JPH11513887A

JPH11513887A - 特定のヌクレオチド配列の検出方法および組成物

Info

Publication number: JPH11513887A
Application number: JP9516836A
Authority: JP
Inventors: ランバーグ，エリオット，アール．
Original assignee: ランバーグ，エリオット，アール．
Priority date: 1995-10-27
Filing date: 1996-10-25
Publication date: 1999-11-30
Also published as: US20020119475A1; CA2235804A1; KR19990067080A; AU730154B2; EP0864002A4; US6100040A; MX9803308A; EP0864002A1; WO1997015691A1; AU1156897A; US6458540B1; US5962225A

Abstract

(57)【要約】細胞、または組織材料より精製された特定の核酸配列の検出のための方法、および組成物を提供する。より詳細には、本発明は、図面に示されるように、ターゲットの核酸配列を含む二重体または三重体核酸構造物のような保護された核酸配列（ＰＮＡＳ）を形成するような保護分子を用いた核酸配列の検出のための方法、および組成物を含んでいる。本発明の方法を用いた測定法は、１、２または３の特異性のレベルを含んでおり、擬陽性のシグナルを最小限に押さえるものである。本発明の方法または組成物を利用した測定法は、多量の精製ＤＮＡについて単一試験で、高いレベルの感度で実施でき、従って、ＤＮＡ増幅手法の必要性を排除している。

Description

【発明の詳細な説明】特定のヌクレオチド配列の検出方法および組成物先願関係本出願の請求の範囲は、１９９５年１０月２７日出願の米国仮出願第６０／００５，９３８号の「診断方法および特定のＤＮＡ配列の検出方法」についての優先権主張をするものである。前記仮出願は本願明細書中に引用により完全に組み込まれるものである。技術分野本発明は核酸配列を検出するための方法および組成物を含む。より詳細には、本発明は核酸ターゲット保護ストラテジーを用いる特定の遺伝子配列を検出するための方法および組成物を含む。本発明の方法および組成物は、微生物の検出、ヒト、動物および植物の感染症の診断、血液製品の検査、および腫瘍の早期発見、法医学、父性の決定、組織または臓器の移植および遺伝病の決定といった分野に活用される遺伝子解析に利用可能である。発明の背景多くのターゲットおよびシグナル増幅の方法が論文に記載されてきたが、高い特異性、簡便性および迅速性の組み合わせを提供すると認識されるものはない。これらの方法の一般的な総論はLandegren U他、Science 242:229-237(1988)およびLewis，R.，Genetic Engineering News 10:1，54-55(1990)に示されている。これらの方法にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＰＣＲインシツ（in situ ）、リガーゼ増幅反応（ＬＡＲ）、リガーゼハイブリダイゼーション、Ｑβバクテリオファージレプリカーゼ、転写ベース増幅システム（ＴＡＳ）、転写シークエンシングを伴うゲノム増幅（ＧＡＷＴＳ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）およびインシツ（in situ）ハイブリダイゼーションがある。これらの様々な方法のいくつかを以下に示す。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ＰＣＲは、Mullisによる米国特許Nos.4,683,195および4,683,202に記載されている核酸増幅法である。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸張反応の繰り返しよりなる。ターゲットＤＮＡは熱変性され、増幅されるＤＮＡに向かい合う鎖にターゲットの配列を擁する２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる。これらのオリゴヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼと共に使用されるプライマーとなる。ＤＮＡはプライマー伸張により複製され両方の鎖の第２の複製を作る。熱変性、プライマーハイブリダイゼーションおよび伸張のサイクルを繰り返すことにより、約２時間から４時間でターゲットＤＮＡが１００万倍またはそれ以上増幅されうる。ＰＣＲは、増幅の結果を決定する検出技術と共に利用されるべき分子生物学の道具である。ＰＣＲの利点は、約４時間のうちに１００万倍から１０億倍にターゲットＤＮＡの量を増幅することによって感度を上げられる点にある。欠点はコンタミネーションが擬陽性を起こしたり、または特異性を低下させうる点にある。転写ベース増幅システム（ＴＡＳ）ＴＡＳはＲＮＡ転写を利用して、ターゲットのＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するもので、Kwoh他、(1989)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:1173に記載されている。ＴＡＳは増幅の２つの段階を利用している。第１段階として、ポリヌクレオチドのターゲットへのハイブリダイゼーションによって、一本鎖のＴ７転写プロモーターが覆い被さった二重体cＤＮＡが形成される。このＤＮＡはリバーストランスクリプターゼによって二重体型に複写される。この二重体は熱変性され、プライマーがＴ７領域を含む相対する鎖にハイブリダイズされる。このプライマーを用いて、リバーストランスクリプターゼが再度添加されることにより二重鎖の（活性の）Ｔ７ポリメラーゼ結合部位を持った二重鎖cＤＮＡが形成される。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは二重体を転写し多量の一本鎖ＲＮＡを形成する。第二段階として、プライマーが上記の新しいＲＮＡにハイブリダイズされ、再度、二重体cＤＮＡに転化される。この二重体は熱変性され、上記のようにサイクルが繰り返される。ＴＡＳのＰＣＲに対する優位点は、ＰＣＲではターゲットの２つのコピーがそれぞれのサイクルで形成されるのであるのに対し、それぞれのターゲット分子の１０から１００のコピーがそれぞれのサイクルで生産されることである。これは、わずか４から６のサイクルで１０⁶倍の増幅が達成できることを意味する。しかしながら、この数の増幅サイクルが完了するにはおよそ３から４時間を要する。ＴＡＳの主な欠点は酵素の添加および熱変性を含む多数の工程を必要とすることである。転写増幅（３ＳＲ）３ＳＲとして知られるＴＡＳの改変法では、Guatelli他(1990)Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 87:1874に記載されている通り、ＲＮＡ/ＤＮＡヘテロ二重体のＲＮＡの酵素デグラデーションが熱変性に代わって使用されている。同じ温度下で、さらなる試薬を添加することなくＲＮＡseＨおよび全ての他の酵素が添加されて反応し、全工程が行われる。この手法により１０⁶から１０⁹の増幅が４２℃、１時間で達成された。連結増幅（ＬＡＲ／ＬＡＳ）連結増幅反応、または連結増幅システムはＤＮＡリガーゼ、および４個のオリゴヌクレオチドを使用し、ターゲット鎖あたり２個を使用する。この手法は、Wu , D.Y.およびWallace，R.B.(1989)Genomics 4:560に記載されている。このオリゴヌクレオチドはターゲットＤＮＡの近傍の配列にハイブリダイズし、リガーゼによって接合される。反応は熱変性、およびサイクルの繰り返しにより進む。ＬＡＲは、リガーゼが、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドをも接合してしまうという事実に煩わしさを伴う。これは高いバックグラウンドをもたらしてしまう。加えて、ＬＡＲは効率的な反応ではなく、各サイクルに約５時間を要する。従って、この増幅は完了まで数Ｈを要する。Ｑβレプリカーゼこの技法では、Lizardi他（1988）Bio/Technology 6:1197に記載されているように、一本鎖ＲＮＡを複製するバクテリオファージＱβのためのＲＮＡレプリカーゼがターゲットＤＮＡの増幅に使用される。まずターゲットＤＮＡがＴ７プロモーターおよびＱβ５’配列領域をふくむプライマーにハイブリダイズされる。この方法では、このプライマーを用いて、逆転写酵素が５’末端にプライマーを連結したcＤＮＡを生成する。これら２つの工程はＴＡＳの手法に類似する。できあがったヘテロ二重体は熱変性される。次にＱβ３’配列領域を持つ第２のプライマーによってcＤＮＡ合成の第２ラウンドが誘導される。この結果、活性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と共にＱβバクテリオファージの５'および３'末端を持つ二重鎖ＤＮＡができる。そしてＴ７ＲＮＡポリメラーゼは二重鎖ＤＮＡを、Ｑβに類似の新しいＲＮＡに転写する。ハイブリダイズしていないプローブが十分に洗い取られた後、新しいＲＮＡはターゲットから溶出されＱβレプリカーゼによって複製される。後半の反応は約２０分のうちに１０⁷倍の増幅をする。反応中に非特異的に保持される微少のプローブＲＮＡのために、有意なバックグラウンドが形成される。カイロンシグナル増幅法 Urdea他、(1987)Gene 61:253に記載されているカイロン法は非常に煩雑である。この方法は、１２のキャプチャーオリゴヌクレオチドプローブ、３６の標識オリゴヌクレオチド、２０以上の酵素標識プローブにクロスリンクされる２０のビオチン標識固定プローブを使用する。この膨大な方法は、幾多の洗浄、および試薬の添加の工程を必要とする段階的方式で構築される。増殖はサイクルが無い故に制限される。プローブは単純に大きなネットワークを形成する。イムクローンシグナル増幅イムクローンの技法はカイロンに似たネットワーク概念を利用しているが、アプローチは全く異なる。イムクローンの技法はKohlbert他、(1989)Mol．and Cel l Proves 3:59に記載されている。イムクローンはまずターゲットプローブを含む一本鎖Ｍ１３ファージＤＮＡを結び合わせる。この結び合わされた環状ＤＮＡに、ひとつの末端で結合しもう片方の末端は溶液中にさらけ出された５個のＤＮＡフラグメントが添加されハイブリダイズされる。他のプローブセットは前述のプローブセットのさらけ出された部分にハイブリダイズされる。後者のセットは酵素で直接的に標識されているか、またはビオチン標識されている。ビオチン標識されている場合は、ストレプトアビジン酵素複合体によって検出される。いずれの場合でも検出は酵素呈色反応による。カイロン法のようにイムクローン法は大きなネットワークの構築に依存している。