JPS58209993A - インタ−フエロンの産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は培誉細胞からインターフェロンを産生する際に
多価アルコールを用いることによるインターフェロンの
大量生産方法、に関するものである。

長野ら（Ｃｏｍｐｔ、　Ｒｅｎｄ、　Ｓｏｃ、　Ｂｉｏ
ｌ−＋１４８巻、１７００頁。

１９５４年）およびｌ５ａａｃｓら（Ｐｒｏｃ、　Ｒｏ
ｙ、　Ｓｏｃ、　５ｅｒＢ、１４７巻、２５８頁、　１
９５７年）によって発見されたインターフェロンは、抗
ウイルス作用以外に、近年抗腫瘍効果を含む多岐にわた
る生物学的作用を有する事が報告され（Ｇｒｅｓｓｏｒ
、　ＩらＢ、　Ｂ、　Ａ、。

５１６巻、２６１頁、　　１９７８年）、医薬としての
可能性が注目を集めている。現在、インターフェロンは
大きく５橿に分類名れ、それぞれインターフェロン−α
、インターフェロン−β、インターフェロン−γと命名
されている（Ｎａｔｕｒｅ。

２８６巻、１１０貞、　　１９８０年）。インターフェ
ロン−ｄは培養した白血球ｌたはリンパ芽球を、各種の
ウィルス、たとえばセンダイウィルス（ＨＶＪ）、ニュ
ーキャスルデイシーズウィルス（ＮＯＶ）、−ＥｆｃＨ
インフルエンザウィルスなどで刺激することによっ−Ｃ
誘起される。

インターフェロン−βは正常二倍体細胞を各種のウィル
ス、たとえばＨＶＪ、　ＮＬ）Ｖ、インフルエンザウィ
ルスや二重鎖■ζＮＡ等で誘起して得られる。この方法
は近年大きな発展をとげた。たとえばＶｉｌｃｅｋら（
Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、Ａｇ、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、、
　２巻、４７６頁、　　１９７２年）によるスーツ々−
インダクションは二重鎖ＲＮＡ等の誘起剤で細胞を刺激
した鎌、シクロヘキシばド、アクナノマイシンＤなどの
代謝阻害剤で処理する方法であり、インターフェロン−
βの産生を著しく増強させた。

インターフェロン−γｆｌＴリンパ球ニフィトヘマグル
チニン（Ｐｉ−ＩＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ　
）などのマイトゲンあるいは抗原抗体反応などで刺激を
与えると誘起される。また細ｊＭを各ａ！誘起剤で刺激
する前にインターフェロンを含む培地で一晩培養するこ
とにより、インターフェロンの生殖が上昇することが仰
られておシ、この効果をプライミング効果と呼んでいる
。

本発明はプライミング培地、ｈり起時の培地および／ま
たは生産培地へ多価アルコールを添加するかあるいは培
地を交換する際に培養細胞をφ価アルコールを含有する
溶液と一過性に接触させるか又はこれらの処理を併用す
ることによる高単位インターフェロンの産生方法である
。

本発明で使用する多価アルコールは、−分子中に２つ以
上のアルコール性ＯＨ基を肩する物質である。分子量が
大きくても使用濃度で培地等に可溶性であり、細胞毒性
を示さない限り使用し得る。たとえばポリエチレングリ
コール（平均分子量２００〜２００００　）、ジオール
タイプポリプロピレングリコール（平均分子量１０００
〜５０００）、トリオールタイプポリプロピレングリコ
ール（重合度５００〜２０００）、エチレングリコール
、プロパンジオール、グリセリン、ブタンジオール、ブ
タントリオール、ブタンテトロール、−ベンタンジオー
ル、ペンタエ’ＪトＩＪ）−ル等が使用できる。使用す
べき一度は培養細胞の種類、培地の柵類、誘起剤の種類
および使用する多価アルコールの種類等によって異なる
ので、最も過当な一度は実験的に定めるが、一般的には
、培地に添加する場合は約１００１〜３０％、好１しく
は約［１１〜５ｑｂ、一過性に細胞と接触嘔せる場合は
約［１，１〜６０％、好１しくに約１〜５０％を基準と
して使用壊れる。

