JPH11507839A

JPH11507839A - Telomerase activity assay

Info

Publication number: JPH11507839A
Application number: JP9512229A
Authority: JP
Inventors: ハーレイ，カルバン，ビー．; キム，ナム，ウー; ウェインリッチ，スコット，エル．
Original assignee: ジェロンコーポレイション
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-07-13
Also published as: AU6380896A; WO1997015687A1

Abstract

(57)【要約】標本中のテロメラーゼ活性は、２つの反応プロトコールにより測定し得る。第一の反応は、テロメラーゼ基質からのテロメラーゼ基質延長生成物の生成を包含する。第二の反応は、テロメラーゼ基質延長生成物の複製及び／又は結合プローブにより生成される信号の増幅を包含する。ヒト体組織又は細胞標本中のテロメラーゼ活性の存在は癌の存在と正に相関し、患者における疾病又はその他の医学的状態、並びに疾病の進行又は寛解の経過の診断に用い得る。 (57) [Summary] Telomerase activity in a sample can be measured by two reaction protocols. The first reaction involves the production of a telomerase substrate extension product from the telomerase substrate. The second reaction involves replication of the telomerase substrate extension product and / or amplification of the signal generated by the bound probe. The presence of telomerase activity in human body tissue or cell specimens is positively correlated with the presence of cancer and can be used to diagnose disease or other medical conditions in patients, as well as the course of disease progression or remission.

Description

【発明の詳細な説明】テロメラーゼ活性検定本発明は、米国保健福祉省からの補助金下で政府の支持により成された。政府は本発明に一定の権利を有する。本出願は、ともに1993年11月12日提出の同時係属中の米国特許出願第08/151,4 77号及び第08/153,051号の一部継続である1994年 6月 7日提出の同時係属中の米国特許出願第08/255,774号の一部継続である1994年 9月28日提出の同時係属中の米国特許出願第08/315,214号の一部継続である1995年 6月 7日提出の同時係属中の米国特許出願第08/482,132号の一部継続である（前記の特許及び特許出願の各々の記載内容はすべて、参照により本明細書中に含まれる）。産業上の利用分野本発明はテロメラーゼに関するものであって、テロメラーゼ活性を同定し、測定するための検定及び物質を提供する。本発明は、分子生物学、化学、薬学、並びに医学的診断及び予後技術に関する。発明の背景テロメアは、染色体の安定化、位置調整及び複製に機能する真核生物染色体の末端の分化した構造である（Blackburn and Szostak，1984，Ann．Rev．Biochem ．53:163-194; Zakian，1989，Ann．Rev．Genetics 23:579-604; Blackburn，19 91 Nature 350:569-573）。全脊椎動物において、テロメアは５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’配列の数百〜数千のタンデム反復体及び関連タンパク質から成る（Blac kburn，1991; Moyzis et al.，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．85: 6622-6626）。染色体の末端制限断片（ＴＲＦ）のサザーンブロット分析は、細胞集団の全テロメアの複合長を提供する（Harley et al.，1990，Nature 345:45 8-460; Allsopp et al.，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:10114-10118; Vaziri et al.，1993，Am．J．Human Genetics 52:661-667）。今日までに調べられたすべての正常体細胞において、ＴＲＦ分析は、染色体が１分裂当たり約50 〜200 ヌクレオチドのテロメア配列を失い、これはＤＮＡポリメラーゼが直鎖ＤＮＡを末端まで複製することができないことと一致する（Harley et al.，1990; Allsopp et al.，1992; Vaziri et al.，1993; Watson，1972，Nature New Bio logy 239:197-201）。テロメアのこの短縮は、細胞がその分裂を数える有糸分裂時計であると提唱されており（Harley，1991，Mut．Res．256:271-282）、十分に短いテロメア（単数又は複数）は正常細胞における複製老化に対する信号であると考えられる（Al lsopp et al.，1992; Vaziri et al.，1993; Hastie et al.，1990，Nature 346 :866-868; Lindsey et al.，1991，Mut．Res．256:45-8; Wright and Shay，199 2，Trends Genetics 8:193-197）。これに対比して、今日までに調べられた不死の細胞の大多数が細胞分裂に伴うテロメアの長さ又は配列の正味の損失を示さず、これはテロメアの維持には細胞が複製老化を免れ、そして無期限に増殖する必要があることを示唆する（Counter et al.，1992，EMBO 11:1921-1929;Counter et al.，1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:2900-2940）。独特のリボヌクレオタンパク質ＤＮＡポリメラーゼであるテロメラーゼは、その酵素のＲＮＡ成分内に含有される配列を鋳型として用いることにより、染色体末端にテロメアＤＮＡを合成することが公知の唯一の酵素である（Greider and Blackburn，1985，Cell 43:405-413; Greider and Blackburn，1989，Nature 33 7:331-337; Y u et al.，1990，Nature 344:126-132; Blackburn，1992，Ann．Rev．Biochem． 61:113-129）。ヒトの細胞及び組織に関しては、テロメラーゼ活性は不死細胞株及び卵巣癌で同定されたが、しかし死を免れない細胞株又は正常非生殖系列組織においては生物学的有意レベル（多数の細胞分裂の間テロメア長をお維持するのに必要な）では検出されていない（Counter et al.，1992; Counter et al.，19 94; Morin，1989，Cell 59:521-529）。ＴＲＦ分析とともに、これらの結果は、テロメラーゼ活性がテロメア維持に直接関与し、これらの酵素と細胞不死との関連を示唆する。テロメラーゼ活性を検出するための、並びにテロメラーゼ活性を調節するか又はそれに影響を及ぼす化合物を同定するための方法は、テロメア長及びテロメラーゼ活性を対照又は測定することによる細胞老化及び不死化の治療又は診断のための方法とともに、記載されている（1993年11月25日に公開されたPCT 特許公告第93/23572号及び1995年 5月18日に公開された第95/13382号参照）（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に含まれる）。癌細胞は不死のためにテロメラーゼ活性を発現し且つ必要とし、大半の正常ヒト体細胞はテロメラーゼ活性を発現しないので、テロメラーゼ活性を阻害する化合物は癌治療に用い得る。テロメラーゼ活性を刺激又は活性化する化合物は、年齢関連疾患及び細胞老化に関連したその他の症状を治療するのに用い得る。細胞標本中のテロメラーゼ活性を検定するための公知の方法は、放射能標識化ヌクレオチドのテロメラーゼ基質中への取込みに依っている（Morin，1989）。慣用的検定は、オリゴヌクレオチド基質、標識のための放射性デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、並びに生成物の分解及び表示のためのゲル電気泳動を用いる。テロメラーゼは５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’テロメア反復体における最初のＧを付加後にＤＮＡを停止させ、ほどき得るため、ゲル上の生成物の特徴的パターンは延長オリゴヌクレオチド基質の６つのヌクレオチド梯子である。反復相は、基質の３’末端配列に依る；テロメラーゼは、どこで末端が反復しているかを認識して、連続反復配列を産生するよう合成する。テロメア配列オリゴヌクレオチドは有効なin vitro基質であるが、しかしテロメラーゼはさらに非テロメアＤＮＡ配列から成る基質を用いて反復体を合成する。このような方法を用いて、細胞の低張膨張及び物理的破裂による信頼できるテロメラーゼ抽出には少なくとも10⁷〜10⁸細胞を要し、抽出効率は細胞の種類によって変化することを科学者は見出した（Counter et al.，1992; Morin，1989）。慣用的検定と比較した場合、テロメラーゼ活性の検出の感度、速度及び効率の増大がテロメラーゼ活性検定には必要であり、本発明はその要求をかなえる。本発明の要約本発明の目的は、小規模（又は低予算）臨床環境でも十分用いうるほど簡単ではあるがしかし容易に利用可能なロボット工学技術を用いる高スループットに関する可能性を有する、テロメラーゼ活性を検出するための容易に再現可能な検出系を提供することである。本検定は、診断又は予後のために、又はテロメラーゼ阻害剤として作用する分子の同定、スクリーニング及び発現に用い得る。本発明はさらに、本発明の実施に有用な試薬、キット並びに関連の方法及び物質を提供し得る。本発明の一局面において、以下の：（ａ）テロメア反復配列の付加によりテロメラーゼが上記のテロメラーゼ基質の延長を触媒し得るような条件下でテロメラーゼ基質を包含する反応混合物中で細胞標本又はそれから得られる抽出物をインキュベートし；（ｂ）延長テロメラーゼ基質を複製し；そして（ｃ）細胞標本中のテロメラーゼ活性の存在を延長テロメラーゼ基質の存在と、並びに細胞標本中のテロメラーゼ活性の非存在を延長テロメラーゼ基質の非存在と相関させる工程から成る方法が提供される。一実施態様では、本方法は、例えば非イオン性及び／又は両イオン性洗剤から成る緩衝剤を用いた細胞標本からの、もしあれば、テロメラーゼ活性の抽出を包含する。抽出テロメラーゼを用いて、テロメラーゼ基質延長反応におけるテロメラーゼ基質の延長を媒介する。あるいは、基質が標本中の細胞にインターナライズされ、次いでテロメラーゼによりin situ に延長される場合には、テロメラーゼ活性はin situ に検出される。延長テロメラーゼ基質は、多数の方法により検出し得る。一実施態様では、特異的ハイブリダイゼーション及びその後のテロメア反復配列と相補的なオリゴヌクレオチド「プライマー」の延長の前に、延長テロメラーゼ基質を複製する。本発明の多数の有用な試薬は、この段階に関する。典型的には、プライマー延長は鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ又はリガーゼを用いて媒介され、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによるプライマーへのヌクレオチドの付加により延長される。この段階に用いられるＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。このようなポリメラーゼを用いて、各周期が（１）反応混合物を加熱して二本鎖ＤＮＡ分子を変性し；そして（２）反応混合物を相補的核酸がハイブリダイズし、ポリメラーゼを不活性化することなくポリメラーゼがプライマーを延長し得る温度に冷却する工程から成る多周期プライマー延長を実施し得る。本方法のこの実施態様では、反応混合物中のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための２つのプライマーのうちの１つとして役立つ余分量のテロメラーゼ基質を有し、加熱及び冷却工程を５回、１０回、１５回、２０回、３０回又はそれ以上実施することによる強力なＰＣＲ技術の利益を得ることができる。ＰＣＲ実施態様では、テロメラーゼ基質はテロメラーゼ反復体を欠いてプライマー二量体形成を最小限にする。あるいは、プライマーがＤＮＡリガーゼによるオリゴデオキシリボヌクレオチドのプライマーへの付加により延長されるように、鋳型依存性ＤＮＡリガーゼによりプライマー延長は媒介される。典型的には、ＤＮＡリガーゼは熱安定性ＤＮＡリガーゼであって、（１）反応混合物を加熱して二本鎖ＤＮＡ分子を変性し；そして（２）反応混合物を相補的核酸がハイブリダイズし、結紮によりリガーゼがプライマーを延長し得る温度に冷却することにより、プライマー延長工程を実施し得る。本方法のこの実施態様では、反応混合物中の延長プライマーと相補的なオリゴヌクレオチド（「リゴマー」）を有し、加熱及び冷却工程を５回、１０回、１５回、２０回、３０回又はそれ以上実施することによる強力なリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）技術の利益を得ることができる。本発明はさらに、本発明の実施に有用なオリゴヌクレオチド、プライマー及びオリゴマーのような多数の試薬を提供する。例えば、ＰＣＲを用いて核酸を増幅する場合には、非特異的物質が生成しないようにする必要がある。このような物質は、「プライマー二量体」を生成する工程で用いられるプライマーの相互作用による方法を含めた種々の方法により生成し得る。本発明は、特にプライマー二量体生成の問題を最小限にするよう意図されたプライマー及び反応条件を提供する。別の局面において、本発明は、最大プライマー延長生成物のサイズをテロメラーゼ基質のテロメラーゼ媒介延長の最大生成物より大きいテロメア反復体の限定数以下に制限するプライマーを提供する。定量的テロメラーゼ分析に用い得る対照核酸も提供される。さらに別の実施態様では、本方法は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成物の多重ＲＮＡコピーを合成することにより、延長テロメラーゼ生成物を検出する。この場合、テロメラーゼ延長生成物は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列を含有する。したがって、以下の：（ａ）テロメラーゼがテロメア反復配列の付加によりテロメラーゼ基質の延長を触媒し得るテロメラーゼ基質及び緩衝剤を含有する反応混合物中で細胞標本又はそれから得られる抽出物をインキュベートし；（ｂ）延長テロメラーゼ基質が反応混合物中に存在する場合には、ＲＮＡポリメラーゼが延長テロメラーゼ基質のＲＮＡコピーを生成するような条件下でテロメラーゼ基質と操作可能的に結合されるプロモーター配列を認識する鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼを反応混合物に付加し；そして（ｃ）細胞標本中のテロメラーゼ活性の存在を延長テロメラーゼ基質のＲＮＡコピーの存在と、及び細胞標本中のテロメラーゼ活性の非存在をＲＮＡコピーの非存在と相関させる工程から成る方法が提供される。一実施態様では、逆転写酵素を用いてＲＮＡのＤＮＡコピーを作製することにより、延長テロメラーゼ基質のＲＮＡコピーを複製し得る。本発明のさらに別の局面では、以下の：（ａ）テロメラーゼがテロメア反復配列の付加によりテロメラーゼ基質の延長を触媒し得るテロメラーゼ基質及び緩衝剤を含有する反応混合物中で細胞標本又はそれから得られる抽出物をインキュベートし；（ｂ）テロメラーゼ基質を固定化し；（ｃ）反応混合物中に延長テロメラーゼ基質が存在する場合には、プローブが延長テロメラーゼ基質とハイブリダイズするような条件下で、それと特異的にハイブリダイズするのに十分に延長テロメラーゼ基質と相補的な配列を包含するプローブを反応混合物に付加し；そして（ｄ）細胞標本中のテロメラーゼ活性の存在と延長テロメラーゼ基質とハイブリダイズされたプローブの存在とを、並びに細胞標本中のテロメラーゼ活性の非存在とプローブのハイブリダイゼーションの非存在とを相関させる工程から成る方法が提供される。好ましい実施態様では、分枝鎖ＤＮＡプローブを用いることにより、信号増幅を達成する。このような分枝鎖ＤＮＡプローブは、標的核酸増幅を用いてあるいは用いずに使用し得る。複製方法に関係なく、種々の試薬を標識して、テロメラーゼ延長化テロメラーゼ基質の同定及び定量を促進し得る。本発明はさらに、テロメラーゼ活性検定に有用な試薬の新規の立体配置及び本発明の実施を促進するためのそれらの試薬を包含するキットを提供する。キットは、使用説明書の付いたあるいは付かないテロメラーゼ基質を包含する。好ましいキットは、以下の試薬を包含する：ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液（10 mM Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ，pH7.5 ；1 mM ＭｇＣｌ₂；1 mM ＥＧＴＡ；0.1mM ベンザミジン（ＡＥＢＳＦ、ＰＭＳＦ又は同様の試薬をベンザミジンの代わりに、又はそれに付加して用い得る）；5 mM β−メルカプトエタノール；0.5 ％ＣＨＡＰＳ；10％グリセロール）、10ｘＴＲＡＰ反応緩衝液（200 mM Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，pH 8.3；15 mM ＭｇＣｌ₂；630mMＫＣｌ；0.05％Ｔｗｅｅｎ２０；10mM ＥＧＴＡ；1 mg/ml ＢＳＡ）、50ｘｄＮＴＰミックス（2.5 mM ｄＡＴＰ、2.5 mM ｄＧＴＰ、2.5 mM ｄＣＴＰ及び2.5 mM ｄＴＴＰ）、ＴＳプライマー（0.25 μg/μl）、水（ＰＣＲ等級；プロテアーゼ、ＤＮアーゼ及びＲＮアーゼ−無含有）、陽性対照細胞ペレット（10⁶細胞）又は種々の量のテロメラーゼ活性を有する多数の型の細胞のパネル、ＴＲＡＰプライマーミックス（例えばＡＣＸ 0.1 μg/μl ；ＮＴ 0.1 μg/μl ；ＴＳＮＴ 0.01 amol/ μl）並びに定量基準（例えば、ＴＳＲ８；0.1 amol/μl）。本発明のさらに別の局面では、テロメラーゼ活性の高スループット検出を可能にする検定系及び装置が提供される。本検定系及び装置は、多数の標本中のプライマー及びヌクレオチドからのテロメラーゼ生成物の同時分離を提供し、単離テロメラーゼ生成物の定量的検出を可能にする。本発明の方法はあらゆる起源のあらゆる標本中のテロメラーゼ活性の検出に広範に適用可能であるが、本方法は特に、ヒトから得られる生物学的物質の標本中のテロメラーゼ活性の検出に有用であり、且つそれに適用し得る。このような標本は、細胞又は細胞性物質を含有し、典型的には疾病化状態又はその他の当該する医学的状態、例えば癌を検出する目的のためにヒトから得られる。テロメラーゼは、大半の正常生後ヒト体細胞には発現されないが、しかしある種の幹細胞、造血系の活性化細胞及び胎児組織で検出され、したがってヒト体組織又は細胞の標本中のテロメラーゼ活性の存在は、延長増殖能力を有する細胞、例えば不死細胞、胎児細胞又は造血細胞が組織中に存在することを示す。すべての癌細胞がテロメラーゼ活性を発現するというわけではないが、テロメラーゼ発現は細胞が不死になるには必要である。その結果として、テロメラーゼ活性を有する細胞の存在は癌の多数の形態と関連があり、特に侵襲性又は転移性の形態の癌が存在することを示すのに役立つ可能性がある。したがって、本発明は、細胞内のテロメラーゼ活性の上昇（又は低下）を伴う患者における症状の診断方法を提供する。本方法は患者の細胞内のテロメラーゼ活性の存在又は量を確定することに関与し、したがって、本方法は、例えば前立腺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、肝臓癌、卵巣癌、頸部癌、肺癌、尿生殖器癌及び白血病に、レベル低下の場合には不妊症に関連したテロメラーゼ活性レベルの上昇（又は低下）の検出に適用できる。本方法はさらに、その他の疾患状態及び医学的状態を試験するために、例えば妊娠の指標としての母体血液中の胎児細胞を検出するための、又は骨髄増殖能力に関するマーカーとしてのテロメラーゼを検出するための胎児細胞検査に用い得る。診断でもその他の目的でも、本方法は、テロメラーゼ基質延長反応による細胞内のテロメラーゼ活性の存在又は量を確定し、そして例えばＰＣＲの場合のように、プライマー延長により延長テロメラーゼ基質を複製することを包含する。本発明のこれらの及びその他の局面は、本明細書の一部を構成する図面とともに、以下の特定の実施耐容の詳細な説明を参照することにより良好に理解される。図面の簡単な説明図１Ａは、本発明のMultiplex Electrophoretic Separator（ＭＥＳ）装置の透視図である。平行矢印は、電極を電源に取り付けた場合の電場の方向を示す。図１Ｂは、ＭＥＳ装置の横断図である。特定の実施態様の説明本発明は、テロメラーゼ活性の検出のための新規の方法及び物質を提供する。テロメラーゼは染色体の末端にテロメアＤＮＡを合成し、不死細胞の無限増殖に必要であると考えられる。広範な種類のヒト細胞における染色体末端制限断片（ＴＲＦ）の分析は、テロメアの長さ及び配列が不死細胞中では安定して維持されるが、正常体細胞の分裂培養中ではそうではないことを示した。テロメア及びテロメラーゼ生物学は、不死細胞状態及びその他の生物学的状態の維持に明らかに重要である。したがって、本発明の一局面において、以下の：（ａ）テロメア反復配列の付加によりテロメラーゼがテロメラーゼ基質の延長を触媒し得るような条件下でテロメラーゼ基質を包含する反応混合物中で細胞標本又はそれから得られる抽出物をインキュベートし；（ｂ）延長テロメラーゼ基質を複製し；そして（ｃ）細胞標本中のテロメラーゼ活性の存在を延長テロメラーゼ基質の存在と相関させる工程から成る方法が提供される。本方法は、本質的には２つの反応を包含する：（１）テロメラーゼ基質のテロメラーゼ媒介延長；及び（２）テロメラーゼ延長化基質の複製。本発明をもっと完全に理解するためには、（１）標本の性質；（２）テロメラーゼ基質の重要な特徴；及び（３）テロメラーゼ延長化基質の複製の性質に関する一定の全体的問題を考慮する必要がある。標本の性質本発明の方法により、あらゆる種類の標本を試験し得る。特定の興味を有する標本は、診断分析のために採取された細胞標本（組織又は腫瘍標本である場合もある）を含む。種々の細胞中のテロメラーゼ活性の発現が調べられ、科学文献で考察されている。テロメラーゼはある種の病因（即ち、マラリア、真菌、酵母菌及び繊毛虫類）によるだけでなく、ある種の腫瘍及び癌細胞を含めた不死ヒト細胞によっても発現されるが、正常体（生殖細胞株又は胚に対するものとして）組織の細胞によっては発現されないが、しかし低レベルのテロメラーゼ活性は、幹細胞、胎児細胞で、並びに造血系のある種の活性化細胞で検出され得る。その結果として、テロメラーゼ発現病因かあるいは癌又は腫瘍細胞が存在するか否かを確定するために、標本が採取される。このような目的のために、標本はしばしばヒトから採取されるが、本発明の方法により試験される標本は、農業的に重要な物質、例えば畜牛、ウマ、ヒツジ又は獣医学的に興味のある他のあらゆる動物、例えばネコ及びイヌから、並びに環境から、即ち病因の存在に関する環境的試験のために得られる。本発明の一実施態様では、テロメラーゼ活性はin vitroで検定され、細胞抽出物の調製を要する。細胞抽出物の調製方法は、当業界で公知である（例えば、Sc opes，1987，Protein Purification: Principles and Practice，Second Editio n，Springer-Verlag，N.Y.参照）。好ましくは、細胞数が少ない場合でもテロメラーゼのより均一な抽出を提供する洗剤溶解法を用いる。本方法は、（１）細胞の標本を採集し；（２）0.01〜５％の非イオン性及び／又は両イオン性洗剤を含有する溶解緩衝液中で標本を溶解し；（３）遠心分離により細胞屑を除去し；そして（４）細胞屑から分離した上清を採集する工程から成る。このような方法を下記の実施例１で説明する。細胞標本を溶解してテロメラーゼを放出させるだけで、さらに標本を調製せずに細胞抽出物を調製し得る。本方法には、広範な非イオン性及び／又は両イオン性洗剤を用い得る。好ましい非イオン性洗剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ、ＮＰ−４０、ｎ−オクチルグリコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、オクタノイル −Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−８）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０）及びイソトリデシル−ポリ（エチレングリコールエーテル）_n が挙げられる。好ましい両イオン性洗剤としては、ＣＨＡＰＳ（３−｛（３− コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ｝−１−プロパン−スルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−｛（３−コラミドプロピル）ジメチル−アンモニオ｝−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルホネート）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル− ３−アンモニオ−１−プロパン−スルホネート及びジギトニンが挙げられる。ＣＨＡＰＳが特に好ましい洗剤である。洗剤の正確な量は重要でないが、テロメラーゼ活性の抽出増強を観察するには、典型的には0.5 ％で十分である。細胞抽出物の検定は洗剤溶解法を用いて得られた抽出物に限定去れないが、特に単一細胞からテロメラーゼ活性を検定する場合、２〜３個の細胞しか利用できない場合、標本中のテロメラーゼ活性を発現する細胞の数が非常に少ない場合には、このような抽出物が好ましい。本発明のテロメラーゼ活性検定は、このような環境でテロメラーゼ活性を検出するに際して、慣用的検定よりはるかに優れており、迅速に完了し、より効率よく実施し得る。本発明の別の局面では、テロメラーゼ活性検定は、無傷細胞に適用し得る。この実施態様では、テロメラーゼ基質で無傷細胞を処理して基質の内在化を促進し、その後、細胞が機能的テロメラーゼ活性を有する場合には、基質を延長し得る。基質の内在化は、当業界で公知の方法、例えば細胞標本周囲の媒質に付加される基質オリゴヌクレオチド又はその他の核酸の受動的内在化により（典型的には10〜100 μM の濃度で）、洗剤又はStaphylococcus α毒素を用いるマイクロポレーションにより、リポソームを用いて（例えば、BRL から販売されているLipofectAmine^TM、Lipofectin^T ^M 、LipofectAce^TM）、biolisticsを用いて、又はエレクトロポレーションにより達成し得る。細胞が標的ＤＮＡを内在化した後、標本をインキュベートして、細胞中に存在するあらゆる活性テロメラーゼがテロメア反復体のde novo 合成により基質を延長するのを可能にする。インキュベーション後、標本を固定し、例えばプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫ、プロナーゼ、トリプシン、ペプシン等を用いて処理することにより、透過性にする。次に、当業界で公知の種々の方法により、例えばプライマー延長反応（例えば確立されたＰＣＲ又はＬＣＲプロトコールを、あるいは予備in situ 標識化（PRINS; Koch，J.，in”Nonradioact ive in situ; Hybridization Application Manual”(1992)，Boehringer Mannhe im，31-33）を用いる）を用いて、又は下記のその他の方法により、テロメラーゼ延長化基質を増幅する。顕微鏡検査中の細胞における信号の存在は、テロメラーゼ活性の存在に対応する。テロメラーゼ基質の重要な特徴標本の起源に関係なく、テロメラーゼ基質を含有する反応混合物中で標本（又はそのアリコート）を検定する。各々の場合に選択される特定のテロメラーゼ基質は、試験中のテロメラーゼ活性の種類又は起源、あるいは使用する増幅又は検出方法に依って変化し得る。ある生物体が発現するテロメラーゼ活性は、基質特異性に関して、別の生物体が発現するものとは異なる。その結果として、本発明の方法を用いてヒト起源の癌細胞が標本中に存在するか否かを確定する場合には、ヒトテロメラーゼにより認識されるテロメラーゼ基質を用いる。テトラヒメナTetrahymena 、その他の真菌類、哺乳類及びヒト細胞のテロメラーゼに関しては種々の基質が公知であり、他の型の細胞に対して容易に同定し得る。しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼベースのプライマー延長工程を用いる場合、本発明の方法は、プライマー二量体形成を最小限にするために、テロメラーゼ基質が完全テロメア反復配列を包含しないことが必要である。テロメラーゼ活性により生成されるテロメア反復配列はテロメラーゼの起源に依っているということを、当業者は認識する。例えば、テトラヒメナテロメラーゼはテロメラーゼ基質の末端に配列５’−ＴＴＧＧＧＧ−３’の反復体を付加するが、一方ヒトテロメラーゼは配列５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’の反復体を付加する。したがって、本発明の方法を用いてヒトテロメラーゼ活性を検定する場合、テロメラーゼ基質は完全反復配列５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’を欠いたヒトテロメラーゼ基質であるべきである。その異なる反復配列の存在が望ましくない結果、例えばさらに下記で考察するような余分のプライマー二量体形成を生じない限り、ヒトテロメラーゼ基質が異なる反復体を付加するテロメラーゼを有する生物体からのテロメア反復配列を欠くという要件はない。線状一本鎖又は二本鎖核酸の他に、基質は、誘発的に又は特発的に特異的部位で線状化を受ける環状プラスミドＤＮＡであり得る。このようなプラスミド基質は、in situ 適用に特に有用である。プラスミドテロメラーゼ基質の例としては、テロメラーゼ基質配列に対して３’に位置する独自の制限部位（例えばＩｓｃｅＩ）を有する挿入物を含有するベクターが挙げられる。この場合、「独自の」とは、制限部位が分析中の細胞のゲノム中に存在しないことを意味する。好ましくは、ベクターは、哺乳類起源の複製による選択可能な、多重コピーベクターである。本方法はさらに、誘導プロモーターの制御下で、独自の部位に特異的な制限酵素をコードする遺伝子を含有する二次発現プラスミドを含む。２つのプラスミドは、当業界で公知の方法により標的細胞に同時感染し、複製される。発現プラスミド生成物の誘導に際して、制限酵素は独自の制限部位でテロメラーゼ基質プラスミドのＤＮＡを切断して、線状化基質プラスミドを生じ、この末端はテロメラーゼ基質として認識され、テロメラーゼによりＴＴＡＧＧＧ反復体で延長される。いくつかの場合、特に本発明の複製工程がプライマー又はプローブの延長テロメラーゼ基質とのハイブリダイゼーションを包含する場合には、テロメラーゼ基質はテロメア反復配列を欠く必要がある。例えば、いくつかの実施態様では、非テロメラーゼ媒介性プライマー延長反応は、延長テロメラーゼ基質とのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションを包含する。この付加は、延長テロメラーゼ基質が存在する場合には、プライマーは延長基質と結合し、次いで酵素作用により延長されるような条件下で成される。テロメラーゼはテロメア反復体の付加によってのみテロメラーゼ基質を延長し得るため、プライマーはテロメア反復体と相補的な配列を必ず包含する。テロメラーゼ延長反応に用いたテロメラーゼ基質が完全テロメア反復体を包含した場合には、プライマー延長反応に用いたプライマーは非延長テロメラーゼ基質と容易にハイブリダイズして、負の結果を生じる可能性がある。しかしながら、テロメラーゼ基質はテロメア反復配列と高度に関連した配列を包含し、得られた結果の妥当性を危うくすることはない。例えば、本発明の特に好ましいヒトテロメラーゼ基質は、ヒトテロメア反復体の６つの塩基の内の５つと同一のその３’末端の配列を含有するが、そうでなければ完全テロメア反復配列を含有しない、ＴＳとしても公知のオリゴヌクレオチドＭ２である。複製又は検出方法が基質中のこのような反復体の存在により危うくされない場合、即ちプライマー延長がリガーゼ活性により媒介されるか、又は複製がプローブ又はプライマーのテロメア反復配列との特異的ハイブリダイゼーションが問題とならない手段により達成される場合は、テロメラーゼ基質がテロメア反復配列を含有しないという要件はない。検出を増強するためのテロメラーゼ延長化基質の複製（ｉ）プライマー延長テロメラーゼ基質延長後に実施するプライマー延長反応は、二次信号（延長プライマー）を発生することにより標本（延長化テロメラーゼ基質）中のテロメラーゼ活性の存在により生じる信号を増幅するのに役立つ。プライマー延長が起こるために延長化テロメラーゼ基質の存在を必要とするあらゆる手段により、プライマーを延長し得る；好ましい手段は、鋳型依存性ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、鋳型依存性ＤＮＡリガーゼ、又はその２つの組合せにより媒介される。これらの手段を用いて、テロメラーゼ活性が標本中に認められる場合には、延長化テロメラーゼ基質を生成し、次いでプライマーとハイブリダイズして、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼあるいはＤＮＡリガーゼがプライマー延長生成物を生じるための基質を提供する。プライマー延長生成物が一旦形成されれば、延長基質から延長プライマーを解離し得る（典型的には、加熱によるが、しかし酵素又は化学的方法、例えばヘリカーゼによる処理を用いることもできる）。さらに別のプライマー及びプライマー延長試薬が標本中に存在する場合には、新しいプライマー／延長化テロメラーゼ基質複合体を形成して、別の延長プライマーの生成を引き起こし得る。所望の信号の量に依って、プライマー延長及び変性の工程を数回〜多数回反復し得る。典型的には、プライマー延長及び延長プライマー／延長化テロメラーゼ基質複合体の変性を、少なくとも５回、１０回、１５回、２０回〜３０回又はそれ以上、実施する。さらに、延長化プライマーの３’末端と相補的な二次プライマーが反応混合物中に存在する場合は、信号（延長プライマー及び付加的延長化テロメラーゼ基質の両方）を劇的に増大し得る。プライマー延長中に反応混合物中に依然として存在する未延長化テロメラーゼ基質は、このような二次プライマーとして機能し得る。プライマー延長試薬がＤＮＡポリメラーゼであり、二次プライマーが存在する場合、米国特許第4,683,195 号、第4,683,202 号及び第4,965,188 号に詳細に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応のために必要な成分があるが、但し適切な緩衝液及びヌクレオシド三燐酸は反応混合物中に存在する、と当業者は認識する。ＰＣＲ増幅は本発明のプライマー延長反応工程を実施するための好ましい方式であり、慣用的検定と比較して、テロメラーゼ活性を検出する感度、速度及び効率を劇的に増大する。そのプロトコールはテロメア反復体増幅プロトコール Telomeric Repeat Amplification Protocol「ＴＲＡＰ」と呼ばれ、特に実施例２で説明される。テロメラーゼ基質はＰＣＲプライマー（「上流プライマー」と呼ばれる）として便利に役立つが、しかしその他の多数のプライマー配列も用い得る。その他の配列は、プライマー／テロメラーゼ基質アニーリングのレベルは小さくてもテロメラーゼ生成物（例えばＴＳプラス（５'-ＡＧ〔ＧＧＴＴＡＧ〕_n −３'）（ここで、ｎは１、２、５、１０又はそれ以上である、））と同一の初期周期ＰＣＲ生成物を生じ得るため、テロメラーゼ基質とプライマーのアニーリングを避けるために選択される。その後の周期において、これらの生成物はＰＣＲ生成物の生成のための鋳型として役立ち、擬似陽性結果を生じる可能性がある。本発明は、本発明のＰＣＲベースの実施態様に用いるための、種々のオリゴヌクレオチドプライマー及びテロメラーゼ基質を提供する。このようなプライマーの１つ（「下流プライマー」と呼ばれる）は「ＣＸ」と名付けられ、３つの不完全テロメア反復体及び１つの完全反復体と相補的な配列５’−（ＣＣＣＴＴＡ）₃ＣＣＣＴＡＡ−３’（配列番号：１）から成る。３つの反復体における単一ヌクレオチドの差は、ＴＳ／ＣＸ二重鎖中に３’ミスマッチを作りだすことによりテロメラーゼ基質ＴＳ（上記のように、テロメア反復体の６つのヌクレオチドのうち５つを含有する）とアニーリングするＣＸの能力を弱め、それにより非特異的ＰＣＲ生成物、例えばプライマー二量体の形成を最小にする。テロメア配列により相補的に凝集されるこれらのプライマー（ＣＸ及びＴＳ）間の考えられるあらゆる配列は、凹所を成す３’ヌクレオチドが食い違い、したがってポリメラーゼにより効率よく延長されない二重鎖を生じる。ＣＸプライマーが立証するように、そして当業者が本開示の検討に際して認識するように、「テロメア反復体と相補的な」配列を有するプライマーとしては、プライマーがハイブリダイズするよう意図されるテロメラーゼ基質延長生成物に関して、１つ又はそれ以上のミスマッチ塩基を含有し得るプライマーがあげられる。この定義内に耐え得るミスマッチの数は、プライマーの長さ及び配列組成、ＰＣＲ工程中に用いられる温度及び反応条件、検定を実施する目的、並びに所望の結果によって変化し得る。プライマーＣＸの他に、本発明は、本発明の方法の利益を得る必要はないけれども、いくつかの適用のための及びある実施態様における本発明の方法の特異性、感度及び効率を大いに増強し得る基本的ＰＣＲのいくつかの修正を提供する。例えば、in vitro方法に対する重要な一修正は、緩衝液に関する：本発明は、テロメラーゼ活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性がともに観察される緩衝液を提供する。このような緩衝液を用いれば、同一反応容器、例えば試験管中でテロメラーゼ基質延長反応とＤＮＡポリメラーゼ媒介プライマー延長反応の両方を、技工は実施することができる（実施例２参照）。別の修正は、テロメラーゼ基質又は反応混合物中の逆戻りプライマーと相補的な相対的に短いオリゴヌクレオチドの使用に関する。これらの短いオリゴヌクレオチドは、プライマー延長に用いるプライマーのアニーリング温度より約10℃低い融点（短いオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするプライマー又はテロメラーゼ基質に関して）を有するよう、そして特に低温でのプライマー二量体形成及び／又は非特異的プライマー延長を防止するよう設計される。短いオリゴヌクレオチドは、プライマー延長工程のための理想的アニーリング温度より丁度低い温度でその相補的オリゴヌクレオチドから溶けだし、より低い、非特異的温度での不適切なプライマー延長を防止した。短いオリゴヌクレオチドはＤＮＡ合成のためのプライマーとして役立つよう意図されないという前提で、短いオリゴヌクレオチドの３’末端を遮断して短オリゴヌクレオチドへのヌクレオチドの付加を防止し得る。短オリゴヌクレオチドがプライマーとハイブリダイズするよう意図される場合には、短オリゴヌクレオチドノ３’末端を遮断して（例えば、ビオチン、リン酸塩、ジゴキシゲニン、フルオレセイン又はアミノ基）、短オリゴヌクレオチドがテロメラーゼ基質として役立つことのないようにする必要がある。その他の種々の試薬及びフォーマットを用いて、高度の特異性を確保し得る。その例を以下に示す：（１）Ｔ４遺伝子３２タンパク質の使用（例えば、Boehri nger Mannheim より購入）；（２）ＴａｑＳｔａｒｔ^TM抗体（例えば、Clontech より購入）の使用；及び（３）反応混合物をテロメラーゼ媒介延長反応の終了時に加熱後にのみ溶融するワックスバリア（例えば、Ａｍｐｌｉｗａｘ^TM、Perkin Elmerより購入）によるその他の反応成分からのプライマーの分離。ワックスバリアの目的は、増幅反応からテロメラーゼ延長反応を分離することである。したがって、一例と同様に、そして多数の例があるように、ＤＮＡポリメラーゼをワックス層下に密封して、その他の反応成分からそれを分離し得る。あるいは、試験管の底のワックス層又はバリア下にプライマーを密封し、その他の反応成分はバリアの上部に位置する。調製を容易にするために、反応成分を固体マトリックス、例えば直径約1 μ〜約 5mmのポリスチレンビーズ；プレート又は微小滴定プレートのウエル、例えばポリスチレン又はポリビニルクロリド製のもの；ガラスビーズ；磁気粒子；多糖類；あるいは、例えばプライマーで被覆し得るその他の表面に取り付け得る。プライマーは、典型的には、水性媒質から吸着により固体マトリックスに張りつけられるが、貼付のその他の方式を、当業者には十分公知のように、用いてもよい。例えば、固体表面にプライマーの溶液を接触させて、表面が適量のプライマーで被覆されるまで乾燥する。固体表面を被覆するプライマーの量は、接触溶液中のプライマーの濃度を調整することにより変え得る。プライマー被覆固体マトリックスを次に熱溶融ワックスで被覆して、放置し、固化させる。ワックスバリアはこのように、温度がワックス溶融温度に達するまで、他の反応成分（例えば、テロメラーゼ基質、ｄＮＴＰ、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ又はリガーゼ）からプライマーを単離する。高度特異的核酸塩基対を確保し、したがって非特異的プライマー延長及びプライマー二量体（プライマーと非延長化テロメラーゼ基質から成る）形成を低減する温度でのみ、逆戻りプライマーが他の試薬を容易に受け入れることを、これらのホーマットは保証する。さらに、本発明の一有用キットは、ワックスバリアによりテロメラーゼ反応緩衝液及び／又はその他の試薬から分離されたプライマー又はポリメラーゼを含有する反応試験管あるいはその他の固体支持体を包含する。本発明のプライマー延長法を用いて、実施例２で説明するようなヒト細胞株及び正常体細胞中のテロメラーゼ活性に関して試験した。ヒト２９３腎臓細胞からのテロメラーゼ陽性抽出物を、ＴＲＡＰ検定により査定して、10⁵細胞からルーチンに産生した。この特定の実施例に用いた条件に関する下限はテロメラーゼ活性の検出のための10²細胞等価物であった。これらの結果は、慣用的方法と比較して、抽出効率及びテロメラーゼ活性検定の少なくとも100 倍の改良を立証し、少なくとも10⁴の因子によるテロメラーゼ活性の電流検出可能性を増大する。実施例２のテロメラーゼ活性検定法を用いて、下記の実施例３に説明するように、異なる組織及び固体からの種々の不死細胞株及び正常体細胞培養中のテロメラーゼ活性に関して試験した。図３に示すように、不死細胞と正常体細胞との間のテロメラーゼ活性の差は少なくとも1000倍であると概算されたが、これはヒト細胞中のテロメア力学におけるテロメラーゼの直接的役割を支持する。当業者は、上記の検出限界が、ルーチン手順のみを用いた場合には妥当であると認識する。本発明の方法を用いて単一細胞中のテロメラーゼ活性を検出し得るが、但し主として単一細胞単離工程に関して、典型的にルーチンと考えられるものよりやや大きい努力が惜しみなく払われる。テロメラーゼ媒介性延長工程の時間を増大し、テロメラーゼに関する試験抽出物の純度を増大し、検定に用いる標識の量を増大し、そしてプライマー延長周期の数を増大して、少数の細胞又は単一細胞中のテロメラーゼ活性を検出する検定の感度を増大し得る。実施例１１は、本発明のこの局面を説明する。本発明のＰＣＲベースの実施態様は、標本中のテロメラーゼ活性を測定するための一般に利用し得る方法を上回る有意の改良を提供する。しかしながら、本発明のその他の新規の変更も、有意の利益を提供する。特に、本発明の方法を用いて、生成したテロメラーゼ生成物の数を提示することにより、標本中のテロメラーゼ活性を定量し得る。しかしながら、これらの改良の性質を理解するためには、テロメラーゼ延長化基質のゲル電気泳動時に生じたバンドの梯子を先ず注意深く考慮する必要がある。このような結果は、テロメラーゼ媒介性延長反応中にテロメラーゼにより付加された反復体の数を反映するが、しかし本発明のＰＣＲベースの一実施態様においては、これらの生成物のいくつかはＰＣＲ増幅工程中のプライマーの食い違い結合に起因する。「食い違い結合」とは、延長化テロメラーゼ基質の３’末端を凹んだままにし、したがってＤＮＡポリメラーゼによる延長に利用できる方法で延長テロメラーゼ基質中の配列にプライマーを結合させることを示す。このような立体構造では、ＤＮＡポリメラーゼは延長化テロメラーゼ基質の３’末端にヌクレオチドを付加して、テロメラーゼ媒介性延長工程で生成されるものより長い分子を作り得る。食い違い結合が実施例２に記載したような反応において起きていたか否かを確定するために、別々のテロメラーゼ延長生成物を表す合成オリゴヌクレオチド、例えばＴ＋４（ＴＳプラス４つのテロメア反復体）を用いて特異的増幅状態を発現した。高緊縮下でさえ、下流プライマーの食い違いアニーリングが起きた（例えば、４つの反復体のうちの３つによるアニーリング）。ゆえに、別々のテロメラーゼ延長生成物のＰＣＲ増幅は、ゲル分解の限界までのサイズで増大するＰＣＲ生成物の６つのヌクレオチド梯子を生じた。したがって、ＣＸのようなプライマーを用いて生成されるＴＲＡＰ検定生成物は、プライマー延長反応中の鋳型とのプライマーの食い違い結合のために、テロメラーゼ基質延長工程で生成されるテロメラーゼ生成物の長さ分布を直接反映するものではない。しかしながら、いくつかの場合、例えばin situテロメラーゼ検定では、細胞からのテロメラーゼ生成物の漏出を防止する大型分子を生じる食い違い結合を有することは有益である。しかしながら、in vitro検定では、このような相互作用は、検定中で下流プライマーとして本発明の新規の「アンカー化」プライマーを用いることにより防止されるというのが、時として望ましい。本発明の目的のために、アンカー配列は、非テロメア反復配列（完全テロメア反復配列と相補的でも同一でもない配列）であり、例えばプライマー対ＴＳ／（ＣＴＲ）₄又はＴＳ／ＣＸを用いた場合に観察されるように、それ自体における「成長」からＰＣＲ生成物を防止するＰＣＲプライマーの５’末端配列である。したがって、このようなオリゴヌクレオチドは、その５’末端に６ヌクレオチドアンカー配列（長さは重要でないが３〜５〜１５〜３０又はそれ以上のヌクレオチドであり得る）及びその後のＣＴＲ（富Ｃテロメア反復；５’−ＣＴＡＡＣＣ−３’）配列（例えば、ＡＣＴプライマー；５’ＧＣＧＣＧＧ〔ＣＴＡＡＣＣ〕₃−３’；配列番号：２は本発明のアンカー化プライマーである）の３つの反復を包含し得る。広範なアンカー配列を用い得る。一実施態様では、アンカー配列は本方法のテロメラーゼ媒介性延長工程に用いられるテロメラーゼ基質の配列であって、「ＴＳ−アンカー化」プライマー（この場合、「ＴＳ」は完全テロメア反復配列を欠くあらゆるテロメラーゼ基質を示すことに留意）を提供する。アンカー化プライマーは、したがって、５’から３’方向に、テロメラーゼ基質配列及びテロメア反復配列の２又はそれ以上の相補的コピーを包含する。このようなプライマーを用いることにより、第一ラウンドのプライマー延長後、反応混合物中の余分の非延長化テロメラーゼ基質は、第一ラウンドのプライマー延長の結果として生成される二重鎖の合成を用意し得るため、本質的に「一プライマー」方式であるものにおける本発明の方法を実施し得る。例えば、ＴＲＡＰ検定においてプライマーＴＳ（５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’；配列番号：３）及びＡＣＴ（又は別のアンカー化プライマー）を用いて、既定抽出物中のテロメラーゼの最も前進的生成物（ＭＰＰ）を推論し得る。ＡＣＴのようなアンカー化プライマーの使用は、ＰＣＲ中のテロメラーゼ生成物のより長いバージョンへの成長を防止する。ＡＣＴプライマーを用いた場合、最も遅く移動するバンドは、ＰＣＲまえの元のテロメラーゼ生成物のＭＰＰの長さを直接反映する。このようなプライマーを用いない場合、多重周期のプライマー延長及び生成物変性は、テロメラーゼ基質延長反応後の反応混合物中に元々存在するテロメラーゼ延長化テロメラーゼ基質中に存在するよりもより多くのテロメア反復体を包含するプライマー延長生成物を生じ得る。ＡＣＴプライマーは、ＴＳと例えばＣＸ又はＣＴＲ₄のようなプライマーとの間に観察されるプライマー二量体相互反応の型に対してより耐性である場合の本発明の目的のために、特に好ましい。あるいは、ハイブリッドオリゴヌクレオチドは逆戻りプライマーとして用い得る。ハイブリッドはアンカー配列と、その後相補的テロメア反復体の中にミスマッチを含有するプライマーベースの配列、例えば４つの相補的テロメア反復体のうち３つにミスマッチを有するＡＣＸ５’−ＧＣＧＣＧＧ〔ＣＴＴＡＣＣ〕₃ＣＴＡＡＣＣ−３’（配列番号：４）を有する。これは、プライマー二量体形成（ＣＸプライマーのような）を不安定にする、そしてＴＲＡＰ検定から最も前進的テロメラーゼ生成物（ＡＣＴプライマーのような）を予測する能力を有するプライマーを生じる。