびＮ烏１／１９．１］２．！ ８の相対効力を表５に示す、たとえば、４債希釈の場合、デス）した培養上清の 関豊物は市販の抗ｌ血清と比べてム、１皇遮に対する満足しうる反応を示した。

率　本テストで使用したム□１直球に対して１　：　５１！の力価を示す。

すべてのムＮｏ轡真性を有する単一り謬−７抗体か等しく血液量分１１１に遍Ｌ ？−るわけではμｉ、仁ζで挙げた例では３つの単一クローン抗ｌめ中２つは８ ０翼り砿準に比肩しうる骨性な有しては−るか、他の１つに比べると不元号な血 液虚分羨試薬であった。

単一タａ−ン抗邸の肴異性は足置的な７アンクンヨカルアフイニテイーの一定を 可ＷＰ、にする−のである。

７７７タンヨナルアツイニデイーは２つの方決によって表わすことかできる。

第一九、ファンクショナルアフィニティーは、単一クローン抗Ｂ　ＩｇＭ分子と 赤血球上の（対応する免役化学上の１の）ｌ決定基との閾の金合反応の予備定款 として表わすことかで暑る。この予備定款（以嬌にで示す）はまず層液やに存在 する緒合可総な抗体の異なるし４＃ｌｃおける”’ｌ１ｌｌ＊抗藤抗体と１癒赤 皇球の予備結合量を一定することによりて慢られる。実−は次のとおり行われた 。

一定はすべて２回ずつ行った　１！ｉＸ砿猷ｓｍｘＡ９およびＮｌｌ／４ｇのＩ ［１希釈系列（ｌｌｍｅａｒ　ｄｌｉｓｔｉｏｍｓ＠ｒｌ・Ｓ）を＾ζルトン注 射量を便って正ＪＩＩ＃ｃピ（ツ卜することによって（注射湯は各試験管ごとＫ ｌｓ回洗浄する）緩衝液（０，８番ＩＩＩムー罵朋８＋ｌＯｍ麗Ｈす・−＋０． １１！勝 暢九Ｎ、ｐｌｉ７．４）中でｌｉｌ贅した。　！標識抗体の２ＳｐＬＷＩＩｒ分 を１．５−ペツタマン、マイク四フエージチェープ（轟＊＠ｋｍａｍ　＋ｍｉ＊ ｒ＠ｆｓｇ＊　ｔｅｅｂ＊ｓ　）に加え１次ｉで新鮮なａｍ血球２　Ｘ　１Ｇ’ を含む緩衝液１５ｐｔを却えた。

一定用混合物をローラ上で４ＣでインキエペートＬ？６時１１ａｒ＆Ｉｃ氷で冷 ヤした緩ＩＩ液１．５−を急速に拳加し、直ら＃ｃ１５秒間ｉイタロツユージ回 −を行−上清な取り出した。ｍ４ｋｇａｓ加からマイクロッエージのスイッチ投 入までの時間は２〜４秒であった。コントロールイ“ンキエペー’５／　！　７ において、ム□層血球２×１０　で１ｓａｎｉ球をｗＬ洟し、寵加−合町総カウ ントのそれぞれ１．２〜２．０優、０．９〜１．２憾を占める　ｌｌ１ｌｌｌｌ Ｎｊｌｌ／１９）よびＮ　Ｂ　ｓ　／４８の１合を実１ｌｌＩｖＩＬから威算し た。

その績釆を＃Ｉ１図に示す、第１図はＮｊｌｌ／１！ｌおよびＮｌｌ／４ｇにつ めて秦加縮合ｑ１１！抗体量ＫＩｌｆ４”’Ｉ抗体の結合量（＠ｐａ　Ｘ　１Ｇ −”　）をプロットしたものである。これらの！ラフから１！ＩＸ＠＠杭農のＩ ｊｌ赤皇球に対する平ＩＩＩＩＩＩ合轡性の修正スカッチャー１リフトを作るこ とがで寝る。このような図を第２８として示す、４２図＋ｔｍｓｘ／ｘｓとＮ１ １ｌ／４８双方にツーての値を示す、ｔたＮｉｌ／４ｇは内側の！ラフ中に拡大 して示す、どちらの場合４１＠に対する外挿法を裏飽Ｓ拭箇での両会抗体量を示 して−る。

