JPS5834120B2 - ペプチドの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はペプチドの製造方法に関し、特に酵素を触媒と
するペプチドの合成方法に関する。

従来のペプチドを合成する代表的な方法としては、カル
ボキシル活性法に基づくアジド法、混合酸無水物法、カ
ルボジイミド法、活性エステル法、酸塩化物法を挙げる
ことができる。

しかし、これらの従来法ではカルボキシル末端アミノ酸
残基におけるラセ□化および副反応の生起、温度制御、
溶媒の選択をはじめ、ア□ノ保護基およびカルボキシル
保護基の性質、アミノ酸残基の官能基に及ぼす影響等を
考慮しなげればならず工業的には種種の問題がある。

フラグメント縮合法はペプチド合成反応をフラグメント
ごとに分割でき不慮の失敗による損失を最小限にくいと
めることができるばかりでなく工業的には有利な点が多
い。

しかし、フラグメント縮合法ではラセミ化を起こす可能
性のない唯一のア□ノ酸であるグリシンがカルボキシル
末端に在る場合はよいが、それ以外のアミノ酸の場合に
はラセミ化の生起が避げられないという重大な欠点を有
するものである。

ペプチドの製造においてラセミ化を避けることは最も重
要な問題であり、反応中にラセミ化が起った場合には生
酸物を不純にし、不必要な異性体の除去を要し工業的に
は不利となる。

前述のペプチド結合形成に関する従来法のうち、アジド
法はラセミ化を起こしにくい唯一の方法である点で利用
価値が高いが他の方法に比較して操作が煩雑であり、ヒ
ドラジド生成工程において副反応が生起し、そのため収
率では必ずしも優れて※※いるとはいえない。

前述の純有機化学的方法とは別にパパインおよびキモト
リプシンによるペプチド結合の生成が報告されている。

（たとえばＪ 、 Ｓ 、Ｆｒｕｔｏｎ”Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ”
Ｖｏｌ ５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｊｎｃ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ、 Ｙ、 １９４９ ）この方
法を反応式で示すと次ぎのとおりである。

前記（１）〜（３）の従来法において共通している事項
は（ＩＩ）のいわゆるア□ン成分の末端に結合している
フェニルアミン基は容易には脱離しえない基であり、一
旦形成したペプチドから脱離するには激しい条件下での
加水分解が要求され、結局ペプチド鎖の開裂が生起する
という重大な欠陥があり、したがって、これらの方法を
ペプチド合成に利用することは不可能と考えられていた
。

また、（４）の方法はトランスアミデージョンおよびト
ランスペプチデーションという副反応を伴い、実用的で
ないことが報告されている〔たとえばＲｏＢ。

Ｊｏｈｎｓｔｏｎ等： Ｊ、 Ｂｉｏｌ 、 Ｃｈｅｍ
、、１８５．６２９（１９５０）およびＪ 、 Ｓ 、
Ｆｒｕｔｏｎ等： Ｊ、Ｂｉｏｌ 。

Ｃｈｅｍ 、 ２０４．８９１（１９５３））。

すなわち（４）の方法ではアミン成分の末端に結合して
いる酸アミド体の第１級アミノ基がパパインによるアミ
ダーゼ作用を促進させるものである。

したがって前記の方法は、いずれもア□ン成分の末端カ
ルボキシル基の保護基がアニリドまたは第１級アミドの
結合を形成する場合においてもパパインまたはキモトリ
プシンがペプチド結合形成の触媒作用２有することを示
す学術的意義を有するに止り、オリゴペプチド、ポリペ
プチドの合成に対する可能性を示すものではなかった。

本発明はこのような現状に鑑みてなされたものであり、
その目的は所望のオリゴペプチドまたはポリペプチドを
簡単な操作で高純度かつ高収率で製造する方法を提供す
ることである。