サイクルの繰り返しが無いため、反応は幾何級数的には拡大せず結果として増幅は制限される。上記のような核酸増幅法により比較的少量のターゲット核酸分子の検出が可能になっている一方で、より短い時間で、バックグラウンドの干渉をより小さくしてターゲット核酸分子の検出を可能にすることが求められている。ＰＣＲおよび他の増幅技法に伴う問題は収集技術上の試料汚染、およびアンプリコン（増幅されたターゲットＤＮＡ）の存在である。強く関連する配列およびプライマー二量体の産生による非特異的なターゲットの増幅を伴う諸問題がある。特異性のコントロールが劣ることが擬陽性反応を、感度のコントロールが劣ることが擬陰性反応を引き起こしている。ＰＣＲの結果は多くの場合、プローブハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、またはインシツ（in situ）ハイブリダイゼーションのような他の技法によって確認、実証されなくてはならない。加えて、ＰＣＲおよび増殖技術は最大１マイクログラムのレンジといった非常に少ない量の出発試料ＤＮＡに使用可能であるに過ぎない。このことがＰＣＲ技術の少ないコピー数のターゲット核酸の検出への利用を不可能にしている。例えば、ＨＩＶ感染の初期感染直後の早期検出はＰＣＲを使った検出ではほぼ不可能であろう。従って特異的核酸配列の検出、およびその単離が可能な組成物、方法およびキットが求められている。特に、少ないコピー数の核酸ターゲット配列の検出を可能にする方法およびキットが求められている。加えて方法およびキットには、要望される特異性のレベルで核酸配列を単離できる融通性を提供できることが要求されている。また方法には、増幅技術を用いないこと、しかしながらいかなる量の、特に多量の出発試料の核酸から特定のターゲット配列を単離することを可能にすること、要望される特異性のレベルによって、数段階の特異性レベルでの単離を達成する融通性を持つことが要求されている。本発明の概要本発明によれば、細胞または組織の試料から特定の核酸配列を検出するための方法および組成物が提供される。特に、本発明は、ターゲット核酸配列を含む三重体または二重体核酸構造のような保護された核酸配列（ＰＮＡＳ）を形成する保護分子を用いた核酸配列を検出するための方法および組成物を含む。ターゲット核酸配列とは、検出されるべき特定の配列である。本発明の方法を用いた測定法は、１、２または３の特異性のレベルを含み、擬陽性のシグナルを最小限に押さえる。本発明の方法または組成物を用いた測定は、多量の精製ＤＮＡにおいて一回の試験で、感度の高いレベルでの実施が可能であり、よってインビトロ（in vitro）のＤＮＡ増幅手法の必要性が排除される。ターゲット核酸配列が二重鎖の場合は、保護分子によって形成される構造は三重体である。ターゲット核酸配列が一重鎖の場合は、保護分子によって形成される構造は二重体である。この発明の開示において三重体構造を論ずる部分では、二重体構造、またはＰＮＡ（ペプチド−核酸）および適当なヌクレアーゼを用いた構造もこれに代えることができる。本発明の方法を用いた測定はＴＰＡ、即ちターゲット保護測定法と呼べるであろう。特異性の第一のレベルは、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）のような保護分子を対象となる特定のターゲット配列に結合させるのに活用する。このような結合は、ホッグステイン（Hoogstein）型の水素結合を形成することで達成される。ターゲット核酸配列に結合した保護分子は、保護された核酸配列（ＰＮＡＳ）を形成する。ひとたびこれらのＰＮＡＳ構造が形成され溶液中で安定化されると非特異的ＤＮＡは消化される。例えば、この消化は、エンドヌクレアーゼと、ＤＮＡエキソヌクレアーゼIII（Ｅｘｏ III）のような二重鎖依存エキソヌクレアーゼとの組み合わせによって達成され得る。この例で使用されるエンドヌクレアーゼは配列のそれぞれのサイドに約２０塩基対のＤＮＡを残してＰＮＡＳの両サイドを切断するように設計されている。ＤＮＡのひとつの鎖を３ ’末端から漸次切断するエキソヌクレアーゼであるＥｘｏ IIIは三本螺旋構造により阻害される。ヌクレアーゼの組み合わせを用いることで保護されていないＤＮＡ配列は完全に消化される。本発明の特異性の低いレベルを伴う方法では、キャプチャーのために親和性分子を、保護プローブと連係する標識のためにレポーター分子を利用することになるだろう。しかし特異性の高いレベルが要求される場合には、ＰＮＡＳの片側または両側に５’フランク領域を生成し、測定で、さらに２レベルの特異性を活用することができる。フランク領域をもつＰＮＡＳを形成する構造はＰＮＡＳ/テールと呼ばれる。ＰＮＡＳの選択的消化の後、一本鎖フランク領域のひとつに相補的なオリゴヌクレオチドのようなキャプチャープローブが添加される。キャプチャープローブは一本鎖領域にハイブリダイズすることができる。例えば、キャプチャープローブは、一本鎖領域に結合し、付属した親和性分子を持つであろうオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、親和性分子はジゴキシゲニンまたはビオチンであり得る。キャプチャープローブは親和性分子を包含し、ＰＮＡＳと結合できる。キャプチャーシステムは付属したキャプチャープローブによってＰＮＡＳを単離するのに用いられる。キャプチャープローブに結合でき、親和性分子の付いたＰＮＡＳ/テールを混合物から分離できるキャプチャーシステムが熟考されている。上記の例において、このようなキャプチャーシステムはジゴキシゲニンキャプチャープローブの部分に結合する抗ジゴキシゲニン抗体、またはビオチンキャプチャープローブ部分に結合するストレプトアビジンをコートした磁性粒子を使用することを含んでもよい。磁性粒子に結合した、親和性分子を有するＰＮＡＳ /テールは非特異的複合体から分離され、非特異的核酸配列を取り除くように洗浄される。このような洗浄では当業界において周知の洗浄技術が使用できる。例えば、磁性粒子ホルダーが使用できる。更に特異性のレベルが要求された場合、本発明は保護分子またはキャプチャープローブに連携したレポーター分子をも有する測定法を含む。特異的検出の第三のレベルは標識レポータープローブの添加を組み込むものである。レポータープローブは検出可能な標識を含んでおり、ＰＮＡＳと結合可能である。例えば、レポータープローブはＰＮＡＳ/テールの一部である５’一本鎖テールに相補的なオリゴヌクレオチドを含んでいるであろう。この５’領域はキャプチャープローブが結合する相対するフランクテールに存在するか、または存在しないであろう。レポータープローブは放射能のような、または直接検出するためのビオチンまたはジゴキシゲニン標識などの非放射性標識のような当業界において周知のもので標識されているか、または蛍光レポーター分子、例えばフルオレセイン、もしくは化学ルミネセンスまたは生物ルミネセンス標識で直接、標識されている。過剰量のレポータープローブが洗浄された磁性粒子−三重体複合体に添加され、ハイブリダイズされる。結合した標識レポータープローブの検出は、使用された標識の種類に適合した検出装置により、洗浄の後おこなわれる。例えば、蛍光標識のレポータープローブを使用している場合、標識された配列は蛍光光度計を用いるか、または蛍光顕微鏡で粒子を観察することで検出されうる。あるいは結合したプローブの量は、アボットＴＤＭアナライザーのような分析機により蛍光異方性で直接的に評価できる。本発明の組成物は、本明細書に記載された方法を実施する構成要素を含む組成物を含む。例えば、親和性分子を有する標識保護分子を含む組成物が、特異性の第１レベルでの測定に使用され得る。標識保護分子とキャプチャープローブを含む組成物がレベル２の特異性の測定に使用され得る。保護分子、キャプチャープローブおよびレポータープローブを含む組成物がレベル３の測定に使用され得る。個々の分子、プローブおよび構成要素はまた、それぞれ独立して提供され得るものと理解されるべきである。本発明は特に特定の遺伝子配列の検出に有用である。本発明は、ターゲット保護測定法（ＴＰＡ）のような大変多量の精製核酸の処理を可能にするという利点を持つ方法を全てのフォーマットについて含み、ひいてはＰＣＲのような人為的な増幅手法の必要性を排除し、特定のターゲット配列の検出を可能にしている。加えてＰＮＡＳの構造、キャプチャープローブの結合、およびレポータープローブの結合という特異性の３つのレベルが、非特異的増幅および／またはハイブリダイゼーションによる擬陽性シグナルに関連するような技術的問題を軽減する。本発明は、ターゲット核酸配列を含むと推測される試料から単離された核酸配列を取得する工程、、ＰＮＡＳを形成するに十分なハイブリダイズ条件下で保護分子を前記核酸配列に接触させる工程、およびＰＮＡＳを検出する工程を含むターゲット核酸配列の検出ための方法を含んでいる。更に本方法は、ＰＮＡＳの検出工程に先立って、１またはそれ以上のＰＮＡＳを含む単離された核酸を核溶解酵素（nucleolytic enzyme）で消化してＰＮＡＳ/テールを形成する工程、およびキャプチャー分子をＰＮＡＳ/テールにハイブリダイズする工程を含んでもよい。これに加えて本方法は、さらにＰＮＡＳの検出工程に先立って、レポーター分子をＰＮＡＳ/テールにハイブリダイズする工程を含むことも可能である。ターゲット核酸配列を含むと推測される試料から単離された核酸配列を取得する工程、ＰＮＡＳを形成するに十分なハイブリダイゼーション条件下で保穫分子を前記核酸配列に接触させる工程、１またはそれ以上のＰＮＡＳを含む単離された核酸を核溶解酵素で消化してＰＮＡＳ/テールを形成する工程、キャプチャー分子を前記ＰＮＡＳ/テールにハイブリダイズする工程、レポーター分子を前記ＰＮＡＳ/テールにハイブリダイズする工程、およびＰＮＡＳを検出する工程を含む特定の核酸配列の検出方法。本発明は、特定の核酸配列と結合できる保護分子を含む、特定の核酸配列の検出のための組成物を含むものである。本発明の組成物は更にキャプチャー分子を含むこともできる。加えて、本発明の組成物はレポーター分子を含むことも可能である。本発明の方法および組成物は、ＨＬＡタイピングのような多形遺伝子配列の遺伝子解析と同様、ヒト、動物および植物の病原体のようなウィルスおよびその他の微生物の検出について理想的であるべきである。本発明の方法は、法医学、父系の決定、あるいは臓器または組織の移植、もしくは遺伝病の解析に用いることができる。従って本発明の目的は特定の遺伝子配列を検出する方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、三重体ヌクレオチド構造を含む特定のＤＮＡ配列を検出するための方法を提供することにある。本発明の他の目的は、三重体ヌクレオチド構造を含む特定のＲＮＡ配列を検出するための方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、二重体ヌクレオチド構造を含む特定のＤＮＡ配列を検出するための方法を提供することにある。本発明の他の目的は、二重体ヌクレオチド構造を含む特定のＲＮＡ配列を検出するための方法を提供することにある。