千＊５ｉ！数はスカツｔヤーＰｆロットから容易に計算できる。

筐た７アンタシ璽ナルアフイニテイーは単一クローン抗層！−分子と赤血球上の １決定基（Ｓ轟する免疫化学種の］との−に形成される免疫複合体の解離反応の 解−遍度足数として表わすこともできる。解離速度ｊｉ！＃（以曖に−１で示す ）はｏｑ関をと訃って作られる解離−旙の優−のこう配を一定することにより　 ！ｍ鐵単−クローンａｌｌの赤血球からの解庫時肯変化のグツ７から計算するこ とができる。

ｈるｖＩ＆−では４℃および嵐濾における　！纏織抗を抗体の易！赤血球からの 解離速度を冷却した抗体がｚｓ 過鵬の伏１で一定した。　！裸職Ｎｉｌ／１９　（結合可総抗体：　６．ＯＸ　 １０’＊ｐｍ、　５０ｍｇ　）またＮｌｌ／４ｇ（９，０Ｘ　１０　＊ｐｖｍ　 −１２４ｍｇ）’ｔ　２５１１１Ｌずつ１．５ｍマイクロ７エージｆに加え＆− で置型赤血球２　Ｘ　１０　を含む緩衝液（０，８参　１１Ａ−鳳ＩＩｇ　＋　 １０１１１１１ｉｅ）ａｓ　＋　０　、１　ｆｌｋ　ｍａＮｇ４７．４）　２８ ＃４を加えた。１合物をローラ上で４℃！インキュベートした。１時間後これら の菅の中の４本に氷で冷ヤした緩衝液１　、　ｌａｇ　を急速＃Ｃ加えた最直ち に血球をエツベンｌＰ＃７ｖイタａ　７　ニー　ｇ）　（ＩＩＩ：ｐｐｅｍｄｅ ｒｆ鵬五・ｒ＠ｆｓｇ・）中で１５秒閤１転して沈慮名ぜた。上清を素早く取り 瞼自、結合した放射絽（り諷）を一定するため血球をすした。

２時間インキュベートした残９の闘定管ＫＮＩＩ／１Ｇ培養土清の１２８倍硫酸 アノ七二りムー纏液を緩衝液で１／１０に希釈したものを２５Ｐｔ加えた０次い で蟲合豐’ｌ５ｐＬをローラ上で４℃または１回亀でイｙキエベートした。異る 時１１（１！！分〜２４時Ｉｍ）に冷緩衝液を珈え血球を直ちに沈Ａ１１名ぜ上 記の方法で計数した。コントロールイｙ＊：ａ−ぺ−ｆ／Ｈ７ＫＤ−てム、履血 球２　Ｘ　１Ｇ’をＩＩＩＪＩ皇球＃Ｃ砿喪り、１時間４℃でのイン中エベーク ヨｙ＊ｆ）Ｎｌｌ／４ｇおよびＮｌｌ／４ｇの緒合（追加計数の１．１憾および １．１鳴］を実験値から減算した。したかって−合は２嗜閲のイノ１＃瓢ペーシ ョン劇のｄ＋１４（ｐｒ−・１ｍ＠ｍｂａｔ１・鳳ｐ・ｒｌ・シ］終了時に）け る結合鎖の百分率ｌ意ｌ として表わされた。　ｌ儂ｊｌｌＮ脇１／１９および８Ｍ＋１／４８による１０ ０鳴緒合はそれぞれ９．ｌＸ１Ｇ＠ｐ鳳および７１５　Ｘ　１０　であった。