本発明によれば、アミン成分の末端カルボキシル基の保
護基として特定の保護基を導入することにより酵素を利
用するペプチド合成が可能であることが認められた。

すなわち、本発明はチオールプロテイナーセに属する酵
素の存在下に一般式Ｘ−Ａ−ＯＨ（式中Ｘは末端アミノ
基の保護基であり、Ａはアミノ酸残基またはペプチド残
基である）で示されるＮ末端に保護基を有するアミノ酸
またはペプチドと一般式Ｈ−Ｂ−Ｙ（式中Ｙは第３級ア
ルコキシ基、置換または非置換ベンジルオキシ基、置換
または非置換ベンジルアミノ基、置換または非置換ベン
ズヒドリルオキシ基および置換または非置換ベンズヒド
リルア□）基よりなる群から選ばれた末端カルボキシル
基の保護基であり、ＢはＡと同一のまたは異なるアミノ
酸残基またはペプチド残基である）で示されるＣ末端に
保護基を有するアミノ酸またはペプチドとを、反応液の
ｐＨを検出する手段と、反応液のｐＨを調節するために
酸又は塩基を反応液に添加する手段を備えた反応装置中
で、水性溶液中チオールプロティナーゼが酵素活性を示
すｐＨの範囲内において反応させることを特徴とする一
般弐Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｙ（式中Ｘ、Ａ、Ｂ、Ｙは前記定義と
同一である）で示されるペプチドの製造方法である。

本発明について概説すると、本発明で使用されるチオー
ルプロティナーゼ（Ｔｈｉｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
）に属する酵素としては、パパイン（Ｐａｐａｉｎ
）、ステムプロメライン（Ｓｔｅｍ ｂｒｏｍｅｌｅｉ
ｎ ）、フィシン（Ｆｉｃｉｎ ）、カテプシンＢ（Ｃ
ａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ ）、キモパパイン（Ｃｈｙｍｏ
ｐａｐａｉｎ ）およびストレプトコッカルプロティナ
ーゼ（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌｐｒｏｔｅｉｎａｓ
ｅ ）が例示される。

これらの酵素は蛋白質に対する加水分解時の特異性がか
なり広く、極めて多数のペプチド結合、アミド結合およ
びエステル結合を切断し、またベンゾイル−アルギニン
アミド、ベンゾイルグリシルロイシルグリシン、ベンゾ
イルチロシングリシンアミド等を比較的よく分解し、エ
キソ・エンドーペプチターゼの両件用を有する（ Ｊ、
Ｒ，ＫｉｍｍｅｌおよびＥ、 Ｌ。

Ｓｍ１ｔｈ、Ａｄｖａｎｃｅ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
Ｖｏｌ １９．２６７（１９５７））。

出発物質として使用される一般弐Ｘ−Ａ−ＯＨ（式中Ｘ
は末端アミノ基の保護基であり、Ａはアミノ酸残基また
はペプチド残基である）で示されるアミノ酸またはペプ
チドは前記（１）〜（４）の既知方法に示される（Ｉ）
に相当する化合物であり、本明細書では以下この化合物
を酸成分という。

酸成分においてＡはアミノ酸およびそのペプチドの残基
を意味し、アミノ酸としてはペプチド合成の分野で使用
されるグリシン、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイ
シン、インロイシン、ノルロイシンのようなモノアミノ
モノカルボン酸、セリン、スレオニン、ホモセリンのよ
うなオキシアミノ酸、メチオニン、側鎖官能基の保護さ
れたシスチン又はシスティンのようなイオウを含むアミ
ノ酸、側鎖カルボキシル基の保護されたアスパラギン酸
又はグルタミン酸のようなモノアミノジカルボン酸、（
側鎖ア□）基の保護された）オルニチン、リジン又はア
ルギニンのようなジアミノモノカルボン酸などの脂肪族
アミノ酸並にフェニルアラニン、チロシンのような芳香
族核またはヒスチジン、トリプトファンの如き複素環を
もつアミノ酸が例示され、本明細書ではこの分野で通常
使用される略号により表示され、ペプチドについても同
様である。

酸成分の遊離末端アミノ基に対する保護基としては第３
級アルコキシカルボニル、たとえば第３級ブチルオキシ
カルボニル（Ｂｏｃ−）、第３級アミルオキシカルボニ
ル（ｔ −Ａｏｃ−）、など置換または非置換ベンジル
オキシカルボニル、たとえばベンジルオキシカルボニル
（Ｚ−）、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｐ
ＭＺ−）、３・５−ジメトキシベンジルオキシカルボニ
ル （Ｚ （ＯＭｅ ）２ ）、２−４・６−）リメチル
ベンジルオキシ力ルボニル（ＴＭＺ−）、ｐ−フェニル
アゾベンジルオキシカルボニル（ＰＺ−）、ｐ−）ルエ
ンスルホニル（Ｔｏｓ−）、ｏ−ニトロフェニルスルフ
ェニル（Ｎｐｓ −）などが代表的な例として挙げられ
る。