インターフェロン産生細胞としては、ヒトニ培体細胞で
あるＭＲＣ−５細胞、ヒドリ／バ芽球細胞であるＮａｍ
ａ　ｌ　ｗａ細胞の他、ヒＩ−Ｔ細胞およびマウスＬ９
２９細胞、他のヒト細胞、たとえはＷＩ−３８細胞、Ｉ
ＭＲ−９０細胞、ＭＧ６５細胞、Ｂａ　ｌ　ｌ−１細胞
、Ｆ’ｌｏｗ　１０００細胞、Ｆ１０Ｗ４ＵＯＯ細胞嘔
らに他の動物細胞、たとえはＲＫ１３細胞、ＭＤＢＫ細
胞、および種々の動物初代培養細胞も使用し得る。

インターフェロン誘起剤としてはポリ（Ｉ）−ポリ（Ｃ
）、）ｉＶＪ、　ＮＤＶ、　ＣｏｎＡの他、他の誘起剤
たとえばクラミジア、リケッチア、マイトゲン、リボ多
糖類を用いることが可能である。

各細胞の培養培地としてはイーグルＭＥＭ培地、ＲＰＩ
ＶＩＩ　　１６４０培地を用いるのが一般的であるが他
の培地、たとえばＭｃｏｙＳ　ＡＪｆ地、１９９培地、
ハム培地、Ｌ１５培地などを使用することかり能である
。

インターフェロン産生培地としては、イーグルＭＥＭ培
地のみならず、平衡塩類ｍ液、例えばハンクス液、ＰＢ
Ｓ−浴液などを用いることが可能である。

’！ｆＣ，培養細胞と多価アルコール金倉む溶液・と全
接触させる場合の多１曲アルコールの溶媒としてはＰＢ
Ｓ　　の他、他の塩類浴液、例えばハンクス液、アール
液あるいは培養液を使用することができる。

次に、実験例により多価アルコールのインターフェロン
産生に対する効果を説明する。

実験例１ インターフェロン−β産生に対する多価アルコールの効
果を調べた。

ヒト二倍体細胞であるＭＲＣ−５細胞ｉ１０％仔牛血清
添加イーグルＭＥＭ培地を用いてプラスチック製培養フ
ラスコにて３７狐５％ＣＯ２’Ｆで培養し、細胞が単細
胞層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）形成後、培地ｋ　１００単
位／　ｓｔｌのインターフェロン−βを含む０．１％ヒ
ト血清アルブミン含有イーグルｉＶＩＥＭ培地と交換し
て、−晩培養した。次いで、この培地にポリ（Ｉ）・ポ
リ（Ｃ）およびサイクロへキシミド／ｃ終濃贋それぞれ
５０μ汁家および２μｒ／ｍＪとなる様に添加して５時
間培養した後、更に、アクチノマイシンＤヲ１μか實と
なる様に絡加して２時間培養した。次に、この細胞をＰ
ＢＳ−で２度洗浄して生産培地（０，１％ヒト血清アル
ブミン含南イーグル＋ｖｉＥＭ培地）に交換し、−晩培
誉した。インターフェロンの力価はＦＬ細胞−シンドビ
スウィルス系によるＣＰＥ　（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　
ｅｆｆｅｃｔ）法（小長谷ら蛋白質核酸酵素　別冊２５
号、貞６５５〜頁５６５．１９８１年）により測定した
。

この産生工ａｔよ、正常細胞からポＩＪ　（Ｉ）・ポリ
（ＱＪｆｒ：誘起剤としてインターフェロン−βｋｇ生
する一般的方法であり、その概略を第１図に示した。

多価アルコールとして平均分子ｉ１，５４０のポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ　１５４０）（Ｈ用い、鑓度１
．５％の割付でブライミング培地および／または生産培
地へ添加したＪＭ＠、ブライはング培地への交換前また
は、生産培地への交換前に細胞とＰＥＧ　１５４０を含
むＰＢＳ−とを一過性に接触させた場合およびこれらの
処理を併用した場合のインターフェロン−βの増産効果
を検討した。

その結果を第１衣に示した。

次に、ブライばング培地へのＰＥＧ　１５４０の添加量
−２ｏ、　Ｑ、００１．０．（＋１．　ａｌ、　１．０
．１ｎ、ｏｌとｆ　化すせた場合のインターフェロン−
Ｉの増産効果を恢肘した。その結果を第２表に示した。