さらに、その結果生じるＡＣＸはＡＣＴ又はＣＸプライマーよりもプライマー二量体形成に対して耐性である。ＴＲＡＰ検定におけるＡＣＸプライマーの利用は、プライマー二量体形成においてワックスバリア法と同様の利益を提供するが、しかしＴＲＡＰ検定の分析、製造及び実施を簡単にする。オリゴヌクレオチド選択及び熱開始ワックスバリアの使用以外の又はそれに付加する手段により、非特異的、鋳型非依存性ＰＣＲ人工物（例えばプライマー二量体）を低減することにより、ＴＲＡＰ検定をさらに改良し得る。例えば、任意にグリセロールを用いるＴＲＡＰ検定緩衝液へのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の付加は、テロメラーゼ基質プライマー（例えばＴＳ）と逆戻りプライマー（例えばＣＸ、ＡＣＴ）との間の相互作用を不安定にし、それによりＴＲＡＰ検定の信頼性を増大する。同様に、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ又はその断片（例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ^TMＤＮＡポリメラーゼのStoffel 断片；Perkin Elmer）を使用して、プライマー二量体人工物を防止し得る。プライマー、例えばＣＸ又はＣＸベースのプライマーが鋳型（例えばＴＳ）とハイブリダイズする場合、プライマーの３’ミスマッチはプライマー延長を防止すべきである。しかしながら、固有の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは３’ミスマッチヌクレオチドを除去して、プライマーを延長し得る。これに対比して、５’ −３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたＤＮＡポリメラーゼ又は断片はミスマッチ化ヌクレオチドを切断できず、したがってプライマー及びプライマー二量体人工物の誤延長を防止するのに役立つ。本発明はさらに、標本中のテロメラーゼの量を定量するための種々の手段を提供するが、大半の目的に関しては、定性的結果（存在する又は存在しないテロメラーゼ活性）は不十分である。定量的情報を得るための重要な一手段は、下記の実施例４に説明するように、公知量で各反応混合物に付加される対照オリゴヌクレオチド鋳型の使用である。本発明の競合的対照オリゴヌクレオチドの例は、５’−３’のオーダーで、テロメラーゼ基質配列、スペーサー配列（好ましくは長さ３ヌクレオチドであるが、しかしこれはいかなるヌクレオチド又は長さでもよい；３ヌクレオチドの長さは内部対照が延長化基質からのものとは異なることを保証する）、及びテロメア反復配列（典型的には、多重、例えば２〜50コピーで存在する）を包含する。もちろん、上記の対照配列と相補的なオリゴヌクレオチドは対照配列としても役立つし、あるいは二本鎖核酸挿入物を有するプラスミドを用いてもよい。この内部対照の使用は検定が適正に実施されたが否かを確定するのを促すだけでなく、標本中に存在するテロメラーゼ活性の定量をも促す。あるいは、あらゆる配列の対照核酸を公知量で反応混合物に付加し、延長化テロメラーゼ基質（非競合的内部対照）を増幅するのに用いたものとは異なるプライマーによる対照を増幅し得る。対照オリゴヌクレオチド及び／又は対照オリゴヌクレオチドを増幅するのに用いられるプライマーは、テロメラーゼ延長生成物を標識するのに用いた標識と同等に、又はそれとは異なるように標識され得る。好ましい内部対照オリゴヌクレオチドは、上記の対照体の組合せを包含し、この場合、本発明のＰＣＲ実施態様では、内部対照体は唯一のプライマーに対してテロメラーゼ延長生成物と競合し、したがって半競合対照体と呼ばれる。このような対照体は、５’−３’のオーダーで、テロメラーゼに対する基質又はテロメア反復体でない配列、あるいはその相補的配列とその後のテロメア反復配列を包含する。当業者に明らかなように、単一プライマーにより増幅される内部対照体を意図し得る。代替的半競合的対照体は、５’−３’のオーダーで、テロメラーゼ基質配列とその後のテロメラーゼに対する基質でもテロメア反復体でもない配列、又はその相補的配列を包含する。対照体は定量のためにＴＲＡＰ生成物と容易に分離されるよう意図し得る。このような半競合内部対照体の例は、ＴＳテロメラーゼ基質プライマーにより増幅される５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＡＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＴ−３’（配列番号：５；ＴＳＮＴ）及びＮＴプライマー５’−ＡＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＧＣＣＴＴＴＴ−３’（配列番号：６）である。ＮＴプライマーはテロメラーゼに対する基質ではない。ＴＳＮＴオリゴヌクレオチドは、ＴＳ、ＡＣＸ（又は他のあらゆる逆戻りプライマー）及ＮＴとともにＴＲＡＰ検定に用いうる。その結果生じる３６ｂｐ対照二本鎖ＤＮＡは、最小のものが５０ｂｐであるテロメラーゼ延長生成物とは容易に識別される。対照オリゴヌクレオチドはさらに、他の反応成分とともにキット中に便利に包装され得る。標本中の核酸の存在を検出するために、ＴａｑＭａｎ^TM（Perkin Elmer）検出系を用い得る。この系は本発明のテロメラーゼ検定に用いるのに適しており、非放射性である迅速検出法を提供し、マルチウエル系に容易に修正し得る。蛍光リポーター染料タッグ及び消光剤染料タッグの両方を有する標的特異性プローブを、プライマー延長反応（例えば、ＰＣＲ増幅）に組入れる。これらのタッグの位置に関する正確な制限はないが、しかし特定の位置のほうがよい；例えば、タッグは好ましくは６〜８ヌクレオチド離す。ＴａｑＭａｎ^TMプローブはプライマー延長条件下で内部部位の標的配列とハイブリダイズし、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの作用によりプライマーが延長される場合には、ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性はハイブリダイズ化プローブを分解して、消光剤染料の近くからリポーター染料／ｄＮＴＰを失わせる。遊離リポーター染料／ｄＮＴＰ複合体の増大は、蛍光の増大を引き起こし、これは増幅化物質の量に比例する（Livak et al.，January 1995，Research News，Perkin Elmer Corpor ation，1-5; Lee et al.，1993，Nucl．Acids Res．21:3711-3766）。標的が一般に100 bp〜１kbの長さの二本鎖ＤＮＡである典型的ＴａｑＭａｎ^TMＰＣＲ適用においては、３つの特異的ハイブリダイゼーション部位（前方プライマーに対する１部位、逆戻りプライマーに対する１部位及びＴａｑＭａｎ^TMプローブに対する１部位）の選択は容易に達成される。しかしながら、ＴＲＡＰ検定では、ＴａｑＭａｎ^TMプローブ及び２つのプライマーに利用できる特異的ハイブリダイゼーション部位の選択は限定される。これらの部位は、テロメラーゼ基質配列（例えば、ＴＳ：５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’；配列番号：３及びテロメア反復配列（例えば、ＴＴＡＧＧＧ）、又はそれらの相補的配列で、ミスマッチを有する場合もある。例えば、富Ｃテロメア反復（ＣＴＲ；５’−ＣＣＣＴＡＡ−３’）配列を包含するＴａｑＭａｎ^TMプローブを用い得る（例えば、ＣＴＲの４つの反復を包含するプローブ；このプローブはＣＴＲ₄と呼ばれる）。ＴａｑＭａｎ^TMプローブは一般にその３’端で遮断され、したがってＰＣＲ増幅中は延長され得ないが、しかしＣＴＲプローブは、それらが同一部位とハイブリダイズするので、ＡＣＴプライマー（又はその他の逆戻りプライマー）と競合し、これはＰＣＲ効率の低減を引き起こし得る。さらに、プローブはテロメラーゼ基質、例えばＴＳとアニーリングし得るため、本検定における熱開始ＰＣＲ法の使用は有用である；これは、ワックスバリアによりプローブ及び逆戻りプライマーを残りの反応成分から分離することにより、容易に達成される。好ましいＴａｑＭａｎ^TMプローブは、テロメラーゼ基質と相補的な配列から成る；したがって、このようなプローブは前方又は逆戻りプライマーと競合せず、したがってプライマー二量体形成を生じない。このようなプローブは前方プライマー（例えばＴＳ）との二重鎖を形成し得るが、これは指数関数的増幅中のＰＣＲ効率を低減する。しかしながら、テロメラーゼは二本鎖基質を認識し、延長し得る（実施例８参照）し、反応は前方プライマー−プローブ二本鎖体の存在下で進行し得る。あるいは、前方プライマーの３’領域と相補的な配列、およその後のテロメア反復配列（例えば、ＣＴＲ配列）から成るＴａｑＭａｎ^TMプローブを用い得る。このようなプローブは、前方プライマーとテロメア反復配列との間の接合部と特異的にハイブリダイズし、逆戻りプライマーとの競合作用を低減するだけでなく、前方プライマー−プローブ二重鎖形成をも低減する。このようなプローブを用いた場合、プライマー−二量体人工物の生成は、熱開始ＴＲＡＰ法を用いることにより回避し得る。例えば、ＴＳの３’末端とテロメラーゼ生成物のテロメア反復体との間の接合部配列に対応する配列５’−ＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＴＣＴＧＣＴ−３’（配列番号：７）を包含するプローブを用い得る。あるいは、このようなプローブ中にミスマッチを導入して、テロメラーゼ基質延長反応の妨害の可能性を最小限にし、即ち延長工程中のプローブのＴＳとの結合を最小限にし得る。例えば、配列５’−ＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＣＡＣＴＡＴＧＣＴ−３’（配列番号：８）又は５’−ＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＧＴＡＴＡＴＧＣＴ− ３’（配列番号：９）を有するプローブを、本実施態様に用い得る。条件を選択して、ＰＣＲ反応中に延長化テロメラーゼ基質と選択的にプローブを結合させる。テロメラーゼ基質配列又はテロメア反復配列（例えば、５’−ＴＴＡＧＧＧ− ３’）から成るＴａｑＭａｎ^TMプローブをさらに、ＴａｑＭａｎ^TM検出系に用い得る。しかしながら、上記のプライマー−二量体及びプライマー競合の形成の可能性の他に、これらのプローブはテロメラーゼに対するテロメラーゼ基質と競合し得るが、競合は熱開始法を用いて最小限にし得る。ＴａｑＭａｎ媒介性延長の別の実施態様では、配列５’−ＧＣＧＣＧＧ〔ＣＴＴＡＣＣ〕₃ＣＴＡＡＣＣＡＡＴ−３’（配列番号：１０）を有し、プライマーの３’遮断を伴わないプライマーＭＡＣＸにより実証されるように、リポーター及び消光剤染料が３’ミスマッチを有する逆戻りプライマーの２つの末端に存在する。このようなプライマーをプルーフリーディング能力を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとともにＴＲＡＰ検定に用いる場合、プライマーの３’端のミスマッチヌクレオチドはエキソヌクレアーゼ活性により切断され、延長前に消光剤からリポーター染料を放出する。したがって、このようなプライマーを用いるあらゆる増幅は、蛍光信号を生じる。本発明のこの実施態様は、その他の近似指示信号を用い得るので、蛍光消光に限定されない；例えば、プローブを放射性標識で標識し、蛍光発光剤で検出し得る。本発明の方法は標本中のテロメラーゼ活性と延長プライマーとアニーリングされる延長化テロメラーゼ基質から成る二本鎖核酸の形成（反応混合物中の存在）との相関に関与し得る、と当業者は認識し、（１）延長化テロメラーゼ基質；（２）延長化逆戻りプライマー；（３）（１）及び（２）の両方から成る二本鎖核酸；又は（４）前記のいずれかとプローブとのハイブリダイゼーションの存在によりこのような分子の存在を推定し得る。しかしながら、いかなる場合も、典型的には、１つ又はそれ以上の反応生成物中に取り込まれるか又は付着される標識により延長化テロメラーゼ基質及び／又はプライマーの存在を検出することによりこの相関を行うが、しかし上記のＴａｑＭａｎ^TM検出法はおそらくこの規則の例外である。本発明の方法のＰＣＲベースの実施態様を上記で詳細に説明し、下記の実施例で実証するが、本発明の方法は、標的増幅を提供するためのプライマー延長のあらゆる方法を用いて、又は下記のような信号増幅を提供する方法、あるいはその両方を用いて、実施し得る。さらに、ＰＣＲはプライマー延長生成物の指数関数的蓄積を提供するが、プライマー延長生成物の線状蓄積でさえ、有用な結果を提供し得る。したがって、単一プライマーを使用し、テロメラーゼ延長化基質の多数のコピーを作り得る。さらに、下記で詳細に説明するように、ポリメラーゼ媒介性プライマー延長以外の手段により、このようなコピーを作り得る。このような方法の１つは、リガーゼ連鎖反応である（Barany，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:189-193 ）。ＤＮＡリガーゼを用いて延長化テロメラーゼ基質とハイブリダイズされた２つのオリゴヌクレオチドと一緒に結紮することにより、テロメラーゼ延長生成物のコピーを作り得る。ＰＣＲの場合と同様に、二本鎖核酸が変性去れる場合には、結紮及び変性の工程を何回も反復して、元の延長化テロメラーゼ基質の多数の相補的コピーを蓄積し得る。さらに延長化テロメラーゼ基質上での最初の２つのオリゴヌクレオチドの結紮により生成されたコピーと相補的な別の２つのオリゴヌクレオチドを付加し、ＤＮＡリガーゼが２つを一緒に結紮して元の延長化テロメラーゼ基質と同一の（相補的に対するものとして）コピーを形成し得る場合には、ＬＣＲの基本的成分が得られる。説明のために、以下の４つのオリゴヌクレオチド「リゴマー」を用いて、本発明の方法にＬＣＲを用い得る：ＬＴＳ（５’−ＣＣＣＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＧ−３’）（配列番号：１１）、ＣＬＴ（５’−ＴＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＧＡＣＧＧＡＴＴＣＣＣ−３’）（配列番号：１２）、ＬＣ（５’−ＧＧＧＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣ−３’）（配列番号：１３）、及びＬＧ（５’−ＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＡＡ−３’）（配列番号：１４）。ＬＣ及びＣＬＴリゴマーを延長化テロメラーゼ基質とアニーリングさせて、ＤＮＡリガーゼで結紮し、ＬＴＳ及びＬＧリゴマーのための鋳型を形成する。２つのリゴマーがアニーリングして、ＤＮＡリガーゼの盲端結紮活性により混合物中の別の二本鎖核酸と結合し得る二本鎖核酸を形成し得ないように、これらのリゴマーを選択した。広範なこのようなリゴマーを本方法に用いて、鋳型非依存性生成物形成を最小限にし得る。テロメラーゼ延長生成物のＬＣＲ増幅は、均一サイズの増幅化物質を生じ、そこで定量的分析を実施し得る。さらに、熱安定性ポリメラーゼ及びリガーゼとプライマー、例えばＴＳ、ＬＣ及びＣＬＴとの組合せを用いて、テロメラーゼ延長化基質を増幅し得る。（ｉｉ）オリゴヌクレオチド近似検定本発明のさらに別の局面において、上記のＬＣＲ法に関連するもの、テロメラーゼ延長生成物の隣接部分と相補的なオリゴヌクレオチド（例えばＬＣ及びＣＬＴ）を用いて、テロメラーゼ延長生成物の存在を検出する。テロメラーゼ延長生成物とアニーリングさせる場合、あるオリゴヌクレオチドの５’末端を別のオリゴヌクレオチドの３’末端と結紮し得るように、オリゴヌクレオチドを構築する。オリゴヌクレオチドの１つを蛍光「リポーター」標識で、別のオリゴヌクレオチドを「消光剤」標識で標識する。例えば、その成分はともに蛍光発光体で、第一の吸収スペクトルが、第二の発光スペクトルと重なるよう選択される；このような一対の例はフルオレセインとロダミンである。オリゴヌクレオチドのテロメラーゼ生成物とのアニーリングに際して、リポーターと消光剤との近似に起因する消光作用は、テロメラーゼ延長生成物の指標として検出される。アニーリング化オリゴヌクレオチドのその後の結紮はＬＣＲによるさらなる増幅には必要であるが、しかし本検定を用いる検出には、結紮は必要ない。この検定系は蛍光及び消光に限定されないが、電磁又は核放射線の吸着、変調、又は発光による検定可能な方法において相互作用する任意の２つの成分から成るプローブを用い得る。検出は、例えば化学的、酵素的又は放射線的事象により媒介される。例えば、放射性標識及び蛍光発光体、あるいは酵素の生成物が第二の酵素の基質となる酵素対を用いて、近似信号を提供し得る。検出可能信号を生じるあらゆる近似指示対を用い得る；検出は、例えば蛍光測定、放射能測定又は比色定量による。（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼ媒介性複製本発明の一局面において、ＲＮＡポリメラーゼの作用により、テロメラーゼ延長化生成物を複製する。ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸を複製するための種々の方法が公知であって、その例としては、例えば核酸配列ベースの複製（Compton，1991，Nature 350:91-92）、自己持続性配列複製（Guatelli et al.，1990，Pro．Natl．Acad．Sci．USA 87:1874-1878）、及び鎖置換増幅（Wa lker et al.，1992，Pro．Natl．Acad．Sci．USA 89:392-396）が挙げられる。好ましい実施態様では、一本鎖ＤＮＡ鋳型を利用するＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｎ４ＲＮＡポリメラーゼ）を用いて、鋳型の５’末端のプロモーター配列を用いて一本鎖ＤＮＡ鋳型からＲＮＡコピーを合成する。テロメラーゼ基質は、その５’末端に操作可能的に結合するプロモーター配列から成り、あるいは基質の延長後、及びＲＮＡポリメラーゼによる複製の前に、プロモーターを基質に結紮し得る。単一ＤＮＡ鋳型から多数のＲＮＡ転写体を生成し、それにより標的分子の数を増大し得る。逆転写酵素を任意に用いて、ＲＮＡ転写体のＤＮＡコピー作製し得る。あるいは、本方法は、テロメラーゼにより延長され得る非テロメア性テロメラーゼ基質配列（例えば、ＴＳ）、及びテロメア配列と相補性の逆戻りプライマー、例えばＣＴＲ₃（ＣＴＲ配列の３つの反復体から成る）を用いる。次に、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、クレノウ断片、ＡｍｐｌｉＴａｑ^TMポリメラーゼのストッフェル断片）を用いて、テロメラーゼ延長生成物と相補的なｃＤＮＡを合成する。二本鎖基質を認識するＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ）を次に用いて、テロメラーゼ基質又は逆戻りプライマーの５’末端に組込まれたプロモーター配列により指図されるような二本鎖テロメラーゼ延長生成物の多数のＲＮＡコピーを合成する。任意の種々のプロモーター、例えばＴ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーターをこの目的に用い得る。プロモーター配列は、テロメラーゼ延長工程中に存在し、あるいは後期に結紮されて延長生成物となる。上記のように、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）を用いて、増幅を達成し得る。本実施態様では、ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）は、本質的には上記と同様に、延長化テロメラーゼ基質のＲＮＡコピーを合成する。逆転写酵素はＲＮＡのＤＮＡコピーを合成するために用いられし、ＲＮアーゼＨはＲＮＡ鎖を分解し、一本鎖ＤＮＡはＲＮＡ合成のための鋳型として作用し、したがって周期的増幅を提供する。あるいは、逆転写酵素はｃＤＮＡを合成するために用いられ、又はＲＮＡポリメラーゼはプライマーを延長するために用いられ、そしてその生成物はプライマー延長により（例えば、ＰＣＲによる）増幅される。本発明の方法のこれらの及びその他の変更は、本開示を考察するに際して、当業者に明らかになる。これらの実施態様では、テロメラーゼ活性の存在及びレベルは延長化テロメラーゼ基質のＲＮＡコピーの存在と相関する。別の実施態様の場合と同様に、当業者に明らかなように、広範囲のプライマーが意図される（例えばバックグラウンドを減少するように）。（ｉｖ）分枝鎖ＤＮＡ媒介性複製別の実施態様において、テロメラーゼ延長生成物は先ず複製され、及び／又は次いで、プローブの標的核酸とのハイブリダイゼーション時に生成される信号の増幅を包含する分枝鎖ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）信号増幅を用いて検出される（Urdea ，12 Sep．1994，Bio/Tech．12:926-928;米国特許第5,124,246号）。ｂＤＮＡを用いてテロメラーゼ活性を検出するための検定は、多数の標本を用いての実施が簡単であるためにスクリーニングに特に有用なフォーマットであり、市販のハードウエアを利用できるマルチウエルプレートで実施し得る。さらに、テロメラーゼ活性の定量的検出を可能にする条件を選択し得る。あらゆるテロメラーゼ基質（例えば、ＴＳオリゴヌクレオチド５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’；配列番号：３）を用い、基質を細胞抽出物と一緒にインキュベートして、テロメア反復体の付加により存在するあらゆるテロメラーゼが基質（任意に固体支持体に結合されて検出を促進する）を延長し得るようにした。一実施態様では、慣用的化学技法を用いて、基質をその５’末端でマルチウエルプレートの１ウエル（又は他の固体表面）と結合させる。オリゴヌクレオチドに結合されるマルチウエルプレートも市販されている（Chiron Cor p.）。あるいは、固体表面と結合した相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、テロメラーゼ基質を結合する。テロメラーゼ延長反応は、結合オリゴヌクレオチド基質上で、又は後期に結合される遊離オリゴヌクレオチド基質上で起こる。ｂＤＮＡプローブはテロメア反復体と相補的なハイブリダイズ部分（例えば、５’−（ＣＣＣＴＡＡ）_n−３’又はその置換体）から成り、延長テロメラーゼ基質とハイブリダイズする。プローブハさらに、多数の二次プローブ結合部位を提供する分枝鎖領域を包含する。洗浄して未結合プローブを除去後、ｂＤＮＡの分枝鎖に特異的な標識化二次プローブをｂＤＮＡとハイブリダイズし、標識により検出する。技工は、このフォーマットが多数の変更を受け入れるとあ認識する；例えば、テロメア反復体と相補的なオリゴヌクレオチドを不動化するためのハイブリダイゼーションによりテロメラーゼ延長生成物を捕獲することにより、テロメラーゼによる延長後にテロメラーゼ基質を不動化し得る。信号は、ｂＤＮＡ分子上の二次プローブ受容可能部位と直接比例して増大し、したがって標的核酸の集団はｂＤＮＡハイブリダイゼーションによってはほとんど検出されない。感度は、テロメア反復相補性ｂＤＮＡ（又はテロメラーゼ基質相補性ｂＤＮＡ）を、一次ｂＤＮＡプローブ（及び二次プローブに特異的な第三プローブ等）の分枝鎖に特異的な二次ｂＤＮＡプローブでプローブすることにより、さらに増強し、それにより標識化プローブに対するさらに多数のハイブリダイゼーション部位を提示する。延長化テロメラーゼ基質をプローブするためのｂＤＮＡの使用は細胞抽出物による使用に限定されないが、しかし本発明のin situ 方法にも適用し得る。例えば、顕微鏡スライド上に固定された細胞中の延長化テロメラーゼ基質は、慣用的線状核酸プローブの代わりにｂＤＮＡを用いてプローブし得る。しかしながら、大量のｂＤＮＡプローブの内在化を促すためには、分枝鎖長は短いほうが好ましい。したがって、ｂＤＮＡを用いるin situ 検出のためには、分枝鎖長は通常、約60ヌクレオチド未満、好ましくは約40ヌクレオチド未満である。プローブ取込みの改良により、分枝鎖長が短いために起きる検定感度の低下はすべて克服される。さらに、一次ｂＤＮＡプローブに特異的な二次ｂＤＮＡプローブを組合せると、ともに分枝鎖長の短いｂＤＮＡの組合せにより感度は付加される。ｂＤＮＡ法は、この開示を読めば当業者は理解し得るように、プライマー延長生成物の検出にも適用し得る。標的核酸とハイブリダイズするｂＤＮＡ以外のプローブを用いて信号増幅を達成し得るし、ｂＤＮＡプローブ検出を含めたプローブ検出は、本発明の多数の実施態様に用い得る。例えば、テロメラーゼ基質を固体表面、例えば微小滴定プレートのウエル、試験管又はビーズに固定し得る。テロメラーゼ検定を用いて、テロメア反復体（例えばＴＴＡＧＧＧ）を用いてテロメラーゼ基質を延長し得る。所望により、固体表面を洗浄して可溶性反応体を除去することにより、変性量の洗剤又は二価の陽イオンキレート化剤の付加により、加熱により、又はその他の手段によって、反応を停止し得る。次に、延長化テロメラーゼ基質を、テロメア反復体と相補的な標識化核酸でプローブする。典型的には、核酸プローブ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）又はその他の核酸類似体）を直接標識するが、しかし、技工に認識されるように、さらに別の標識化プローブとのハイブリダイゼーションも可能である。特に好ましいプローブは、米国特許第5,196,306 号に記載されているような、チラミド信号増幅により検出され得るポリビオチニル化核酸である。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプタビジンはビオチンと結合し、ＨＲＰはさらに増幅させるためにフルオロフォア、ビオチン、又はＨＲＰにより標識される活性化チラミド分子の沈降を触媒し、したがってフルオロフォア、ビオチン又はＨＲＰの固体表面への共有結合沈降を触媒する。沈降標識は、標準技法により検出し得る。試薬上記の開示及び下記の実施例は、オリゴデオキシリボヌクレオチドテロメラーゼ基質、プローブ、対照及びプライマー又はリゴマーを用いて得られた結果により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。したがって、プローブ又はプライマーとして１つ又はそれ以上の修飾（即ち、合成又は非天然の）ヌクレオチドを包含するオリゴリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを用い得る。通常は、核酸中のヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合又はその類似体により結合する。ホスホジエステル結合の類似体としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート、ペプチド及び同様の結合が挙げられる。例えば、ＰＮＡは、その主鎖中のホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有するオリゴヌクレオチドである。ＰＮＡは電荷を有さないため、ＰＮＡはデオキシリボ核酸より高い結合親和性を有する。別の例としては、当業者に公知の方法でテロメア又は非テロメア配列を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを調製し得るし、テロメラーゼ反応中のテロメラーゼ基質として用い得る。ＤＮＡポリメラーゼとは異なり、テロメラーゼはホスホロチオエートオリゴヌクレオチド基質を認識し、延長する。次いで、本明細書に記載の方法でテロメラーゼ反応の生成物を検出するが、但しホスホジエステルプライマー及びポリメラーゼを用いる延長化テロメラーゼ生成物の増幅は、別のプライマーを付加しないかぎりは、非対称性である。ポリメラーゼはプライマーとしてホスホチオエートオリゴヌクレオチドを利用できず、そこでプライマー−二量体人工物はこのような検定においては低減が、テロメラーゼ生成物の指数関数的増幅と比較して、検定感度は別のプライマーを付加しない限り弱められる。上記のように、複製又は検出のＰＣＲ非依存性方法を用いることにより、例えば分枝鎖ＤＮＡプローブの使用により、本実施態様においては、感度を改良し得る。当業者は、使用する試薬が市販され、あるいはオリゴヌクレオチドの場合には、市販の器械を用いて調製し得ると、そして広範なＤＮＡポリメラーゼ、抗体及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質も用い得ると認識する。複製テロメラーゼ延長化基質の検出複製反応の性質とは無関係に、そして上記のように、本発明の種々の試薬を標識して、反応混合物中でのテロメラーゼ延長化テロメラーゼ基質又はそれから複製された核酸の同定を促進し得る。例えば、１つ又はそれ以上の標識化ヌクレオシド三リン酸、標識化プライマー又は標識化テロメラーゼ基質（又はその組合せ）を用い、そして標識のテロメラーゼ基質又はプライマー延長生成物中への取込みをモニタリングし得る。存在する場合には、内部対照も同一の又は異なる標識で標識化する。広範な標識のいずれかを、本発明の目的に用い得る。このような標識としては、蛍光（例えば、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びローダミン）、リン光、化学発光、酵素及び放射性標識、並びに種々の発色団が挙げられる。好ましい蛍光標識は、挿入染料である。特に好ましい蛍光染料は、二本鎖核酸と結合した場合に蛍光増強を示すが、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用いた場合には最小蛍光しか示さないＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩである。あるいは、標識は、非標識化「タッグ」であるだけでよく、これは次にタッグと結合する標識化分子に認識される。例えば、ビオチンをタッグとして使用し、アビジニル化又はストレプタビジニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）を用いてタッグと結合させ、次いで色原体基質（例えばテトラメチルベンザミンＴＭＢ）を用いてＨＲＰの存在を検出する。同様に、タッグはエピトープ又は抗原（例えばジゴキシゲニン）であり、酵素性、蛍光性又は放射性標識化抗体を用いてタッグと結合させる。さらに別の例は、当業界で公知のテロメア反復結合タンパク質を利用する。このようなタンパク質は、二本鎖又は一本鎖テロメア反復体との結合として同定されており、元の又は組換え体タンパク質を用い得る。典型的には、このようなタンパク質は精製して使用され、特定のタンパク質に結合した標識、又はそれに特異的な抗体に基づいて検出される。標識の検出は、開業医の要求、並びに使用する特定の標識又は検出手段によって、別の工程を包含し得る。いくつかの場合には、開業医は先ず、下記のように、ゲル電気泳動を用いて反応生成物を互いに分離する。その他の分離方法、即ち、クロマトグラフィーを用いてもよいが、しかしいくつかの目的のためには、分離は実施せず、増幅中の二本鎖ＤＮＡにおけるフルオロフォアのインターカレーションを測定する均質ＰＣＲの場合と同様に、反応を実行する容器から反応混合物を取り出さずに、延長化テロメラーゼ基質及び／又はプライマーの検出を実施する。本発明の重要な利点の１つは、あらゆる当該検出フォーマットへの本方法の適応性である。マルチプレックス電気泳動分離機（Multiplex Electrophoretic Separator ＭＥＳ）はプライマー延長生成物又は標的核酸及び非特異的ｄＮＴＰ及び／又はプライマーの混合物を有するその他のあらゆる標本の分析に有用であり（実施例１１参照）、高スループット診断検定に特に有用である。図１Ａ及び１Ｂに示すように、本装置は、マルチウエルプレート（３）及び２つの電極（４）を受容するために適応される貯蔵所（２）を含有するハウジング（１）で構成される。電極は、典型的には互いに平行で、好ましくはハウジングに可動的に取り付けられて、２つの電極間にマルチウエルプレートを保持し、マルチウエルプレートの表面と同一形状を有する（即ち、好ましい実施態様における微小滴定プレート中に存在する全ウエルの表面を電極が覆う）貯蔵所（２）上にマルチウエルプレートを挿入させる。マルチウエルプレートは、典型的には、一列（即ち、一条の微小滴定ウエル）又は複数列で、プレート当たり２４、４８、９６又はそれ以上のウエルを有する。各々のウエル（５）はその上面（６）で開口し、開口した、しかし密閉可能な下面（７）を有する、例えばSilent Monitor^TM96ウエルプレート（ Pall Corp.）であって、着脱式フィルター底を用いて接着テープで再密閉することができる。微小滴定プレートを２つの電極間に置いて、電流を適用するための手段、例えば電源に接続するための出口に接続する。電極は電導性物質のシート製、例えば金属シート又はワイヤ金属グリッドである（図１）。本装置を用いて、密閉ウエル中で電気泳動マトリックス、例えばポリアクリルアミド又はアガロースゲルを調製することにより、多数の標本中の化合物の混合物を分離し得る。シールを除去し、プレートを電極の上の貯蔵所（２）に入れ、電気泳動マトリックスを電気泳動緩衝液中に浸漬する。あるいは、陰又は陽極を含有する緩衝液を、電気泳動マトリックス中で２つの小室間の唯一の接触点がある２つの小室に提供する。本質的には慣用的電気泳動と同様に分離すべき混合物を電気泳動用に調製し、次いで電気泳動マトリックスの表面に適用する。二次電極をマルチウエルプレート上に置き、電極を電源に接続して、反応混合物の成分を分離させる。非取込みｄＮＴＰ及びプライマーが基質から溶離するまで電気泳動を継続し、その後、ゲルを任意に濯ぐか又は洗浄し、マトリックス内の生成物を使用する標識に適した手段により検出する。標識の組合せをプライマーの標識化に用いて、異なる生成物（例えば、延長テロメラーゼ基質の又は対照核酸のプライマー延長生成物）を単一ウエル中に検出する。ストレプタビジン被覆微小滴定ウエルプレート（Boehringer Mannheim）はさらに、増幅化又は非増幅化テロメラーゼ延長物質の検出に用い得る。方法の一例としては、ビオチンによるテロメラーゼ基質の５’末端の標識、ストレプタビジン被覆微小滴定ウエルプレート中の延長テロメラーゼ基質の捕獲、及びテロメア反復体と相補的な標識化プローブによる延長化テロメラーゼ生成物の存在の検出が挙げられる。上記のように、標識は放射性同位元素又は蛍光、リン光、化学発光又は酵素分子、あるいは種々の発色団、エピトープ又は抗原である。もちろん、延長テロメラーゼ基質がビオチニル化逆戻りプライマー（例えば、（ＣＴＲ）₄ 、ＣＸ、ＡＣＴ、ＡＣＸ、ＬＣ）により捕獲され、延長テロメラーゼ基質と相補的なプローブにより検出される場合には、この手順の逆を用い得る。延長生成物は、テロメラーゼ基質と、又はテロメア反復体と相補的なプレートに結合されるプローブを捕獲することにより、捕獲し得る。延長生成物はさらに、テロメラーゼ延長又は生成物増幅中にビオチン標識化ｄＮＴＰ（例えば、ビオチン−ｄＵＴＰ）を取り込む事により、そしてストレプタビジンプレート中の延長化生成物を捕獲することにより、捕獲し得る。次に、テロメラーゼ基質又はテロメア反復体と相補的なプローブにより、生成物を検出する。適用使用する方法及び試薬を説明してきたが、本発明のテロメラーゼ検定のための適用には、研究、診断及びその他の適用が考えられる。本検定は迅速、簡単で且つ単一反応容器中での反応が可能であるため、本検定は、テロメラーゼ陽性細胞又は標本を検出する必要がある研究及び臨床的実験室環境で用い得る。このような適用としては：（ｉ）潜在的癌細胞の同定のための腫瘍生検における不死細胞の検出；（ｉｉ）作因（例えば癌遺伝子）又はテロメラーゼを活性化し、テロメラーゼ及び細胞の複製寿命を延長する化合物を固定することを含めた、テロメラーゼを活性化し、抑制し、阻害し、又は抑圧し得る薬剤の細胞ベースの又は無細胞のスクリーニングにおける同定；（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性を有する幹細胞、初期先祖細胞又は胎児細胞；（ｉｖ）分化及び発生中のテロメラーゼ調節の検査；（ｖ）テロメラーゼの精製中に生じるテロメラーゼ陽性分画の同定；（ｖｉ）原生動物又は真菌類感染の同定；（ｖｉｉ）疾病状態又は特定の医学的状態を有しない個体と比較した場合の患者における種々のレベルのテロメラーゼ活性を特徴とする病状態又は医学的状態の診断；（ｖｉｉｉ）テロメラーゼ活性の非存在を特徴とするある種の不妊症の診断が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の診断方法は、あらゆる起源の細胞又は組織型に関して用い得るし、あらゆる起源の不死細胞を検出するのにも用い得るが、但し細胞はテロメラーゼ活性を発現する。ヒト標本に関しては、典型的には不死細胞の検出を用いて、広範なあらゆる種類の癌細胞の存在を検出する。固体腫瘍及び白血病を含めたそれらの例を以下に挙げるが、これらに限定されない：apudoma、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌（例えばウォーカー、基底細胞、塩基性落屑性、ブラウン−ピアース、管状、エーリッヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞、ムチン性、非小細胞肺、カラスムギ細胞、乳頭、硬性、細気管支、気管支原性、扁平上皮細胞及び一過性細胞癌）、組織球障害、白血病（例えば、Ｂ細胞、混合細胞、ヌル細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞慢性、ＨＴＬＶ−ＩＩ関連、リンパ球性急性、リンパ球性慢性、肥満細胞及び骨髄白血病）、悪性組織球増加症、ホジキン病、免疫増殖性小、非ホジキンリンパ腫、プラスマ細胞腫、細網内皮症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、繊維腫、繊維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、骨膜腫、腺繊維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、栄養膜腫瘍、腺癌、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、肝癌、汗腺腫、島細胞腫瘍、ライディッヒ細胞腫、乳頭腫、セルトリ細胞腫、膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、脳室上衣腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽腫、感覚上皮腫、神経繊維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、被角血管腫、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、繊維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、実験的肉腫、カポジ肉腫、肥満細胞肉腫）、新生物（例えば骨、乳腺、消化系、結腸直腸、肝臓、膵臓、下垂体、精巣、眼窩、頭及び頸部、中枢神経系、聴覚、骨盤、気道及び尿生殖器）、子宮頸部形成異常。本発明の一局面において、癌、例えば尿生殖器癌、膀胱癌、肺癌及び白血病を診断するために、体液（例えば尿、粘液、痰、唾液、血液）、微細針吸引又は生検から、テロメラーゼ活性を確定する。好ましくは、非侵襲性方法を用いて液体標本を採集し、次いで、例えば遠心分離、濾過又はその他の物理的手段によりそれから細胞を単離して、細胞標本を得る。異なる癌に対するスクリーニングのための細胞を得るためのこの簡単な方法は、臨床的環境に特に適している。次に、テロメラーゼ活性を検定して、テロメラーゼ活性の存在を基礎にした診断を可能にする。本発明の診断方法では、テロメラーゼレベルの上昇が認められるか否かを確定するために、検定を実施する。「レベル上昇」とは、特定細胞中のテロメラーゼ活性の絶対値がその個体の正常体細胞に比して、又は疾病状態に罹患していない別の個体の正常体細胞と比較して、上昇していることを意味する。一般に、テロメラーゼ活性のあらゆる検出可能値は、正常、出生後のヒト体組織からの細胞においては高いと考えられる。テロメラーゼ活性は生殖系列細胞中には認められるが、しかし幹細胞及びある種の造血系細胞においては低レベルのテロメラーゼ活性が検出され、このような細胞は本発明の方法について開業医が問題を抱えていない。生殖系列細胞はヒト体組織標本から容易に識別及び／又は分離され、幹細胞及びある種の造血系細胞中に認められるテロメラーゼ活性は、体組織標本中に存在する少数のこのような細胞がテロメラーゼ活性検定から擬似陽性信号を生じない程低レベルで存在するか、又は他の手段を用いて検出及び識別し得る。体細胞中のテロメラーゼ活性の検出は、不死細胞、例えばある種の癌細胞の存在を示し、病理学的に細胞が非癌性であると分類された場合でも、確定を行うために用い得る。したがって、本発明の方法は、細胞が視覚的に癌性になる前に、高信頼度で癌性症状の検出を可能にする。本発明の診断試験はさらに、他の診断試験と一緒に実施し得る。いくつかの場合には、このような組合せ試験により疾病の進行に関する有用な情報が提供されるが、しかしテロメラーゼ活性を試験するための本発明の方法は、それに関して同様に多大の有用な情報を提供する。本発明の方法を用いて患者の標本中の癌細胞の存在を検出する場合、テロメラーゼ活性の存在を用いて患者が疾病進行中であるか、特定の腫瘍が隣接組織を侵害したり又は離れた場所に転移していないか、そして癌が再発してはいないかを確定し得る。本発明の方法と一緒に付加的情報を提供し得る試験としては、ＤＮＡ倍数性、Ｓ相における細胞の分画、結節性症状、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子生成物、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２、ｒａｓ及びその他の癌遺伝子に関する診断試験が挙げられる。さらにテロメラーゼ活性のレベルを用いて、癌治療中の化学療法の効果をモニタリングし得る。テロメラーゼのレベルはテロメラーゼ阻害剤又はレチノイド療法、あるいは他のあらゆる癌療法の効力のモニターであるが、この場合、テロメラーゼ活性は、それぞれテロメラーゼ阻害、細胞分化又は細胞死により低減される。テロメラーゼのレベルは、患者内の不死細胞の数を概算することにより、あらゆる腫瘍崩壊性又は腫瘍分解性手法の効力をモニタリングし得る。テロメラーゼ活性、又はテロメラーゼ成分の存在は、例えば臍帯又は母体血液から採取される胎児細胞に関するマーカーとして測定され得る。母体血液中の胎児細胞の同定は、妊娠の診断に、又は胎児細胞の遺伝的検査に、即ち試験される細胞を同定するのに有用である。テロメラーゼ活性はさらに、骨髄増殖に関するマーカーとして用い得る。骨髄移植は、典型的には低分化骨髄細胞を用いるとうまくいく。造血細胞は、それらが分化するとテロメラーゼ活性を失うため、テロメラーゼ活性の存在は移植目的に有用な造血細胞に関するマーカーとして用い得る。テロメラーゼ活性に関する一般的検定並びに将来開発され得る検定はすべて、用い得る。本発明はさらに、本発明の診断方法を実行するためのキットを提供する。このようなキットは容易に入手可能な物質及び試薬から調製され、種々の組合せが成される。例えば、このようなキットは、少なくとも１検定に十分な量で、以下の１つ又はそれ以上の物質を包含し得る：オリゴヌクレオチドテロメラーゼ基質（例えばＴＳ）、対照試薬（例えば対照オリゴヌクレオチド（例えばＴＳＮＴ、ＴＳＲ８）、陽性対照抽出物又は細胞ペレット）、並びにオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、ＣＸ、ＡＣＴ、ＡＣＸ、ＬＴＳ、ＣＬＴ、ＬＣ、ＬＧ、ＮＴ）が、任意に以下のものと一緒に提供される：反応容器、緩衝液（例えば細胞溶解緩衝液、末端標識緩衝液、ＴＲＡＰ反応緩衝液）、水（好ましくはＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ及びプロテアーゼを含有しない）、ヌクレオチド、標識又は染料（例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ、蛍光剤、標識化オリゴヌクレオチドプローブ、例えばｂＤＮＡプローブ）、酵素（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、ＲＮアーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ）、検定実施に必要な又は役に立つその他の試薬、及び使用説明書。典型的には、使用説明書には、上記の検定のいずれかをユーザーが実施できるように、試薬濃度又は少なくとも１つの検定方法パラメーター、例えば混ぜ合わせる試薬及び標本の相対量、試薬／標本混合のための維持時間、温度、緩衝液条件等を説明した明確な表現が含まれる。本発明の一実施態様では、キットはテロメラーゼ基質及びプライマーを入れる反応試験管を包含する。このキットの好ましい形態は、ワックスバリアによりプライマーが他の反応成分から分離されるような試験管を包含する。プライマーはガラスビーズ上に被覆されるか又はそれに取り付けられる。キットの意図されるユーザー及びユーザーの特定の要求に依って、本発明により広範なキット及び成分を調製し得る。他のフォーマットは、ワックス無含有検定条件を可能にするオリゴヌクレオチドプライマー、例えばＡＣＸプライマーを利用する。本明細書に記載した診断検定の試薬はすべて、易使用性を改良するために、分散液として溶液で、又は実質的に乾燥粉末として、例えば親液性形態で、別々に又は成分の混合物として提供される。酵素又はその他の分解性試薬が提供される場合、試薬を安定化するような条件、例えば低温緒相、安定剤（例えば、グリセロール他派還元剤）の付加等を選択する。不安定試薬は、キットのより安定な成分と一緒に、又は別々に提供され得る。固体支持体、例えばマルチウエルプレート、ガラスビーズ又は試験管、並びに１つ又はそれ以上の緩衝液も、キット中の別々に包装された素子として含まれる。診断方法又は研究適用に関連して本明細書中で考察されるキットは、診断系で通常用いられるものと同じ感覚のものであり、したがってガラス及びプラスチック製（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリカルボネート）瓶、バイアル、プラスチック及びプラスチック−箔積層外被等を含み得る。以下の実施例で本発明の特定の局面を説明し、当業者のための本発明の方法の説明を提供する。実施例は本発明を理解し且つ実施するのに有用な特定の方法を提供するだけであって、本発明はこれらに限定されない。実施例 1 CHAPS で抽出されたテロメラーゼの調製この実施例においては、本発明の両性イオン界面活性剤を基にした抽出法を用いて調製した細胞抽出物のテロメラーゼ活性を、通常のテロメラーゼアッセイを用いて試験した。この細胞抽出物は、不死化した293 細胞から調製したが、これは、テロメラーゼ活性を発現することが公知であり、かつアデノウイルス型5 DNA 断片で形質転換されたヒト胚腎細胞に由来している。この細胞を、５〜10％のウシ胎仔血清を含有するJoklik培地で増殖し、その後遠心分離により収集し（特に言及しない限りは、下記方法では、約１×10⁶細胞が収集されたと推定された。）、一度PBSで洗浄し、10,000×ｇで、１分間、４℃で沈殿し、かつ氷冷したPBS 1ml で再懸濁した。この細胞を再度沈殿し、かつ氷冷した溶解バッファー［10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM MgCl₂、1mM EGTA、0.1mM PMSF（ベンズアミジン又はAEBSF も使用することができる。）、5mM β−メルカプトエタノール、DEPCで処理した水、0.5 ％CHAPS（Pierce 社）、10％グリセロール］中で、 10⁴〜10⁶細胞につき溶解バッファー20μl の濃度（実験の目的に応じて決まる）で再懸濁した。この懸濁液を、氷上で30分間インキュベートし、その後微量超遠心を、10,000×g で、30分間、４℃で回転した。上清を別の試験管に取り出し、ドライアイス上で急速凍結し、かつ任意に-70℃で使用時まで保存した。これらの抽出物は、典型的には総タンパク質濃度5 〜10mg/ml を含有し、テロメラーゼ活性は、複数回の凍結−解凍に対して安定であった。通常のテロメラーゼアッセイの方法及び条件は、Counter et al.、(1992)；Co unter et al.、EMBO J.，11:1921-1929(1994)；及びCounter et al.、J．Virol. ，68:3410-3414(1994)に記載されているが、これはオリゴヌクレオチド基質を、濃度1 μM で使用している。同様にMorin，Cell，59:521-529(1989)参照。この生成物は、８％ポリアクリルアミドシーケンシングゲル上で分離し、かつ一晩、 Phosphorimager（登録商標）スクリーン(Molecular Dynamics 社、Sunnyvale，C A)に晒した。通常のアッセイで使用されるテロメラーゼ基質は、5'-GTTAGGGTTAG GGTTAGG-3'(”(GTTAGG)₃”と略; 配列番号:15);5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'(”(T TAGGG)₃”と略; 配列番号:16)、及び5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'(”TS”と略; 配列番号:3)である。対照試料もアッセイし、これは抽出物10μl を、RNase（DNas e 非含有、Boehringer Mannheim 社）0.5 μｇと共に、25℃で10分間インキュベーションすることにより、テロメラーゼのRNA 成分を分解しかつ不活化するRNas e で前処理した抽出物を含有した。