酸成分は遊離酸として反応系に添加されるが、反応系の
ｐＨ条件において電離しうる塩として添加されてもよい
。

一方の出発物質として使用される一般式 Ｈ−Ｂ−Ｙで示されるア□ノ酸またはペプチドは前記（
１）〜（４）の既知方法で示される（ｎ）の化合物に相
当する化合物であり、本明細書では以下アミン成分とい
い、ＢはＡと同一のまたは異なるアミノ酸またはペプチ
ドの残基な示す。

アミン成分におけるカルボキシル基の保護基としては、
第３級アルコキシ基、たとえば第３級ブトキシ（−０Ｂ
ｕ−ｔ）、置換または非置換ベンジルオキシ基たとえば
ベンジルオキシ（−（）Ｂｚｌ）、置換または非置換ベ
ンズヒドリルオキシ基たとえばベンズヒドリルオキシ（
−０Ｂｈ）、置換または非置換ベンジルアミノ基たとえ
ば２・４−ジメトキシベンジルアミノ（−ＮＨＤＭＢ）
、置換または非置換ベンズヒドリルアミノ基たとえばベ
ンズヒドリルアミノ（−ＮＨＢｈ ）等を用いる。

これらのアミン成分のカルボキシル末端の保護基は、本
発明で用いる酵素すなわちチオールプロテイナーゼに属
する酵素たとえばパパインがエステラーゼおよびアミダ
ーゼ作用を伴うため、このような作用を受けないもので
あることを要する。

本発明で用いる酸成分及びアミン成分はすでに述べたこ
とから明らかな様にアミノ酸又はペプチド残基の側鎖に
官能基のある場合を含むものである。

この場合これらの官能基を保護するのが望ましいことが
多く、その保護基としては、ω−アミノ基（Ｎ″Ｊ）の
保護にはＮ（″）−ベンジルオキシカルボニル（Ｎｏ）
−Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｎ（１′）−ＢＯＣ
）及びトシル（Ｎ”−ＴＯ８）などを、アルギニンのＮ
−グアニジノ基（Ｎ’）の保護にはニトロ基のほかＮＧ
−ベンジルオキシカルボニル（Ｎ’−Ｚ）およびＮｏ・
Ｎｏ−ジベンジルオキシカルボニル（Ｎｏ−Ｚ−Ｚ）な
どを、イミダゾール核（Ｎ１ｍ）の保護にはＮ１ｍ −
ベンジル（Ｎｉｍ−ＢＺｌ）及びトシル（Ｎｉｍ−ＴＯ
８）などを、ω−カルボキシル基の保護にはω−ベンジ
ルオキシ（−ＯＢｚｌ）などを、またオキシアミノ酸の
水酸基が保護される必要のある場合には脂肪族、芳香族
アミノ酸の別なく、０−エーテル型、たとえば０−ベン
ジル基（ＯＢｚｌ）などを使用することができる。

システィンのメルカプト基のＳ−保護基としてはＳ−ベ
ンジル基（ＳＢｚｌ）などが使用できる。

本明細書でいう保護基は少なくとも導入された基が反応
に際して安定であることおよび生成物から容易に脱離で
き、その脱離の際に副反応を生起しないことの条件を満
すことが必要である。

出発物質の酸成分およびアミン成分は前記の保護基を有
するほか、ア□ン成分のＮ″−アミノ基は遊離の場合は
勿論、塩酸塩、臭化水素酸塩、しユウ酸塩、ｐ−１ルエ
ンスルホン酸塩および酢酸塩などの無機または有機酸塩
の形態のいずれのものを使用してもよい。

本発明においてペプチド結合を生成する脱水縮合反応は
水性溶液中、本発明で用いる酵素が酵素活性を示すｐＨ
の範囲で実施することが必要である。

この範囲はほぼｐＨ４乃至７．５程度の範囲である。

本発明を工業的に実施する際、反応溶液のｐＨをこの範
囲に保つために反応装置に反応液のｐＨを検出する手段
と酸又は塩基を供給する手段とを設け、検出した反応液
のｐＨに応じて、これに酸又は塩基を供給し、これによ
り、反応液のｐＨを所望の範囲に保つ。