史に、ブライミング培地へ、種々の多価アルコール、た
とえば）’ＥＧ　１５４０、ヘキサントリオール、ブタ
ンジオール、ベンタンジオールをそれぞれ添加した場合
のインターフェロン−βの増産効果を検討した。その結
果を第６衣に示した。

ＩＡ　　１　　表 ＰＥＧ　　１ｓ４ｏ１用いた　　　　　インターフェロ
ン−Ｉ産処理方法　　　　　　　　　生賞単位／ｒｔｔ
ｉ１、非処理　　　　　　　　　　１２，７００２．０
．３係ＰＥＧ　　１５４０含有 プライミング培地使用　　　　　　　　２５，６００＆
Ｑ、６係ＰＥＧ　　１５４０含 Ｍ午腫培地使用　　　　　　　　　　　１４２００４、
ブライミンク培地への父 換前に１０％ＰＥＧ１５４０ 含有ＰＢＳ−にて細胞表面 洸汐　　　　　　　　　　　　　　　１７．５　Ｕ　Ｕ
民生座培地への交換ＭｉＪに１０頭 ＰＥＧ　　１５４０　　含有ＰＢＳ− にて細胞表面洗浄　　　　　　　　　２乙５０口＆処理
２＋処理５　　　　　　　　２７．１００Ｚ処ｆＭ２＋
処理４　　　　　　　　　２７．４００ａ処理２＋処理
５　　　　　　　２へ７００第２表 プライミング培地への　　　　　　　インターフェロン
−β産ＰＦ２Ｇ　　１５４０　　添加風（％）　　　　
　化量　単位／虹０　　　　　　　　　　　　　１２．
７０００．００１　　　　　　　　　　１４８００（Ｌ
Ｏｌ　　　　　　　　　　　　１５，１００ｎ　１　　
　　　　　　　　　　２７．９００１・０　　　　　　
　　　　　　２４，６００１Ｑ、０　　　　　　　　　
　　　２［１，５００第　　５　　表 プライミング培地へ添　　　　　　インタ−７エロンー
β厘生無添加　　　　　　　　　　１１，８００ＰＥＧ
　　１５４０　０．３％　　　　　　　　　　２７，５
００ヘキサントリオ一ルα５％　　　　　　　１９，７
００ブタンジオール　α３チ　　　　　　　　１７．１
　［１［１ペンタンエリトリトール　１５％　　　　　
　　　１４４００実験ＶＩＩ２ マウス細胞Ｌ９２９細胞ヲ１０％仔牛血清添加イーグル
ＭＥＭ培地を用いて１５０Ｃ−プラスチ・ツク製培養フ
ラスコにて６７℃　５９６　Ｃ０ｍ下で培養し、細胞が
単細胞層形成後第１図に示した方法でインターフェロン
を産生じた。多価アルコールとしては、ＰＥＧ　　１５
４０−Ｅたはヘキサントリオール添加用い、プライミン
グ培地に［１３チの＃度で添加した。また−適性の処理
としては、生産培地への交換前に１０チのＰＦＪＧ　１
５４０を含むＰＢＳ−で２回洗浄することにより実施し
た。インタ−７エロンーβはＬ９２９細胞−シンドビス
ウイルス系によるＣＰＥ法により測定した。その結果ｆ
：第４表に示した。

第　　４　　表 処理方法　　　　　　　　　　インターフェロン−β産
生址　単位／１ ＰＥＧ　　１５４０　無添加　　　　　　　　乙０９０
プライミング培地にａ６％ プライミング培地に０．５％ ヘキサントリオール添加　　　　　　　　２，９７０生
産培地への交換前に１０％ ＰＥＧ　１５４０　ＰＢＳ−で ２回洗浄　　　　　　　　　　　　　　　２，５６０実
験例６ インターフェロン−αの産生に対する多価アルコールの
効果を調べた。