瀘改の反応混合物では、＊＊上信中の単一クローン抗体の一直を少くと％１０Ｐ ｔ／−と見なすと、椰慮抗体の少くと１０倍通肩の冷ｊｌＮＩＪ／１９＄存在し て−た。

上記諸結果を１１３−に示す、ｇｓｇ！！（−は２４時鴎の期間における屏喝を 示し、第３１伽）は時間−を拡大して最初の４５分開開再プロットしたものであ る。

ＩＳ さらに他の実＃ＩＫお−て、！健識抗Ｂ抗体の１型赤血球またはム、ＢＩＮ赤血 球２　Ｘ　１０’からの室温における解廟速Ｒな通肩の冷＃抗体の拭！Ｉ″ｔ’ 醐足した。実験の操作はｍＩ妃とＦＭ憾であるが、冷却抗体を抗原で纏繊した抗 体儂合体に加えた険血球を２分１１自に沈殿さゼ仁れを１０分子ｓ続けた点で異 る。その結果の６理はｌＩＩ記と同一である。その結果以下の績ｌｌｌが使用さ れまたは優られた。

＃＆２ＩＩＩａ合可１！　ｔ”ｔｌｌ’Ｐｙド　×１（至）噛”’Ｉ　ＩＩ織抗 体　Ｘム□血球　結合値（＠ｐｍ）　（ｍｇ）（１懺鴫加・−１（・ｐ鳳）第４ 隙１７　ＮＢＩ／１９　６．９刈♂　５８　０．３畳　１．３Ｘ１０’Ｎ８１Ａ ８９．ＯＸ１♂１２４　ｏ、ｓｔ　ｓ、ｚｘｌ−第４図（−）Ｎ藤１／ＩＡ９　 上記と同じ　上記と同じ　３．７Ｘｌ♂Ｎ！１ｍ／４ｇ　４．１　ｘｉｏ” 結果を第４図に示す、第４１田はＢ鳳赤血球に関する°ものでありＪ４！４図ζ −）はム１Ｂｍ赤血１１Ｋｆ４するｔのである。

上記６実−によって＃１定したファｙククヨナルアフイニテイーおよび上記他の 実−で−足した骨性をＮＢＩ／１９．１１２．１８　およびＮ！１１／４８．３ ０．４０　Ｋ）いて下表・および７＃ｃＩ約する。

表６　単−タミーｙ抗１ｗｃ体Ｎｌ！１　／１９．１１２　、２［１５１釣り一 とひ一！些斐亮望９号！ ｉｃ　”　ｘ　’　１ｏｏ＃／ｍ　Ｉ＄’　１００　ｐｔｘ’　ｍｔｉｍ　４１ （Ｍ−’）　（ｓｓ＊−”Ｊ　につ−ての＠　１ｇ１ｔＫ−）　ｉｃに４１ＬＪ ＩＪ＃＋ｉ４　（初ｖ＝ての力貴　ｅｌｇＭＢ　２，３Ｘ１０”　３．８ＸｌＯ −’　＠±２　ｋ（’Ａ２−＠）　０−３１ＡＩＢ　Ｎ？　、１７ＸｌＯ−”　 ２３ｆＳ　ｈ（ａ−ｓｔ）　１．２０８ＭｍスカツチャーＦＩＣよる予備定数ｂ ｓＩＩＩ！ＩＣ体につめての解離定数（Ｗ分間―樺）−薯タイル凝集Ｘ生履食塩 水中の２Ｄ暢血球：３μを抗体＋２５声を血球櫨■２時閲管内凝集×生湯食塩水 中の２０鳴皇球：２５ｐＬ抗体＋５声を血球 ・電反応容量団声り中の赤血球４×−を完全凝集させるために畳した抗体の童、 すなわち２時間管内凝集×種々のａ＊の抗体δ声を十赤慮球す戸ｔｔ使用、生理 食塩水中２醤赤血球ＮＴミ試験ゼず 上記の試験管内およびタイル生理★場本テストならびＫｌ暢メチル−にルローズ 訃よびＯ，ＺＳ饅プロメシン’ｔ’ｊＩＩ強した血球を使用した自動テストにお −て、単一！ローフ抗層はム、Ｉ１１皇球普たは０置皇罐とはまったく反応しな かった。　Ｎ１ｍ／１９．１１，２．２８の抗ｌ籍＾性は。