具体的には検出した反応溶液のｐＨに応じて、これに調
節された量の塩基を供給し、ｐＨが７．５程度を超えた
場合には酸を供給する。

出発物質は一般にアミン成分１モルに対して酸成分０．
８〜２モル好ましくは１〜１．５モルの割合で用いるこ
れらの出発物質が水性溶媒に溶は難い場合にはメタノー
ル、エタノールのようなアルコール、ジメチルホルムア
ミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルスル
ホキシド等の溶媒を加えてその溶解性を改善することが
できる。

この場合その添加量は本発明の酵素反応を阻害しない程
度に止める必要があり、通常水１重量部に対して溶媒１
重量部以下を用いる。

本発明の反応は水性溶媒中で進行し、反応生成物が相対
的にこれに対する溶解度の小さくなる系であることが必
要で、好ましくは反応生成物が難溶または不溶となる系
である。

反応に要する酵素量はアミン成分１ｍｍｏｌに対して１
０〜４００■、望ましくは５０〜３００即である。

また溶液中に酵素の活性化剤としてシスティン若くはそ
の塩または２−メルカプトエタノール若くはその塩など
を添加してもよい。

反応温度は酵素活性を維持する観点から一般には２０〜
５５℃、望ましくは３０〜４０℃である。

前記の条件で反応を実施することにより、反応は円滑に
進行し、通常１〜２４時間で完結する。

生成物は反応系外に析出するので、容易に単離すること
ができる。

本発明を更に具体的に説明すると、チオールプロテイナ
ーセに属する酵素、たとえばパパインを用いて前記一般
式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｙにおいて示される最も小さなペプチド
すなわちジペプチドを容易に製造することができる。

たとえばに示されるようにリジルリジンのようなジペプ
チドを製造する場合６位アミノ基をカルボベンゾキシル
基（２−）で保護したリジンより得た２−誘導体を酸成
分、又ｔ−ブチルエステルをアミン成分として上記の方
法を適用するとぎ、側鎖アミノ基の保護されたリジルリ
ジンを得ることができる。

又アルギニンを含むジペプチドとしてアルギニルロイシ
ンの場合 すなわち、アルギニンのグアニル基及びアミノ基なＺで
保護した）ＩＪ−Ｚ−アルギニンを酸成分として又アミ
ン成分としてはロイシンのベンツヒドリルエステルを用
いてパパインの存在下反応させるとジペプチド誘導体を
容易に得ることができる。

又側鎖に官能基を有するア□ノ酸の場合、上記の二側の
ようにこれを保護して反応を行うか、又は無保護のまま
反応を行うこともできる。

ヒスチヂンを例にとれば （イ）が側鎖保護、（ロ）が無保護の例に和尚するがパ
パインを用いて反応を行うといづれの場合にも良好な結
果が得られた。

以上ジペプチドについて述べたが酸成分がペプチド結合
を１ケ所含む場合すなわち、アシルジペプチドとア□ノ
酸アミド誘導体の反応もパパインによって副反応を伴う
ことなく進行する。

−例をあげれば この場合にも反応は円滑に進行し、生成物としてカルボ
ベンゾキシ−プロリル−グリシル−ロイシン−ペンツヒ
ドリルアミドを得ることができた。

酸成分、アミン成分共にジペプチドの場合につ・。

・いて−例をあげれば、ペプチドホルモンとして知られ
ているＶａｌ ５−アンジオテンシン−■の３−６のテ
トラペプチドの合成に適用できる。

すなわち アミン成分としてパリルーヒスチジンエステルを用いパ
パイン存在下反応を行なうとこの場合は生成物としてテ
トラペプチドのベンジルエステル基が脱離したものが得
られる。

これらはパパインの性質の１つであるエステラーゼ作用
を受けた結果であると考えられる。

このような反応はペプチド合成の計画でこのテトラペプ
チドを次に酸成分として予定している場合には極めて好
都合である。

本発明は前記から明らかなようにエステラーゼおよびア
ミダーゼ作用を伴うチオールプロテイナーゼに属する酵
素を使用するにもかΣわらず、酸成分のカルボキシル保
護基として前述の特定の基を選択することによりオリゴ
ペプチド・ポリペプチドの合成を可能にした点で特異な
効果を奏するものである。