リンホブラストイドとして５俤仔牛血清添加ＲＰＭＩ　
　１６４０培地で維持されているＮａｍａｌｗａ　ａ胞
ヲ用い、１００単位／ｌｄのインターフェロン−αｔｆ
む０．１％ヒト血清アルブミン添加ＲＰＭ１１６４０４
地を用いて一晩プライミングし、その後ＨＶＪ　’ｃ　
Ｉ　Ｇ　Ｏ１１［ＡＶ７＆ｌの濃度で添加して一晩放置
した。そのｋ、ｐＨ２として１−ＩＶＪ金失活烙せ、史
に、ｐＨ７にもどしインターフェロンの収量全測定した
。この工程は、白血球ｔｆｃはリンホブラストイド細胞
を用いるインターフェロンーαの一般的處生方法であシ
、その概略を第２図に示した。多価アルコールとしては
、ＰＥＧ１５４０　’！ｃ用い、プライミング培地にＣ
Ｌ３％の濃度で添加した。

また、一過性の処理としては、プライミング培地への交
換前に１０％のＰｈ：Ｇ１５４０′を含むＰＢＳ−で細
胞乞２回洗浄することによシ実施した。その結果を第５
表に示した。１次、前記の処理を行う際（Ｄｋ’ＥＧ　
　１５４０Ｃり濃度ｉ０．１．１．１０．３０．６０％
と変化させた場合のインターフェロン−αの増産効果に
ついても検討した。七の結果を第６表に示した。

第　　５　　表 ＰＥＧ　　１５４ｏｙ２用いた　　　　インターフェロ
ン−０厘処理方法　　　　　　　　　　生産　単位／ｎ
ｔＪ非処理　　　　　　　　　　１．７４０ａ−ｓｑｂ
　　ＰｇＧ　１５４０　　含有ブライミング培地使用　
　　　　　　　　へ６２０プライミング培地への父換前 に１０％　ＰＥＧ含有Ｐ　Ｂ　Ｓ　− にて細胞表曲況浄　　　　　　　　　　　乙９８０第　
　６　　懺 プライミング培地への父換前　　　　イ／ターｌエロン
ーα産生量における一過性処理のＰＥＧ　　　　　　　
単位／＃！１１５４０の濃度（％） 無添加　　　　　　　　　１．７４　［１［Ｌ１％ＰＥ
Ｇ　１５４０　　　　　　　１，９６０１チ　　　　　
　　　　　　２．１７０１０チ　　　　　　　　　　　
２，９８０６０チ　　　　　　　　　　　２，９５０６
０　％　　　　　　　　　　　　２．６５０実験例４ インターフェロン−γの産生に対する多価アルコールの
効果を調べた。

健康成人より得た末梢血ｆ　Ｆｉ　ｃｏ　ｌ　ｌ−Ｈｙ
ｐａｑｕｅｇｒａｄｉｅｎｔにより単核球を分離し、こ
の単核球をプラスチックシャーレで培養後、非付着細胞
を分取し、α１％ヒト血清アルブミン添加ＲＰＭ１１６
４０培地に浮遊した。この浮遊液にＣｏｎ　Ａを５μｒ
／ｄの濃度で添加して４８時間培譬した。

この工程はインターフェロン−ｒを産生する一般的方法
であり、その概略を第６図に示した。

多価アルコールとしてｔ／′１ＰＥＧ　１５４０を用い
、０．１％ヒト血清アルブミン添加ＲＰＭＩ　　１６４
０培地に［ｌＬ５％の割合で添加した。その結果ｆｉｌ
−第７表に示した。

第　　７　　表 無添刀ロ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　７９０ＰＥＧ　　α５％　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１．４　２　０次に実施
例により本完明を具体的に説明するが、本発明ｔまこれ
らの実施例に限定されるものではない。

実施例１　　インターフェロン−αの産生Ｎａｍａ　１
　ｗａ細ｊＢ　ｆ　３　ｘ　１ａｓ　Ｃｅ１ｌ　Ｓ／ｍ
ｅ　）割合テ５チ仔牛血清添加ＲＰＭＩ　　１６４０培
地に植込み５日間培養後、１０予ＰＥＧ　１５４０含！
　ＰＢＳ−で細胞を洗浄した。次に、１００単位／　ｒ
ｎｌのインターフェロン−αヲ含むα１％ヒト血清アル
ブミンおよび［１３％ＰＥＧ添加ＲＰＭＩ　　１６４０
培地を用い、１Ｘ１０’　Ｃｅ　１１　ｓｏｌの割合で
懸ｆｆ１Ｌ、１８時間後に）１ＶＪ　ｆ　１００　　／
Ｈ）；になるように象〃口した。−夜培養後にＨＣｌを
用いｐＨ２とし、ＨＶＪｔ失活後、ｐ）Ｌ７．０にもど
しＩＦＮ−α活性を側冗した。インターフェロン−αの
生産量は４，７００単位／　＃ＥＡ！であった。