本発明の他の目的は、ＰＮＡ構造を含む特定のＲＮＡ配列を検出するための方法を提供することにある。本発明の他の目的は、ＰＮＡ構造を含む特定のＤＮＡ配列を検出するための方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、抗体を含む特定のＤＮＡ配列を検出するための方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、抗体を含む特定のＲＮＡ配列を検出するための方法を提供することにある。本発明の他の目的は、放射性標識された核酸を含む核酸配列を検出する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、非放射性標識された核酸を含む核酸配列を検出する方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、様々な特異性のレベルを持つ、特定の遺伝子配列を検出する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、微生物の固有特性を決定するための核酸配列を検出する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、ヒトの病原体の固有特性を決定するための核酸配列を検出する方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、動物の病原体の固有特性を決定するための核酸配列を検出する方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、植物の病原体の固有特性を決定するための核酸配列を検出する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、試料の、父性または種の同定のような遺伝子間関係の決定のための核酸配列を検出する方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、移植目的の臓器または組織の可能性のある提供者の決定、もしくは血液供給の保護のための核酸配列を検出する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、法医学的な決定に使用するための核酸配列の検出方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、遺伝子疾患を解析するための核酸配列を検出する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、個体、または組織液に対して、微生物、または他の病原体を検出する試験をするための方法を提供することにある。本発明のこれらの、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に詳細に記載する開示される態様、および付属の請求の範囲の説明により明確になるであろう。図面の簡単な説明図１は本発明の方法の工程を示すものである。ＴＰＡ手法には、図１に示すとおり、以下の独立した５工程がある。すなわち、ＤＮＡの単離工程；ＰＮＡＳの形成工程（図１では三重体の形成を示している）；エンド／エキソヌクレアーゼ消化工程；親和性分子（図１ではジゴキシゲニンを示す）を有するキャプチャープローブの添加工程；磁性粒子の添加によるキャプチャープローブを有するＰＮＡＳ/テールの単離工程；標識（このケースではＦＩＴＣ（蛍光イソチオシアネート）である）を有するレポータープローブの添加工程；およびレポーターおよびキャプチャープローブを有する標識ＰＮＡＳ/テールの検出工程である。詳細な説明本発明は、ターゲット核酸配列を含む保護された核酸分子（ＰＮＡＳ）構造を形成する、保護分子を使用した特定のターゲット核酸配列の検出のための方法を含むものである。本発明の方法を使用する測定は、ＴＰＡすなわちターゲット保護測定法と呼べるであろう。本発明の一つの態様は特定のＤＮＡ配列の検出のための方法である。本発明は特定のＲＮＡ配列の検出方法もまた含んでいる。本明細書での開示においては、核酸ＤＮＡが使用されるであろうが、ＲＮＡを含むあらゆる核酸が本発明の方法と共に使用可能であることが理解されるべきである。特定のヌクレアーゼが言及される部分では、特定の機能を発揮できるあらゆるヌクレアーゼが、名前を挙げたヌクレアーゼに代わって使用できるものである。本発明の方法、すなわちターゲット保護測定法(ＴＰＡ)における工程は、ターゲット核酸配列に特異的な特徴ある核酸診断術に達するいくつかの技術の組み合わせを含んでいる。ＤＮＡターゲット核酸に実施される本発明の好ましい方法は、１）ＤＮＡの単離、２）ＰＮＡＳの形成、３）非保護ＤＮＡの酵素消化、４）キャプチャー、および、５）標識、そして、６）ＰＮＡＳの検出の工程を含む。本明細書において要約される多くの独立した手法は、論文に記載されているか、またはキットのかたちで購入可能ないくつかの変法と共に分子生物学分野の当業者において周知の技術を使用することが可能である。本発明は開示された特定の技術によって制限を受けるものではなく、同じ機能または結果をもたらすことができるいかなる技術も記載されたものに取って代わることができると理解されるべきである。例示の目的で、ＴＰＡ手法の各工程について一つの技術を記載するであろう。代替可能であり好適な技術が適応する部分で記載されている。しかし本発明は、他の多くの適合する選択肢を本発明の範囲に含めようとすることについて、制限されるものではない。本発明はその範囲にＤＮＡ（一本鎖および二本鎖）およびＲＮＡ（一本鎖および二本鎖）のような核酸ターゲットを含む。本発明の方法は、大幅に過剰の非ターゲット核酸中の非常に少ないコピー数の核酸ターゲットの存在を特異的に検出するのに有用である。本発明の方法は、本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡもしくはペプチド核酸（ＰＮＡ）分子のような保護分子によって、ターゲット核酸配列をヌクレアーゼの反応から保護することを含む。保護分子はターゲットの核酸配列に特異的に結合できるように選択されるか、または設計される。保護分子はターゲットの核酸配列と結合してＰＮＡＳの構造を形成する。例えば、ＰＮＡＳは、三重体および二重体核酸構造、ペプチド核酸および抗体結合構造を含むが、これらに制限されるものではない。本発明の方法は、溶液中でＰＮＡＳを固定された基質に結合させるような親和性分子と結合した保護分子を含んでもよい。親和性分子の存在は過剰の異質の核酸の除去を可能にする。本発明の方法は更にターゲット核酸の存在の視覚化を可能にするレポーター分子を含む。特異性の最低のレベルを考慮する本発明の測定は、これによりＰＮＡＳを形成する、保護分子の特定のターゲット核酸配列への結合を含む。診断の技術は、これらが高い特異性（わずかな擬陽性のみ）および高い感度（わずかな擬陰性のみ）を達成した場合にのみ有用である。高いレベルの特異性を提供するために、本発明は、ターゲットの核酸配列が保護分子と結合してＰＮＡＳを形成したときヌクレアーゼの攻撃から保護され、ＰＮＡＳの一方かまたは両側に親和性分子を含むキャプチャープローブがハイブリダイズされるように１または２の酵素的に生成された５’ＤＮＡテールが生成されるような方法を含む。キャプチャープローブはテールを持つＰＮＡＳのテール領域に特異的に結合するように選択されるか、または設計される。この測定は結果として、保護分子の結合および親和性分子のターゲット核酸のテールへの結合の特異性の２つのレベルを示す。親和性分子においては、完全な保護構造と結合した親和性分子との付着部が、固定された基質に付着することを可能にしている。この２つのレベルの特異性を伴う測定の例においては、親和性分子または保護分子のどちらかが、当業者において周知のいずれかのタイプの標識によって標識されている。この標識が親和性分子をもつＰＮＡＳの検出を可能にするであろう。特異性の第三のレベルは、保護分子の結合したターゲット核酸配列を越えて伸張した、好ましくはターゲット核酸のそれぞれのサイドに１つずつの、２つの異なるテール領域が生成されることによって、本発明により十分に計画された測定に組み込まれることができる。このテール領域は保護構造に含まれるが、保護分子に結合するものではなく、この構造はＰＮＡＳ/テールと称する。一方のテール領域は、ターゲットが（親和性分子を介して）固定された基質につなぎ止められるようにキャプチャープローブに結合でき、他方のテールは、ターゲットの核酸の存在が視覚化されるような標識をもつレポータープローブと結合するのに使用される。ＰＮＡＳのテール領域は要求される特異性のレベルによって、使用が必要な場合、必要ない場合があるであろう。好ましくは、キャプチャープローブおよびレポータープローブは一方のテールまたは他方に、特異的かつ独占的に結合するように選択されるか、または設計され、それによって、２つのプローブのそれぞれがＰＮＡＳ/テールにハイブリダイズされるのを確実にしている。特異性のレベル数を増やすと測定の特異性は上昇するが（擬陽性なし）、過度の特異性のレベル数は感度を低下させるであろう（高い擬陰性）。本発明は、いかなる特定の核酸ターゲットにも対応できるように個別製造することができ、要望される特異性レベルのうちのいかなる種類もかなえることができる強力な診断技術である測定法を含む。核酸の単離核酸は当業者において周知の方法を用いて単離することができる。本明細書において用いられる核酸とは、細胞において発見される、または分子生物学的な手法で構築される全ての形のＤＮＡおよびＲＮＡの双方を意味する。使用されるＤＮＡ単離の方法は抽出される材料の量と種類に大きく依存するであろう。実際は、ゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡを調製する論文に報告されたどのＤＮＡ単離手法も、または市販されているどのＤＮＡ単離キットもその使用にかなうであろう。方法はそれぞれの測定に使用されるＤＮＡのサンプル量が、試験されるＤＮＡの溶解度に依存して０.１から１.０mLの範囲にはいる体積に濃縮されることを考慮する。大きなＤＮＡ試料にはより大きな液量の使用が必要であろう。本発明の方法は、ピコグラムからミリグラムにかけての量の核酸を試験することができる。反応の構成因子は、例えば、構成因子のハイブリダイゼーションに適する量が供されるように調整されるものとする。反応の構成因子は試験される試料の大きさだけでなく、存在するターゲット配列の相対数に対しても調整される。試料ＤＮＡの量は、試料の大きさと種類に依存するものであることが理解されるべきである。ＤＮＡは二重体または三重体形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯまたはＴＦＯ）またはペプチド核酸を使用した、二重体構造または三重体構造のようなＰＮＡＳの形成のために適する緩衝液中におかれる。全血、単離された血球、血清、血漿；新鮮な、凍結のまたは調製された組織；および組織培養細胞を含むいくつかの起源物質からの高分子量ＤＮＡを単離する多くの手法が報告されている。