テロメラーゼは、Ｇトリプレットの第一のG を添加した後に休止し、第一の休止の（従ってラダーの同調(phasing)）前に添加されたヌクレオチドの数は、(GTTAGG)₃(配列番号:15)が５個、(TTAGGG)₃(配列番号:16)が４個、及びTS オリゴヌクレオチドが２個であった。この結果は、CHAPS で抽出されたテロメラーゼ活性が、ヒトテロメラーゼで予測されたように機能することを示した。この界面活性剤で抽出された活性は、テロメラーゼ活性を特徴とする伸長生成物の６個のヌクレオチドラダーを生じた。生成物同調シフトが、オリゴヌクレオチドテロメラーゼ基質の3'- 配列に応じて認められ、これはテロメラーゼが介在した伸長と予想され、かつこの抽出されたテロメラーゼは、以前にテロメラーゼ基質として示された、非テロメア性オリゴヌクレオチドを、5'-TTAGGG-3'反復配列により、伸長することができた（ジデオキシヌクレオチド鎖末端配列を用いて確認）(Morin，Nature，353:454-456(1991 ))。この活性は、RNase 処理により破壊されるので、テロメラーゼ活性であろうと予想される（Greider and Blackburn,Cell,43:405-413(1985); Greider and B lackburn，Nature，337:331-337(1989); Morin，Cell，59:521-529(1989)）。実施例 2 テロメラーゼ伸長生成物のPCR 増幅この実施例は、DNA ポリメラーゼを、PCR におけるプライマー伸長反応を仲介するために用いる、本発明のテロメラーゼアッセイ法を詳細に説明している。この反応成分は、テロメラーゼ基質TS（この配列は、前記実施例１で示した）を含み、このテロメラーゼは、テロメア性の反復配列の合成により伸長し、かつこの PCR 法における上流プライマー、及び下流プライマーCXとしても機能し、この構造は、その配列5'-(CCCTTA)₃CCCTAA-3'（配列番号:1）によって定義される。CXプライマー及び非伸長TSオリゴヌクレオチドテロメラーゼ基質の間の相互作用を減少し、その結果プライマー−ダイマー（より正確にはCXプライマー／TSダイマーの形成）が最小化されるように、CXプライマー/ 伸長したテロメラーゼ基質において、ミスマッチを設計した。前述のように、テロメラーゼは、例えばTSオリゴヌクレオチドのような非テロア性配列のオリゴヌクレオチドを伸長することが判っていて(Morin，Nature，35 3:454-456(1991))、及びオリゴヌクレオチド基質TSを、PCR プライマーの相補性によって、非特異的増幅を避けるために使用した。この実施例で記載されたテロメラーゼ活性アッセイを行うために、プライマー相互作用を避けるための別の変更として、下流プライマーCXにおけるミスマッチ（TSに対して）、１本鎖結合タンパク質T4遺伝子32タンパク質、温開始PCR 、及び50℃のアニーリング温度を使用した。これらの条件下では、特異的増幅が、このオリゴヌクレオチド基質が、３個以上の5'-TTAGGG-3'反復によって伸長される場合にのみ生じ、その結果、40 ヌクレオチド（第一の増幅可能なテロメラーゼ生成物）からゲル解析の上限まで伸びているTRAPアッセイ生成物の６個のヌクレオチドラダーを生じた。本発明の方法の簡便性及び効率を大きく改善する別の重要な変法は、テロメラーゼ及びDNA ポリメラーゼの両方が機能することができるような、新規反応バッファーの開発に関する。このバッファーの使用は、TRAPアッセイの１本の試験管でのセットアップ又は構成を可能にする。この変更は、プライマー伸長の特異性を増加することを可能にするが、これは、CXプライマーが、緊縮性のハイブリダイゼーション条件を達成するような、より高温でのみ溶融するワックスバリアによって、最初はこの反応混合物の残りから分離されているためである。このアッセイ試験管に、CXプライマーの50ng／μl 懸濁液を２ μl(0.1μg)添加し、これを、Speed-Vac（登録商標）遠心分離機で、試験管の底に沈殿させ、かつ乾燥するまで蒸発することによって、調製した。このCXプライマー懸濁液に、微量のプロモフェノールブルーを添加し、熱サイクルの前にこのワックスバリアを通って起こり得る漏出をモニタリングした。この目的のための色素の添加は、本発明の実践においては必須ではないが、色素の添加は、生成過程の完全性をモニタリングする一般的方法である。その後試験管を70℃で加熱し、かつ溶融ワックス（Ampliwax（登録商標），Perkin-Elmer社） 7-10μl を、この試験管の底にピペットで入れた。このワックスが、室温で固形化した後、この試験管を40℃で静置した。試験管は、使用前に室温まで温めた。４℃で保存した調製された試験管を用いたところ、２ヶ月までアッセイ性能に対する影響は認められず；このような試験管（及びこれが入ったキット）の予想される保存期間は、少なくとも１年である。反応は、典型的には、このワックスバリア上に、TRAP反応溶液50μl を添加して行った。この反応溶液は、20mM Tris-HCl 、pH8.3、1.5mM MgCl2 、63mM KCl 、0.005 ％Tween 20、1mM EGTA、50mM各dNTP、0.1μg のTSオリゴヌクレオチド、0.5mM T4遺伝子32タンパク質、0.1mg/ml BSA、２ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ（任意に、温開始PCR を促進するために、Clontech社の等量のTaqStart（登録商標）抗体で処理したTaq 2 ユニットを使用する。）、及び１〜２μl のCHAP S 細胞抽出物を含んだ。生成物の放射標識のために、10μCi/ μl の32P-dGTP及び／又は32P-dCTP(3000 Ci/mmol)を0.2 〜0.4 μl 、この反応に添加した。テロメラーゼで、オリゴヌクレオチドTSを、20℃で10分間伸長した後に、これらの試験管を、熱サイクラー（96ウェルのSingleblock（登録商標）システム、Ericomp 社）に移し、27サイクルを行い、各サイクルでは、インキュベーション温度及び時間が、 94℃／30秒、50℃／30秒、及び72℃／30秒から1.5 分であった。このCXプライマー(0.1μg)は、このワックスバリアが70℃以下で溶融する場合に、放出された。実施者の便宜に応じて、この実施例に記載された反応時間、温度、及びバッファー、更には使用した特定の基質及びプライマー、並びに抽出物及びDNA ポリメラーゼの起源を変更することができることを、当業者は認めるであろう（実施例４参照）。例えば、このテロメラーゼ伸長反応は、テロメラーゼの起源に応じて、温度約 10〜約42℃の範囲で行うことができる。テロメラーゼ反応時間は、用いたプライマー伸長工程の数、試料中の予想されるテロメラーゼ量、及び実施者が利用できる時間に応じて、大きく異なることができる。典型的には、このテロメラーゼ反応時間は、５〜60分の間であるが、数時間に及ぶこともできる。同様に、このPC R サイクルは、広範に変化するサイクル時間及び温度で構成される。最も単純な PCR サイクルは、デュプレックス核酸変性工程、その後のプライマーアニーリング及び伸長工程を含む。変性は、典型的にはこの反応混合物の加熱によって行われるが、他の方法、例えばヘリカーゼ処理を用いることもでき、かつ加熱法それ自身は、DNA を変成するが損傷を及ぼさないために十分な量及び時間で、広い温度範囲で行われる。同様に、プライマーアニーリング工程の時間及び温度は、反応バッファー、並びにプライマー配列、濃度、及び組成、更には実施者の求める特異性にかなり依存する一方で、プライマー伸長工程の時間及び温度は、使用したDNA ポリメラーゼの種類に大きく依存する。当業者は、本発明が、この方法で使用することができる、時間、温度、並びにバッファー及び他の反応成分の変動によって限定されるものではないことを認めかつ理解するであろう。試料の分析のために、反応混合物の半分を、15％ポリアクリルアミド非変性ゲル上での、0.5×TBEでの電気泳動で分析した。これらの生成物の可視化は、ゲルを、臭化エチジウム染色、銀染色、SYBR（登録商標）グリーン（Molecular Prob es社）染色、オートラジオグラフィー、又はPhosphorimager（登録商標）分析(M olecular Dynamics 社，Sunnyvale，CA)することによって行った。対照試料を、下記を用いてアッセイした：TSオリゴヌクレオチドを除いた試料；細胞抽出物を除いた試料；不死化した293 細胞抽出物のTRAPアッセイ試料；テロメラーゼの熱による不活性化のために、65℃で10分間のインキュベーションの前処理を施した 293 抽出物の試料；テロメラーゼのRNA 成分を破壊するために、RNase（DNase非含有、Boehringer Mannheim 社）0.5 μg で、25℃で10分間のインキュベーションの前処理を施した、293 抽出物の試料；フェノール抽出された293 抽出物の試料（等量のフェノール：クロロホルムの1:1 混合物と混合し、30秒間激しく攪拌し、相分離のために遠心分離し、かつ水相を収集した。）；293 抽出物（50μl ）をBromelain プロテアーゼ(Boehringer Mannheim 社)5μg と共に、37℃で10 分間インキュベーションし、等量の担体に固定したα2-マクログロブリン(Boehr inger Mannheim社)と、25℃で30分間、振盪しなからインキュベーションし、かつその後10,000×g で10分間遠心分離し（沈殿は、α2-マクログロブリン／Brom elain 複合体）、更に上清を分析のために収集することによって、Bromelinプロテアーゼを除去することによって、プロテアーゼによる前処理を施した293 抽出物の試料；正常な繊維芽BJ細胞抽出物、これはテロメラーゼ活性欠損である；並びに、DEAEクロマトグラフィーによる、テロメラーゼが豊富な細胞抽出物(Morin，Nature，353:454-456(1991))。これらの複数の対照実験の結果は、TRAP(テロメラーゼ反復配列増幅プロトコール)アッセイにおける陽性シグナルは、２個以上の5'-TTAGGG-3'の反復配列を伴うTSオリゴヌクレオチドの伸長が可能な、不死化した細胞抽出物中において、リボ核タンパク質が必要であることを示し、このアッセイがテロメラーゼ活性の検出に特異的であることを立証した。 TRAPアッセイの感度についてより厳密に試験するために、アッセイの別のセットを行い、使用した条件下での界面活性剤抽出及びTRAP検出の限界を試験した。様々な数の細胞の抽出のために、溶解バッファーの量を100 μl と一定に保った。 10⁷の正常な繊維芽BJ細胞抽出物からの約10⁵細胞等価物のアッセイでは、バンドラダーがないことで示されるように、活性が認められなかった。テロメラーゼ活性は、10⁶の不死化した293 細胞抽出物からの約10⁴の細胞等価物のアッセイ、 10⁵の293 細胞抽出物からの約10³細胞等価物のアッセイ、及び10⁴の293 細胞抽出物からの約10²細胞等価物において認められた。10³の293 細胞抽出物からの約 10細胞等価物のアッセイ、又は溶解バッファーのみの対照アッセイにおいては、活性は認められなかった。 10²細胞におけるテロメラーゼ検出の限界は、10⁶の293 細胞のの抽出物の一連の希釈物のTRAPアッセイによって確認された。この限界は、用いたTRAPアッセイ条件の機能であり、かつ現在の方法の感度の絶対限界というよりも、むしろ所定の条件下での実際の限界であると考えるべきである。実施例15は、１個の細胞のテロメラーゼ活性の検出について記した詳細な実施例である。当業者は、このアッセイ感度を上昇する別の方法を利用できることを認めるであろう。例えば、CX の代わりに、プライマーCTR3［(5'-CCCTAA-3')₃( 配列番号:17)］又はCTR4［(5'-CCCTAA-3')₄(配列番号:18)］を使用すると、更に感度が高まるが、これらのプライマーは、おそらくより非伸長TSプライマーと相互作用するであろう。感度限界は、合成テロメラーゼ生成物TS +4(これは、オリゴヌクレオチドTS、これに続く４個のテロメア性反復配列を含む。)の滴定によっても分析した。TS+4オリゴヌクレオチドの希釈物は、熱処理した（テロメラーゼ不活性化した）293 抽出物と混合し、かつTRAPアッセイで分析した。この分析において、このアッセイは、TS+4の10⁶分子から明確な陽性シグナルを生じた。これに加え、マウス組織及び細胞抽出物由来のテロメラーゼ活性(テロメラーゼ活性は、マウスの体細胞に存在する。)を、TRAPアッセイで検出したが、通常のアッセイによるマウスのテロメラーゼは、ほとんど非前進型であることが示され（すなわち１個の反復配列のみ添加される；Prowse et al.，Proc．Nati．Acad ．Sci．USA 90:1493-1497(1993)）、これはTRAPアッセイが、通常のアッセイでは可視化することができないような、前進型マウステロメラーゼ活性の非常に低いレベルが検出されたか、もしくはマウステロメラーゼが、TRAP条件下でより前進されることを示した。実施者の便宜を計り、下記の生成物情報を提供する。反応試験管は、RobbinsS cientiiic 社(Sunnyvale，CA)の0.2ml Strip-ease（登録商標）試験管であり、使用前に滅菌した。全てのオリゴデオキシリボヌクレオチドは、Keystone Labor atory 社 (Menlo Park，CA)から入手した超純グレード(HPLC 精製)であり、かつDEPC処理した水又はTEバッファー(10mM Tris.Cl、pH7.6; 1mM EDTA、pH8.0)中に、濃度1mg/mlで懸濁した。Taq DNA ポリメラーゼ、Tween 20、及びT4遺伝子32 タンパク質は、Boehringer Mannheim 社から購入した。放射性同位元素は、NEN- Dupont社から購入した。dNTPは、Phar macia 社から購入し、アリコートを-20℃で保存し、使用前に解凍した（２回以上は解凍せず）。他の反応成分は特に言及しない限りは全て、分子生物学用グレードであり、Sigma 社から購入した。ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理し、脱イオンした、滅菌水を、通常使用した。実施例 3 TRAP 及び通常のテロメラーゼアッセイの相対感度−正常体細胞及び不死化した細胞のテロメラーゼ活性のアッセイこの実施例は、様々な組織及び個体から得た不死化した細胞系及び正常体細胞の培養物の細胞試料におけるテロメラーゼアッセイについて説明した。BJ細胞のような接着細胞培養物、ヒト皮膚繊維芽細胞の正常体細胞培養物を、抽出調製の前に、80％の密集度まで増殖した。このアッセイ（10⁵細胞等価物／反応）を、前記の実施例１及び２に従って行い、アッセイの結果を下記表１にまとめた。アッセイは、同じ10細胞抽出物について行い、これはCHAPS 界面活性剤溶解法を用いて調製した（実施例１及び２参照）。対照試料は、試料中のあらゆるテロメラーゼ活性を除くように、RNase で前処理した抽出物でアッセイした。乳がん系MCF-7/ADR-RES 、膵がん系AsPC-1、前立腺がん系PC-3、黒色腫系M14 、正常な包皮繊維芽細胞培養物BJ、肺がん系NCI-11 23、正常体細胞の繊維芽細胞培養物31Y0、正常肺の繊維芽細胞培養物IMR-90、卵巣がん系OVCAR-3 、大腸がん系C0L0205 、及び不死化した腎細胞系293 についてアッセイした。通常のアッセイは、１反応につき10⁶細胞等価物を使用した。いくつかの不死化した細胞系（293、MCF-7/ADR-RES 、NCI-H23 、OVCAR-3 、C 0L0205 、M14)は、両方のアッセイにおいて活性を示し、その他(AsPC-1 及びPC- 3)は、TRAPアッセイでのみ活性を示し、かつ正常体細胞培養物(BJ 、IMR-90及び31Y0)は、いずれのアッセイにおいても、検出可能な活性を示さなかった。これらの結果は、TRAP法が、通常のアッセイでは陰性であるような抽出物におけるテロメラーゼ活性を検出することができることを示している。この研究は、18の異なる組織からの、74の不死化した細胞系及び22の正常体細胞培養物を含むように拡大され、かつこの結果を、下記表１にまとめた。各個別の細胞培養物は、界面活性剤で抽出され、かつTRAPアッセイを用いて、テロメラーゼ活性を調べた。この特異的不死化した細胞系及び正常体細胞培養物は、起源の組織でまとめた。試験した不死化した細胞系及び正常体細胞培養物は：(１)皮膚−黒色腫(LOXIMVI，M14，Malme-3M，UACC-62)、正常繊維芽細胞（GFS，S37b， Malme-3，BJ）、正常角質細胞（始原(primary)包皮）；(２)結合組織−繊維肉腫 (HT-1080)；(３)脂肪細胞−脂肪肉腫(SW872)；(４)乳房−腺がん(MCF7，MCF-7/A DR-RES，MDA-MB-231)、乳管がん（T47D，MDA-MB-435）、がん腫(MDA-MB-157，MD A-MB-175-VI，MDA-MB-436，MDA-MB-468，ZR-75-1，ZR-75-30，UACC-812，UACC-8 93，BT-20，BT-474，BT-483，BT-549，HS578T，SK-BR-3，SCC70，SCC38，SCC202 )、正常上皮及び間質細胞(HME: 15，17，31，32，35);(５)肺−がん腫(NCI-H522 ，NCI-H23，A549，EKVK，1299，H146，H69，NCI-H460，H358，H182)，SV40 T- 抗原形質転換体(IDH4，SW26-IG，SW-26-C4）、正常胎児繊維芽細胞(GFL，IMR-90 ，Wi38);(６)胃−胃がん腫(KATO-III);(７)膵−膵管がん（SU.86.86）、腺がん( AsPC-1，Capan-1)；(８)卵巣−がん腫(OVCAR-3，OVCAR-5，IGROV- 1)、腺がん(O VCAR-8);(９)子宮頚部−がん腫(HeLa S3，C-33 A，HT-3)，正常始原上皮細胞;(1 0)子宮−正常始原上皮細胞;(11)腎−がん腫（A498，CAKI-1）、Ad5-形質転換された胚の腎細胞(293);(12)膀胱−がん腫(5637)、移行細胞がん腫(T24)、扁平上皮がん（SCaBER）、正常胎児(FHs 738B1);(13)大腸−腺がん(COLO 205，SW-620 ，HCT-116);(14)前立腺−腺がん(PC-3，DU 145)、SV40形質転換したBPH繊維芽細胞(BPH-1)、正常間質繊維芽細胞(31YO)，BPH繊維芽細胞(S52);(15)CNS−がん腫（U251，SNB-75）、グリア芽細胞腫(SF268);(16)血液−白血病(Molt4，HEL)，T- 細胞白血病(Jurkats)、急性前骨髄性白血病(HL-60)、慢性骨髄性白血病(K-562) 、細網肉腫(U-937);(17)網膜- SV40形質転換した色素沈着した上皮細胞(AGO6096 A);及び(18)関節: 正常滑液繊維芽細胞(HSF)である。正常な体細胞培養物は、このTRAPアッセイにおいて、検出可能なテロメラーゼ活性を示さなかった。74の不死化した細胞系の内68は、腫瘍由来の系であり、かつ６はウイルスのオンコタンパク質で形質転換された細胞系であった。68全ての腫瘍系は、テロメラーゼ活性を有していた。６の形質転換された系のうちの２は、テロメラーゼ活性について陰性であった。これらの２の系が不死であるならば、検出可能なテロメラーゼ活性の欠損は、予想されなかった。しかしこれらの系のテロメアの長さの研究は、これらのテロメアが、この系が由来した正常な体細胞のそれよりも長いことを示し、このことは、これらの細胞がテロメラーゼ活性の一過性の突発を経験したことを示し得る。このテロメラーゼ活性が、再度開始されないならば、その後これらの細胞は不定に複製されることはないであろう。実施例 4 テロメア性反復配列増幅プロトコール(TRAP)の標準的操作法この実施例は、本発明のTRAPアッセイを行うための、５段階のプロトコールを提供する：（A）作業場の配置;(B)予防措置;（C）微量抽出;(D)定量的アッセイ；及び(E)分析。ここで記された方法は、この活性の定量的分析を提供し、推奨される数値はあるが、使用した条件及び望ましい結果の性質に応じて、あらゆる状況において全ての推奨事項に従う必要はないことが、当業者には理解されるであろう。(A) 作業場の配置 TRAPアッセイのこの配置における重要な因子は、PCR 工程に先行して行われる最初の反応混合物を作製する環境である。この理想的な環境は、誤ってそれぞれ陰性及び陽性の結果を生じることがあるような、リボヌクレアーゼ及びPCR 増幅されたDNA 生成物の夾雑物を含まない。PCR 生成物(及びRNase)夾雑物の主な起源は、実験の実施者によるものであることがあり、高い個人的衛生基準を維持し、かつPCR 生成物の開封又はピペッティング時のPCR 生成物のエアゾルの発生、又はPCR 生成物の電気泳動後のゲルバッファーの破棄を避けなければならない。研究者の方へ、試料の上の空気をろ過して吹出すような正圧の換気フードが、理想的である。個別の溶液、ピペット、試験管及びチップを、常に使用し、かつフードの中に置かなければならない。作業場は、反応の準備前に、10％漂白剤で拭き取り、かつフードは、使用しない時は、定期的にUV照射する。更に、ピペットの胴部は、エアゾル耐性(aerosol-resistant)のチップを使用する場合であっても、定期的に1 0％漂白剤に浸さなければならない。研究者は、手袋をはめ、手首にゴム製のひものついた使い捨ての実験着を着用し；この実験着は、定期的に交換しなければならない。 TRAP反応の準備用に指定された区域は、標準的ひきだしのついた机の上に、VW R 社の寸法が45.7cm(L)×30.5cm(W)×61cm(H)のアクリルシールド(カタログ番号 56615-848)を置く。この机の上は、板又は重い布のいずれかで覆い、かつ前面は、該シールドで保護する。この配列は、空気が停滞した空間を作り出し、夾雑物が作業場から外側に漏れることを防ぎ、かつこれらの試料は、研究者から物理的に保護される。全ての溶液、ピペット、チップ、及び試験管は、このステーション内に保管し、かつ作業場は、この作業場の天井に装備された短波長UVランプにより、定期的にUV照射する(Black Ray UV lamp，XX-1SS，VWR 社、カタログ番号 36575-059)。(B) 予防措置前述のように、TRAPアッセイは、PCR 増幅及びリボ核タンパク質（テロメラーゼ）のin vitroでの活性の使用の両方を組込んでいるので、このアッセイに対し有害であり得る、PCR-生成物(DNA)汚染及びRnase 汚染を防ぐために特に注意が必要である。下記の基本的予防措置を、テロメラーゼ抽出及びPCR 増幅工程を含む、アッセイプロトコールの全ての工程で遵守し、問題点を避ける：(１)全ての溶液に、DEPC処理したH20 、又は市販のヌクレアーゼを含有しない水（Sigma 社）を用い、かつ使用前に少量の溶液に分割する;(２)このアッセイ溶液（PCR バッファー、CHAPS 抽出バッファー、dNTP 、Taq ポリメラーゼなど）を、実験室内の他の試薬とは分けて保管する;(３)手袋をはめる;(４)このアッセイ用に指定されたピペッターセット及びエアゾル耐性チップ(ART)を使用する; 並びに(５)増幅された試料は、試料が調製された区域と同じ区域では分析しない（すなわちPCR 試験管は、PCR 増幅後は、アッセイ試薬及びピペット／チップが置かれている、同じベンチでは開封せず；このPCR ベンチから離れた位置で、代わりの別のピペッターを使用する（任意にARTなし）。）。(C) 微量抽出この微量抽出法で使用した溶解バッファーの材料の必要条件を、下記に示す。溶解バッファー(0.5％CHAPS 又はCHAPSO) ＊ 0.1Mベンズアミジン(1μl)及びβ−メルカプトエタノール(0.35 μl)は、抽出工程を行う直前に、溶解バッファー1mM に添加した：PMSF又はAEBSF を、ベンズアミジンの代わりに使用することができる。この微量抽出法は、下記の工程を含む；１．数を数えるか、もしくは組織重量から外挿して、細胞数を確定する。２．細胞又は組織を沈殿し、PBS（Ca 及びMg非含有）中で２回洗浄し、再度沈殿し、かつPBS を除去する。細胞又は組織は、この時点で-80 ℃で保存する。３．再懸濁した細胞を、細胞10⁶〜10⁵につき（用途によって異なる）200 μl の溶解バッファー中で沈殿する。組織については、溶解バッファー200 μl を、組織20〜100 mgに使用する。組織は、下記の方法(a，b 又はc)のいずれかで処理することができる。 a)軟組織は、電動式使い捨て内筒(VWR社、カタログ番号KT749520-0000 、KT7495 40-0000)を用いて、ホモジナイズする。最初にこの組織試料を、滑らかなコンシステンシーに達するまで、滅菌した刃で細かく切る。この試料を、1.5ml の遠心管に移し、かつ溶解バッファーを添加する。その後この試料を、均一なコンシステンシーが得られるまで、電動式内筒中、氷上でホモジナイズする（10秒以下）。 b)結合組織は、滅菌した乳鉢の中に入れ、かつ液体窒素を添加することによって凍結する。その後この試料を、適した乳棒で粉砕し、微粉とする。次に解凍した試料を、滅菌した1.5ml 遠心管に移し、かつ溶解バッファーで再懸濁する。 c)結合組織は、溶解バッファーと混合し、かつこの混合物を、均一なコンシステンシーが得られるまで、氷上で、機械的ホモジナイザーを用いてホモジナイズする(例えば、PowerGen（登録商標）Mode1 35ホモジナイザー、Fishe r 社、カタログ番号15-338-35H)(5秒以下)。この試料の氷上でのホモオジナイズは、タンパク質を不安定にする可能性がある熱から、試料を守る。４．この細胞又は処理した組織を、氷上で、30分間インキュベートする。５．この細胞又は処理した組織を、微量遠心分離機(Eppendorf社)で、12,000 g で、30分間、4 ℃で回転する。６．抽出物を別の試験管に取り出し、かつ1 TRAPアッセイにつき１〜２μl 使用し；残りは、ドライアイス上で急速凍結し、望ましい場合には-70 ℃で保存する。典型的なタンパク質濃度は、１〜10μg/μl である。(D) 定量的アッセイこのアッセイには、下記の物質が推奨される：TSプライマー(5'-AATCCGTCGAGC AGAGTT-3'；配列番号:3; HPLC精製、1 μg/μl); ACX プライマー(5'-GCGCGG[CT TACC]₃CTAACC-3';配列番号4; HPLC精製、0.1 μg/μl)；NTプライマー(5'-ATCGC TTCTCGGCCTTTT-3'; 配列番号:6; HPLC精製、0.1 μg/μl); TSNT内部対照(5'-AA TCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3';配列番号:5;HPLC 精製、0.01 amol/μ l); TSR8定量標準(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]₇-3'；配列番号: 19; HPLC 精製、1 amol/μl); 2.5mM dNTPs(Pharmacia 社); Taq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer 社、AmpliTaq（登録商標）);及び10×TRAPバッファー。10 ×TRAPバッファー成分 5ml について 200mM Tris-HCl，pH8.3 1mM(1M Tris-Cl,pH8.3) 15mM MgCl₂ 75μl(1M MgCl₂) 630mM KCl 3.15ml(1M KCl) 0.5 ％ Tween 20 250 μl(10％、Boehringer Mannheim社） 10mM EGTA 250 μl(0.2M EGTA) 1mg/ml BSA 250 μl(20mg/ml)Boehringer Mannheim社フラクション５）水（プロテアーゼ、RNase、及びDNase-非含有） 25μl 定量アッセイのためには、末端を標識したTS基質を使用することができ、この場合基質／プライマーは、使用した特定の検出及び定量システムに応じて、下記の反応混合物、［³²P］γATP、又は他の試薬、例えば5'- ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光性色素又は他の発蛍光団を用いて、末端を標識することができる。末端標識反応混合物 (³²P)γATP(3000Ci/mmol,10μCi/μl) 2.5μl TSプライマー（1 μg/μl） 1.0μl 10×OPA バッファー（Pharmacia 社） 1.0μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ(9.7U/ μl) 0.5μl DEPC水 5.0μl この末端を標識する試薬は、反応容器中で一緒にし、かつ37℃で20分間、引き続き95℃で5 分間インキュベートする。当業者には、末端標識の条件（例えば放射活性ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの量）は、具体的な用途及び実施者の必要性に応じて変更することができることは明らかであろう。例えば、このアッセイの感度を上げるためには、実施例15に示したように、標識プライマーの比活性を増加することによって達成することができる。テロメラーゼアッセイ反応混合物を調製するために、下記の物質をPCR 反応試験管内で混合する。物質総容量50μl 10×TRAPバッファー 5μl 2.5 mM dNTPs（Pharmacia 社） 1μl 末端標識したプライマー（0.1 μg/μl TS） 1μl ACX プライマー（0.1 μg/μl） 1μl NTプライマー（0.1 μg/μl） 1μl TSNT内部対照（0.01 amol/μl） 1μl Taq ポリメラーゼ（AmpliTaq，Perkin Elmer社） 0.4μl （2ユニット） DEPC処理したH₂O 37.6 μl テロメラーゼ抽出物 2μl 任意の成分、T4遺伝子32タンパク質0.2 μl（5mg/ml，Boehringer Mannheim 社から入手）、及びTaqStart（登録商標）抗体0.4 μl(Clontech社から入手; このポリメラーゼは、アッセイ前に、該抗体と混合される。)を含む。対照前記反応混合物において、テロメラーゼ抽出物は、下記の１種と置換することができる：陰性対照RNase-不活性化した又は熱で不活性化した抽出物(抽出物は、75〜85℃で、10分間インキュベーションすることによって、熱により不活性化する。);陽性対照細胞抽出物; CRAPS 溶解バッファー(プライマー−ダイマー/PC R 夾雑物対照);及びTSR8（0.1 amol定量対照）。この反応は、下記の工程で行う：１．反応混合物を、30℃で、10分間インキュベート（この工程は、工程２で使用した装置と同じ物を用いて行う。）；２．この反応混合物を、下記の時間、温度でインキュベートし、PC R を行う：94℃／30秒、その後60℃／30秒；これを、25〜30サイクル繰り返す；３．ブロムフェノールブルーを含有する色素及びキシレンシアノール（50％グリセロール/50 mM EDTA中に、それぞれ、0.25％）を添加し、試料を、0.5 ×TBE を溶媒とする非変性PAGEの10〜15％、好ましくは12.5％に、プロモフェノールブルーがゲルを通過するまで曝す（Boehringer Mannheim 社の分子マーカーV は、このゲルにおいて良好なDNA マーカーである。）；及び４．例えばPhosphorirmager（登録商標）（放射標識用）及び他の検出に適した手段で、生成物の形成を可視化する。前記TSNT内部対照は、RNase 処理又は抽出対照にかかわりなく、TRAPアッセイの第一の生成物のゲル14bp以下のバンドとして見える、特異的PCR 増幅生成物を生じる。この内部対照バンドは、様々な試料からのPCR 増幅物を、標準化するために用いることができ、かつ下記のように、末端標識したTSオリゴヌクレオチド基質／プライマーと共に使用した際に、生成したテロメラーゼ生成物の数を算出することができる。(E) 分析 i)非加熱処理(x)及び加熱処理試料抽出物(Xo)、CHAPS 溶解バッファーのみの対照(r_o)、及びTSR8定量対照(r)を含む、全ての試料に由来したTRAP生成物のラダーバンドに対応しているゲル列の領域のシグナルを測定する； ii)非加熱処理試料のTSNT内部対照(c)、及びTSR8定量対照(c_R)からのシグナルを測定する； iii)下記式を用いて、テロメラーゼ生成物の量を定量する： TPG（ユニット）×（(x−x_o)／c）／（(r−r_o)／c_R×100(TSR8 の 1μl(0.1 amo l)を使用の場合) TPG（生成した総生成物）の各ユニットは、抽出物中のテロメラーゼによって、少なくとも３又は４もしくはそれ以上のテロメア性反復配列で伸長された、TS プライマーの数(１×10^-3amole 又は600 分子)に相当する。典型的には、このアッセイは、１〜1000 TPGの直線性の範囲を有し、これは30℃、10分間における、約10から10,000の対照細胞のテロメラーゼ活性に等しい。この計算は、TS基質が末端標識された場合にのみ、無効であり、かつ検出に、放射性dNTPs の直接取込み又は非放射性定量法が使用されるような、TRAPプロトコールには、この場合シグナルが生成物の長さによって決まるので、適用することができない。これらのプライマーは、正確な定量分析のために、鋳型よりも過剰に存在しなければならない。従って、試料が非常に高レベルのテロメラーゼ活性を有する場合は、該抽出物を希釈し、PCR プライマーを制限しない。あるいは、いずれかの配列の対照の核酸を、所定の量、この反応混合物に添加することができ、かつ伸長されたテロメラーゼ基質を増幅するために使用されたものと異なるプライマーで、この対照を増幅する。この対照オリゴヌクレオチド及び／又は対照オリゴヌクレオチドの増幅に使用されたプライマーは、テロメラーゼ伸長生成物に使用された標識と、同じであるか、もしくは異なる。実施例 5 テロメラーゼ活性のin situ 検出この実施例は、in situ で用いる、本発明のテロメラーゼアッセイ法について、説明している。この方法は、細胞によるテロメラーゼ基質のインターナリゼーション、及びテロメラーゼが細胞内に存在する場合の、伸長したテロメラーゼ基質の検出に関連している。当業者には、多数の方法が、細胞による核酸のインターナリゼーションに利用でき、かつ本願明細書については、様々な方法を、伸長したテロメラーゼ基質の検出に使用することができることが理解されるであろう。テロメラーゼ基質の使用については、使用した特定の検出法によってもたらされたもの以外は、限定はない。ある具体例においては、プラスミドテロメラーゼ基質が使用される。好ましいプラスミドテロメラーゼ基質は、選択可能な、哺乳類の複製起点を有する複数の複製ベクターであり、このベクターは、哺乳類ゲノムには存在しない制限部位（例えばIsce I）に隣接する、非テロメア性テロメラーゼ基質配列（例えば、TS配列、5'-AATCCGTCGAGCAGAGTG-3'）（配列番号:3）を含む。この具体例において、この制限部位に特異的な制限エンドヌクレアーゼは、直線状のテロメラーゼ基質の提供によってもたらされる。例えば、特異的制限酵素（例えばIsce I）をコードしている遺伝子を有し、操作により誘導可能なプロモーターに連結された第二のプラスミドは、標的細胞へと、第一のプラスミドと共に、共感染(coinfected)される。誘導時に、独特な制限酵素をコードしているプラスミドは、テロメラーゼ基質プラスミドの挿入部位に存在する特異的制限部位を切断するような制限酵素を発現する。このことは、テロメラーゼにより、 TTAGGG反復配列で延長することができる、直線状のテロメラーゼ基質プラスミドを生じる。A.DNA 基質のインターナリゼーションこれらの基質のインターナリゼーションは、受動インターナリゼーション（例えば標的オリゴヌクレオチド又はDNA を、細胞媒質に、濃度10〜100 μM で添加する。）か、界面活性剤又はStaphylococcusα毒素(BRL社、製造業者の指示に従う)による微量穿孔法か、リポソーム（例えばLipofectAminem（登録商標）、Lip ofectin（登録商標）、LipofectAce（登録商標）、BRL 社、製造業者の指示に従う）か、もしくは電気穿孔法（例えばDMEM媒質中で、総量0.8ml 、V=0.25KV、キャパシタンス＝960 μF 、0.4cm ギャップを伴う電気穿孔キュベット内の抵抗なし）を用いて達成することができる。標的核酸が該細胞によりインターナリゼーションされた後、この細胞は、37℃で、１〜６時間インキュベートした。固体の組織試料については、凍結した固定していない組織を、クリオスタットで薄切片に切り取り、滅菌した顕微鏡用スライドガラス上に置き、DNA テロメラーゼ基質、もしくはリポソームを取り込んだDNA テロメラーゼ基質を含有する媒質で、37℃で、１〜６時間インキュベーションした。インキュベーション後、この組織を、PBS で優しく洗浄し、下記の方法を用いて固定した。活性テロメラーゼが存在する場合は、このDNA 基質は、TTAGGG反復配列のde novo 合成により伸長した。B. 試料の固定及び透過(permeabilzzation) 基質のインターナリゼーション及びインキュベーション後に、この細胞又は切片状の組織に、テロメラーゼ反応、及びあらゆる分解反応を停止する処理を行い、かつ検出のために透過性とした。例えば、これらの試料は、PBS で２回洗浄又はリンスし、かつ当該技術分野において公知の多くの方法のいずれかで固定することができ、これには、例えばメタノール：酢酸（比3:1 、-20℃で一晩インキュベート）、緩衝した10％ホルマリン（室温で４〜15時間）、３％パラホルムアルデヒド（室温で４〜15時間）、４％ホルムアルデヒド（室温で４〜15時間）、又は市販のPermeafix のような固定液（ORTHO 社、室温で1 〜5 時間）を使用することができる。次にこれらの細胞を、Cytospin（登録商標）（Shandon 社）により、顕微鏡用スライドガラス上で固定し、かつ室温で一晩乾燥した。この固定した試料を、その後プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼK、プロナーゼ、トリプシン、ペプシン[2 mg/ml]）で、室温で10-60 分処理することにより透過性とした。これらの試料を、その後PBS で、室温で10分間、洗浄又はリンスし、100 ％エタノールで簡単に洗浄し、乾燥した。C. 伸長したテロメラーゼの検出これらの試料を透過性にした後、伸長したテロメラーゼ基質が存在するならば、これを、様々な方法で検出することができる。本発明のひとつの態様においては、PCR 検出を用いた。TS及びCTR5プライマー([5'-CCCTAA-3']₅、配列番号:20) を用いる様々なin situ PCR 条件を下記に示す。当業者には公知であるように、他のプライマー対及び反応条件を使用することもできる。GeneAmp（登録商標）i n situ PCR システム1000及びGeneAmpm（登録商標）in situ PCRコアキット(Per kin Elmer 社)を用い、反応混合物50μl（10mM Tris-HCl、50mM KCl、pH8.3；2. 5mM MgCl₂；200 μM dNTPs；1μM TS及びCTR5プライマー；10U AmpliTaqm（登録商標）DNA ポリメラーゼ）を、70℃に加熱した試料に添加し、シリコーンガスケット及びクリップで密封し（製造業者のプロトコールに従う、Perkin Elmer社）、かつ94℃/40 秒、55℃/90 秒で30サイクル増幅した。増幅された生成物の検出のために、印を付けたdUTP又はプライマーを（蛍光標識、放射性同位元素、ビオチン又はジオキシゲニンにより印を付け、dTTPに対するdUTPの比は、T-dUTP94μ M:dTTP 106μMであった。）、PCR 増幅時に取込むことができる。最後のPCR 工程が終了した後、試料を洗浄バッファー（４× SSC; 0.05％Tween 20）で、70℃ で、２分間、３回洗浄した。細胞DNA への印を付けたdNTPの直接の取込みによって生じるバックグラウンドシグナルを減らすために、in situ PCR 増幅前に、試料を、dNTP及びプライマーを含まないDNA ポリメラーゼで、任意にDNA リガーゼで前処理した。このDNA ポリメラーゼは、好ましくは Taq DNA ポリメラーゼであるが、これは、細胞DNA 及び該リガーゼ、好ましくは熱に安定なリガーゼにおける、１本鎖領域の相補的複製物を形成し、得られた生成物においては切れ目がない。従って、この増幅工程におけるDNA ポリメラーゼの添加は、熱に安定なDNA ポリメラーゼで前処理した場合は、不要である。D. シグナル検出蛍光in situ ハイブリダイゼーション（FISH）は、細胞又は組織の混合集合物において、テロメラーゼ陽性細胞を同定するために使用することができる。顕微鏡用スライドガラス上に固定した組織又は細胞の透過後、これらの核酸を、あらかじめ70℃に温めた70％脱イオンしたホルムアルデヒド／２×SSC溶液中に、２〜３分間浸し、変性した。このスライドを、氷冷した70％エタノールに移し、その後、100 ％エタノールに移した（各溶液で４分間）。標識したプローブ（例えば、5'-TTAGGG-3'反復配列の約500bp を含むプラスミド挿入断片の100 〜200ng を、１スライドにつき使用することができる。このプローブは、ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性同位元素、又は蛍光標識物により標識することができる。標識後、このプローブを乾燥し、100 ％脱イオンしたホルムアルデヒド中で再懸濁し、75℃で８分間インキュベートし変性し、かつ迅速に氷で冷却した。これに、２×ハイブリダイゼーションバッファー10μl(４×SSC ; 4 ×Denhardt溶液；20 ％硫酸デキストラン；l00 mM Tris，pH7.5)を添加した。このプローブ／ハイブリダイゼーション混合物(20μl)を、前述の固定した試料に添加し、カバーガラスで覆い、かつゴムセメント(rubber cement)又はマニュキアでカバーグラスの周りを密封し、その後試料を、37℃で、８〜48時間インキュベーションした。その後カバーガラスを取り除き、かつ試料を、２× SSC／50％ホルムアルデヒドで、37℃で２回洗浄し、２×SSC で、37℃ で２回洗浄した（１回の洗浄は５分）。このDNA プローブを、蛍光標識物又は法放射性同位元素で標識している場合は、試料を、退色防止(antifade)溶液(VectaShield（登録商標）、VectaLab社)中に固定、もしくは写真用乳剤を用いて現像し、かつ顕微鏡で観察した。ジゴキシゲニンで標識したプローブは、抱合した抗ジゴキシゲニン抗体(Boehringer Mann heim社)を用いて、製造業者の指示に従い検出した。プローブがビオチンで標識された場合は、このスライドは、2×SSC ／1 ％BSA で、室温で10分間ブロックし、かつ蛍光体で抱合したアビジン／2 ×SSC ／1 ％BSA（最終のアビジン濃度：5 μg／ml）中で、室温で1 時間インキュベートした。このスライドを、下記を用い、室温で5 分間洗浄した：4 ×SSC 、4 ×SSC ／0.1 ％Triton X-100、4 ×SSC、PNバッファー(0.1M Na₂HPO₄; 0.1M NaH₂PO₄及び0.1 ％Nonidet P40)。この試料を、退色防止に固定し、かつ顕微鏡下で観察する。シグナル増幅については、このスライドを、PNM バッファー(PN バッファー＋5 %［w/v］脱脂乾燥乳) を用い、室温で、10分間ブロックし、かつPNM バッファーを溶媒としたビオチン処理をした抗アビジン抗体(5 μg/ml)の溶液中で、室温で20分間インキュベートした。その後このスライドを、前述の４洗浄工程で洗浄し、PNM バッファーで再びブロックし、かつPNM バッファーを溶媒とする蛍光的に抱合したアジビン（5 μg/ml）で、室温で20分間インキュベートした。このスライドを、再度４洗浄工程で洗浄し、退色防止に固定し、顕微鏡下で観察した。当業者には、前述のin situ ハイブリダイゼーションプロトコールの様々な変更が、本発明の方法に適用できることが理解されるであろう。例えば、前述の in situ ハイブリダイゼーション検出法の変更は、最良のin situ 標識法（PRIN S; Koch，J.，“Nonradioac tive in situ Hybridization Application Manual”(1992)，Boehringer Mannhe im,社、31-33頁）を含む。PRINS によるテロメア反復配列の検出は、テロメア反復配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ及び標識されたヌクレオチドを取り込む延長鎖を含む。５％(v/v)グリセロールを溶媒とするPRINS 混合物(10 μl); 10mM Tris-HCl， pH 8.3; 100mM KCl; 0.05％(w/v)Tween 20; 0.75mM EGTA; 2.5mM MgCl2; 0.4 μ M リターンプライマー[例えばCTR4]; 200μM dATP，dGTP，dCTP; 110μM dTTP; 及び90μM 標識されたdUTPを、固定した透過性にした試料上に置き、カバーグラスで密封し、マニュキアで固着し、鉱油を重ね、かつ70℃で30分間から3 時間インキュベートした。PCR 完了後、この試料を、70℃に加熱した洗浄バッファー（4X SSC; 0.05％Tween 20）で、２分間、３回洗浄し、かつシグナルを前述のように観察することができた。 PCR 増幅時の蛍光標識物の直接の取込みから生じるバックグラウンドシグナルを少なくするために、無印のdNTTs 及び非標識プライマーを用いるPCR 増幅に関連した間接的検出法を用いた。その後in situ ハイブリダイゼーションを用いて、PCR 増幅された生成物を、前述の生成物に特異的な印を付けたハイブリダイゼーションプローブにより検出した。E.in situ PCR 生成物の延長 In situ PCR は、細胞からのPCR 増幅生成物の漏れを最小化することで改善することができる。この理由は、このPCR 生成物が、典型的には200bp よりも大きく、好ましくは500bp よりも大きく、及びより好ましくは700bp よりも大きいことである。あるいは、細胞マトリックスからの200 bpよりも小さいPCR 生成物の漏れは、“大量の”dNTPs（例えばビオチン標識したdNTP、蛍光標識したdNTP、又はジゴキシゲニン標識したdUTPである。）のPCR 生成物への取込みによって、もしくはin situ PCR プロトコールへの生成物伸長プライマーの混入によって、防止することができる。このようなプロトコールに関する具体的なプライマーは、その5'末端に、6bp 反復性の不完全（もしくはミスマッチ）のテロメア性配列(例えば，[5'-TTTCCC-3']_3-4)(配列番号:21 及び配列番号:22)の複数（３又は４）の複製を含み、これに標的に特異的配列が続いているようなプライマー、適当なリターンプライマーであり、第三番目のプライマーは、不完全な反復性(例えば、[5'-TTTCCC-3']₄)(配列番号:22)を含む。これらのプライマーは、in situ PCR において、特異的標的の増幅に使用することができる。第三のプライマーの存在は、標的PCR 生成物の3'末端に不安定に(staggered)結合するために、このPCR 生成物を延長する。このPCR 生成物の延長は、更に最初のPCR 条件での、アニーリング温度の低下によってもたらされる。例えば標的配列への第一のプライマーのアニーリングの温度が、60℃であるならば、この試料は、最初は、94℃/45 秒及び60℃/45 秒で、15-20 サイクル増幅し、その後94℃/45 秒及び50℃/45 秒で、15-20 サイクル増幅される。第二のPC R 工程におけるより低いアニーリング温度が、第三のプライマーの反復性配列への不安定な結合には好ましく、従って延長したPCR 生成物を生成する。得られた延長したPCR 生成物は、細胞マトリックスを通じてもれることは少なく、その結果in situ PCR 分析における、改善されたシグナル保持時間をもたらす。実施例 6 TRAP 反応ビーズの調製この実施例は、TRAPアッセイ時に、より特異性が高い核酸塩基対を確実にする温度でのみ、リターンプライマーが、DNA ポリメラーゼ及びいずれかの伸長されたテロメラーゼ基質に接近し、その結果非特異的プライマー伸長及びプライマー−ダイマー形成を減少することができることを確実にするために、他の試薬から、PCR リターンプライマーを区別するための、ワックスバリアの使用を説明している。微量のプロモフェノールブルーを含むプライマー溶液(例えばACT; 5-10 ng/μ g)を、清潔な滅菌したガラスビーズ（例えば直径が300 ミクロン以下、酸で洗浄、Sigma 社から購入）に混合した。このプロモフェノールブルーは、熱サイクル以前に、このワックスバリアを通っての漏れのモニタリングを可能にするために添加することができる。本発明の実践には、この目的で色素を添加することは必ずしも必要ではないが、色素の添加は、製造工程の厳密性をモニタリングする通常の方法である。この混合物は、ビーズが、適量の乾燥プライマー（実施例２参照）で被覆されるまで乾燥し、その後このプライマーが被覆したビーズは、温溶融ワックスと混合する。激しく攪拌しながら、ビーズ／ワックス混合物を、ピペッティングにより、清潔な表面上に分散し、その後固形化した。ビーズ１滴を、 PCR 試験管に添加し、実施例２に記した条件を用いるTRAPアッセイで使用した。あるいはこのプライマー液(例えば ACT; 5-10 ng/μl)を、ガラスビーズ（直径1000ミクロン以下）と混合した。温溶融ワックス（５μl 以下）のアリコートを、被覆された底面を有するプラグ状型に入れ、かつ硬化した。このビーズを、硬化したワックス層の表面に置き、かつ第二の温溶融ワックス（５μl 以下）を、このビーズの上の型に入れ、かつ硬化した。その底面のカバーを取り除き、かつ仕上げした(finished)プラグを、型を通して押し付けた。1 TRAPアッセイにつき１プラグを、通常の反応試験管の代わりに用い、かつTRAPアッセイは、実施例 2 に示したように行った。