＆９に示すように、ツクパイン逃場した赤血球の場合および２０暢アルズンンを 使用した場合にお−て％Ｉｍ持された。　Ｎ１１／１９，１１２．２８の＃＠活 性の磯界増強効果（■ａｒｇｌ騰ａｌ＠聰ｈａｍ＠・■・亀りがこれらのテスト にお−てｌ！掴され、これは脣Ｋ　Ａ　Ａイン処履をしたム□Ｂ１１皇球にりｉ て嬌着であった。

率−クロー／抗Ｂ　ヒ　ト　梳　Ｂ Ｎｉｌ／１９．１１！！、２８　１ＧＩＩＬ　７３２７生１負寝水ＡＡイン　ア ルプ建７生理角１水ＡＡイン　アルプ建ンＡ、Ｂ　シ　１．α！４　５３２　１ ６　社　１６〜ｌ　５１２　１．０２４　１，０２４　３２　３２　＠Ｂ　５］ ２　１．０２４　１．０２４　＆？　６４　３２安定性試−においては、無希釈 Ｎ１１１／１９，１１２．２８培誉上清の２ｄ７９コートを異る線条件下にさら した酸室温で力愉および結合活性４１−再び一定した。

反復１ｌＩＩＩＩＩ１１聯（表１・８履）によりて値農虐性しベ＃が賊少するこ とはなかった。

ｊｌ締　単−タ冒−ン抗農（Ｎｌｌ／磨、１１！、Ｊ）の直結−屏二−１４茸！ 真球　１：１上清　１：２上清 ＸＩ　１．０！４　Ｓ　７ Ｘ２　１．０２４　４　７ ！１　１．０！４　Ｓ　？ ！４　１，０２４　！！　’Ｉ Ｘ５　Ｕ２　ｍ　？ 蝋時閾の島安定性試験（表１１参ＪＩＩ）は、単一！−−ン抗ｌか一２０Ｃおよ び４℃での貯ＩＥに対しても。

また５１１ＣでのインキエペーＳ／璽ンに対しても、安定であることを示Ｌ’Ｃ Ｍも。

１℃で２遥鴎　５１２　Ｓ　７　１０ ４℃で１遥鴎　５１２　５　６　Ｇ ａ１ｃ”ｔ？ｄ−伺　５１２　５　７　Ｇ真”α輪重　５１２　５　６　９ ＊ｍ食釈上清のＩＩ＆ｊｌ嫌の希釈 無希釈の上清は１ｓ加燗を使用しなくても少くとも層免置−婁賦ｌＩ＆七角等の 着力を有する。それは６嘗の分額作鋼で出くわす１ｓｖｈｌ履（ム−ｊＩおよび ｌ＊ｅｒｄ鳳皇球）な血球するのに好適な迅遍フす＊＊な（凝集したタイル反応 な墓する。それはまた自動血液差分ＩａＫ％安心して使用することかで龜る。２ １ｉｌｌＩＩ／ａ−ン化した抗体産生鑵撞ｌｌｌ１麿系列は大盤の岨威培養器中 で成長するように遍合され、（９返し繍代培褥をすることにより均一な置注の抗 体を分＠Ｌ続ける。連続成長によって作られた大量の活性場養上信はスフ９−ｘ ｙ／テストの１歇が儒々にスタ暗−ンされる多数の供与血清から同量のζト試薬 を生産するために現在必要とされて−る１歇よりもはるかに少（てすみ、テスト に４に−する手間をかなり省けるという利点を有する。また強力な＊＊上清ＩＬ を作るための材料費は５１１Ｒ］ｒと一う低コストであるが、この費用は活性上 清の＃’Ｆ＃Ｌうる希釈ａ４１Ｅ書（表５参！ｌ）を使用する仁とによってさら （低減することかできる。