ＲＮＡもまた当業者において周知のどの方法でも単離できる。文献公知のＲＮＡ単離手法では、リボヌクレアーゼが変性する化学的環境下で細胞を溶解し、対象となる型のＲＮＡタイプを他のＲＮＡおよび他の細胞性巨大分子から分画する。使用されるＲＮＡ単離方法は、ＲＮＡが単離される細胞のタイプ型、およびＲＮＡの後の使用法に依存する。真核細胞の全ＲＮＡを調製するための文献公知の方法があり、その方法は本明細書において参考文献に組み込まれる。Favaloco他、1979、およびChomczynski と Sacchi,1987の方法では、細胞はグアニジンイソチオシアネートを使用して溶解する。この方法には微妙な操作が無く、多くの起源物質から純粋なＲＮＡが調製でき、高いレベルの内因性のＲＮＡseを持つ組織のために選択される方法である。Palmiter,1974の第三の方法では、細胞をフェノールおよびＳＤＳで溶解する。この方法では、大量の植物細胞から純粋な高分子量のＲＮＡが取得でき、またいくつかのほ乳類細胞および組織にも適用できる。原核細胞からの全ＲＮＡの調製のための、文献公知の方法には、プロテアーゼ消化、および蛋白質を除去する有機化学的抽出、およびＤＮＡを除去するヌクレアーゼ消化によるグラム陰性菌およびグラム陽性菌よりのＲＮＡの抽出法（Redd y他 1990）、および有機化学的抽出、プロテアーゼまたはヌクレアーゼ処理を用いないE.coliからの迅速なＲＮＡ単離のため単純な手法（Summers,1970）がある。最後に、AvivおよびLeder,1972の文献公知の方法で、メッセンジャーＲＮＡをリボゾームＲＮＡおよびトランスファーＲＮＡから、mＲＮＡ上のポリ(A)テールの過剰な存在に基づいて分画できるものが挙げられる。ＰＮＡＳ形成本発明の方法において、核酸の単離後の次の工程はＰＮＡＳの形成を含む。この工程は測定の第１レベルの特異性を誘導する。この工程は、ターゲット核酸配列−特異的ＴＦＯまたはＤＦＯまたはＰＮＡを使用したＰＮＡＳの形成を含む。以下、ＴＦＯが好ましい態様の実施例において使用されるが、本発明においては三重体および二重体構造およびＰＮＡが意図されていることが理解されるべきである。ＴＦＯの配列は検出する特定のターゲット配列に依存するであろう。よく特徴付けられた殆どの三重体構造は、二本鎖のホモプリン−ホモピリミジン螺旋と一本鎖のホモピリミジンのトラクトとで形成されたものである。このような構造の形成は当業界において周知である。このような構造の形成の特徴的な詳細は、本明細書における文献に組み込まれた以下の文献に記載されている。S.W.Blume，J .E.Gee,K.ShresthaおよびD.M.Miller、ヒトのジハイドロフォレートリダクターゼプロモーターをターゲットとするプリンに富んだオリゴヌクレオチドによる三重鎖構造、Nucl．Acids Res．20:1777 1784(1992)。三重螺旋の第一のタイプでは、第三のホモピリミジンの鎖が、ワトソン−クリックの二重螺旋ＤＮＡのホモプリン鎖に平行してホッグステイン（Hoogstein）水素結合を介して主要な溝に結合する。第三の鎖のチミジン（Ｔ）はＴ：Ａ：Ｔ三重体を形成するアデニン−チミン塩基対（Ａ：Ｔ）を認識し、Ｎ−３の位置に陽子を与えられた第三の鎖のシトシン（Ｃ）はＣ⁺：Ｇ：Ｃ三重体を形成するグアニジン−シトシン（Ｇ−Ｃ）塩基対を認識する。ホモプリンオリゴヌクレオチドはより大きな二重鎖ＤＮＡのホモプリン部位に関連した部分的三重体を形成するとみられてきた。他に対象となる三重体構造は、二本鎖螺旋ホモピリミジン− ホモプリンと一本鎖ホモプリンのトラクトのＴＦＯである。また他の代替可能な三重体構造には、上記２つの構造の組合せが含まれる。ＴＦＯの設計は前に記載したピリミジン−プリン−ピリミジン結合の原則に一般的には従い、必要に応じてプリン−プリン−ピリミジン三重体を形成するようにデザインされる。このような構造は当業界において周知である。しかし他の結合モチーフも適用し、その例は、４塩基領域におけるＩ. Rec Aの介するＴＦＯ結合（Rec Aは溶液中に存続する必要がある）、II．３量プリンおよび３量ピリミジンの三重体である。Rec Aは類似のホモロジーの２個のＤＮＡ鎖の組み替えを触媒する組み替え酵素である。以下の方法論に拘束されるものではないが、ＤＮＡの特定領域を診断に使用する目的で選択するＴＦＯの使用の前提としては、ターゲット配列から保存されているＤＮＡ配列を持つもの、ハイブリダイゼーションおよび選択が確実に行えるに充分な長さの配列を持つものが必要とされる。ヒトゲノムは約５×１０⁹塩基対のＤＮＡを持つ。独特の配列を得るためには、約１６から２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが必要である。実際のヌクレオチド数はＤＮＡのイントロン配列の存在によって、多分より少ないものである。長い配列は特異性を低下させる一方で、ＴＦＯとＤＮＡの間のハイブリダイゼーションを増加させる。ＴＦＯは、ターゲット領域におけるポリ−プリン／ピリミジンの強度についての研究実験に基づいて選択される。本発明の方法においてはＤＮＡ/蛋白質の相互反応のようないくつかの条件因子がＴＦＯのターゲット配列への結合を阻害するものであってはならない。また二次構造は温度に影響され得るもので、その温度はより効率的にＴＦＯの結合をなすものでなくてはならない。この配列はしばしば完全なホモプリン鎖ではなく、プリミジンを混在させている。ピリミジンの導入は二重体ＤＮＡに対するＴＦＯの親和性を低下させることがあるが、完全な配列は望ましいハイブリダイゼーション温度における選択的結合をまだ可能にする。三重体構造を形成する条件もまたターゲット配列に大きく依存するが、次の工程に使用されるヌクレアーゼに適合しなくてはならない。例えば、条件は、手順（次の章を参照のこと）における次の工程のために選択されるエキソヌクレアーゼIII（Ｅｘｏ III）および種々の制限エンドヌクレアーゼによる活性に合わせて調節される必要がある。三重体構造の形成を促進するには、低ｐＨ緩衝液（ｐＨ６.８から７.４）が適当であろう。これはまた、酵素消化工程における構造の安定化を促進するであろう。当業者において周知の、追加的な安定化の手法もまた採用できる。例えば、ＴＦＯは様々な状況においてよく機能する一方で、三重体形成に特有の２つの基本的な問題を持っている。第一としては、ＣＴモチーフについては三重体形成には酸性のpHが要求されることである。第二としては、認識配列はオリゴプリンに制限されることである。第一の問題は、当業者において教示されているような化学的改変によって核酸を変化させることにより解決されうる。J.S.Lee，L.J.Woo dsworth，P.Latimer、およびA.R.Morgan，中性ｐＨにおいて安定した三重体を形成する５−メチルシトシンを含むポリ（ピリミジン）ポリ（プリン）合成ＤＮＡ，Nucleic Acids Res．12:6603-6614(1984)を参照のこと。これは、５−メチル −ｄＣ、Ｃ−５プロピンピリミジン、６−メチル−８−オキソ−２’−デオキシアデノシン、または２’−Ｏ−メチルシュードシステインのような改変した塩基でｄＣを置換することで実施されている。他の解決策は、ターゲット配列との相互作用を増強し安定させるリンカーを添加することである。追加的な解決策として、ＴＦＯを三重体構造の形成が普通に進まない場合、それを可能にするように独特の化学基に結合させることもできる。高いイオン強度によって、またはマグネシウムのような陽イオンの存在によってだけでなく、三重螺旋複合体を挿入するベンゾピリドイオゾール（ＢＰＩ）誘導体と呼ばれる三重螺旋特異的リガンドによっても三重鎖ＤＮＡ複合体は安定化させることができる。本発明は当業界において周知のこれら全ての方法、および同様に機能する他の結合手法を熟慮している。低いｐＨ条件は、Ｅｘｏ IIIおよび殆どの制限エンドヌクレアーゼに、必ずしも最適ではないが、適応する。加えて、この条件は、次の消化工程に必要な上昇した温度（３７℃）における三重体の形成を可能にする。三重体構造の形成例を以下に示す。１０倍モル量を越える過剰のＴＦＯを単離したＤＮＡに添加し（１０pmolＴＦＯ／μgＤＮＡ）、１０分間で三重体構造を形成させる。ＤＮＡとＴＦＯを等量で混合させた場合、三重体の形成の反応速度は１５０〜３９０秒の半減時間（ｔ１／２）によって特徴づけられている。対照的に、ＴＦＯがＤＮＡの１０倍量であった場合は、反応速度はより早く、ｔ１／２は１９〜２８秒に減少した。三重体の形成速度は、１０⁶のオーダーの速度定数を持つ二重体の組み替え速度より、規模で約３オーダー遅いと判明している。三重体形成の速度定数に関連している発現活性化エネルギーは低く、負であった（Ｅ₁＝２６±１５ｋＪ／ｍｏｌ）。三重体形成の第一オーダーの速度定数（ｋ_- ₁ ）は温度に依存しており、１０^-7から１０^-5ｓ^-1の範囲にあり（それぞれ２０ ℃と３３℃において）、発現活性化エネルギーは大きく、正であった（Ｅ_-1＝３５５±３３ｋＪ／ｍｏｌ）。三重体形成の速度はまた緩衝液のイオン強度（Ｉ）への依存性がみられた（１７，２３，２４）。Ｉが１３７ｍＭから５７ｍＭに低下すると結合定数は６倍低下した。ＤＮＡの酵素消化本発明の方法におけるこの工程は、およそ少なくとも２０塩基対の５’テールがＰＮＡＳから上流および下流に形成されることを確実にするものである。これらのテールはキャプチャーおよび検出の工程において有用である。この工程はまた、結合していないＴＦＯ、ＤＦＯおよびＰＮＡ分子と同様に全ての非特異的核酸が消化され、それによって潜在的な擬陽性シグナルを減少させることを確実にする。より具体的には、ひとたびＰＮＡＳが形成され、安定化されれば、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの混合物がその混合物に添加される。エンドヌクレアーゼはターゲット核酸配列部位をその両側のおよそ２０塩基対（通常はより多く）を残して攻撃するように選択された配列特異的制限酵素である。ターゲット核酸配列がdsＤＮＡである場合、エキソヌクレアーゼはdsＤＮＡに依存し、特異的プローブとハイブリダイゼーションできるssＤＮＡの大きなトラクトを残して一本の鎖だけを消化する（３’から５’へ、または５’から３’へ）ものでなければならない。好ましい酵素（そして全ての例において使用されている酵素）はＥｘｏ IIIである。Ｅｘｏ IIIは２８,０００ダルトンの一量体の蛋白質で、遊離の３’−ＯＨ末端を持つdsＤＮＡからの段階的な３’から５’への５’ モノヌクレオチドの除去を触媒する。Ｅｘｏ IIIはまた固有の３’フォスファターゼ活性、およびＲＮＡseＨ活性を持っている。従ってＥｘｏ IIIは、ＲＮＡターゲット配列を使用する本発明の方法においても使用することができる。表１に示す酵素は本発明において使用され得るものである。本発明は、開示された酵素に制限されない。１；エンド＝エンドヌクレオリティック、エキソ＝エキソヌクレオリティック２；至適ｐＨ３；示されたオリゴヌクレオチドは主な反応産物である。