当業者には、各種プライマーの使用及びガラスビーズ以外の表面のような、これらの２種の具体例の多くの変更が可能であることは、明らかである。実施例 7 ワックス非含有／温開始でないTRAPアッセイプライマー−ダイマー人為産物を減少する方法は、実施例6 で詳細に説明したワックスバリアの使用以外に、反応条件の選択などいろいろある。例えば、限定を意図するものではないが、TRAPバッファーへの、約5%ジメチルスルホキシド(D MSO)の添加が、プライマー−ダイマー人為産物の生成を減少することができる。 DMSOと組合わせたグリセロールの添加は、DMSOによって引き起こされた可能性のある酵素の不安定化を補償する。従って、約５％のDMSOを含有するTRAPバッファー中の試料に、約５％グリセロールを添加することは、酵素の安定性が重要である場合には有益である。適当なプライマーのデザインも、プライマー−ダイマー形成を減少するために使用される。具体的なプライマーは、その5'- 末端にACT プライマー(5'-GCGCGG -3')(配列番号:2)のアンカー配列を有する、キメラオリゴヌクレオチドである、 ACX リターンプライマー（5'-GCGCGG[CTTACC]₃CTAACC-3'、配列番号:4）であり、これは後ろに、３の４の相補的テロメア性反復配列(5'-TAACCC-3')におけるミスマッチ(5'-[CTTACC]₃CTAACC-3'、配列番号:23)を有する、CXプライマーを基にした配列が続く。TRAPアッセイは、約５％DMSOの存在下で、TX及びACX、又はTS 及びACT のいずれかの293 抽出物を用いて、本質的に実施例2 で行ったように行い、冷出発条件（すなわちワックスバリアなし）を用い、生成物を、15％ポリアクリルアミドゲルで分離した。対照試料には抽出物を投入せず、及び対照試料の１セットは、合成テロメラーゼ生成物(TSR8; 5'-AATCCGTCGAG CAGAGTTAG(CGGTTAG)₇-3'；配列番号:19)を含んだ。293 非投入又は合成生成物投入の結果は、TS及びACT 組み合わせが、プライマー−ダイマー人為産物を生じる一方で、TS及びACX プライマーでは、プライマー−ダイマー人為産物が認められなかったことを示した。 ACX プライマーの強固さを試験するために、TS及びACX を含有するTRAPアッセイ混合物を、ワックスバリアなしで、氷上でインキュベートし、その後予備加熱しない熱サイクラーブロック中で、PCR 増幅を開始することによって、TSプライマーによる、プライマー−ダイマー人為産物の形成を誘導することを試みた。TS 及び ACXプライマーの組み合わせは、一貫してプライマー−ダイマー人為産物の形成を示さず、かつTRAP反応の効率に対して有害な作用を有さなかった。更に TS及びACX プライマーは、DMSOが存在しない条件で、プライマー−ダイマー形成に同様に抵抗性を示す。従ってTRAPアッセイにおけるTS及びACX プライマーの使用は、TRAPアッセイのためのワックスバリア法と置き換えることができ、その結果この分析の実行、製造、TRAPアッセイ成分の性能をより再現性のある、簡単で、信頼性のあるものにする。しかし当業者に明らかであるように、このようなプライマーを、ワックスバリア法を含む、様々な実施態様で使用することができる。実施例 8 TaqMan （登録商標）検出システムによるTRAP生成物の検出この方法は、TRAPアッセイで使用するように変更された、非放射性TaqMan（登録商標）検出システム（Perkin Elmer社）を用いる、伸長したテロメラーゼ基質の検出に関する。蛍光リポーター色素標識及び消光色素標識の両方を有する、Ta qMan（登録商標）プローブを、プライマー伸長反応（例えばPCR 増幅）に混入した。これらの標識の位置に関する正確な制限はなかったが、特定の位置が、他よりも好ましいことは、当業者には明らかであり；例えば標識は、６〜８ヌクレオチド部分に位置することが好ましい。この検出システムに使用される具体的なプローブは、反復性CTR(5'-CCCTAA-3' )配列を含む。通常の形態では、CTRプローブ及びリターンプライマー(例えばACT )は、両方とも、実施例２で示した温開始法において使用されるワックスバリアで分離さる。第二の具体的なプローブは、テロメラーゼ基質に相補的配列を含み、これは、 TS又はACT プライマーのいずれとも競合せず、従ってプライマー−ダイマー形成を生じない。この人為産物について、TSプライマーとこのようなプローブの間のデュプレックスの形成が、PCR の効率を著しく低下することが懸念されるが、下記のようなPCR 検出を用いるアッセイにおいて、テロメラーゼは、このような２本鎖基質を認識しかつ伸長することを示した。デュプレックスDNA(GTSI-1)は、等量のM2A テロメラーゼ基質プライマー(修飾されたTS: 5'-GCCCAATCCGTCGAGCAGAGTTAG-3'；配列番号:25)を、その相補的配列 CM2A(5’-CTAACTCTGCTCGACGGATTGGGC-3'；配列番号:26)とハイブリダイゼーションすることによって構成された。GTSI-1は、実施例２に本質的に示されたような、冷開始条件（すなわちワックスバリアは用いず）下での、リターンプライマー、HKC(アンカーCTR プライマー変異体: 5'-CTCGGTACCAAGCTTCTAACCCTAACCCTAACC -3';配列番号:27)、及び293 抽出物による、TRAPアッセイにおいて使用した。このTRAP生成物は、このプライマーの組み合わせによって認められ、かつRNase 感受性であることが示され、従ってテロメラーゼ活性の検出において、テロメラーゼ基質と相補的であるプローブの利用を示唆している。従って、CM2Aは、TaqMan （登録商標）のプローブとして使用することができる。プローブデザインの修飾は、当業者は容易に行うことができる。例えば、TSプライマーの3'領域に相補的な配列、それに続いてCTR配列（例えば、5'-AACCCTAACCCTAACTCTGCT-3';配列番号:7）を含み、5'末端にリポーター色素を、及び5'末端の内側、好ましくは5'末端の約７ヌクレオチド内側に消光色素を伴う、プローブを使用することができる。このプライマーは、TSプライマー及びテロメア性反復配列の間の接合部に特異的にハイブリダイゼーションし、これにより、ACT-プローブ及びTS- プローブデュプレックス形成で生じる競合作用が減少する。TS配列及び少なくとも１個のTTAGGG反復を含むプローブも、Taqman（登録商標）検出システムで使用することができ、好ましくは実施例２の温開始法で用いる。実施例 9 多重電気泳動分離機(MES) この多重電気泳動分離機（The Multiplex Electrophoretic Separator）(MES) は、多数の試料を同時に分析するための装置である。この装置は、同じ形状の、多数のウェルの付いた、２枚の導電性シート（例えば銅）を含む。これら２枚のシートは、電極として作用する（図１）。15％の非変性ポリアクリルアミドゲルは、一時的に封入された、底のない、多ウェルプレートにおいて調製し、ゲルを重合した。封を取り外した後、この多重ゲルユニットを、２本の電極から等距離に配置し、かつ装置全体を、電気泳動バッファー(例えば、0.5×TBE; 0.045MTri s-ホウ酸、0.001M EDTA)に沈めた。この装置を用いる方法を詳細に説明すると、放射標識したTSプライマーを、本質的に実施例２において説明したように、293 細胞抽出物（10⁵〜10¹細胞等価物）の一連の10倍希釈物を用いるTRAPアッセイの基質として用いる。対照として、同じく10fmol〜16amolの合成TSR8生成物（実施例７参照）の一連の５倍希釈物を含んだ。各アッセイ／希釈物は、トリプリケートで調製した。 TRAP反応後、各試料を、前記MES のウェルの頂点に入れ、ゲルを越えて電界をかけた。取り込まれていないdNTP及びプライマーから前記生成物を分離した後、このゲルを水で洗浄し、ゲル内部の生成物を、PHOSPHORIMAGER（登録商標）装置 (Molecular Dynamics 社)を用いて検出した。この詳細な具体例においては、市販の微量滴定プレートを用いた。このプレート材料は、本アッセイのためには最適化されていないので、MES ゲルユニットのプラスチック壁による放射活性の散乱は、このシグナルの曇りを引き起こした。しかしこの装置は、陰性試料（RNas e 対照及び抽出物なし）の陽性試料からの識別には使用することができ、そのテロメラーゼ活性は、広範な領域において、直線性の定量で、10,000倍希釈物においても検出することができる。当業者には明らかであるように、各種物質をMES で使用することができ、及びアッセイ条件をその特異性に従って変更することができる。実施例 10 TRAP-SYBR グリーンによるテロメラーゼ活性の検出このTRAPアッセイは、本質的に前述の実施例４で記載したような、テロメラーゼ試料について行われ、典型的には総容量50μl において、非標識プライマーを用いて行われる。典型的には、TRAP-SYBR グリーンのアッセイのための PCRパラメーターは、２工程の22-35 サイクル、すなわち、94℃／30秒及び60℃／30秒である。電気穿孔後、このゲルを、SYBRグリーンで染色し、生成物を可視化した。別の具体例においては、バックグラウンドを減少するために、この反応混合物を、500ng のRNase 及びS1ヌクレアーゼの10ユニットを含有する0.3M酢酸バッファーpH4.5 の25μl で処理し、37℃で15分間インキュベートし、このテロメラーゼ抽出物中の過剰なプライマー及びRNA を消化した。電気穿孔の代わりに、SYBRグリーン色素(Molecular P robe社)の1:2000希釈物のアリコート（50μl）を、微量滴定ブレートのウェルに加え、前述の消化したTRAPアッセイの50μl アリコートを、テロメラーゼ活性の測定のために該色素と混合した。この２本鎖DNA/色素複合体は、励起波長497nm 及び発光波長520nm を用いる蛍光プレート測定装置で検出した。このような非放射性テロメラーゼアッセイは、容易で、安価であり、望ましい場合には、臨床検査室における処理量の多いスクリーニング、又はテロメラーゼ阻害活性化合物のスクリーニングにおける可能性があり、同じく試料中のDNA 生成物の容易な定量を可能にしている。実施例 11 １個の細胞のテロメラーゼ反復配列の増幅プロトコール(STRAP) この実施例は、TRAPアッセイの感度を説明するために、１個の細胞のテロメラーゼ活性を検出する方法を説明している。１個の細胞は、様々な方法で得ることができ、例えば一連の希釈によるか、又は全細胞系又は特異的にマークした細胞集団のいずれかを選別する蛍光活性化した細胞選別装置(FACS)を用いる。後者の方法を、この実施例で詳細に説明している。この細胞は、蛍光標識された又は標識できる抗体でマークされ、この抗体は特異的マーカーを認識する。このマーカーは、様々な寿命(life span)、機能の細胞を識別し、かつ異なるように発現することができる。細胞は、20mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl₂、63mM KCl、1mMEGTA、1mg/mL B SA、0.5 ％Tween 20、50mM dNTPs、100ng TSオリゴヌクレオチド、及びDEPC- 処理した水を含有する25μl の調製用バッファーに浸す。このバッファーは、8-チューブの微量滴定用PCR 片(strips)に入れた。Tween20 の濃度は、細胞膜を溶解するのに十分であった。この実施例で使用した反応時間は、30℃で60分であったが、これに限定するものではない。このインキュベーションは、微量滴定用Pe rkin Elmer 9600 熱サイクラーブロック内で行った。熱ブロック又は水浴も使用することができる。インキュベーション後、各反応試験管に、増幅バッファー25μｌを添加した。この増幅バッファーは、TSオリゴヌクレオチドを、100ng のγ末端標識したリターンプライマー、ACX に換えた以外は、前述のものと同じ成分を含有した。この ACXオリゴヌクレオチドは、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB)、10×PNKバッファー（NEB）、及びγ-³²P ATP／1 μｇ ACXの比が100 μCi／3000Ci/mmol であるものを含む反応で、標識した。T4キナーゼは、ACX 1 μｇにつき40U の比で用い、かつ37℃で30分間インキュベートし、引き続き65℃で15分間加熱処理し、このキナーゼを不活性化した。Taq DNA ポリメラーゼ（2U; Boehringer Mannheim 社）を、この増幅バッファーに添加し、かつPerkin Elmer 9600 熱サイクラー中で、94℃／30秒及び60℃／30秒の32サイクルで増幅した。生成物は、15％ポリアクリルアミド非変性ゲル上で、0.6×TBE 中で電気泳動し、分析した。当業者は、プライマーに対する放射性標識の比が、増幅生成物からの強力なシグナルを生じる、高い比活性を有するプライマーの調製、及び１個の細胞レベルでのテロメラーゼ活性の検出をもたらすことを認めるであろう。実施例 12 体液のテロメラーゼ活性の検出法この実施例は、非侵襲的、簡便な方法での、特に臨床での使用に有用な、テロメラーゼ活性アッセイで使用される体液からの細胞の収集を提供する。具体的な目的のために、この方法は、尿管からの細胞の収集について説明しているが；しかし、この方法が、尿での使用に限定されるものではなく、他の体液、例えば唾液、粘液、痰、血液、腫瘍（乳房の腫瘍、前立腺腫瘍、又は細針による吸引が適用できる他の腫瘍）からの細針による吸引物であってもよいことに注意しなければならない。更に、当業者には、この方法の多数の他の変更が可能であることも明らかであろう。(A) 試料の調製及び保存方法１：１．50mlの遠心管に、放尿(30-40ml)を収集する。２．1000 gで15分間遠心分離する。３．沈殿を破壊しないよう、慎重に上清を捨てる。４．沈殿をPBS 30ml中に再懸濁し、遠心分離により再度沈殿とする。５．1ml PBS 中に再懸濁した沈殿を、1.5ml の遠心分離管に移し、遠心分離により再度沈殿とする。６．Coulter カウンター又は血球計数器を用いて、細胞数を数える。７．慎重に上清を全て捨てる。この細胞沈殿は、望ましいならば、運搬のためにドライアイスで凍結することができ、この時点で-80 ℃でと保存することができる。方法２：１．50mlの遠心管に、放尿(30-40ml)を収集する。２．収集した尿に、100 ％グリセロールを添加し、最終濃度を20％とするか、もしくは収集した尿に、100 ％DMSOを添加し、最終濃度を10％とする。処理した試料は、望ましいならば、運搬のためにドライアイスで凍結することができ、この時点で-80℃で保存することができる。使用前に、この試料を、方法１の工程２から７に記載したように処理する。方法３：１．放尿を収集し、Coulter カウンター又は血球計数器を用いて細胞数を数える。２．0.45ミクロンのフィルターを通して、尿(30 〜40ml)をろ過する。３．同じフィルターに、PBS 10mlを通す。このろ液を滅菌したプラスティックバッグに封入し、この時点で、望ましい場合は、かつドライアイス中に入れて運搬するか、もしくは-80℃で保存することができる。(B) 抽出法沈殿化した細胞の抽出法１．１×10⁶以下の細胞に、CHAPS 溶解バッファー20μl を添加した。細胞数が判らない場合は、入れた細胞容量と等量の溶解バッファーを加えた。２．実施例１に記した、標準的CHAPS 抽出法に従って、抽出物を得た。フィルター上に収集された細胞の抽出法：１．フィルターを小片に裁断した（２平方mm以下）。２．このフィルター小片を、CHAPS 溶解バッファー（1 ×10⁶細胞につき20μlCH APS溶解バッファー）で再懸濁し、該溶解バッファーの量を、該フィルター小片の封入した量と等しい又は多いことを確実にした。３．実施例１に記した、標準的CHAPS 抽出法に従って、抽出物を得た。(C) 尿由来の抽出物のTRAP分析抽出物(２〜５μl)を、実施例２に記載したように、30〜35 PCR サイクルによる標準的TRAPアッセイに用いた。感度は、１個以上の放射標識した dNTPの添加、末端標識したプライマーの添加によって、増感された。テロメラーゼ活性の存在は、尿試料中の癌細胞の存在、及び尿生殖器癌の診断に関連した。前述のように、この方法は、いずれかの体液又は細針吸引物に使用することができ、従ってテロメラーゼ活性の存在を、細針吸引物中の癌細胞の存在関連づけることができ、特定の癌、例えば痰又は粘液が被験液である場合には肺癌の、および乳房の細針吸引物又は他の組織（例えば前立腺）を試験した場合は乳癌の診断を下すことができる。実施例 13 TRAP アッセイ試薬及びキット一式この実施例においては、TRAPアッセイを行う際の実施者の便宜を図るための、様々な試薬及びキット一式を提供した。パートA においては、CHAPS 溶解バッファーについて記した。パートB においては、TRAP内部対照について記した。パートC においては、各種キット一式について記した。意図された用途に応じて、試薬及びキットの様々な変更が可能であることは、理解されるであろう。(A) CHAPS 溶解バッファー好ましいCHAPS 溶解バッファーは、下記の組成である：10mM Tris-Cl，pH7.5; 1mM MgCl₂; 1mM EGTA; 0.1mM ベンズアミジン；5mM β- メルカプトエタノール ; 0.5 ％CHAPS; 10 ％グリセロール。このCHAPS 溶解バッファー中に、KCl を濃度1mM 添加し、かつCHAPS界面活性剤の濃度を３％まで増加すると、テロメラーゼ抽出の効果が、２〜５倍増強される。従って、TRAPアッセイにおいて使用される変更されたCHAPS溶解バッファーは、10mM Tris-Cl，pH7.5; 1mM MgCl₂; 1mM E GTA; 0.1mM 4-(2- アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオリド(AEBSF)又はベンズアミジン; 5mM β- メルカプトエタノール；0.5 -3 ％CHAPS;及び1mM KCl を含有する。(B) TRAP 内部対照(TSNT) この内部対照TSNTは、配列5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3'(配列番号: 5)を有し、これはTSテロメラーゼ基質プライマー、及び配列5'-ATCGCTT CTCGGCCTTTT-3'（配列番号:6）を有するリターンプライマーNTによって増幅される。このNTは、テロメラーゼの基質ではない。この対照は、TRAPアッセイキットに組込むことができ、任意に10×TRAPバッファー中（濃度0.002amol／μｌ以下）、又はプライマー混合物中(0.01amol／μl )に含まれ、36bpのTRAP生成物を生じる。前述のプライマー対及び内部対照は、単に説明のために記したものであり；いずれかのプライマー及び相補的対照と交換できる。(C) TRAP キット一式様々なキット及び成分を、キットの使用者の意図及び使用者の特定の必要性に応じて、本発明に従って調製することができる。TRAPアッセイを行うための具体的なキットは、下記のように提供される。このようなキットは、容易に入手できる物質及び試薬から調製され、かつ当業者には明らかであるように、容易に変更できる。最も簡単な形態では、キットは、指示を伴う又は伴わないテロメラーゼ基質を含む。更に別の具体例においては、キットは、テロメラーゼ基質及びリターンプライマーを含む。別の具体例においては、キットは、テロメラーゼ基質、リターンプライマー及び１種以上のバッファーを含む。このバッファーは、例えば、細胞溶解バッファー、末端標識バッファー、又はTRAP反応バッファーであることができる。このTRAP反応バッファーは、任意に対照試薬、例えばTSNT又はTSR8のような対照オリゴヌクレオチドを含有することができるが、このような対照試薬は、キット内では個別に提供される。このキットは、更に、細胞抽出物又は細胞沈殿、陰性細胞抽出物又は沈殿、反応容器、水、ヌクレオチド、標識試薬又は酵素を含む。陽性細胞沈殿は、293細胞、Hela細胞、又は他のテロメラーゼ陽性細胞沈殿のいずれか、もしくは異なるテロメラーゼ活性を有する複数の細胞型のパネルであることができる。このキットは、指示を伴う又は伴わないで提供することができる。好ましくは指示は、実施例４に記された試薬の使用法を記している。好ましいキットは、下記の試薬を含む：１．CHAPS 溶解バッファー（10mM Tris-Cl，pH7.5; 1mM MgCl₂; 1mM EGTA; 0.1m M ベンズアミジン; 5mM β- メルカプトエタノール; 0.5 ％CHAPS;10％グリセロール）２．10×TRAP反応バッファー（200mM Tris-Cl，pH8.3; 15mM MgCl₂; 630mM KCl; 0.5％ Tween20; 10mM EGTA; 1mg/ml BSA）３．50×dNTP混合物（2.5mM dATP，2.5mM dGTP，2.5mM dCTP，及び2.5mM dTTP）４．TSプライマー（0.1 μg/μl）５．水(PCRグレード；プロテアーゼ、DNase 及びRNase-非含有）６．陽性対照細胞沈殿(106細胞)又は様々なテロメラーゼ活性を有する複数の細胞型のパネル。当業者には、特定の試薬の濃度を、有害作用を伴わずに変更することができ、更に保存溶液の変動は、使用時の試薬濃度の変動を反映することもしないこともできることは明らかであろう。特に好ましいキット一式は、TRAPプライマー混合物(例えば、ACX 0.1μg/μl ；NT 0.1μg/μl; TSNT 0.01 amol/μl)で、任意に定量標準(例えばTSR8; 0.1 a mol/ μl)を含む。別の具体例において、このキットは、CHAPS 溶解バッファー、TS NT(0.002 amol/ μl)を含む10×TRAP反応バッファー、50×dNTP混合物、TSプライマー(1μg/μl)、水(PCRグレード；プロテアーゼ、DNase 及びRNase-非含有) 、陽性対照細胞沈殿(10⁶細胞)又は様々なテロメラーゼ活性を有する複数の細胞型のパネル、TRAP反応試験管（0.1 μg ACT ワックスで密封）、Taq DNA ポリメラーゼ(5U/μl)、任意に10×末端標識用バッファー(100mM Tris-OAc; 100mM MgO Ac; 500mM KOAc)、ポリヌクレオチドキナーゼ(1U/μl)、及びゲルに入れる色素を含む。あるいは、前記TRAP反応試験管は、ACX プライマー(50×濃度、0.1 μg /μl)で置きかえることができる。実施例14 分枝したDNA(bDNA)プローブによるテロメラーゼ活性の検出この実施例は、微量プレート形式におけるテロメラーゼ活性を検出するための bDNAプローブを説明している。このような本発明の方法におけるbDNAプローブは、このような形式に限定されるものではなく、このbDNAプローブは、テロメラーゼ伸長生成物のin situ 検出のような、様々な方法で使用することができる。実施者の便宜のために、bDNAはChiron Corp.，CA．から入手し、かつオリゴヌクレオチドはSynthetic Genetics Corp.，CA．から入手できることを特記する。あるいは、核酸は、例えばアミド又はエステル結合のような通常の結合化学技術を用いて、固体表面に結合することができる。ある形態において、多ウェブプレートが、5'末端でプレートに結合したテロメラーゼ基質オリゴヌクレオチド、TS、(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3';配列番号:3) で調製される。細胞抽出物は、実施例１に記したように調製した。テロメラーゼバッファー（100μl; 20mM Tris-Cl pH8.3，1.5mM MgCl₂，63mM KCl，0.05％Twe en 20，1 mMEGT A，0.1 mg/mlBSA，50 μM dNTP）、及び5 μl のCHAPS テロメラーゼ細胞抽出物を、TSを結合した微量滴定プレートに添加し、かつ30℃で、30 分から2 時間インキュベートした。その後この反応混合物を、ウェルから取り除き、かつこのウェルを、200 μl の1 ×SSC(8.76g/1 NaCI，4.41g/lクエン酸ナトリウム，pH7)を用い、室温で２回洗浄した。その後テロメア性反復配列（すなわち、少なくとも３個の5'-(CCCTAA)-3'反復を含む，配列番号: 17）に特異的な bDNAプローブの15mM以下を含む1 ×SSC 50μl を、ウェルに添加し、かつゆっくり振盪しながら、55℃以下で、30分間インキュベートした。次にこのbDNAプローブ混合物を、ウェルから除去し、ウェルを、200 μl の0.1 ×SSCを用いて、37 ℃で２回洗浄した。bDNAの分枝した腕に特異的な第二のプローブ（例えばFITCで標識した18-merオリゴヌクレオチド）を50pmol以下を含む1 ×SSC 50μl を、ウェルに添加し（米国特許第5,124,246 号、Urdea 、1994年）、ゆっくり振盪しながら、55℃以下で、30分間インキュベートした。この溶液を、ウェルから取り除き、かつウェルを、0.1×SSC で、37℃で２回洗浄し、その後0.1 ×SSC 200 μl を添加した。その後テロメラーゼ生成物を、例えば蛍光標識が使用された場合は、蛍光プレート測定器を用いるような適当な方法で検出した。別の具体的な形式は、相補的核酸を用いる微量滴定プレートに対するテロメラーゼ基質の固定に関連している。TSプライマー15pmolを含有するテロメラーゼバッファー（100 μl; 20mM Tris-Cl pH8.3，1.5mM MgCl₂，63mM KCl，0.05％Twee n 20，1mM EGTA，0.1mg/ml BSA，50μM dNTPs）を、CHAPS 5 μl テロメラーゼ細胞抽出物と共に、滅菌した標準微量滴定プレートに添加した（抽出物の量は、総反応容量の50％であることができる。）。このプレートは、30℃で、30分から２時間インキュベートした後、この溶液を、その5'末端にTSプライマー（例えば5'-AACTCTGCTCGACGGATT ;配列番号24 の１種以上の反復）が結合したを含む第二の微量滴定プレートに移した。その後この第二のプレートを、ゆっくり振盪しながら、55℃以下で、30分間インキュベートし、その後このウェルから溶液を取り除き、かつウェルを、200 μl の1 × SSC で２回洗浄した。その後、テロメア性反復配列に特異的なbDNAプローブの15 pmol以下を含む1 ×SSC 50μl を、ウェルに添加した。このプレートを、ゆっくり振盪しながら、55℃以下で、30分間インキュベートし、その後この溶液をウェルから取り除いた。次にこのウェルを、200 μl の1 ×SSC で、37℃で２回洗浄した。bDNAの分枝した腕に特異的なローダミンで標識した第二のプローブの15pm ol以下を含む1 ×SSC 50μl を、ウェルに添加した。ゆっくり振盪しながら、55 ℃以下で、30分間インキュベートし、溶液を除去し、かつその後ウェルを、1 × SSC で、37℃で２回洗浄した。200 μl の0.1 ×SSC を添加した後、この蛍光を、蛍光プレート測定器を用いて、簡便に検出したが、直接可視化するような他の方法も使用できる。これらの形式の様々な変更、例えば相補的TS結合した微量滴定プレート中での前述のテロメラーゼ反応の実行、従って移し替えの工程が省略される、テロメラーゼ伸長反応後の、テロメラーゼ反復に相補的核酸による固定、又はテロメラーゼ基質に相補的な核酸を用いるテロメラーゼ反応前の固定などが可能である。更に蛍光標識以外の広範な種類の標識物を、使用することができ、かつこのような標識物からのシグナルを、第一のbDNA分枝に特異的な第二のbDNAプローブで、テロメラーゼ伸長生成物に特異的なbDNAをプローブとすることによって増強することができ、この場合、第二のbDNAプローブは、標識されている（別のプローブで直接又は間接に）。本願明細書において記載した全ての出版物及び特許明細書は、個々の出版物又は特許出願が、具体的かつ個別に参照として組込まれることが示されたのと同じ範囲で、ここに参照として引用される。ここで十分に説明されている本発明が、添付の請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しないならば、多くの変化及び変更ができることは、当業者には明らかであろう。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Telomerase activity assay This invention was made with government support under subsidy from the United States Department of Health and Human Services. government Has certain rights in the invention. This application is a pending pending application Ser.No. 08 / 151,4, filed Nov. 12, 1993. Co-pending rice filed June 7, 1994, a continuation of No. 77 and 08 / 153,051 A co-pending application filed on September 28, 1994, which is a continuation of National Patent Application No. 08 / 255,774. Co-pending June 7, 1995, a continuation of U.S. Patent Application Serial No. 08 / 315,214 US patent application Ser. No. 08 / 482,132, which is incorporated herein by reference. All of the descriptions are included herein by reference). Industrial applications The present invention relates to telomerase, which identifies and measures telomerase activity. Provide assays and materials to determine The present invention relates to molecular biology, chemistry, And medical diagnostic and prognostic techniques. Background of the Invention Telomeres are eukaryotic chromosomes that function in chromosome stabilization, alignment, and replication. Terminal differentiated structure (Blackburn and Szostak, 1984, Ann. Rev. Biochem. . 53: 163-194; Zakian, 1989, Ann. Rev. Genetics 23: 579-604; Blackburn, 19 91 Nature 350: 569-573). In all vertebrates, telomeres are 5'-TTAGG Consists of hundreds to thousands of tandem repeats of the G-3 'sequence and related proteins (Blac kburn, 1991; Moyzis et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6622-6626). Southern blot analysis of chromosome terminal restriction fragments (TRFs) Provides the combined length of all telomeres in the cell population (Harley et al., 1990, Nature 345: 45 8-460; Allsopp et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10114-10118; Vaziri et al., 1993, Am. J. Human Genetics 52: 661-667). Check to date In all normal somatic cells subjected, TRF analysis showed that the chromosome Loses a telomere sequence of ~ 200 nucleotides because the DNA polymerase has a linear D Consistent with the inability to replicate NA to the end (Harley et al., 1990; Allsopp et al., 1992; Vaziri et al., 1993; Watson, 1972, Nature New Bio 239: 197-201). This shortening of telomeres has been proposed to be the mitotic clock by which cells count their division. (Harley, 1991, Mut. Res. 256: 271-282) and a sufficiently short telomere (simple Number (s) are considered to be a signal for replicative senescence in normal cells (Al lsopp et al., 1992; Vaziri et al., 1993; Hastie et al., 1990, Nature 346. : 866-868; Lindsey et al., 1991, Mut. Res. 256: 45-8; Wright and Shay, 199 2, Trends Genetics 8: 193-197). In contrast, immortality examined to date Majority of cells do not show net loss of telomere length or sequence with cell division This requires that cells survive replicative senescence and proliferate indefinitely for telomere maintenance. (Counter et al., 1992, EMBO 11: 1921-1929; Counter et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2900-2940). Telomerase, a unique ribonucleoprotein DNA polymerase, is By using the sequence contained in the RNA component of the enzyme as a template, It is the only enzyme known to synthesize telomeric DNA at the termini (Greider and Blackburn, 1985, Cell 43: 405-413; Greider and Blackburn, 1989, Nature 33. 7: 331-337; Y u et al., 1990, Nature 344: 126-132; Blackburn, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61: 113-129). For human cells and tissues, telomerase activity is an immortal cell line Cell lines or normal non-germline tissues identified in ovarian cancer but not mortal At biologically significant levels (maintaining telomere length during multiple cell divisions) Are not detected (Necessary for ET) (Counter et al., 1992; Counter et al., 19 94; Morin, 1989, Cell 59: 521-529). Together with the TRF analysis, these results Telomerase activity is directly involved in telomere maintenance, and the link between these enzymes and cell immortality. Suggest a ream. For detecting telomerase activity, as well as modulating telomerase activity or Methods for identifying compounds that affect it include telomere length and telomere For the treatment or diagnosis of cell aging and immortalization by controlling or measuring (PCT Patent Publication published November 25, 1993) Nos. 93/23572 and 95/13382, published May 18, 1995) (these notes). All listings are incorporated herein by reference). Cancer cells are dying for immortality. Most normal human somatic cells express and require lomerase activity and telomerase activity Because they do not express sex, compounds that inhibit telomerase activity can be used for treating cancer. Compounds that stimulate or activate telomerase activity may contribute to age-related diseases and cellular senescence It can be used to treat other related conditions. Known methods for assaying telomerase activity in cell preparations include radiolabeling. It relies on incorporation of nucleotides into the telomerase substrate (Morin, 1989). Conventional assays include oligonucleotide substrates, radioactive deoxyribonucleic acid for labeling. Reotide triphosphate (dNTP) and gel electrolysis for product degradation and display Use electrophoresis. Telomerase is present in 5'-TTAGGG-3 'telomere repeats. The DNA is stopped after the initial G has been added and can be unwound, resulting in a product characteristic on the gel. The signature pattern is a six nucleotide ladder of an extended oligonucleotide substrate. The repetitive phase depends on the 3 'terminal sequence of the substrate; telomerase is where the ends repeat And synthesizes to produce a continuous repeat. Telomere sequence oligo Nucleotides are effective in vitro substrates, but telomerase is more untethered. A repeat is synthesized using a substrate consisting of a romere DNA sequence. Using such a method, reliable texturing due to hypotonic swelling and physical rupture of the cells. At least 10 for Romerase extraction⁷~Ten⁸Requires cells and extraction efficiency depends on cell type Scientists have found that changes occur (Counter et al., 1992; Morin, 1989). . The sensitivity, speed and efficiency of detection of telomerase activity when compared to conventional assays Enhancement is required for telomerase activity assays and the present invention fulfills that need. SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to be simple enough to be used in small (or low budget) clinical settings. For high throughput using robotics technology that is available but is readily available Easily reproducible detection to detect telomerase activity Is to provide a system. This assay may be used for diagnosis or prognosis or for telomerase It can be used to identify, screen and express molecules that act as inhibitors. The present invention Further provides reagents, kits, and related methods and materials useful in the practice of the present invention. I can do it. In one aspect of the invention, the following: (A) telomerase is added to the above telomerase substrate by addition of a telomere repeat sequence In a reaction mixture containing a telomerase substrate under conditions that can catalyze the extension of Cell preparation or extract obtained therefrom Incubate; (B) replicating an extended telomerase substrate; and (C) extending the presence of telomerase activity in the cell preparation with the presence of a telomerase substrate Prolong the absence of telomerase activity in the cell preparation and the absence of telomerase substrate Correlate with presence A method comprising the steps is provided. In one embodiment, the method comprises, for example, from a non-ionic and / or zwitterionic detergent. The extraction of telomerase activity, if any, from cell preparations using Include. Using extracted telomerase, telomerase in telomerase substrate extension reaction Mediates the elongation of the lase substrate. Alternatively, if the substrate is internalized If telomerase is subsequently extended in situ by telomerase Zetas activity is detected in situ. Extended telomerase substrates can be detected by a number of methods. In one embodiment, Oligonucleotides complementary to differential hybridization and subsequent telomere repeats Prior to extension of the nucleotide "primer", the extended telomerase substrate is replicated. Book Many useful reagents of the invention relate to this stage. Typically, primer extension is Mediated using a template-dependent DNA polymerase or ligase, the primer It is extended by the addition of nucleotides to the primer by NA polymerase. The DNA polymerase used in this step is preferably a thermostable DNA polymerase. Merase. Using such a polymerase, each cycle is (1) reaction mixture To denature the double-stranded DNA molecule; and (2) react the reaction mixture with complementary nucleic acids. Hybridize and prime the polymerase without inactivating the polymerase. Multi-cycle primer extension comprising cooling the primer to a temperature at which it can be extended. You. In this embodiment of the method, the polymerase chain reaction (PCR Extra telomerase group to serve as one of the two primers for 5 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times or more with heating and cooling process By implementing the above, the benefits of powerful PCR technology can be obtained. PCR real In embodiments, the telomerase substrate lacks the telomerase repeat and the primer dimer Minimize formation. Alternatively, the primer is an oligodeoxyribonucleotide by DNA ligase. Template-dependent DNA ligase, as extended by the addition of More primer extension is mediated. Typically, DNA ligase is a thermostable DN A ligase, wherein (1) heating the reaction mixture to denature the double-stranded DNA molecule; (2) The complementary nucleic acid hybridizes to the reaction mixture, and is ligated by ligase. The primer extension step is performed by cooling to a temperature at which the primer can be extended. Can be given. In this embodiment of the method, the primer is complementary to the extension primer in the reaction mixture. 