ＦＩｏ、　１ 〔結合抗体ＩＸＩＵＭ ＋ａ）　（ｂ） 時間　分 時間 ＦＩＧ、　３ １２５Ｉ抗体 ０　２　４　６　８　１０　０　２　４　６　８　１０ＦＩＧ、　４ 国際調査報告 ｌａ１ｍ＋ａｍＩｌａｌＡＩＩｐｌｋ―竜・６１１Ｎｏ、ＰＣＴ／ＧＢ８２１０ ００７６第１頁の続き ０発　明　者　サックス・ステイーブン・ハワードイギリス国ケンブリッジシア ・ケンブリッジ・バブラハム・ロード・シェルフオード・ボトム３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ｌｊｌ朧球の抗原決定基に対する轡＾性を有する単一！ローン抗体（ｍｅｍ ＠＠ｌ＠ｍａｌ　ａｍｔｌｂ＠ｄｙ　）。 λ　ａｌｌ血球の抗Ｊｌｌ［ｆｋ定基に対する骨真性を有し、該決足基な有する ｉｌｌ血球試料の凝集を生じさせることができる単一クローン抗体。 ′Ｌ　該抗体とＩｌｌ血球との閑の相互作用の予備定数が１．３ＸＩＱ’１ｇ− １よりも大き一請求の範−第１項または第２Ｊｉｌ記或の単一クローン抗体。 ４Ｌ　該抗体と１１膳血球との閾の相互作用の平貞定歇が１、！Ｘ１０”Ｍ−” 　より４大ＩＩｖｈｔＩＩ求の範−纂３項記載の単一！−一）抗体。 Ｌ　鎖抗体と血液ｆｉｇのｌ星皇球を含む免疫複合体の解離反応の装置定数が２ ．２Ｘ１０　・・健　より小さ一膚求の曙１１項またはａ！２項記填の単一！ロ ーフ抗体。 ＆　譲抗体と血痕型層の３型車球を含む免役複合体の解−反応の逼直足叔か７． ６Ｘ１Ｇ”’ｓ＠＠−”より小さ一＃累の４−第５鷹記載の単一クローン抗体。 の５１１１！反応の迩直定叔か５．０Ｘ１Ｇ　ｇ＠偕　よつ小さＶｓ　、請求の １１１県１項または第２鷹記載の単一クローン抗体。 ＆　該抗体と血液型ム□墨のＩＪＩ血球を含む免役複合体の解離反応の遮度定歇 が３．４Ｘ１０−”ｓｅ＠−”より小さ一請求の範囲第７１１記填の単−クロー ン抗体。 東　マクスＥｌ星物質を注射し、マウスを犠牲ＫしてそのｌＩ＃ｓＩを取９出し 胛績鳳の懸濁液を形成するｌ−と、雑種ａａを形成するため＊紀胛繻胞をマウス のイエローｉａ麿と融合する工程と、該鑵橿ａ泡をクローン化する工程と、縦り 四−７化した鑵櫨ａｌｌＫ単一タローｙ抗体を分易させろ工程とを含む請求の範 Ｓ第１項ｉｅ棋の単一タローフ抗体の生産方法。 １０、該雑種ＪＩＪＩをクローン化するｍに遇択する工程を含む請求のｌｌｓ第 ９第９域記方法。 １］−該ンエローマｓＩｍは薦ｌ鑵胞である請求の範−第９項または５１１０項 記載の方法。 広　請求の範ｉｍａｇｓ項の方法で生産された単一クローン抗体。 １３、請求のｌ１１ｓＩ纂１項または第２鷹記載の単一クローン抗体を分泌しう る鑵ｍ綱砲。 １４、請求の範囲ａｌ１１項または第２鷹記載の単一クローン抗体を含む皇Ｉｌ ＆ｌａ分頭試薬。