オリゴ＝オリゴヌクレオチドモノ＝モノヌクレオチド４；ＵＶ照射二本鎖ＤＮＡＥｘｏIIIは多くのの供給元より適正な価格で購入することができ、ターゲットＤＮＡに適する望ましい一本鎖領域を形成するであろう。最も重要なのは、ＥｘｏIIIが三重体構造内のdsＤＮＡを消化せず、従ってターゲット配列を持つＰＮＡＳが消化から保護されるであろうということである。ＥｘｏIIIの１単位は３７℃、１０分で５０ngのゲノムＤＮＡを消化する。エンドヌクレアーゼの主な目的は、ＥｘｏIIIを補助するためにＴＦＯターゲット部位の近傍に遊離のdsＤＮＡ末端を作ることである。さらに、エンドヌクレアーゼ活性はサンプルＤＮＡの溶解性を高め、完全な消化が非特異的反応の原因である非ターゲットＤＮＡを排除する。いくつかの反応では、干渉しないヌクレアーゼによる前処理を、核酸の溶解性を高め、試験する溶液の量を少なくするのを助ける目的で施す。これにより、全長のゲノムＤＮＡの消化に必要なＥｘｏIIIの量を少なくすることができる。加えて、完全なエンドヌクレアーゼ消化が望まれる産物の取得に必ずしも必要でなくなる。最も単純な形式において、本発明の方法は、キャプチャーシステムのための分子、およびＰＮＡＳのターゲット同定のためのレポーター分子の同時導入による単一保護工程によって完成されうるもので、単一の特異性レベルによる測定法をもたらす。追加的なヌクレアーゼ工程は、非結合のＴＦＯおよび非特異的シグナルの干渉を防ぐのに必要であろう。特異性のレベルを上げるためには、さらなるオリゴヌクレオチドプローブを使用する工程がさらに追加できる。オリゴヌクレオチドプローブ−キャプチャーシステム本発明における更なる工程は、第二の特異性のレベルを含む。これらの工程は、（ビオチンまたはジゴキシゲニンのような）親和性分子を含むキャプチャープローブの消化済みＰＮＡＳ/テールへのハイブリダイゼーション、および複合体の、修飾された固相支持体（磁性粒子、マイクロタイタープレートまたは膜など）への結合を含む。この工程は非ターゲット核酸の除去だけでなく標識配列の濃縮、緩衝液の交換に使用可能であるため、より多くのサンプルを扱うことができるようになる。キャプチャープローブの配列は、ヌクレアーゼ消化工程で作られたＰＮＡＳに挿入されたひとつのss（一本鎖）ＤＮＡ領域に相補的（ワトソン−クリック塩基ペアリング）である。例えば、１０倍モル量を越える過剰のキャプチャープローブをＰＮＡＳ/テールに、特異的ハイブリダイゼーションに適当な条件下で添加することができる。このような条件は当業者に周知である。例えば、２.０ＭＮａＣｌ、０.２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４.５、５０℃で１時間の条件が使用可能である。ハイブリダイゼーションに続いて、修飾された固相支持体と共に、同条件下でさらに１時間インキュベートし、非結合の複合体を適当な方法で洗浄して（例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液にて８回）、複合体を精製する。この段階で、必要ならば、複合体を分離緩衝液にて支持体から分離することができる。このような条件は、当業者において周知である。例えば１.０ＭトリスＨＣｌ，ｐＨ９、０.５ｍＭＥＤＴＡにて２０分の条件が使える。親和性キャプチャーシステムの選択肢は数多くあり、当業において周知である。このようなキャプチャーシステムは、最もよく引用される２つのシステム、即ちビオチン（ストレプトアビジンと結合）およびジゴキシゲニン（Ｄｉｇ，ベーリンガーマンハイム社、抗Ｄｉｇ抗体と結合）を含むが、これに制限されない。しかし他の類似したいずれのシステムも使用可能である。固体の支持体の場合は、状況が類似している。修飾された膜（ナイロンなど）の使用は文献において広く利用されており、フィルムの露光、または光物質による写像（放射能または化学ルミネセンスのような）を利用した検出が要求されるとき、本発明において有用であろう。これらの支持体は、非放射性の色素産生基質を使用した有用酵素結合システム（アルカリフォスファターゼ［ＡＰ］またはホースラディッシュパーオキシダーゼ［ＨＲＰ］）にも有用である。固体の支持体の他の選択肢としては、修飾されたマイクロタイタープレートがある。これらのプレートはいくつかの起源物質の種類に適用できる。マイクロタイタープレートの利点のひとつは、自動の操作（すなわち、洗浄工程）および検出のオプション（放射能、紫外線および可視光線分光、および蛍光）のための多くのサポーティングシステムに使用できる点である。このシステムは比較的に少ない体積（１００〜２００μｌ／ウェル）に限られることに欠点がある。急激に一般的になりつつあるシステムが修飾された磁性粒子（Dynal）を使用する方法である。非磁性粒子（通常アガロースまたはセファロース）は長年、親和性キャプチャーおよび精製に使用されてきた。磁性粒子システムは本発明の方法に必要とされる操作に好ましいシステムであり、本明細書に示す実施例に使用されるシステムである。これらの粒子はストレプトアビジンおよび抗Ｄｉｇの双方で修飾することができる。特異性のこのレベルが許容できるものであるかという点においてこの測定法は完成されるものであろう。キャプチャープローブまたは保護分子はキャプチャーされたＰＮＡＳが検出されるように標識される。オリゴヌクレオチドプローブの検出本発明の方法における、特異性の第３レベルはレポータープローブの使用によって実施される。検出の特異的な仕組みが導入されるのもまたこの工程である。レポータープローブは、ヌクレアーゼ消化によってできたもう片方の一本鎖の末端（キャプチャーシステムの接合部に使用するものではない）に相補的な合成一本鎖オリゴヌクレオチドよりなる。この検出工程の組成物は採用する方法に大きく依存する。全ての検出法には、捕らえられたＰＮＡＳ上の特定の配列に結合したことが特異的に検出されるレポータープローブの存在が必要である。本発明にとっては、その方法が、積極的な結果が提示されるように、この特異的なプローブ−複合体の相互作用を検出するに十分の感度を持つことだけが求められる。オリゴヌクレオチドプローブの組成物は採用される検出方法に依存するであろう。プローブの直接的検出のためには、そのプローブはただ、オリゴヌクレオチドの特定の相互作用を検出できるいずれかの物理的方法によってその相互作用が検出されるＰＮＡＳ/テールの特定の配列に、相補的なヌクレオチドの特定の配列であろう。そのような検出技術の例は、結合したプローブの相対量を非結合のプローブを排除することなく直接測定することができる蛍光異方性法であろう。蛍光異方性法の場合は、結合したプローブの相対レベルを非結合のプローブを排除することなく直接測定することができる。分離に基づく方法はプローブの結合の平衡を乱し、間違った結果をもたらすであろう。異方性分光光度検出を使用した場合、遊離のまたは結合した物質の濃度は発色団における観察可能な変化によって（即ち、ハイブリダイゼーション後の分子量の変化によって）測定される。結合したフラクションはｆ_b＝（ｒ_obs−ｒ_in）／（ｒ_b−ｒ_in）と表記され、ここでｆ_b結合したフラクション、ｒ_inは初期の異方性、ｒ_obsはハイブリダイゼーション後に観察された異方性、ｒ_bは全結合を示す（過剰の結合剤にてプローブの小さな濃度を滴定して決定する）。この情報によって、小分子、巨大分子の双方の結合の反応速度が推測できる。この方法論は溶液中のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの観察に適用されてきており、ＴＰＡ測定法に使用されている。他の物理的方法には、蛋白質または核酸がその表面で特異的に反応したときの表面の物理的特性における変化を検出する水平波長技術が挙げられる。結合した、および遊離の標識オリゴヌクレオチドの分離をせずに特定の相互反応を測定することができる、使用可能な物理的方法は数多くある。オリゴヌクレオチドプローブの直接検出は、ターゲットのＤＮＡ三重体に特異的に結合したときシグナルを放つことが可能な標識でオリゴヌクレオチドが修飾された、ＰＮＡＳ/テール部分の５’テールに相補的なヌクレオチドの特定の配列を包含できる。特異的に検出するには、あらゆる非結合の直接標識オリゴヌクレオチドが、検出に先立って結合したものから分離されなくてはならないであろう。オリゴヌクレオチドに直接取り込むことができる標識の例は、その検出にシンチレーションまたはガンマカウンターを使用する³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、¹²⁶Ｉのような放射性アイソトープ；検出に蛍光光度計が使用できる蛍光染料；特定のトリガー反応によって、ルミノメーターで定量できる光を発することで検出可能な生物ルミネセンス、化学ルミネセンスまたは電気化学ルミネッセンス標識を含む。ヌクレオチド配列の標識の種々の標識の種類および方法は、当業者において周知である。これらの標識の様式の多くは、第１または第２の特異性を持つ既述の測定法に使用できる。いくつかの特定の標識やレポーターグループは以下に記載する。例えば、放射性の標識には、これに制限されるものではないが、³²Ｐ、³Ｈ、¹ ⁴ Ｃ、³⁵Ｓ、¹²⁵Ｉ、または¹³¹Ｉが挙げられる。³²Ｐはニックトランスレーション、末端標識または標識ヌクレオチドの取り込みによってプローブの配列に取り込むことができる。³Ｈ、¹⁴Ｃまたは³⁵Ｓ標識は、標識プレカーサーの取り込み、または化学的改変によって、プローブの配列に取り込むことができる。¹²⁵Ｉ、または¹³¹Ｉは化学的改変によって、プローブの配列に取り込むことができる。標識の検出は、シンチレーションカウント、ガンマ線光度計、またはオートラジオグラフィーのような方法で行うことができる。例えば¹³Ｃ、¹⁵Ｎまたは¹⁹Ｏのような標識は、質量または核磁気共鳴（ＮＭＲ）標識として使用できる。このような標識は質量分析またはＮＭＲによって検出できる。染料および蛍光料もプローブの標識に使用できる。染料の例には、エチジウムブロマイド、アクリジン、プロピジウムおよびその他の浸入型の染料、および４ ’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Sigma Chemical Company，St.louis，MO）あるいはその他の核酸染色製品が含まれる。蛍光料の例は、フルオレセインとその誘導体、フィコエリトリン、アロ−フィコシアニン、フィコシアニン、ロダマイン、テキサスレッドまたはその他の蛍光料製品が含まれる。蛍光料は通常化学的改変によって付着される。染料標識は分光光度計によって検出でき、蛍光料は蛍光検出器で検出できる。プローブは、酵素または親和性標識を提供するために発色料で代替的に標識しても良い。例えば、プローブはビオチン−アビジン反応に利用できるようにビオチン標識することができ、これはまた酵素または蛍光料のような標識と結合させることができる。プローブは、基質を加えることで発色の、または蛍光の反応を起こすことができるパーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、または他の酵素で標識することができる。