5 oligonucleotides ("ligomers"), 5 heating and cooling steps, 10 Powerful ligase ream by performing 15, 20, 30, or more times The benefits of chain reaction (LCR) technology can be obtained. The present invention further provides oligonucleotides, primers and primers useful in the practice of the present invention. A number of reagents are provided, such as oligomers. For example, amplify nucleic acids using PCR In this case, it is necessary to prevent non-specific substances from being generated. Something like this The quality depends on the interaction of the primers used in the process of generating the "primer dimer". Can be produced by various methods, including the method by The present invention is particularly useful for primers Provide primers and reaction conditions that are designed to minimize You. In another aspect, the present invention provides a method for maximizing primer extension. Long product size is greater than maximum product of telomerase-mediated elongation of telomerase substrate Primers are provided that limit the number of large telomere repeats to no more than a limited number. Quantitative Also provided is a control nucleic acid that can be used for Romerase analysis. In yet another embodiment, the method comprises using RNA polymerase to multiply the product. The extended telomerase product is detected by synthesizing heavy RNA copies. This In the case of telomerase extension products, the Contains a motor sequence. So the following: (A) Telomerase is extended telomerase substrate by addition of telomere repeat sequence Cell preparation or a reaction mixture containing a telomerase substrate capable of catalyzing Incubates the extract obtained therefrom; (B) RNA polymerase if an extended telomerase substrate is present in the reaction mixture Under conditions such that merase produces an RNA copy of the extended telomerase substrate, Template dependence recognizing a promoter sequence operably linked to a merase substrate Adding RNA polymerase to the reaction mixture; and (C) Prolong the presence of telomerase activity in the cell preparation RNA of telomerase substrate The presence of the copy and the absence of telomerase activity in the cell specimen Correlate with non-existence A method comprising the steps is provided. In one embodiment, the method comprises using reverse transcriptase to make a DNA copy of the RNA. Thus, an RNA copy of an extended telomerase substrate can be replicated. In yet another aspect of the invention, the following: (A) Telomerase is modified by addition of a telomere repeat sequence to telomere In a reaction mixture containing a telomerase substrate and a buffer capable of catalyzing elongation of Incubating the cell preparation or extract obtained therefrom with; (B) immobilizing the telomerase substrate; (C) when an extended telomerase substrate is present in the reaction mixture, Under conditions that hybridize with the extended telomerase substrate, specifically A sequence containing a sequence that is complementary to an extended telomerase substrate sufficiently to hybridize. Adding lobes to the reaction mixture; and (D) Presence of telomerase activity in cell specimen, extended telomerase substrate and hive The presence of the rediscovered probe, as well as the absence of telomerase activity in the cell specimen Correlate presence with absence of probe hybridization A method comprising the steps is provided. In a preferred embodiment, signal amplification is achieved by using branched DNA probes. To achieve. Such branched-chain DNA probes may be used with target nucleic acid amplification. Can be used without. Regardless of the replication method, various reagents can be labeled to extend telomerase Can facilitate the identification and quantification of zeosubstrate. The present invention further provides novel configurations of reagents useful in telomerase activity assays and the present invention. Kits are provided that include those reagents to facilitate the practice of the invention. kit Include telomerase substrates with or without instructions for use. Preferred The kit includes the following reagents: CHAPS lysis buffer (10 mM Tris- HCl, pH 7.5; 1 mM MgCl_Two1 mM EGTA; 0.1 mM benzamidine (A EBSF, PMSF or similar reagent instead of or in addition to benzamidine 5 mM β-mercaptoethanol 0.5% CHAPS; 10% glycerol), 10 × TRAP reaction buffer (200 mM Tris-Cl, pH 8.3; 15 mM MgCl_Two630 mM KCl; 0.05% Tween n 20; 10 mM EGTA; 1 mg / ml BSA), 50 × d NTP mix (2.5 mM dATP, 2.5 mM dGTP, 2.5 mM dCTP and 2.5 mM dTTP), T S primer (0.25 μg / μl), water (PCR grade; protease, DNase) And RNase-free), positive control cell pellet (10⁶Cells) or various amounts Panel of multiple cell types with telomerase activity, TRAP primer mix (Eg ACX 0.1 μg / μl; NT 0.1 μg / μl; TSNT 0.01 amol / μl) as well as quantification criteria (eg, TSR8; 0.1 amol / μl). Yet another aspect of the present invention allows for high-throughput detection of telomerase activity Assay systems and devices are provided. The assay system and equipment Provides simultaneous separation of telomerase products from immersers and nucleotides Allows for quantitative detection of the lomerase product. The method of the present invention is broadly applicable to the detection of telomerase activity in any specimen from any source. The method is particularly applicable to specimens of biological material obtained from humans. Is useful for and can be applied to the detection of telomerase activity. Such a mark The book contains cells or cellular material and is typically in a diseased state or other condition. Obtained from humans for the purpose of detecting certain medical conditions, such as cancer. Telomere Zeze is not expressed on most normal postnatal human somatic cells, but certain stem cells, Detected in activated cells of the hematopoietic system and in fetal tissues, and therefore in human body tissues or cells The presence of telomerase activity in the specimen indicates that cells with extended growth potential, e.g., immortal Indicates that vesicles, fetal cells or hematopoietic cells are present in the tissue. All cancer cells Romerase activity Although it does not express sex, telomerase expression is important for cells to become immortal is necessary. As a result, the presence of cells with telomerase activity is Associated with the form of the cancer, particularly indicating the presence of invasive or metastatic forms of cancer Could help. Therefore, the present invention involves increasing (or decreasing) telomerase activity in a cell. Methods for diagnosing symptoms in a patient are provided. The method uses telomerase in the patient's cells. Involved in determining the presence or amount of activity, and thus the method may be, for example, Adenocarcinoma, breast cancer, colon cancer, kidney cancer, skin cancer, liver cancer, ovarian cancer, cervical cancer, lung cancer, urogenital Telomerase activity levels associated with organ cancer and leukemia and, in the case of reduced levels, infertility It can be applied to detection of rise (or fall) of a bell. The method may further include other disease states. Conditions in the maternal blood as an indicator of pregnancy, e.g. Telomeres for detecting offspring cells or as a marker for myeloid proliferation potential It can be used for fetal cell tests to detect lyase. For diagnostic or other purposes, books The method comprises detecting the presence of telomerase activity in the cell by a telomerase substrate extension reaction or Determine the amount and extend the primer by primer extension, for example, as in PCR. It involves replicating the Romerase substrate. These and other aspects of the invention Together with the drawings that form a part of this specification, provide a detailed description of the specific tolerable It is better understood by reference to the following text. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1A shows a Multiplex Electrophoretic Separator (MES) apparatus of the present invention. It is a perspective view. Parallel arrows indicate the direction of the electric field when the electrodes are attached to a power supply. FIG. 1B is a cross-sectional view of the MES device. Description of specific embodiments The present invention provides novel methods and materials for detecting telomerase activity. Telomerase synthesizes telomere DNA at the end of the chromosome, resulting in infinite proliferation of immortal cells Deemed necessary. Chromosome end restriction fragments in a wide variety of human cells ( (TRF) analysis shows that telomere length and sequence are stably maintained in immortal cells. But not during normal somatic cell division cultures. Telomeres and te Romerase biology is evident in maintaining immortal cell and other biological states is important. Thus, in one aspect of the invention, the following: (A) Telomerase is extended telomerase substrate by addition of telomere repeat sequence Cell standards in a reaction mixture containing a telomerase substrate under conditions that can catalyze Incubating the book or the extract obtained therefrom; (B) replicating an extended telomerase substrate; and (C) extending the presence of telomerase activity in the cell preparation with the presence of a telomerase substrate Correlate A method comprising the steps is provided. The method essentially involves two reactions: (1) the telomerase substrate And (2) replication of the telomerase elongation substrate. More on the invention To fully understand, (1) the nature of the specimen; (2) the important properties of the telomerase substrate Characteristics; and (3) certain global questions regarding the nature of replication of the telomerase elongation substrate Issues need to be considered. Specimen properties Any type of specimen can be tested by the method of the present invention. specific Specimens of interest include cell specimens (tissue or tumor specimens) taken for diagnostic analysis. May be included). The expression of telomerase activity in various cells was examined. , Are discussed in the scientific literature. Telomerase has certain etiologies (ie, malaria, Fungi, yeasts and ciliates) as well as certain tumor and cancer cells It is also expressed by immortalized human cells, As) not expressed by cells of the tissue, but with low levels of telomere Activity is detected in stem and fetal cells, as well as in certain activated cells of the hematopoietic system. obtain. As a result, telomerase-expressing etiology or the presence of cancer or tumor cells A sample is taken to determine whether to do so. For this purpose, Although books are often obtained from humans, specimens tested by the method of the present invention Industrially important substances such as cattle, horses, sheep or any other veterinary interest. From any animal, such as cats and dogs, and from the environment, i.e. Obtained for environmental testing. In one embodiment of the invention, telomerase activity is assayed in vitro and cell extraction Preparation of the product is required. Methods for preparing cell extracts are known in the art (eg, Sc opes, 1987, Protein Purification: Principles and Practice, Second Editio n, Springer-Verlag, NY). Preferably, the telomere is Use a detergent lysis method that provides a more uniform extraction of the enzyme. The method comprises: (1) cells (2) containing 0.01-5% of non-ionic and / or zwitterionic detergent; Lysing the sample in a lysis buffer with water; (3) removing cell debris by centrifugation; And (4) collecting the supernatant separated from the cell debris. Such a method This will be described in Example 1 below. Just lyse cell samples and release telomerase Thus, a cell extract can be prepared without further preparing a specimen. The method may employ a wide range of nonionic and / or zwitterionic detergents. Preferred Non-ionic detergents include Tween 20, Triton X-100, T riton X-114, Thesit, NP-40, n-octyl glycoside , N-dodecylglucoside, n-dodecyl-β-D-maltoside, octanoyl -N-methylglucamide (MEGA-8), decanoyl-N-methylglucamide (MEGA-10) and isotridecyl-poly (ethylene glycol ether)_n Is mentioned. Preferred zwitterionic detergents include CHAPS (3-{(3- Colamidopropyl) dimethylammonio {-1-propane-sulfonate), C HAPSO (3-{(3-cholamidopropyl) dimethyl-ammonio} -2-h Droxy-1-propane-sulfonate), N-dodecyl-N, N-dimethyl- 3-ammonio-1-propane-sulfonate and digitonin. C HAPS is a particularly preferred detergent. The exact amount of detergent is not important, but telomera Typically, 0.5% is sufficient to observe enhanced extraction of protease activity. Assays for cell extracts are not limited to extracts obtained using the detergent lysis method. When assaying telomerase activity from a single cell, only a few cells are available If no, the number of cells expressing telomerase activity in the sample is very small Is preferably such an extract. The telomerase activity assay of the present invention Far better than conventional assays for detecting telomerase activity in complex environments And can be completed quickly and performed more efficiently. In another aspect of the invention, the telomerase activity assay can be applied to intact cells. This In one embodiment, treating intact cells with a telomerase substrate to promote substrate internalization Can then extend the substrate if the cell has functional telomerase activity . Substrate internalization is an industry A substrate oligonucleotide added to the medium around the cell specimen Or by passive internalization of other nucleic acids (typically at a concentration of 10-100 μM) Microporation with detergent or Staphylococcus alpha toxin allows (For example, LipofectAmine sold by BRL)^TM, Lipofectin^T ^M , LipofectAce^TM), Using biolistics or by electroporation Can be achieved. After the cells internalize the target DNA, the specimen is incubated and Any active telomerase present in the vesicles is produced by de novo synthesis of telomere repeats. To extend the substrate. After incubation, fix the specimen, Proteases such as proteinase K, pronase, trypsin, pepsin And so on to make it transparent. Next, various people known in the art Depending on the method, for example, a primer extension reaction (eg, an established PCR or LCR protocol) Protocol or pre-in situ labeling (PRINS; Koch, J., in “Nonradioact ive in situ; Hybridization Application Manual ”(1992), Boehringer Mannhe im, 31-33)) or by other methods described below. Amplify the elongation substrate. The presence of a signal in the cell under microscopy, Corresponds to the presence of the protease activity. Key features of telomerase substrates Regardless of the source of the sample, the sample (or the sample) in the reaction mixture containing the telomerase substrate Is an aliquot). The specific telomerase group chosen in each case The quality depends on the type or origin of the telomerase activity under test, or the amplification or assay used. It can vary depending on the exit method. Telomerase activity expressed by certain organisms is With respect to the opposite sex, it is different from that expressed by another organism. As a result, the present invention To determine if cancer cells of human origin are present in the specimen using the method of Use a telomerase substrate recognized by human telomerase. Tetrahymena, telomeres of other fungi, mammalian and human cells Various substrates are known for proteases and can be easily identified for other cell types. You. However, when using a DNA polymerase based primer extension step, If so, the method of the present invention may be used to minimize telomere formation to minimize primer dimer formation. It is necessary that the zeosubstrate does not include a complete telomere repeat. Telomerase activity Sex-generated telomere repeats are dependent on the origin of telomerase Those skilled in the art will recognize that. For example, Tetrahymena telomerase is telomerase A repeat of the sequence 5'-TTGGGG-3 'is added to the end of the substrate while the human Romerase adds a repeat of the sequence 5'-TTAGGG-3 '. Therefore, When assaying human telomerase activity using the method of the present invention, a telomerase substrate Is a human telomerase substrate lacking the complete repeat sequence 5'-TTAGGG-3 ' Should. The presence of the different repeats is an undesirable result, for example Human telomere unless extra primer dimer formation occurs as discussed in Telomere counterparts from organisms with telomerase whose zeosubstrate adds different repeats There is no requirement for lack of rearrangement. In addition to linear single-stranded or double-stranded nucleic acids, substrates can be induced or spontaneously at specific sites. May be a circular plasmid DNA that undergoes linearization. Such a plasmid substrate Is particularly useful for in situ applications. Examples of plasmid telomerase substrates include , A unique restriction site located 3 'to the telomerase substrate sequence (e.g., Isc Vectors containing inserts with eI). In this case, " "Means that the restriction site is not present in the genome of the cell under analysis. Like Alternatively, the vector is a selectable, multicopy vector by replication of mammalian origin. It is. The method further provides for the specificity of a unique site under the control of an inducible promoter. And a secondary expression plasmid containing a gene encoding a restriction enzyme. Two plastic Smids co-infect and replicate target cells by methods known in the art. Expression During the induction of the plasmid product, the restriction enzyme uses a telomerase group at its own restriction site. The DNA of the quality plasmid is cleaved to yield a linearized substrate plasmid whose ends are Recognized as a Romerase substrate and extended by telomerase in TTAGGG repeats Is done. In some cases, in particular, the replication step of the invention may involve the extension of primers or probes. If it involves hybridization with a merase substrate, the telomerase group Quality should lack telomere repeats. For example, in some embodiments, The telomerase-mediated primer extension reaction hybridizes only with the extended telomerase substrate. Includes hybridization of oligonucleotide primers to redistribute You. This addition will extend the primer if an extended telomerase substrate is present. It is done under conditions such that it binds to the substrate and is then extended by enzymatic action. terrorism Melase can extend telomerase substrate only by addition of telomere repeats For this reason, the primer necessarily includes a sequence complementary to the telomere repeat. Telomerase When the telomerase substrate used for the elongation reaction includes a complete telomere repeat, The primers used in the primer extension reaction easily hybridized with the non-extended telomerase substrate. May hybridize and produce negative results. However, telomerase Substrates include sequences highly related to telomere repeats and the validity of the results obtained Will not jeopardize. For example, particularly preferred human telomerase substrates of the invention Is a human terrorist It contains a sequence at its 3 'end that is identical to five of the six bases of the mea repeat, Oligos, otherwise known as TS, that do not contain complete telomere repeats It is nucleotide M2. The presence of such repeats in the substrate is determined by the method of replication or detection. Is not compromised, i.e. primer extension is mediated by ligase activity Specific hybridization with the telomere repeat sequence of the probe or primer Telomerase if re-digestion is achieved by insignificant means There is no requirement that the substrate does not contain telomere repeats. Replication of a telomerase elongation substrate to enhance detection (I) Primer extension The primer extension reaction carried out after the extension of the telomerase substrate has a secondary signal (extension signal). Telomere in the specimen (elongated telomerase substrate) Serves to amplify the signal generated by the presence of the protease activity. Primer extension occurs By any means that require the presence of an extended telomerase substrate The preferred means is a template-dependent DNA or RNA polymerase. Mediated by the enzyme, template-dependent DNA ligase, or a combination of the two. this If telomerase activity is found in the sample using these means, an extended Produces a Romerase substrate and then hybridizes with a primer to produce DNA or RNA polymerase or DNA ligase produces primer extension products Provide a substrate for Once the primer extension product is formed, release the extension primer from the extension substrate Separable (typically by heating, but by enzymatic or chemical methods such as helicopter Case treatment can also be used ). If additional primers and primer extension reagents are present in the sample To form a new primer / extended telomerase substrate complex and It can cause the formation of immers. Depending on the amount of signal desired, primer extension and The denaturation step can be repeated several to many times. Typically, primer extension and extension The denaturation of the primer / extended telomerase substrate complex is performed at least 5 times, 10 times, Perform 15 times, 20-30 times or more. In addition, the extension primer If a secondary primer complementary to the 3 'end is present in the reaction mixture, the signal (extension) Long primers and additional extended telomerase substrates) can be increased dramatically. Unextended telomerase groups still present in the reaction mixture during primer extension Quality can serve as such a secondary primer. Primer extension reagent is DNA polymerase, secondary primer is present Cases