次に本発明を更に詳細な実施例について説明するが本発
明はこれにより伺等限定されるものではない。

実施例 Ｉ Ｚ −Ｇｌｍ −ＯＨ２８０，２■（１ｍｍｏｌ ）及
びＨ−Ｐｈｅ −Ｐｈｅ−ＯＢｕｔ３６８．５７７１（
１ｍｍｏｌ）をフラスコで水１０ＴｒＬｌに懸濁した。

これにｐＨメーターのガラス電極を挿入し水酸基ナトリ
ウム水溶液（１／１０規定）を滴下してｐＨを約５，０
に調節しながらパパイン１５０７Ｑ及び２−メルカプト
エタノールｏ、ｉ ｍｌを添加しフラスコを振盪して固
形分を溶解させた。

これを３８℃で２０時間振盪して反応させた。

この間ガラス電極ｐＨメーターにより反応液のｐＨを測
定し、水酸化ナトリウム水溶液（１／１０規定）を添加
して反応液のｐＨを５乃至６に保持した。

析出した結晶を日別し、水、希塩酸（１規定）、水、ア
ンモニア水（７％）及び水で順次洗浄後乾燥した。

これを酢酸エチルより再結晶し、ｍ、ｐ、１９７〜２０
０°Ｃを有するＺ −Ｇｌｍ −Ｐｈｅ −Ｐｈｅ−Ｏ
Ｂｕｔ５１０■を得た。

収率８０，８％。実施例 ２ Ｚ −Ｐｈｅ −Ｖａｌ −ＯＨ３９８，５ｍ９及びＨ
Ｐｈｅ −Ｖａｌ−ＯＢｕｔ３２０．４ ｍ９をフラス
コ中で水１０ｍ１に懸濁した。

次いでこれにｐＨメーターのガラス電極を挿入し希塩酸
で系のｐＨを約４．５５．０に調節しながら、パパイン
１５０即及び２メルカプトエタノール０．１ ｍｌを添
加し、フラスコを振盪して固形分を溶解させ、これを３
８℃で２０時間振盪して反応させた。

この間ガラス電極ｐＨメーターにより反応液のｐＨを測
定し、塩酸を添加して反応液のｐＨを４．５乃至５．０
に保持した。

析出した結晶を戸別し、水、希塩酸（１規定）、水、ア
ンモニア水（７％）及び水で順次洗浄後乾燥した。

これを酢酸エチル・石油エーテルで再結晶してｍ、ｐ、
１３０〜１４５℃を有するＺ −ＰｈｅＶａｌ −Ｐｈ
ｅ −Ｖａｌ−ＯＢｕｔ３ Ｑｍ９を得た。

収率４．３％。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ チオールプロテイナーゼに属する酵素の存在下に一
   般弐Ｘ−Ａ−ＯＨ（式中Ｘは末端アミノ基の保護基であ
   り、Ａはアミノ酸残基またはペプチド残基である）で示
   されるＮ末端に保護基を有するア□ノ酸またはペプチド
   と、一般式Ｈ−Ｂ−Ｙ（式中Ｙは、第３級アルコキシ基
   、置換または非置換ベンジルオキシ基、置換または非置
   換ベンジルア□）基、置換または非置換ベンズヒドリル
   オキシ基および置換または非置換ベンズヒドリルアミノ
   基よりなる群から選ばれた末端カルボキシル基の保護基
   であり、ＢはＡと同一のまたは異なるアミノ酸残基また
   はペプチド残基である）で示されるＣ末端に保護基を有
   するアミノ酸もしくはペプチドとを、反応液のｐＨを検
   出する手段と、反応液のｐＨを調節するために酸又は塩
   基を反応液に添加する手段を備えた反応装置中で、水性
   溶液中チオールプロテイナーゼが酵素活性を示すｐＨの
   範囲内において反応させることを特徴とする一般弐Ｘ−
   Ａ−Ｂ−Ｙ（式中、Ｘ、Ａ、Ｂ、Ｙは前記定義と同一で
   ある）で示されるペプチドの製造方法。