例えば５−アミノ−２，３−ジハイドロ−１，４ −フタラジネジオン（ルミノール^TMとしても知られる）（Sigma Chemical Compa ny，St.louis，MO）のような添加物、およびｐ−ヒドロキシジフェニル（p-フェニルフェノールとして知られる）（Sigma Chemical Company，St.louis，MO）のような速度上昇剤が、ルミネセンス反応を通じてホースラディッシュパーオキシダーゼのような酵素を増幅するのに使用でき、また酵素の基質の発光性のまたは蛍光性のジオキセタン誘導体も使用できる。制限酵素部位のような酵素の認識部位を検出可能な標識を提供するためにプローブに組み込むことができる。標識はまた、何らかの標識をもつ改変された塩基または前駆体の取り込み、特異的な抗体、または免疫蛍光発光または免疫−酵素反応を含む様々な方法による結合した抗体複合体の検出によって検出可能な化学分子団を持つ改変された塩基の取り込み、を利用して作ることができる。このような標識は酵素連結免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の使用によって、または分光光度計の補助を伴う色変化の検出によって検出できる。他のレポーター群も使用できることは当業者において周知であると理解されるだろう。オリゴヌクレオチドプローブの間接的検出は、ＰＮＡＳ/テールの特定の配列に相補的な特定のヌクレオチド配列を含むことができ、ここで、このオリゴヌクレオチドは、ほかの特定の試薬または実体の存在下で検出できるシグナルを出すことができる試薬または実体によって修飾されている。間接的な検出システムの例は、オリゴヌクレオチドプローブの、結合パートナー、即ち、ビオチンまたはジゴキシゲニンのようなハプテン標識、または独特の核酸断片、核酸関連物質により独特に認識される得る独特の化学的構造物での共有結合的修飾であり、ここでアビジン、抗ジゴキシゲニン、または核酸の相補的鎖は、それ自体が直接的に標識され、特異的に結合した標識から遊離の標識を除去した後、物理的方法により検出できるものである。間接標識の他の例には、基質を検出可能な化合物に変換できるか、物理的方法で検出できるエネルギーを放散できる酵素で共有結合的に修飾されたオリゴヌクレオチドがある。間接的検出に使用できる酵素−基質の組合せの例としては、以下のものが挙げられる。１）脱リン酸化されるとａ）基質と異なる波長の光を吸収する、ｂ）特定の蛍光を発する、ｃ）ルミネセンスになる、ｄ）検出可能なシグナルを出す第二の基質を共に包含可能な第二の酵素のための基質になる、というような化合物になるリン酸化化合物の添加によって検出できるアルカリフォスファターゼなどのフォスファターゼ。２）適当な化合物の存在下で、ａ）基質と異なる波長の光を吸収する、ｂ）特定の蛍光を発する、ｃ）ルミネセンスになる、ｄ）検出可能なシグナルを出す第二の基質を共に包含可能な第二の酵素のための基質になる、といういうような化合物を産生できる反応産物をもたらす、例えば、ホースラディッシュパーオキシダーゼなどのパーオキシダーゼ。３）適当な基質および補因子の添加によって検出でき、結果として光を発するルシフェラーゼ。また、ルシフェラーゼは、リン酸の除去後ルシフェラーゼによってのみ活性化するリン酸化ルシフェリンを基質とする反応において第二の酵素として包含されることもできる。本明細書において列挙された特異的な酵素以外の他の加水分解酵素は間接的酵素標識として使用できる。本発明の方法は多量の核酸を含む、いかなるサイズのサンプルからも単一コピーまたは少ない数のコピーの核酸配列を検出するのに用いることができる。本発明の測定法の予期していなっかった利点は、多数の核酸サンプルを処理できる点、多量のサンプルにおいて配列の複雑な混合物中に少量の化合物しか作らない特定のヌクレオチド配列を検出し定量できる点にある。感度の限界は、特定のサンプルサイズから得ることができるターゲットの量に照らして可能な検出システムの評価により予測できる。核酸検出の非常に高感度なシステムは、フォトプロテインAquaLite（登録商標）に基づいたバイオルミネセンス技術である。この技術はActor他、(1996)J．NIH Res．8(10):62に記載されており、本明細書において参照文献としてその全容を組み込む。このシステムは、ハイブリダイゼーション免疫測定技術によりバックグラウンドのノイズ比に対して高いシグナルで３×１０⁶の特定のＤＮＡ配列を検出可能である。本発明の方法において、抗ジゴキシゲニン抗体にカップリングされたAquaLite （登録商標）のバイオルミネセンスコンジュゲートは、本発明の方法で使用される２〜３のジゴキシゲニン分子を含むジゴキシゲニン標識のレポータープローブを検出するのに使用される。現在は、バイオルミネセンス蛋白質によるシグナルの検出の最低検出限界は３×１０⁶シグナルが発生することを必要とする。ＰＣＲのような増幅型のシステムでは、選択された配列をこの検出のレベルに近づけるように増幅することが要求される。これに対し、本発明の方法を使用すれば、少なくとも３×１０⁶の特定の配列を含む大きなオリジナルサンプルから開始でき、直接に大きなサンプルから検出できるであろう。制限的工程はシグナル検出システムであって、本発明の方法の測定ではない。他の技術が最低検出限界を提供するのに使用できる。ＴＰＡとの連携でのシグナル増幅システムにより、単一遺伝子が１００μlほどの少量の血液サンプルからのＤＮＡサンプルで検出された。例えば、ＨＩＶ感染のごく初期の検出が本発明の方法によって可能になるであろう。ＴＰＡが無ければ、初期感染から６ヶ月の期間に感染者がＨＩＶに対する抗体を産生するまで、ＨＩＶの初期検出はできないであろう。ＴＰＡを使用すれば、ロイコフォレシスによって全白血球を単離し、ＤＮＡを抽出し（５００ｍｌの全血中ＤＮＡは約５〜８ｍｇ）、２〜３のジゴキシゲニンで標識したレポータープローブを使用した本発明の方法により測定し、抗ジゴキシゲニン抗体にカップリングされたAquaLite（登録商標）によってＨＩＶ配列を検出する手法で、想定されるＨＩＶ感染の直後に血液を試験することができる。初期サンプルにおいてシグナル検出システムのための配列が充分量なかったら、次の血液サンプルを取っておいてプールできる。なぜならＴＰＡはそのような大きなサンプルサイズの核酸に使用できるからである。この試験手法はＨＩＶ感染のごく初期の検出法を提供できるであろう。本発明は、ターゲットの核酸配列を含んでいると予測されるサンプルから単離された核酸配列の取得工程、ＰＮＡＳを形成するに適したハイブリダイズ条件下での保護分子の核酸配列との接触工程、ＰＮＡＳの検出工程を含むターゲット核酸配列の検出方法を含む。本法は更に、ＰＮＡＳの検出工程に先立って、１またはそれ以上のＰＮＡＳを含む単離核酸の、ＰＮＡＳ/テールを形成するような核溶解酵素による消化の工程、キャプチャー分子のＰＮＡＳ/テールへのハイブリダイゼーション工程を含んでもよい。追加的には、本法はＰＮＡＳの検出工程に先立って、レポーター分子のＰＮＡＳ/テールへのハイブリダイゼーション工程をさらに含んでもよい。ターゲット配列が含まれると推測されるサンプルからの単離核酸配列の取得工程、ＰＮＡＳを形成するに適するハイブリダイズ条件下での保護分子の核酸配列との接触工程、ＰＮＡＳ/テールを形成するような、核溶解酵素による１またはそれ以上のＰＮＡＳを含む単離核酸の消化工程、キャプチャー分子のＰＮＡＳ/テールへのハイブリダイゼーション工程、およびＰＮＡＳの検出工程、を含む特定の核酸配列の検出のための方法。本発明は、特定の核酸配列に結合することができる保護分子を含む、特定の核酸配列の検出のための組成物を含む。本発明の組成物はさらにキャプチャー分子を含んでもよい。加えて、本発明の組成物はさらにレポーター分子を含んでもよい。本発明の方法における手法の多様性上述のように本発明の方法は、大変多様な選択し得る方法を持ち、上記各工程をその方法の中で交換することができる。全ての方法はインシツ（in situ）（完全な細胞を使用）で行われ、顕微鏡的にまたはフローサイトメーターにて評価できる。加えて工程自体もまた好ましい結果が出るように改変されてもよい。例えば、第２工程（ＰＮＡＳの形成）および第３工程（対象外の核酸の消化）を単一の手法に統合することも可能である。これは、ＰＮＡＳの形成（第２工程）に望まれる条件が、保護プローブのターゲット配列への素速い結合をもたらすことによる（既述の三重体形成反応速度論を参照のこと）。保護構造の形成がエキソヌクレアーゼによる核酸の消化（第３工程）より有意に速い限りは、ターゲット配列を含む保護構造の完全な保護は保たれるであろう。第２工程における形成のための少なくとも約１０分のリードタイムが、保護プローブの結合が酵素によるＤＮＡの消化より優位に進むことを確実にするように加味されたが、殆どの場合その必要は無いであろう。同様に、第４工程および第５工程もまた、その間に精製工程を入れることなく、単一のハイブリダイゼーション／キャプチャー工程に統合ことができる。それぞれのプローブはそれ自身のターゲット配列に対して独特なものなので、誤ったシグナルを出すようなクロスハイブリダイゼーションの危険はないはずである。この可能性は、それぞれのプローブが異なる標識を持っている（即ち、Ｄｉｇを持つキャプチャー、対、ＦＩＴＣを持つレポーター）ということからも、さらに少なくなる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の手法は各工程で同一であるので、この２工程が統合されることは本発明の方法の工程の有意な単純化を提示するであろう。結局は方法の工程数は、要望される特異性のレベルに依存する。余分な工程は感度に悪影響を及ぼす。当業者において周知のこれらのことは、要望される特異性のレベル、およびその測定が発揮するレベルに配慮したものである。本発明の方法は、特定された遺伝子配列の検出に特に有用である。本発明は、非常に大量（＞１ｍｇ）の精製ＤＮＡの処理を可能にする利点を持つターゲット保護測定法（ＴＰＡ）のような方法を包含しており、これにより、ＰＣＲのような人為的な増幅手法を排除し、一本鎖のターゲット配列の検出を可能にしている。加えて、３つのレベルの特異性−ターゲット保護、キャプチャープローブおよびレポータープローブ−が、擬陽性ＤＮＡ増幅、および／またはハイブリダイゼーションのシグナルに関連するような技術的問題を大幅に減少している。本発明の方法は、ＨＬＡタイピングのような多形遺伝子配列の遺伝学的分析同様、ヒトおよび動物の病原体のようなウィルスおよびその他の微生物の検出に使用できる。本発明の方法は、細胞、微生物、動物、植物またはその他のあらゆる核酸を持つ生命体の分類の目的に使用可能である。特定の核酸配列の単離は、ヒト、動物、植物またはその他の生命体に見られる疾病の診断に使用可能であろう。本発明の方法は、法医学、父性の決定、または臓器または組織の移植、あるいは遺伝子疾患の解析に使用可能である。微生物の核酸配列は、これらに制限されるものではないが、ウィルス、細菌、マイコプラズマ、真菌類、ウィロイド、遅発ウィルス、およびスクラピー様生命体のような微生物からの核酸配列によって決定される。