are described in detail in U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,965,188. There are components required for the polymerase chain reaction as listed, but One skilled in the art will recognize that the clear buffer and nucleoside triphosphate are present in the reaction mixture. I do. PCR amplification is preferred for performing the primer extension reaction step of the present invention. Method to detect telomerase activity, speed, and speed compared to conventional assays. And increase efficiency dramatically. The protocol is a telomere repeat amplification protocol. Called Telomeric Repeat Amplification Protocol "TRAP". This is explained in 2. Telomerase substrate is a PCR primer ("upstream primer") Convenient), but also uses a number of other primer sequences. obtain. For other sequences, the level of primer / telomerase substrate annealing is A telomerase product (eg, TS plus (5′-AG [GGTTAG])_n -3 ′) (where n is 1, 2, 5, 10 or more, which can result in the same early cycle PCR product as in)) It is selected to avoid annealing of the primer with the telomerase substrate. That In later cycles, these products serve as templates for the generation of PCR products. And may produce false positive results. The present invention provides various oligonucleotides for use in the PCR-based embodiments of the present invention. A nucleotide primer and a telomerase substrate are provided. Such primers One (referred to as the "downstream primer") is named "CX" and has three incomplete Sequence complementary to all telomere repeats and one complete repeat 5 '-(CCCTTA )_ThreeConsists of CCCTAA-3 '(SEQ ID NO: 1). Single in three repeats The nucleotide difference is due to the creation of a 3 'mismatch in the TS / CX duplex. Telomerase substrate TS (as described above, the six nucleotides of the telomere repeat The CX's ability to anneal with the Minimize the formation of foreign PCR products, eg, primer dimers. Telomere sequence Possible between these primers (CX and TS) that are aggregated complementarily by All sequences are staggered in the recessed 3 'nucleotides and thus the polymer Produces a duplex that is not efficiently extended by the enzyme. As the CX primer proves, and will be recognized by those skilled in the art upon review of this disclosure. As such, as a primer having a sequence "complementary to a telomere repeat", To the telomerase substrate extension product that the primer is intended to hybridize to In particular, primers that can contain one or more mismatched bases include You. The number of mismatches that can withstand within this definition depends on primer length and sequence composition, The temperature and reaction conditions used during the PCR process, the purpose of performing the assay, and the desired May vary depending on the result of In addition to the primer CX, the invention need not take advantage of the method of the invention. Specificity of the method of the invention for some applications and in certain embodiments Provides some modifications of basic PCR that can greatly enhance sensitivity and efficiency. For example, one important modification to the in vitro method relates to buffers: Providing a buffer in which both romerase activity and DNA polymerase activity are observed You. If such a buffer is used, telomere in the same reaction vessel, for example, a test tube For both substrate extension reaction and DNA polymerase-mediated primer extension reaction, (See Example 2). Another modification is complementary to the telomerase substrate or the reverse primer in the reaction mixture. The use of relatively short oligonucleotides. These short oligonucleotides Otide is about 10 ° C lower than the annealing temperature of the primer used for primer extension. Low melting point (primers or telomeres that hybridize with short oligonucleotides) Primer-dimer formation and especially at low temperatures And / or designed to prevent non-specific primer extension. Short oligonucleotide Otide has a temperature just below the ideal annealing temperature for the primer extension process. Melts from its complementary oligonucleotide at a lower, non-specific temperature Incorrect primer extension was prevented. Short oligonucleotides are useful for DNA synthesis. Short oligonucleotides, provided that they are not intended to serve as primers for Blocks the 3 'end of the otide to prevent addition of nucleotides to short oligonucleotides Can stop. Short oligonucleotides are intended to hybridize with primers The short oligonucleotide 3 'end (e.g., biotin , Phosphate, digoxigenin, fluorescein or amino group), short oligonucleotide Otide is a terrorist It must not serve as a merase substrate. A variety of other reagents and formats can be used to ensure a high degree of specificity. Examples are as follows: (1) Use of T4 gene 32 protein (eg, Boehri nger Mannheim) (2) TaqStart^TMAntibodies (eg, Clontech At the end of the telomerase-mediated elongation reaction. A wax barrier that melts only after heating (eg, Ampliwax^TM, Perkin Separation of primers from other reaction components (purchased from Elmer). Waxba The purpose of the rear is to separate the telomerase extension reaction from the amplification reaction. did Thus, as in one example, and as in many examples, DNA polymerases Sealing beneath the shell layer to separate it from other reaction components. Or try Seal the primer under the wax layer or barrier at the bottom of the test tube, and leave the other reactants Located at the top of the barrier. For ease of preparation, the reaction components are separated into a solid matrix, e.g., About 5 mm polystyrene beads; wells of a plate or microtiter plate, eg Made of polystyrene or polyvinyl chloride; glass beads; magnetic particles; polysaccharide Or it can be attached to another surface that can be coated with, for example, a primer. Step Limers are typically attached to a solid matrix by adsorption from aqueous media However, other methods of attachment may be used, as is well known to those skilled in the art. . For example, contact a solid surface with a primer solution, and Dry until covered. The amount of primer that coats the solid surface depends on the By adjusting the concentration of the primers. Primer-coated solid matrices The cake is then coated with hot melt wax, left to set and solidify. Wax barrier Thus, until the temperature reaches the wax melting temperature, other reaction products (Eg, telomerase substrate, dNTP, buffer, DNA polymerase or Gauze). Ensure highly specific nucleobase pairs and therefore Primer extension and primer dimer (primer and non-extended telomere) Only at temperatures that reduce formation (consisting of an enzyme substrate), the reverse primer These Homats guarantee that you will accept easily. Furthermore, the present invention One useful kit is a telomerase reaction buffer and / or its Reaction tubes containing primers or polymerases separated from other reagents Or other solid supports. Using the primer extension method of the present invention, a human cell line and a cell line as described in Example 2 are used. And telomerase activity in normal and somatic cells. From human 293 kidney cells Telomerase positive extracts were assessed by TRAP assay to give 10^FiveRoux from cells Produced in Chin. The lower limit for the conditions used in this particular example is the telomerase activity. 10 for sex detection^TwoCell equivalent. These results are compared with the conventional method To demonstrate at least a 100-fold improvement in extraction efficiency and telomerase activity assay, At least 10^FourIncrease the current detectability of telomerase activity by the factor. Real Using the telomerase activity assay of Example 2, as described in Example 3 below, Telomere in different immortal cell lines and normal somatic cell cultures from different tissues and solids Tested for activity. As shown in FIG. 3, the texturing between immortal cells and normal somatic cells The difference in lomerase activity was estimated to be at least 1000-fold, Supports a direct role for telomerase in telomere dynamics during One skilled in the art will recognize that the above detection limits are reasonable when using only routine procedures. Recognize. The method of the present invention can be used to detect telomerase activity in a single cell But mainly for the single cell isolation process And generous efforts have been made in what is typically considered a routine It is. Test for telomerase, increasing the time of the telomerase-mediated elongation step Increase the purity of the extract, increase the amount of label used in the assay, and extend the primer Increase the number of cycles to detect telomerase activity in a small number of cells or a single cell The sensitivity of the assay may be increased. Example 11 illustrates this aspect of the invention. The PCR-based embodiment of the present invention is for measuring telomerase activity in a specimen. Provide significant improvements over commonly available methods for However, Other new changes in Ming also provide significant benefits. In particular, using the method of the present invention The number of telomerase products produced, Activity can be quantified. However, to understand the nature of these improvements, First, carefully examine the ladder of the band generated during gel electrophoresis of the telomerase-extended substrate. Need to be considered. Such results were observed during telomerase-mediated elongation reactions. It reflects the number of repeats added by Romerase, but does not In one embodiment, some of these products are used during the PCR amplification step. Due to staggered binding of primers. "Staggered" refers to leaving the 3 'end of an extended telomerase substrate recessed. Thus extending telomeres in a manner available for extension by DNA polymerase FIG. 4 shows binding of a primer to a sequence in a zeolite substrate. In such a three-dimensional structure DNA polymerase attaches nucleotides to the 3 'end of the extended telomerase substrate. In addition, it can make longer molecules than those produced in the telomerase-mediated elongation step . Determine if staggered binding occurred in the reaction as described in Example 2. Synthetic oligonucleotides representing separate telomerase extension products to determine For example, T + 4 (TS plus 4 telomeres) (A repeat) was used to express a specific amplification state. Downstream primer, even under high stringency -A staggered annealing occurred (for example, by 3 out of 4 repeats) annealing). Therefore, PCR amplification of the separate telomerase extension products was performed on gel Generate six nucleotide ladders of PCR products growing in size up to the limit of degradation I did Therefore, a TRAP assay produced using primers such as CX The product is used for primer misalignment with the template during the primer extension reaction. The length distribution of the telomerase product produced in the telomerase substrate extension step is directly It does not reflect. However, in some cases, for example, in in situ telomerase assays, cells With staggered linkages resulting in large molecules that prevent telomerase product leakage from It is useful to do. However, in vitro assays show that such interactions Uses the novel "anchored" primers of the invention as downstream primers in assays It is sometimes desirable to be prevented by use. The purpose of the present invention For example, the anchor sequence should be a non-telomere repeat (complementary to the complete telomere repeat). Are not identical to each other). For example, the primer pair TS / (CTR)_FourOr TS As can be observed when using / CX, PCR from "growth" on its own 5'-end sequence of PCR primer to prevent product. Therefore, this Such an oligonucleotide has a 6 nucleotide anchor sequence (length Is not critical but can be 3-5 to 15-30 or more nucleotides) and And subsequent CTR (C-telomere-rich repeats; 5'-CTACACC-3 ') sequence (eg, For example, ACT primer; 5'GCGCGG [CTAACC]_Three-3 '; SEQ ID NO: : 2 is the anchoring primer of the present invention). A wide range of anchor sequences can be used. In one embodiment, the anchor sequence Is the sequence of the telomerase substrate used in the telomerase-mediated extension step of the method. And a “TS-anchored” primer (where “TS” is the complete telomere) Note that any telomerase substrate lacking the repetitive sequence is shown). Ann The curled primer is therefore the 5 'to 3' direction of the telomerase substrate sequence. And two or more complementary copies of a telomere repeat sequence. like this By using primers, after the first round of primer extension, the reaction mixture Extra non-extended telomerase substrate in is the result of the first round of primer extension Essentially a "one primer" The method of the invention in what is a formula may be performed. For example, in the TRAP assay, the primer TS (5'-AATCCGTCGA GCAGAGTT-3 '; SEQ ID NO: 3) and ACT (or another anchored plasmid). Using the most advanced product of telomerase (MPP) in a given extract Can be inferred. The use of anchored primers, such as ACT, is Prevents growth of the merase product into longer versions. ACT primer When used, the slowest migrating band is the original telomerase product before PCR. Directly reflects the length of the MPP. If such primers are not used, multiple rounds Primer extension and product denaturation during the reaction mixture after telomerase substrate extension reaction Telomerase elongation telomerase originally present in the product Primer extension products that include more telomere repeats can result. ACT Reimers can be combined with a TS, eg CX or CTR_FourObserved between primers like Of the invention when more resistant to the type of primer-dimer interaction Is particularly preferred for Alternatively, the hybrid oligonucleotide reverts Can be used as a primer . Hybrids contain mismatches in the anchor sequence and then in complementary telomere repeats. Primer-containing sequences that contain, for example, four complementary telomere repeats. ACX5'-GCGCGG [CTTACC] having three mismatches_ThreeCT It has AACC-3 '(SEQ ID NO: 4). This is due to primer dimer formation (C X primers (such as X primers) and the most progressive A ply that has the ability to predict Romerase products (such as ACT primers) Gives rise to Further, the resulting ACX is more active than the ACT or CX primers. Are also resistant to primer dimer formation. ACX plastic in TRAP test The use of immers offers similar benefits to the wax barrier method in primer dimer formation But simplifies the analysis, manufacture and performance of the TRAP assay. Other than or in addition to oligonucleotide selection and the use of thermally initiated wax barriers In addition, non-specific, template-independent PCR artifacts (eg, primers ) Can further improve the TRAP assay. For example, any Dimethylsulfoxide (DMS) in TRAP assay buffer using glycerol The addition of O) is performed by adding a telomerase substrate primer (eg, TS) and a reverse primer. (E.g., CX, ACT), thereby destabilizing the interaction between Increased reliability. Similarly, DNs lacking 5'-3 'exonuclease activity A polymerase or a fragment thereof (eg, AmpliTaq^TMDNA polymerase Primer fragment; Perkin Elmer) to prevent primer-dimer artifacts obtain. A primer, such as CX or a CX-based primer, is used as a template (eg, TS )), The 3 'mismatch of the primer will Should be prevented. However, the inherent 5'-3 'exonuclease activity DNA polymerase having 3 'misma Can be removed to extend the primer. In contrast, 5 ' DNA polymerase or fragments lacking 3 'exonuclease activity are Primers and primer dimers Helps prevent erroneous extension of work. The present invention further provides various means for quantifying the amount of telomerase in a sample. Qualitative results (existing or nonexistent telomeres) for most purposes. Enzyme activity) is inadequate. One important means of obtaining quantitative information is: Control oligonucleotides added to each reaction mixture in known amounts as described in Example 4. The use of a reotide template. Examples of competitive control oligonucleotides of the invention are on the order of 5'-3 ' Romerase substrate sequence, spacer sequence (preferably 3 nucleotides in length, , But this can be any nucleotide or length; 3 nucleotides in length Ensures that the internal control is different from that from the extended substrate), and telomeres Includes repetitive sequences (typically present in multiples, eg, 2-50 copies). Also Of course, oligonucleotides complementary to the above control sequence also serve as control sequences Alternatively, a plasmid having a double-stranded nucleic acid insert may be used. Inside this The use of controls not only helps to determine whether the test was performed properly, but also It also facilitates the quantification of telomerase activity present in the book. Or any pair of arrays A control nucleic acid is added to the reaction mixture in a known amount and an extended telomerase substrate (non-competitive internal Control can be amplified with a different primer than the one used to amplify the control . Used to amplify control oligonucleotide and / or control oligonucleotide The primers used are the same as those used to label the telomerase extension product. Etc. or different from it Can be labeled as follows. Preferred internal control oligonucleotides are those of the above control. Combinations, wherein in the PCR embodiment of the invention the internal control is the only one Compete with the telomerase extension product for the primer and therefore the semi-competitive control Called. Such a control is associated with telomerase on the order of 5'-3 '. Sequence that is not a substrate or telomeric repeat, or its complementary sequence followed by Includes romere repeats. As will be apparent to those skilled in the art, a single primer An internal control that is widened may be contemplated. An alternative semi-competitive control is a 5'-3 ' Telomerase substrate sequence followed by telomerase substrate Includes sequences that are not a repeats or their complementary sequences. Controls are used for quantification It may be intended to be easily separated from the TRAP product. Such a semi-competitive internal control An example of a body is 5'-AATCC amplified by a TS telomerase substrate primer. GTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCCGAGAAGCGAT-3 '(distribution Column number: 5; TSNT) and NT primer 5'-ATCGCTTCTCGGGC CTTTT-3 '(SEQ ID NO: 6). NT primers bind telomerase It is not a substrate to be used. TSNT oligonucleotides may be TS, ACX (or other Any reverse primer) and NT can be used in the TRAP assay. As a result raw The 36 bp control double stranded DNA contains a 50 bp minimum telomerase extension. It is easily distinguished from long products. Control oligonucleotides are also used for other reaction components. Conveniently packaged in kits with minutes. To detect the presence of nucleic acids in a sample, TaqMan^TM(Perkin Elmer) detection A system can be used. This system is suitable for use in the telomerase assay of the present invention, Provides a rapid detection method that is radioactive and can be easily modified to a multiwell system. Fluorescent Porter dye tag and A target-specific probe having both quencher dye tags is ligated to a primer extension reaction ( For example, PCR amplification). The exact restrictions on the location of these tags are No, but specific positions are better; for example, tags are preferably 6-8 Release the cleides. TaqMan^TMThe probe is located at the internal site under primer extension conditions. DN hybridizing with a target sequence and having 5'-3 'exonuclease activity When the primer is extended by the action of A polymerase, The 5'-3 'exonuclease activity degrades the hybridized probe and disappears. The reporter dye / dNTP is lost from near the photoagent dye. Free reporter dye An increase in the / dNTP complex causes an increase in fluorescence, which is (Livak et al., January 1995, Research News, Perkin Elmer Corpor ation, 1-5; Lee et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21: 3711-3766). One target A typical TaqMan, which is generally double-stranded DNA 100 bp to 1 kb in length.