実施例２　　インターフェロン−βの産生Ｗ１５Ｂ細胞
ｆ　５　Ｘ　１０’　Ｃｅ１ｌｓ／１５０ｃｒＡ培養フ
ラスコの割合で１０チ仔牛血清含有ＭＥＭ庵地？用いて
植込み佐５日間培養した。その後１００単位／ｄのイン
ターフェロンーβを含む（Ｌ１％ヒト血清アルブミン、
および［１５％ＰＥＧ　１５４０添加ＭＥＭ培地で一晩
ブライミングを実施した。次にポリ（Ｉｌ・ポリ（Ｃ）
、サイクロヘキシミド、アクチノマイシンＤｔ−用いた
スーツ（−インダクション法によりインターフェロン金
誘導した。生産培地としては、［Ｌ１チヒト血清アルブ
ばン金倉むアール液を用いたが、本培地交換前に１０チ
プタンジオールを用い細胞派面を洗浄した。インターフ
ェロン−βの生産量は５７．５００単位／罰であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実験例１におけるインターフェロン−βの産生
工程を示す図） 第２図は実験例３におけるインターフェロン−αの産生
工程を示す図 第５図は実績例４におけるインターフェロン−γの産生
工程を示す図である。 ％許出願人　持田製薬株式式会 代理人　萼　優美、ソミｔ）１名） Ｊ７ｔＩ図 単細胞層を形成した培養細胞 ↓ プライミング培地に交換 ポリ（Ｉｌ・ポ１月Ｑ　、サイクロへキシミド添加土 生産培地に交換 インターフェロン活性測定 ′２２図 培　　養　　細　　胞 土 プライミング培地に交換 ＨＶＪ　、ＮＤＶ等ウィルス添加 土 ｐＨ２，０処理によりウィルス失活 上 ｐＨ７，０にもどしインターフェロン 活性測定 才３ｒＩ！Ｊ ＴＣｅ１１浮遊液 ＰＨＡ　、　Ｃｏｎ　Ａ等添加 インターフェロン活性測定

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　培養細胞をインターフェロン誘起剤で刺激し
   てインターフェロン金産生ずる方法において、培地に多
   価アルコールを添加するか、あるいは培地の交換時に培
   養細胞と多価アルコールを含む溶液とを一過性に接触さ
   せるか又は両者全併用することを％徴とするインターフ
   ェロンの産生方法〇
2. （２）　　多価アルコールをプライミング培地に添加す
   る特許請求の範囲第１項記載の産生方法。
3. （３）多価アルコールを誘起時の培地に添加する特許請
   求の範囲第１項記載の産生方法。
4. （４）　　多価アルコ−ルを生産培地に添〃口する特許
   請求の範囲第１項記載の産生方法。
5. （５）多価アルコールをブライミング培地、誘起時の培
   地および生産培地のいずれか２種以上に添加する特許請
   求の範囲第１項記載の産生方法。
6. （６）培養細胞と多価アルコール２！Ｉ−合む溶液との
   接触金、ブライミング培地に交換する時、訪起培地に交
   換する時および／または生産培地に交換する時に行なう
   特許請求の範囲第１項記載の産生方法。
7. （７）　　４価アルコールがポリエチレ７　りｌ）コー
   ルである特許請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか
   一項に記載の産生方法。
8. （８）　　多価アルコールの濃度がα００１〜３０％で
   ある特許請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか一項
   に記載の産生方法。
9. （９）　　多価アルコールのａ度がα１〜５％である特
   許請求の範囲第８項記載の産生方法。 （イ）　多価アルコールの濃度が［ｌＬ１〜６０％であ
   る特許請求の範囲Ｍ１項又は第６項記載の産生方法。 （ロ）　多価アルコールの濃度が１〜３０％である特許
   請求の範囲第１０項記載の産生方法。