本発明の方法は核酸配列の検出に使用可能であり、従って、多くの目的に適用可能である。以下に本発明の方法の使用法を列挙する。感染性媒体の伝搬を防ぐための輸血血液の試験血液、血液製品、および、組織提供者の感染性媒体の検出ＨＩＶ感染状態の感染後早期における検出小児AIDSの診断の確認遺伝病の診断感染したヒト、動物、および植物の体液、または組織からの感染性疾病の早期検出。正常組織における腫瘍の早期検出胎児成育中のＩ型糖尿病の検出薬剤服用の前の薬剤耐性の決定法医学上の同定試験例えば、本発明の方法は、個体の体液よりの、および、表面、空気または水といった環境的材料よりのサンプルにおける核酸の検出に使用可能である。本発明の方法は、多量の核酸を含むサンプルから特定の核酸配列を単離できるため、核酸の起源材料は本明細書に既述された例に制限されるものではない。本発明の方法によって、あらゆる核酸の起源材料を採用することができる。本発明をさらに、下記の実施例によって説明するが、これらは請求の範囲に対して制限を課す様に解釈されるものではない。見方を変えれば、明らかに、多様な他の様態、変法および同等な方法が手段として存在し、本明細書に明らかなように、これらは本発明の精神、および／または付属の請求の範囲から離れることなく、当業者において示唆されるものであろう。実施例１三重体形成をともなったＰＮＡＳを持つdsＤＮＡターゲット配列を用いた、ターゲット保護測定法の一般的な様式ＤＮＡの単離以下に示す手順は、多量の全血からのＤＮＡの迅速な単離のための典型的な手法である。静脈穿刺チューブ（ヘパリン、ＡＣＤまたはＥＤＴＡ）に集めた１５０ｍｌの血液をプールし、５００ｍｌ遠心管中にて１５０ｍｌのＩｓｏｔｏｎII （Coulter Diagnostics）で希釈する。３０ｍｌの１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し３秒激しく撹拌する。細胞の核を最大速度（１２，０００×ｇ）、５分間で沈殿させる。上澄みを除いた後、沈殿を１０ｍｌのＰＫ混合液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８.０，１ｍＭＥＤＴＡ，０.５％Ｔｗｅｅｎ２０，０. ５％ＮＰ−４０, および２.５ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫ）で懸濁して、５５ ℃で１５分間、９５℃で１０分間、インキュベート（プロテアーゼＫのインキュベート）し、その後ゆっくり室温まで冷却する。それから、サンプルを遠心管に移し、１２，０００×ｇ、１０分間の遠心処理を行う。上澄みを回収し、０.２容量の１０Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容量のエタノールを添加して、ＤＮＡを析出させる。沈殿したＤＮＡは５，０００×ｇ、１０分間の処理で沈殿物とし７０％エタノールで２回洗浄し、それから、０.５ｍｌの滅菌水で再懸濁させる。緩やかに超音波をかけるか、振るかして、沈殿物を完全に溶解する。１５０ｍｌの全血（約１億５千万の有核細胞）より、約１ｍｇの全ゲノムＤＮＡが回収されるはずである。どのＲＮＡ調製技術も応用できる。三重体形成を介するＰＮＡＳの形成０.５ｍｌのＤＮＡサンプル水溶液に５０μｌの１０×ＴＦＯ緩衝液（０.２５ＭＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ７.０、０.５ＭＮａＣｌ、１００ｍＭＭｇＣｌ₂，５０ｍＭメルカプトエタノール、０.１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、および４０ｍＭスペルミン−ＨＣｌ）を添加し、次いで１０ｎｍｏｌの特異的ＴＦＯを添加する。次の工程に進む前に、安定なＰＮＡＳが形成されるに適した時間と温度で、例えば、３７℃で１０分間、インキュベートする。酵素消化各制限酵素を５００単位（殆どの場合５０μｌ）、および４，０００単位のＥｘｏIII（１００，０００ｕ／ｍｌストックの４０μｌ）を添加する。反応液を３７℃でさらに５０分間インキュベートする。この後、生化学的、または生物理学的方法で酵素を不活化する。これでサンプルは手順の次の工程への準備が完了する。キャプチャーシステム消化したＤＮＡ混合物に、１０ｎｍｏｌのＤｉｇ標識キャプチャープローブ、および０.５ｍｌの２.５×ハイブリダイゼーション緩衝液（５.０ＭＮａＣｌ, ０.５ＭＮａＯＡｃ，ｐＨ４.５）を添加する。この混合物を、最適ハイブリダイゼーション温度で、安定なハイブリダイズ複合体が形成されるに適当な時間、例えば、１時間、インキュベートする。続いて１００μｌの抗Ｄｉｇコート磁性粒子を添加し、洗浄しハイブリダイゼーション緩衝液で再懸濁する。さらに１時間インキュベートした後、粒子を磁性粒子収集機を用いて単離し、０.５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液で８回洗浄する。これでサンプルはＤＮＡ三重体ＴＰＡ手法の最終工程への準備が完了する。ＦＩＴＣ標識レポータープローブを使用し、蛍光異方性法を使って検出を実施する。ハイブリダイゼーション緩衝液に１０ｎｍｏｌのレポーター分子を含む溶液１.０ｍｌの初期異方性を測定した後、これに洗浄した磁性粒子を添加する。この混合物を緩やかに振盪しながら５０℃で１時間インキュベートし、続いて、全内容物（粒子を含む）をアボット（Ａｂｂｏｔｔ）ＴＤＭのサンプルバイアルに移す。そして分析のために、異方性を初期値に比較して再測定する。結合したフラクションはｆ_b＝（ｒ_obs−ｒ_in）／（ｒ_b−ｒ_in）と表記され、ここでｆ_bは結合したフラクション、ｒ_inは初期の異方性、ｒ_obsはハイブリダイゼーション後に観察された異方性、そしてｒ_bは全結合を示す（過剰の結合剤にてプローブの小さな濃度を滴定して決定する）。実施例２ＨＩＶヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ-1）はＡＩＤＳの２つの病原体のうちの１つである。最近では、抗ＨＩＶ抗体の存在を検出する血清学的測定法が、血液、および血液製品のスクリーニングに使用されている。全般的に信頼性がありながら、この試験は時折、クロス反応する抗体のために擬陽性の結果を、または、感染が測定可能な免疫反応の起こる前の初期段階である場合には擬陰性の結果をもたらす。後者の場合、代替的な方法としてＴＰＡ（ターゲット保護測定法、即ち、本発明の方法）が、多量のサンプルＤＮＡが一本の測定チューブで処理、および測定できる点で大変有用であろう。易感染の細胞株との同時培養によるウィルスの直接測定法が存在するが、この方法は作業が多く、完了に数日を要する。下記の実施例には、大量の血液の抽出について記載したが条件は最低に厳しく、サンプルは最近感染した患者のもので、感染ＣＤ４陽性細胞のレベルは低い。１.１５０ｍｌの全血（１億５千万の白血球を含む）から、実施例１に既述した通りにＤＮＡを抽出する。精製ＤＮＡを０.５ｍｌの水で再懸濁する。２.５０μｌの１０×ＴＦＯ緩衝液、および１０ｎｍｏｌのＴＦＯを添加する。ＨＩＶ−１ＴＦＯ：５’−ＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＴ−３’ ３.３７℃で１０分間インキュベートする。４.５００単位のＳａｕ３Ａ、および４，０００単位のＥｘｏ IIIを添加する。５.３７℃で５０分間、続いて、６０℃で２０分間インキュベートする。６.０.５ｍｌの２.５×ハイブリダイゼーション緩衝液、および１０ｎｍｏｌのＤｉｇ標識キャプチャープローブを添加する。ＨＩＶ−１キャプチャープローブ：５’−ＡＣＴＧＣＣＡＴＴＴＧＴＡＣＴＧＣＴＧＴ−Ｄｉｇ−３’ ７.５０℃で１時間インキュベートする。８.１００μｌの洗浄済みＤｉｇコート磁性粒子を添加する。９.５０℃で１時間、振盪しながらインキュベートする。１０.チューブを磁性収集機に置き、液体を除去する。１１.０.５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液にて８回洗浄する。１２.蛍光異方性をあらかじめ測定した、１０ｎｍｏｌのレポータープローブを含む１.０ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液に粒子を再懸濁する。ＨＩＶ−１レポータープローブ：５’−ＧＡＡＴＡＧＴＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＴＡ−ＦＩＴＣ−３’ １３.５０℃で１時間インキュベートする。１４.異方性を再測定し、上述の式によって結合プローブのフラクション（ｆ_b）を解析する。あるいは、工程１３の後、粒子を磁性粒子収集機を用いて再精製し、ハイブリダイゼーション緩衝液で８回洗浄して、蛍光計にかけて直接的な蛍光測定（−_ex _c ＝４９０ｎｍ、−_em＝５２０ｎｍ）をするか、または、粒子をスライド上に置いて蛍光顕微鏡で観察することもできる。実施例３ボレリアベルグドルフェリ（Borrelia bergdorferi）スピロヘータ B.bergdorferi はライム病の発症媒介体である。この媒介体は主に感染したダニに噛まれることによって伝搬し、関節系、神経系、およびリュウマチの症候群を引き起こし、臨床検査が難しい。この媒介体の主たる試験法は、血清学的なもの、および細菌の培養であるが、双方とも、特に病態初期において比較的感度が低い。試験材料の起源には、全血、血清、関節液、脳脊髄液、および尿がある。以下の手法は３０ｍｌの全血を対象としたものである。１.既述の実施例１と同様に３０ｍｌ全血（３千万の白血球を含む）よりＤＮＡを抽出する。精製ＤＮＡを０.５ｍｌの水に再懸濁する。２.５０μｌの１０×ＴＦＯ緩衝液、および２ｎｍｏｌのＴＦＯを添加する。ＴＦＯ：５’−ＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＣ−３’ ３.３７℃で１０分間、インキュベートする。４.１００単位のＳｓｐＩ、１００単位のＸｈｏＩ、および８００単位のＥｘｏ IIIを添加する。５.３７℃で５０分間、続いて６０℃で２０分間、インキュベートする。６.０．５ｍｌの２.５×ハイブリダイゼーション緩衝液、および２ｎｍｏｌのＤｉｇ標識キャプチャープローブを添加する。キャプチャープローブ：５’−ＣＣＡＧＧＣＡＡＡＴＣＴＡＣＴＧＡＡＡＣＧＣＴＧ−Ｄｉｇ −３’ ７.５０℃で１時間インキュベートする。８.２０μｌの洗浄済みＤｉｇコート磁性粒子を添加する。９.５０℃で１時間、振盪しながらインキュベートする。１０.チューブを磁性収集機に置き、溶液を除去する。１１.０.５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液にて８回洗浄する。１２.蛍光異方性をあらかじめ測定した、２ｎｍｏｌのレポータープローブを含む１.０ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液に粒子を再懸濁する。