^TMPCR application In, three specific hybridization sites (for the forward primer One site, one site for the reverse primer and TaqMan^TMFor the probe Selection is easily achieved. However, in the TRAP test, Ta qMan^TMSpecific hybridization available for probe and two primers The choice of the site is limited. These sites contain the telomerase substrate sequence (eg, For example, TS: 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 '; SEQ ID NO: 3 And telomere repeat sequences (eg, TTAGGG), or their complementary sequences, It may have a mismatch. For example, the C-rich telomeric repeat (CTR; 5'-C TaqMan including CCTAA-3 ') sequence^TMProbes can be used (eg, , A probe that includes four repeats of the CTR;_FourCalled ). TaqMan^TMProbes are generally Is blocked at the 3 'end and therefore cannot be extended during PCR amplification, but The R probe is an ACT primer because they hybridize to the same site. (Or other reversing primers), which causes a decrease in PCR efficiency. I can rub. In addition, the probe anneals to a telomerase substrate, eg, TS. The use of heat-initiated PCR in this assay is useful; Separation of the probe and reverse primer from the remaining reaction components This is easily achieved. Preferred TaqMan^TMProbes consist of sequences complementary to the telomerase substrate. Therefore, such probes do not compete with the forward or reverse primer, Therefore, no primer dimer formation occurs. Such a probe is Can form a duplex with a mer (e.g., TS), but this is due to the PC during exponential amplification. Reduce R efficiency. However, telomerase recognizes and extends the double-stranded substrate (See Example 8) and the reaction is performed in the presence of the forward primer-probe duplex. Can proceed. Alternatively, a sequence complementary to the 3 'region of the forward primer, approximately after the telomere TaqMan consisting of repetitive sequences (eg, CTR sequence)^TMProbes may be used. Such a probe is characterized by a junction between the forward primer and the telomere repeat. Differentially hybridizes and reduces competition with reversing primers , Also reduces forward primer-probe duplex formation. Using such a probe If present, the primer-dimer artifact should be generated using the heat-initiated TRAP method. Can be avoided. For example, the 3 'end of TS and the telomere counterpart of the telomerase product Sequence 5'-AACCCACCACCTAAC corresponding to the junction sequence between the bodies Probes that include TCTGCT-3 '(SEQ ID NO: 7) may be used. Or ,like this Introducing mismatches in the probe may interfere with telomerase substrate extension Ie, the binding of the probe to the TS during the extension step can be minimized. An example For example, the sequence 5'-CCTAACCTCAACCCCACTATGCT-3 '(sequence Column number: 8) or 5'-CCTAACCCTACCACCTGTATAGCT- A probe having 3 '(SEQ ID NO: 9) can be used in this embodiment. Select condition To selectively bind the probe to the extended telomerase substrate during the PCR reaction . Telomerase substrate sequence or telomere repeat sequence (e.g., 5'-TTAGGG- TaqMan consisting of 3 ')^TMThe probe was further added to TaqMan^TMUsed for detection system obtain. However, the formation of primer-dimer and primer competition as described above is possible. In addition to potency, these probes compete with telomerase substrates for telomerase However, competition can be minimized using a thermal initiation method. In another embodiment of TaqMan-mediated elongation, the sequence 5'-GCGCGG [CT TACC]_ThreeHaving CTAACCAAT-3 '(SEQ ID NO: 10) and a primer Reporter as demonstrated by primer MACX without 3 'blockade of And a quencher dye at the two ends of the reverse primer with a 3 'mismatch I do. A thermostable DN having proofreading ability is used for such a primer. When used in a TRAP assay with A polymerase, mistakes at the 3 'end of the primer Match nucleotides are cleaved by exonuclease activity and quencher Releases the reporter dye from Therefore, when using such primers, Any amplification results in a fluorescent signal. This embodiment of the invention provides other approximate indications. It is not limited to fluorescence quenching because the signal can be used; And can be detected with a fluorescent agent. The method of the present invention can be used to determine whether telomerase activity in a sample Of double-stranded nucleic acid consisting of extended telomerase substrate (present in reaction mixture) Those skilled in the art will recognize that they may be involved in the correlation with (1) an extended telomerase substrate; 2) an extended reverse primer; (3) a double-stranded nucleus consisting of both (1) and (2) Acid; or (4) in the presence of hybridization between any of the foregoing and the probe The presence of such a molecule can be better estimated. However, in any case, typical Typically, a label incorporated or attached to one or more reaction products By detecting the presence of an extended telomerase substrate and / or primer Perform the correlation, but perform the above TaqMan^TMThe detection method is probably There is an exception. The PCR-based embodiments of the method of the present invention are described in detail above, and are described in the Examples below. The method of the present invention does not require primer extension to provide target amplification. Using any method, or providing signal amplification as described below, or It can be performed with both. In addition, PCR is an exponential function of the primer extension product. Provides linear accumulation, but even linear accumulation of primer extension products can provide useful results. Can be served. Therefore, using a single primer, multiple telomerase elongation substrates You can make several copies. In addition, as described in detail below, Such copies may be made by external means. One such method is Riga (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193). ). 2 hybridized with an extended telomerase substrate using DNA ligase Telomerase extension product by ligating together with two oligonucleotides You can make a copy of As in the case of PCR, when the double-stranded nucleic acid is denatured and left, Repeat the ligation and degeneration steps many times to extend the original It can accumulate multiple complementary copies of the telomerase substrate. Further extended telomere The copy generated by ligation of the first two oligonucleotides on the Add two complementary oligonucleotides and let the DNA ligase join the two Ligated to the same as the original extended telomerase substrate (as complementary to) If a copy can be made, the basic components of the LCR are obtained. For explanation, Using the following four oligonucleotides “Ligomer”, LCR was applied to the method of the present invention. Can be used: LTS (5'-CCCAATCCGTCGAGCAGAGTTAG-3 ') ( SEQ ID NO: 11), CLT (5'-TAACTCTGCTCGACGGGATTCCC-3 ') (distribution Column number: 12), LC (5'-GGGGTAACCCTACACCTAACCC-3 ') (sequence number No .: 13), and LG (5'-GGTTAGGGTTTAGGTTAAA-3 ') (SEQ ID NO: 14). Annealing the LC and CLT ligomers with the extended telomerase substrate yields D Ligation with NA ligase to form a template for LTS and LG ligomer. Two Of the ligomer have annealed and the DNA ligase has a blind end ligation activity in the mixture. So that these double-stranded nucleic acids cannot form a double-stranded nucleic acid that can bind to another double-stranded nucleic acid. Selected A wide range of such ligomers can be used in this method to generate template-independent Product formation can be minimized. LCR amplification of telomerase extension product Of amplified material, where quantitative analysis can be performed. In addition, heat-stable poly Combining merases and ligases with primers such as TS, LC and CLT Can be used to amplify a telomerase extended substrate. (Ii) Oligonucleotide approximation test In still another aspect of the present invention, which relates to the above LCR method, Oligonucleotides that are complementary to adjacent portions of the ze extension product (eg, LC and CLT) ) Is used to detect the presence of telomerase extension products. Telomerase extension production When annealing with an oligonucleotide, the 5 'end of one oligonucleotide is An oligonucleotide is constructed so that it can be ligated to the 3 'end of the nucleotide. One of the oligonucleotides is labeled with a fluorescent "reporter" Label with a "quencher" label. For example, the components are both fluorescent emitters, Is selected to overlap the second emission spectrum; One example of such a pair is fluorescein and rhodamine. Oligonucleotide telomeres Due to the approximation of the reporter and the quencher during annealing with the protease product The quenching effect is detected as an indicator of telomerase extension products. Annealing Subsequent ligation of the oligonucleotide is required for further amplification by LCR However, ligation is not required for detection using this assay. The assay system is not limited to fluorescence and quenching, but can absorb or modulate electromagnetic or nuclear radiation. Or any two components that interact in an assayable manner by luminescence. Probes can be used. Detection can be by chemical, enzymatic or radiological events, for example. Mediated. For example, radiolabels and fluorophores, or products of enzymes Approximate signals can be provided using an enzyme pair that is a substrate for the enzyme. Generate detectable signal Any approximate indicator pair can be used; detection can be, for example, fluorescence measurement, radioactivity measurement or By colorimetry. (Iii) RNA polymerase-mediated replication In one aspect of the present invention, the action of RNA polymerase Replicate the lomerase extension product. Replicate nucleic acids using RNA polymerase Various methods are known for such, for example, nucleic acid sequence-based Replication (Compton, 1991, Nature 350: 91-92), self-sustained sequence replication (Guatelli et al., 1990, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878) and strand displacement amplification (Wa lker et al., 1992, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396). In a preferred embodiment, an RNA polymerase utilizing a single-stranded DNA template (eg, Promoter sequence at the 5 'end of the template using N4 RNA polymerase Is used to synthesize an RNA copy from a single-stranded DNA template. The telomerase substrate is Consisting of a promoter sequence operably linked to its 5 'end, or a substrate After extension of the promoter and before replication by RNA polymerase, the promoter is Can be ligated. Generate multiple RNA transcripts from a single DNA template, thereby May increase the number of offspring. DNA copy of RNA transcript, optionally using reverse transcriptase Can be made. Alternatively, the method comprises a non-telomeric telomere that can be extended by telomerase. Reversal primer complementary to a lyase substrate sequence (eg, TS) and telomere sequence , Eg CTR_Three(Consisting of three repeats of the CTR sequence). Next, DN A polymerase (eg, Taq polymerase, Klenow fragment, AmpliTa q^TMPhase with the telomerase extension product Synthesize complementary cDNA. RNA polymerases that recognize double-stranded substrates (eg, , T7 polymerase, T3 polymerase, SP6 polymerase) Promoter arrangement incorporated at the 5 'end of telomerase substrate or reverse primer Multiple RNA copies of the double-stranded telomerase extension product as dictated by the row Are synthesized. Any of a variety of promoters, such as T7, T3, SP6 promoters Can be used for this purpose. Promoter sequence is present during telomerase extension Or ligated at a later stage to produce an extended product. As described above, amplification is achieved using nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). obtain. In this embodiment, the RNA polymerase (eg, T7 RNA polymerase ) Synthesizes an RNA copy of an extended telomerase substrate essentially as described above. I do. Reverse transcriptase is used to synthesize DNA copies of RNA, Hasease degrades RNA strands and single-stranded DNA acts as a template for RNA synthesis And thus provide periodic amplification. Alternatively, reverse transcriptase synthesizes cDNA RNA polymerase is used to extend primers And the product is increased by primer extension (eg, by PCR). It is width. These and other modifications of the method of the present invention will be discussed in light of the present disclosure. And will be apparent to those skilled in the art. In these embodiments, the presence of telomerase activity And levels correlate with the presence of RNA copies of the extended telomerase substrate. Another fruit As in the embodiment, a wide range of primers is contemplated, as will be apparent to those skilled in the art. (Eg, to reduce background). (Iv) Branched DNA-mediated replication In another embodiment, the telomerase extension product is first replicated and / or The signal generated during hybridization of the probe with the target nucleic acid is then Detected using branched DNA (bDNA) signal amplification, including amplification (Urdea , 12 Sep. 1994, Bio / Tech. 12: 926-928; U.S. Pat. No. 5,124,246). bDNA Assays to detect telomerase activity using large numbers of specimens A format that is particularly useful for screening because of its simplicity. Performed on multi-well plates where hardware is available obtain. In addition, conditions can be chosen that allow for quantitative detection of telomerase activity. Any telomerase substrate (eg, TS oligonucleotide 5'-AATCC Using GTCGAGCAGAGTT-3 '; SEQ ID NO: 3), and using a cell extract as a substrate. Incubated with the telomere repeats Lomerase can extend the substrate (optionally attached to a solid support to facilitate detection) It was to so. In one embodiment, the substrate is attached to its 5 'end using conventional chemical techniques. With one well of a multi-well plate (or other solid surface). Oligo Multiwell plates that bind to nucleotides are also commercially available (Chiron Cor p.). Alternatively, a hybrid with a complementary oligonucleotide bound to a solid surface The telomerase substrate is bound by the isomerization. The telomerase extension reaction is Free oligonucleotides bound on or late to bound oligonucleotide substrates Occurs on the substrate. A bDNA probe is a hybridizing moiety complementary to a telomere repeat (eg, 5 '-(CCCTAA)_n-3 'or a substituted product thereof), and an extended telomerase Hybridize with substrate. In addition, multiple secondary probe binding sites Includes the provided branch regions. After washing to remove unbound probe, the bDNA A labeled secondary probe specific for branching is hybridized to bDNA and labeled. Detected. Technicians recognize that this format accepts a number of changes; for example, Hybridization to immobilize oligonucleotides complementary to telomere repeats Telomerase by capturing the telomerase extension product by zation Telomerase substrates can be immobilized after prolongation. The signal is the two on the bDNA molecule. Increase in direct proportion to the next probe-acceptable site, so that the population of target nucleic acids is b Hardly detectable by DNA hybridization. Sensitivity is terrorism The mair repeat complementary bDNA (or telomerase substrate complementary bDNA) is converted to primary bD Specific to the branch of NA probe (and third probe specific to secondary probe) Further enhanced by probing with a secondary bDNA probe More hybridization sites for the labeled probe are presented. The use of bDNA to probe extended telomerase substrates can be used in cell extracts. It is not limited to such use, but is also applicable to the in situ method of the present invention. example Elongated telomerase substrate in cells fixed on microscope slides Probes can be probed with bDNA instead of linear nucleic acid probes. However, In order to promote the internalization of a large number of bDNA probes, a shorter branch chain length is preferable. No. Thus, for in situ detection using bDNA, the branched chain length is usually It is less than about 60 nucleotides, preferably less than about 40 nucleotides. Probe acquisition The improved sensitivity overcomes any loss of assay sensitivity due to shorter branch lengths. You. Further, a secondary bDNA probe specific to the primary bDNA probe is combined. The sensitivity is added by a combination of bDNAs having a short branched chain length. bDNA As will be appreciated by those of skill in the art upon reading this disclosure, It can be applied to outgoing. Signal amplification is achieved using a probe other than bDNA that hybridizes with the target nucleic acid Probe detection, including bDNA probe detection, can be performed in a number of implementations of the invention. It can be used in embodiments. For example, a telomerase substrate may be applied to a solid surface, such as a microtiter plate. Can be fixed to the wells, test tubes or beads of the plate. Using the telomerase assay, A telomerase substrate can be extended using a romere repeat (eg, TTAGGG). Optionally, by washing the solid surface to remove soluble reactants By adding a modified amount of a detergent or a divalent cation chelating agent, Alternatively, the reaction may be stopped by other means. Next, the extended telomerase substrate Is probed with a labeled nucleic acid complementary to the telomere repeat. Typically, nucleic acid Lobe (DNA, RNA, or peptide nucleic acid (PNA) or other nucleic acid analog ) Directly, but as recognized by the lab, yet another labeling Hybridization with a probe is also possible. Particularly preferred probes are US Detected by tyramide signal amplification as described in patent 5,196,306. The resulting polybiotinylated nucleic acid. Horseradish peroxidase (HR P) Bound streptavidin binds to biotin and HRP is used for further amplification Activated tyramide molecule labeled with a fluorophore, biotin, or HRP To the solid surface of the fluorophore, biotin or HRP Catalyzes the covalent settling of Precipitated labels can be detected by standard techniques. reagent The above disclosure and the examples below describe oligodeoxyribonucleotide telomerers. According to the results obtained using the enzyme substrates, probes, controls and primers or ligomers. The present invention will now be described, but the present invention is not limited thereto. Therefore, the probe Or one or more modified (ie, synthetic or non-natural) nucleotides as primers Oligoribonucleotides or oligonucleotides including leotide may be used . Usually, the nucleotide monomers in the nucleic acid are phosphodiester bonds or similar. Connected by the body. Analogues of the phosphodiester linkage include phosphorothioate , Phosphorodithioate, phosphoroselenoate, phosphorodiselenoate, Phosphoroanilothioate , Phosphoranilidates, phosphoramidates, peptides and similar bonds You. For example, PNA replaces phosphodiester bonds in its backbone with peptide bonds. An oligonucleotide having a combination. Since PNA has no charge, PNA is Has higher binding affinity than deoxyribonucleic acid. Another example is known to those skilled in the art. Phosphorothioate oligonucleotide having a telomere or non-telomere sequence by the method of Otides can be prepared and used as telomerase substrates in telomerase reactions . Unlike DNA polymerase, telomerase is a phosphorothioate oligonucleotide. Recognizes and extends nucleotide substrates. The telomere may then be treated in the manner described herein. Detects the products of the enzyme reaction, except for phosphodiester primers and polymer Of extended telomerase products using lyase does not add another primer The limit is asymmetry. Polymerase is phosphothioate as primer Oligonucleotides are not available, so primer-dimer artifacts In a simple assay, the reduction is relative to the exponential amplification of the telomerase product. Constant sensitivity is diminished unless another primer is added. As described above, By using a PCR-independent method of detection, for example, the detection of branched-chain DNA probes By use, sensitivity can be improved in this embodiment. Those skilled in the art will recognize that the reagents used are commercially available or, in the case of oligonucleotides, Can be prepared using commercially available instruments, and have a wide range of DNA polymerases, antibodies and And that single-stranded DNA binding proteins can also be used. Detection of elongation substrate for replication telomerase Irrespective of the nature of the replication reaction, and as described above, the species of the present invention Each of the reagents is labeled to provide a telomerase-extended telomerase substrate or telomerase substrate in the reaction mixture. Can facilitate the identification of nucleic acids replicated therefrom. For example, one or more markers Generic nucleoside triphosphate, labeled primer or labeled telomerase substrate (also Is a combination thereof) and produces a labeled telomerase substrate or primer extension Incorporation into objects can be monitored. If present, internal controls are identical or Are labeled with different labels. Any of a wide variety of labels may be used for the purposes of the present invention . Such labels include fluorescent (eg, fluorescein-5-isothiocyanate). (FITC) and rhodamine), phosphorescence, chemiluminescence, enzymes and radiolabels , As well as various chromophores. Preferred fluorescent labels are intercalating dyes. Special Preferred fluorescent dyes exhibit fluorescence enhancement when bound to double-stranded nucleic acid, SYBR Green showing minimal fluorescence when using DNA or RNA I. Alternatively, the label need only be an unlabeled "tag", which is The tag is then recognized by the labeled molecule. For example, using biotin as a tag Avidinylated or streptavidinylated horseradish peroxy The tag is conjugated with a sidase ("HRP") and then the chromogenic substrate (eg, The presence of HRP is detected using tetramethylbenzamine TMB). Similarly, Tags are epitopes or antigens (eg digoxigenin), enzymatic, fluorescent Alternatively, it is bound to the tag using a radiolabeled antibody. Yet another example is in the industry. A known telomere repeat binding protein is utilized. Two such proteins Identified as binding to a single-stranded or single-stranded telomere repeat, the original or recombinant Proteins can be used. Typically, such proteins are purified and used. Detected on the basis of a label bound to a particular protein, or an antibody specific for it. It is. The detection of the sign depends on the requirements of the practitioner and the particular sign or detection means used. And may include another step. In some cases, the practitioner first begins by: Separate the reaction products from each other using gel electrophoresis. Other separation methods, namely Chromatography may be used, but for some purposes, No separation was performed, and fluorophore intercalation in the double-stranded DNA during amplification was performed. Reaction mixing from the vessel in which the reaction is performed, as in homogeneous PCR Detection of extended telomerase substrate and / or primer without removing material I do. One of the important advantages of the present invention is that the method for any such detection format Is adaptive. Multiplex Electrophoretic Separator MES) is a primer extension product or target nucleic acid and non-specific dNTPs and / or Useful for the analysis of any other sample containing a mixture of primers (see 11), especially useful for high-throughput diagnostic assays. Shown in FIGS. 1A and 1B As such, the device receives a multi-well plate (3) and two electrodes (4). A housing (1) containing a reservoir (2) adapted for use. Electric The poles are typically parallel to each other and are preferably movably mounted to the housing. And hold the multi-well plate between the two electrodes, and Having the same shape as the surface (ie, in the microtiter plate in the preferred embodiment) Electrodes cover the surface of all existing