レポータープローブ：５’−ＴＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＴＴＡＡＡＧ−ＦＩＴＣ−３’ １３.５０℃にて１時間インキュベートする。１４.異方性を再測定し、上述の式によって結合プローブのフラクション（ｆ_b）を解析する。あるいは、工程１３の後、粒子を磁性粒子収集機を用いて再精製し、ハイブリダイゼーション緩衝液で８回洗浄して、蛍光計にかけて直接的な蛍光測定（−_ex _c ＝４９０ｎｍ、−_em＝５２０ｎｍ）をするか、または、粒子をスライド上に置いて蛍光顕微鏡で観察することもできる。実施例４Ｂ．デルマチチディス（B.dermatitidis） B.dermatitidisは、特に免疫機能に問題のある患者（臓器移植を受けた患者など）の間でその感染の範囲を広げている真菌類を代表するものである。従来の、真菌の病原体の試験は、血清学的なもの、および培養を含むもので、比較的時間を要し、感度も悪い。ＤＮＡに基づく試験（非ＰＣＲ）も報告されているが、試験前に病原体の初期培養が必要である。この病原体のためのＴＰＡ手法は、上記実施例に以下のような改変を加えたものである。０.３ｇの浸潤した酵母または菌糸体より、LeeおよびTaylorの方法（３９）にて、ＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡを０.５ｍｌの水に再懸濁する。三重体形成工程には、５’−ＴＴＣＣＴＣＣＧＴＣＧＴＣＣＧＣＧＣ−３’の配列のＴＦＯを１ｎｍｏｌ使用する。消化工程では、１００単位のＲｓａＩおよびＭｓｐＩと、８００単位のＥｘｏ IIIを使用する。５−ＧＧＴＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣ−Ｄｉｇ−３’の配列のＤｉｇ標識キャプチャープローブを１ｎｍｏｌ、および、キャプチャーのために５０μｌのＤｉｇコート磁性粒子を使用する。最後に、検出工程のために、５’−ＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＣＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＧＡＴ−ＦＩＴＣ−３’の配列のレポータープローブを１ｎｍｏｌ使用する。実施例５バベシアミクロチ（Babesia microti） B．microtiはヒトに感染する原生動物の病原体を感染せられたダニで、主に米国で見られる。これは、ニューイングランド沿岸で流行したナンタケット熱に関連する主要な原因媒体である。診断は主に、血清中の抗B．microti抗体の検出、または赤血球内の包有物の可視化に基づくものである。この媒体のためのＴＰＡ手法は、上述の実施例に以下のような改変を加えたものである。１.３０ｍｌ全血よりＤＮＡを抽出し、０.５ｍｌの水に再懸濁する。２.各工程に適した、それぞれ２ｎｍｏｌのプローブを用いる。ＴＦＯ：５’−ＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣＧＧＧＧ−３’ キャプチャー：５’−ＴＣＴＧＡＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＴＧＧＡＣＧＧＴ−Ｄｉｇ −５’ レポーター：５’−ＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＧ−ＦＩＴＣ−３’ ３.１００単位のＸｈｏＩおよびＭｕｎＩと、８００単位のＥｘｏ IIIを消化のために用いる。実施例６メチシリン耐性スタフィロコッカスアウレウス（Staphylococcus aureus） S.aureusのメチシリン耐性株は、抗生物質が医療に導入されてすぐに初めて単離された。耐性株は、ラクタム抗生物質に対して低い親和性を持つペニシリン結合蛋白質を産生し、病原体に耐性を与える。この蛋白質は獲得遺伝子ｍｅｃＡによって産生され、この遺伝子はＴＰＡ検出法のターゲットである（４５）。ＤＮＡは、感受性ディスク寒天培地（Nissui）上に生育した菌コロニーからCassiday らの方法（４６）により、または、上述のように直接、血液または血清から、単離される。下記の改変法は、S.aureusの薬剤耐性の株のための、上記のＴＰＡ手法に使用される。１.３０ｍｌ全血よりＤＮＡを抽出し、０.５ｍｌの水に再懸濁する。２.各工程に適したそれぞれ２ｎｍｏｌのプローブを使用する。ＴＦＯ：５’−ＣＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴ−３’ キャプチャー：５’−ＴＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＡＧＴＴＡＡＴＧＧＧＡ−Ｄｉｇ−５ ’ レポーター：５’−ＡＡＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧＴＧＴＣ−ＦＩＴＣ −３’ ３.消化のために、１００単位のＳａｌＩおよびＭｎｌＩ、そして８００単位のＥｘｏ IIIを使用する。実施例７測定における組合せ以下に、ターゲット核酸と保護分子の組合せを列挙する。本発明はこれらの実施例に制限を受けるものではなく、他の組合せが当業者によって使用されうる。１；”＋ＤＮＡ/ＲＮＡハイブリッドのための抗体”は結合の促進に使用することができる。２；ｐＨおよびイオン強度によって促進される結合３；ＰＮＡを加えることもできる。親和性分子の位置ｓｓＤＮＡプローブｓｓＤＮＡ上流５’ＤＮＡ（ターゲット核酸）テールに相同的なオリゴ５’プローブ（保護プローブ）テールに相同的なオリゴｓｓＲＮＡプローブｓｓＲＮＡ得られる５’ＤＮＡ（ターゲット核酸）テールに相同的なオリゴＲＮＡ（保護プローブ）テールに相同的なオリゴプローブがクロスリンクしたｓｓＲＮＡ抗体キャプチャーシステムに使用される抗体ハイブリッド蛋白質構造に対する抗体ＰＮＡ（ペプチド−核酸）ＴＦＯ（三重体を形成するオリゴ）ターゲットの５’フランク領域に相補的なオリゴＴＦＯ（三重体を形成するオリゴ）ターゲットの５’フランク領域に相補的なオリゴ５’ＤＮＡプローブテールに相補的なオリゴターゲットの５’フランク領域に相補的なオリゴＰＮＡに接合したオリゴＴＦＯ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）に接合したオリゴ配列特異的蛋白質レポーター分子の位置ｓｓＤＮＡプローブｓｓＤＮＡ下流５’ＤＮＡテールに相同的なオリゴ上流５’ＤＮＡテールに相同的なオリゴ生成された５’ＤＮＡテールに相同的なオリゴ５’プローブテールに相同的なオリゴｓｓＲＮＡｓｓＲＮＡプローブＲＮＡテール（プローブ）に相同的なオリゴプローブがクロスリンクしたｓｓＲＮＡ抗体キャプチャーシステムに使用される抗体ハイブリッド蛋白質構造に対する抗体ＰＮＡ（蛋白質−核酸）ＴＦＯ（三重体を形成するオリゴ）ターゲットの５’フランク領域に相補的なオリゴ５’ＤＮＡプローブテールに相補的なオリゴターゲットの５’フランク領域に相補的なオリゴＰＮＡに接合したオリゴＴＦＯに接合したオリゴ配列特異的蛋白質ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド蛋白質構造、つまりＲＮＡ保護プローブを伴うＤＮＡターゲットまたはＤＮＡ保護プローブを伴うＲＮＡターゲットのどちらか、に対する抗体がキャプチャーシステムとして使用できる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、第二のハイブリダイゼーション工程において使用できる。三重体を形成するオリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）は、第二のハイブリダイゼーション工程において使用できる。当然のことながら、前述は本発明の好ましい態様についてのみ関連したものであって、数多くの変法または選択肢が、付随する本発明の精神と範囲に反することなく作出可能であると理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．下記工程ａ）〜ｃ）を含むターゲット核酸配列の検出方法：ａ）ターゲット核酸配列を含むと推測されるサンプルから単離された核酸配列を取得する工程；ｂ）ＰＮＡＳを形成するに十分なハイブリダイズ条件下で保護分子と前記核酸配列を接触させる工程、および；ｃ）ＰＮＡＳを検出する工程。２．更に、ＰＮＡＳの検出工程に先立って、下記工程ａ）、ｂ）を含む請求の範囲第１項に記載の方法：ａ）１またはそれ以上のＰＮＡＳを含む前記単離核酸を、核溶解酵素によって消化して、ＰＮＡＳ/テールを形成する工程、および；ｂ）キャプチャー分子を前記ＰＮＡＳ/テールにハイブリダイズする工程。３．更に、ＰＮＡＳの検出工程に先立って、下記工程ａ）を含む請求の範囲第２項に記載の方法：ａ）レポーター分子を前記ＰＮＡＳ/テールにハイブリダイズする工程。４．前記ＰＮＡＳが三重体構造を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。５．前記ＰＮＡＳが二重体構造を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。６．前記ＰＮＡＳが蛋白質を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。７．前記ターゲット核酸配列が微生物の核酸を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。８．前記ターゲット核酸配列が微生物の核酸を含む、請求の範囲第２項に記載の方法。９．前記ターゲット核酸配列が微生物の核酸を含む、請求の範囲第３項に記載の方法。１０．前記微生物の核酸がウィルスの核酸を含む、請求の範囲第７項に記載の方法。１１．前記微生物の核酸がウィルスの核酸を含む、請求の範囲第８項に記載の方法。１２．前記微生物の核酸がウィルスの核酸を含む、請求の範囲第９項に記載の方法。１３．下記工程ａ）〜ｆ）を含む特定の核酸配列の検出方法。ａ）ターゲット核酸配列を含むと推測されるサンプルから単離された核酸配列を取得する工程；ｂ）ＰＮＡＳを形成するに十分なハイブリダイズ条件下で保護分子と前記核酸配列を接触させる工程；ｃ）１またはそれ以上のＰＮＡＳを含む前記単離核酸を、核溶解酵素によって消化して、ＰＮＡＳ/テールを形成する工程；ｄ）キャプチャー分子を前記ＰＮＡＳ/テールにハイブリダイズする工程；ｅ）レポーター分子を前記ＰＮＡＳ/テールにハイブリダイズする工程、および；ｆ）ＰＮＡＳを検出する工程。１４．前記ターゲット核酸配列が微生物の核酸を含む、請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．前記微生物の核酸がウィルスの核酸を含む、請求の範囲第１４項に記載の方法。１６．特定の核酸配列との結合が可能な保護分子を含む、核酸配列検出のための組成物。１７．更に、キャプチャー分子を含む、請求の範囲第１６項に記載の組成物。１８．更に、レポーター分子を含む、請求の範囲第１７項に記載の組成物。