wells) Multi-well plate on reservoir (2) Insert. Multi-well plates are typically arranged in a row (ie, Titration wells) or multiple rows, 24, 48, 96 or more wells per plate With ell. Each well (5) is open at its upper surface (6) and open With a sealable lower surface (7), eg Silent Monitor^TM96 well plate ( Pall Corp.) It can be resealed with adhesive tape using a removable filter bottom. A means for applying a current, for example by placing a microtiter plate between two electrodes, for example Connect to outlet to connect to power supply. The electrodes are made of a sheet of conductive material, such as gold Metal sheet or wire metal grid (FIG. 1). Using this device, an electrophoresis matrix, such as polyacryl, in a closed well Mixing compounds in multiple samples by preparing amide or agarose gels Things can be separated. Remove the seal and place the plate in the reservoir (2) above the electrodes, The electrophoresis matrix is immersed in the electrophoresis buffer. Or the shade or anode The buffer containing the solution should have only one point of contact between the two compartments in the electrophoresis matrix. To two small rooms. Mixture to be separated essentially as in conventional electrophoresis Is prepared for electrophoresis and then applied to the surface of an electrophoretic matrix. Secondary power Place the electrodes on the multiwell plate, connect the electrodes to a power source, and Is separated. Swim until unincorporated dNTPs and primers elute from substrate The gel is optionally rinsed or washed, and the product within the matrix Is detected by a means suitable for the label used. Combination of labeling and labeling of primers Differentiated products (eg, for extended telomerase substrate or control nucleic acid) (Limer extension product) is detected in a single well. Streptavidin-coated microtiter well plates (Boehringer Mannheim) Furthermore, it can be used to detect amplified or non-amplified telomerase elongation substances. An example of the method Include labeling the 5 'end of the telomerase substrate with biotin, streptavidin Of extended telomerase substrate in telomere coated microtiter well plates and telomere Detection of the presence of an extended telomerase product with a labeled probe complementary to the repeat Is mentioned. As noted above, the label may be radioisotope or fluorescent, phosphorescent, Light or enzyme molecules, or various chromophores, epitopes or antigens. of course The extended telomerase substrate is a biotinylated reverse primer (eg, (CTR)_Four , CX, ACT, ACX, LC) and are compatible with the extended telomerase substrate. The reverse of this procedure may be used if detected by a complementary probe. Extension generation Is bound to a plate complementary to the telomerase substrate or to the telomere repeat Can be captured by capturing the probe. The extension product can also be biotin-labeled during telomerase extension or product amplification. By incorporating NTP (eg, biotin-dUTP) and Capture can be achieved by capturing the elongation product in a vidin plate. Next, Detect the product with a probe that is complementary to the lomerase substrate or telomere repeat You. Apply Having described the methods and reagents used, for the telomerase assay of the present invention, Applications may include research, diagnostics and other applications. The assay is quick, simple and Since the reaction can be carried out in one single reaction vessel, Or it can be used in research and clinical laboratory settings where the specimen needs to be detected. like this Specific applications include: (i) Immortal cells in tumor biopsies for identification of potential cancer cells (Ii) activating the agent (eg, oncogene) or telomerase, Telomeres, including immobilizing compounds that extend the lifespan of cells and the replication of cells Cell-based or drug-free agents that can activate, suppress, inhibit, or suppress (Iii) stem cells having telomerase activity (Iv) detection of telomerase regulation during differentiation and development (V) Identification of telomerase positive fractions generated during telomerase purification; (vi ) Identification of protozoan or fungal infections; (vii) identifying disease states or particular medical conditions; Different levels of telomerase activity in patients when compared to individuals without Diagnosis of a characteristic disease state or medical condition; (viii) absence of telomerase activity But not limited to the diagnosis of certain types of infertility characterized by location. The diagnostic method of the present invention can be used for cells or tissue types of any origin, It can also be used to detect immortal cells of any origin, provided that the cells have telomerase activity. Expressing sex. For human specimens, extensive detection is typically performed using immortal cell detection. Detect the presence of any kind of cancer cells. Those including solid tumors and leukemias Examples of, but not limited to: apudoma, segregoma, gilloma, malignant Carcinoid syndrome, carcinoid heart disease, cancer (eg, Walker, basal cells, Basic desquamation, brown-Pierce, tubular, Erich tumor, Krebs 2, mel Kell cell, mucinous, non-small cell lung, oat cell, papillary, rigid, bronchiole, qi Bronchogenic, squamous cell and transient cell carcinoma), histiocytosis, leukemia (eg B Cell, mixed cell, null cell, T cell, T cell chronic, HTLV-II related, lymph Acute acute, lymphocytic chronic, mast cell and myeloid leukemia), malignant histiocytosis, Zikkin disease, small immunoproliferative, non-Hodgkin's lymphoma, plasmacytoma, reticuloendotheliosis, Melanoma, chondroblastoma, chondroma, chondrosarcoma, fibroma, fibrosarcoma, giant cell tumor, tissue Coloboma, lipoma, liposarcoma, mesothelioma, myxoma, myxosarcoma, osteosarcoma, osteosarcoma, Ein Sarcoma, periosteoma, fibroid tumor, adenolymphoma, carcinosarcoma, chordoma, craniopharyngioma, undifferentiated Germinoma, hamartoma, mesenchymal, mesothelioma, myoma, ameloblastoma, cementoma, Odontoma, teratoma, thymoma, trophoblastic tumor, adenocarcinoma, adenoma, cholangiomas, cholesterinoma, Cylindoma, cystadenoma, cystadenoma, granulosa Cysts, semi-positive ovarian tumors, liver cancer, sweat adenomas, islet cell tumors, Leydig cell tumors, breast Head tumor, Sertoli cell tumor, membrane cell tumor, leiomyoma, leiomyosarcoma, myoblastoma, fibroid, Myoma, rhabdomyomas, rhabdomyosarcoma, ependymoma, ganglionoma, glioma, medulloblastoma , Meningioma, schwannomas, neuroblastoma, sensory epithelioma, neurofibroma, neuroma, paraganglioma , Non-chromotropic paraganglioma, angulated hemangiomas, eosinophil-associated paravascular lymphoid tissue Hyperplasia, sclerosing hemangiomas, hemangiomatosis, glomus hemangiomas, hemangioendothelioma, hemangiomas, blood vessels Pericytoma, hemangiosarcoma, lymphangioma, lymphangiomyoma, lymphangioma, pinealoma, Carcinosarcoma, chondrosarcoma, phyllodes sarcoma, fibrosarcoma, hemangiosarcoma, leiomyosarcoma, leukasarcoma, Liposarcoma, lymphatic sarcoma, sarcoma, myxosarcoma, ovarian cancer, rhabdomyosarcoma, sarcoma (e.g. For example, Ewing sarcoma, experimental sarcoma, Kaposi's sarcoma, mast cell sarcoma), neoplasm (eg Bone, mammary gland, digestive system, colorectal, liver, pancreas, pituitary, testis, orbit, head and neck , Central nervous system, hearing, pelvis, respiratory tract and urogenital), cervical dysplasia. In one aspect of the invention, cancers such as urogenital cancer, bladder cancer, lung cancer and leukemia are treated. Body fluid (eg, urine, mucus, sputum, saliva, blood), fine needle aspiration or raw From the test, telomerase activity is determined. Preferably, a liquid specimen is collected using a non-invasive method and then, for example, centrifuged. Isolating cells therefrom, by filtration or other physical means, to obtain a cell specimen . This simple way to get cells for screening against different cancers is Especially suitable for clinical environment. Next, telomerase activity is assayed, and a diagnosis based on the presence of telomerase activity is made. Enable the disconnection. In the diagnostic method of the present invention, an increase in telomerase level was observed. A test is performed to determine if this is the case. "Elevated levels" refers to Absolute telomerase activity The value is relative to the individual's normal somatic cells or the value of another individual not afflicted with the disease state. It means that it is elevated compared to normal somatic cells. Generally, telomerase activity All detectable values of gender are high in cells from normal, postnatal human body tissue. I think it is. Telomerase activity is found in germline cells, but Low levels of telomerase activity are detected in stem cells and certain hematopoietic cells Such cells are not problematic for practitioners with the method of the present invention. Reproduction Lineage cells are easily identified and / or separated from human body tissue specimens, stem cells and certain Telomerase activity found in hematopoietic cells of various species is The number of such cells is low enough not to give a false positive signal from the telomerase activity assay. It may be present in a bell or detected and identified using other means. Terrorism in somatic cells Detection of merase activity indicates the presence of immortal cells, for example, certain cancer cells, Even if the cells are specifically classified as non-cancerous, they can be used to determine. I Thus, the method of the present invention provides a reliable method of treating cancerous cells before cells become visually cancerous. Enables the detection of the shape. The diagnostic test of the present invention can further be performed together with other diagnostic tests. Some places In some cases, such combination studies provide useful information about disease progression. However, the method of the present invention for testing telomerase activity It also provides a great deal of useful information. The method of the present invention may be used to remove cancer cells in a patient sample. When detecting the presence of vesicles, the presence of telomerase activity is used to Is there a specific tumor that has invaded adjacent tissues or has spread to distant locations? And can determine if the cancer has recurred. Additional information along with the method of the present invention Tests that can provide information include DNA ploidy, fractionation of cells in S phase, nodularity Symptoms, Her-2 / neu gene product, p53, p16, p2, ras and its Other cancer remains Diagnostic tests on genes are included. In addition, the level of telomerase activity can be used to monitor the effects of chemotherapy during cancer treatment. You can tap. Telomerase levels are measured by telomerase inhibitors or retinoid therapy. Or monitoring the efficacy of any other cancer therapy, but in this case telomere Rase activity is reduced by telomerase inhibition, cell differentiation or cell death, respectively. You. Telomerase levels can be determined by estimating the number of immortal cells in the patient. The efficacy of any oncolytic or oncolytic approach can be monitored. Telomerase activity, or the presence of a telomerase component, may be determined, for example, by umbilical cord or maternal blood. As a marker for fetal cells harvested from the Fetus in maternal blood Identification of fetal cells is tested for diagnosis of pregnancy or for genetic testing of fetal cells, ie Useful for identifying cells. Telomerase activity can further be used as a marker for bone marrow proliferation. Bone marrow Transplantation typically works with poorly differentiated bone marrow cells. Hematopoietic cells Telomerase activity is lost for the purpose of transplantation Can be used as a marker for hematopoietic cells useful for Telomerase activity All general assays as well as assays that can be developed in the future can be used. The invention further provides A kit for performing the diagnostic method of the present invention is provided. Such a kit is easy And various combinations are made from materials and reagents available at For example, Kits, in amounts sufficient for at least one assay, one or more of the following: Substances may be included: oligonucleotide telomerase substrate (eg TS), control Reagents (eg, control oligonucleotides (eg, TSNT, TSR8), positive control Extract or cell pellet), and oligonucleotide primers (For example, CX, ACT, ACX, LTS, CLT, LC, LG, NT) Provided with the following: reaction vessel, buffer (eg, cell lysis buffer) , Terminal labeling buffer, TRAP reaction buffer), water (preferably RNase, DNase). Containing no proteases and proteases), nucleotides, labels or dyes (eg, SYBR Green, fluorescers, labeled oligonucleotide probes, eg b DNA probes), enzymes (eg, RNA or DNA polymerase, ligase, RNase, polynucleotide kinase), its necessary or useful for performing assays. Other reagents and instructions for use. Typically, the instructions for use include any of the above assays Reagent concentration or at least one assay method parameter so that the user can perform Meters, eg, relative amounts of reagents and specimens to be mixed, for reagent / specimen mixing Includes clear expressions that describe maintenance time, temperature, buffer conditions, and the like. In one embodiment of the invention, the kit contains a telomerase substrate and primers Includes reaction test tubes. The preferred form of this kit is Includes test tubes where the primers are separated from other reaction components. The primer is Coated or attached to glass beads. Kit intended Depending on the user and the specific needs of the user, the present invention provides a broader range of kits and components. Minutes can be prepared. Other formats allow for wax-free assay conditions. A oligonucleotide primer, such as an ACX primer, is utilized. All of the diagnostic assay reagents described herein have been analyzed to improve ease of use. Separately in solution as a dispersion or as a substantially dry powder, for example in lyophilic form Or provided as a mixture of components. Enzymes or other degradable reagents are provided In some cases, conditions that stabilize the reagents, such as low-temperature phase, stabilizers (eg, Return to other role (Base agent) is selected. Unstable reagents, along with the more stable components of the kit, Or they may be provided separately. Solid supports, such as multiwell plates, glass vials The tubes or tubes and one or more buffers are also separately packaged in the kit. Included as an integrated device. Discussed herein in relation to diagnostic methods or research applications. Kits are of the same sense as those normally used in diagnostic systems and are therefore Glass and plastic (eg polyethylene, polypropylene and poly Carbonate) bottles, vials, plastics and plastic-foil laminate jackets May be included. The following examples illustrate certain aspects of the present invention, and illustrate the methods of the present invention for those skilled in the art. Provide a description. The examples illustrate specific methods useful in understanding and practicing the present invention. The present invention is only provided and the present invention is not limited thereto.Example 1 CHAPS Of telomerase extracted in step In this example, an extraction method based on a zwitterionic surfactant of the present invention was used. The telomerase activity of the cell extract prepared in And tested. This cell extract was prepared from immortalized 293 cells, Is known to express zealase activity and is transformed with an adenovirus type 5 DNA fragment. It is derived from transformed human embryonic kidney cells. The cells are replenished with 5-10% fetal bovine serum. Grow in containing Joklik medium, then harvest by centrifugation (unless otherwise noted). In the following method, about 1 × 10⁶It was assumed that the cells were collected. ), Once in PBS Wash, precipitate at 10,000 xg for 1 minute at 4 ° C, and resuspend in 1 ml of ice-cold PBS did. The cells are again pelleted and chilled on ice. Buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl_Two, 1mM EGTA, 0.1mM PMSF (Benz Amidine or AEBSF can also be used. ), 5 mM β-mercaptoethanol Water, DEPC treated water, 0.5% CHAPS (Pierce), 10% glycerol] Ten^Four~Ten⁶20 μl concentration of lysis buffer per cell (depending on the purpose of the experiment) And resuspended. The suspension is incubated on ice for 30 minutes, then The heart was spun at 10,000 xg for 30 minutes at 4 ° C. Remove the supernatant to another test tube, Snap frozen on dry ice and optionally stored at -70 ° C until use. these Extracts typically contain 5-10 mg / ml total protein and contain telomerase Activity was stable to multiple freeze-thaw cycles. Conventional telomerase assay methods and conditions are described in Counter et al., (1992); unter et al., EMBO J., 11: 1921-1929 (1994); and Counter et al. Virol. 68: 3410-3414 (1994), which describes an oligonucleotide substrate, Used at a concentration of 1 μM. See also Morin, Cell, 59: 521-529 (1989). this The products were separated on an 8% polyacrylamide sequencing gel and overnight. Phosphorimager® screen (Molecular Dynamics, Sunnyvale, C A). The telomerase substrate used in the usual assay is 5'-GTTAGGGTTAG GGTTAGG-3 '("(GTTAGG)_ThreeSEQ ID NO: 15); 5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3 '("(T TAGGG)_ThreeSEQ ID NO: 16), and 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 '(abbreviated as "TS"; Column number: 3). A control sample was also assayed, which used 10 μl of the extract with RNase (DNas e-free, Boehringer Mannheim) with 0.5 μg for 10 min at 25 ° C. RNas degrades and inactivates the RNA component of telomerase e containing the extract pretreated. Telomerase is the first G of the G triplet Pause after adding Of the nucleotides added before the first pause (and thus phasing of the ladder) Number is (GTTAGG)_Three5 (SEQ ID NO: 15), (TTAGGG)_Three(SEQ ID NO: 16) and TS There were two oligonucleotides. This result indicates that telomerase activity extracted with CHAPS was predicted by human telomerase. It works as measured. The activity extracted with this surfactant is A 6 nucleotide ladder of extension products characterized by romerase activity resulted. The product synchronization shift is dependent on the 3'-sequence of the oligonucleotide telomerase substrate Which was expected to be telomerase-mediated elongation and Telomerase is a non-telomere oligo that was previously shown as a telomerase substrate. Nucleotides could be extended by the 5'-TTAGGG-3 'repeat (ideo (Confirmed using the end sequence of the xynucleotide chain) (Morin, Nature, 353: 454-456 (1991) )). Since this activity is destroyed by RNase treatment, it may be telomerase activity. (Greider and Blackburn, Cell, 43: 405-413 (1985); Greider and B lackburn, Nature, 337: 331-337 (1989); Morin, Cell, 59: 521-529 (1989)).Example 2 PCR amplification of telomerase extension products In this example, DNA polymerase mediates the primer extension reaction in PCR. The telomerase assay method of the present invention is described in detail. This The reaction components contained a telomerase substrate TS (this sequence was shown in Example 1 above). This telomerase is extended by the synthesis of telomere repeats, and It also functions as an upstream primer and a downstream primer CX in the PCR method. The structure is the sequence 5 '-(CCCTTA)_ThreeDetermined by CCCTAA-3 '(SEQ ID NO: 1) Is defined. Between CX primer and non-extended TS oligonucleotide telomerase substrate Of the primer-dimer (more precisely, the CX primer) -/ TS dimer formation) to minimize CX primers / extended telomeres. A mismatch was designed in the enzyme substrate. As mentioned above, telomerase is a non-telomere, such as a TS oligonucleotide. It has been shown to extend oligonucleotides with sexual sequences (Morin, Nature, 35 3: 454-456 (1991)), and the oligonucleotide substrate TS Used to avoid non-specific amplification. The terrorism described in this example Another modification to avoid primer interactions for performing the merase activity assay In addition, mismatches (with respect to TS) in the downstream primer CX, single-stranded binding tags Using protein T4 gene 32 protein, warm-start PCR, and 50 ° C annealing temperature Used. Under these conditions, specific amplification is Only occurs when extended by more than two 5'-TTAGGG-3 'repeats, resulting in 40 From nucleotide (first amplifiable telomerase product) to upper limit of gel analysis A six nucleotide ladder of the growing TRAP assay product resulted. Another important variation that greatly improves the simplicity and efficiency of the method of the present invention is Novel reaction buffer so that both the enzyme and the DNA polymerase can function. Regarding fur development. The use of this buffer is for one test tube in the TRAP assay. Enables setup or configuration at This change is due to the specificity of primer extension That CX primers are more stringent hybrids. For wax barriers that melt only at higher temperatures, such as achieving the conditions of Thus, initially separated from the rest of the reaction mixture Because it is. To this assay tube, add 2 suspensions of 50 ng / μl of CX primer. μl (0.1 μg) and add it to the bottom of the tube with a Speed-Vac® centrifuge. And evaporated to dryness. To this CX primer suspension, add a small amount of Possible leakage through this wax barrier was monitored prior to the creel. This The addition of a dye for the purpose of is not essential in the practice of the present invention, Addition is a common method of monitoring the integrity of the production process. Then test tube Is heated at 70 ° C. and melted wax (Ampliwax®, Perkin-Elmer) 7-10 μl was pipetted into the bottom of the tube. This wax is solid at room temperature After the reaction, the test tube was allowed to stand at 40 ° C. The test tubes were warmed to room temperature before use. Using prepared test tubes stored at 4 ° C, the assay performance was up to 2 months. No impact was observed; the expectation of such test tubes (and kits containing them) The shelf life is at least one year. The reaction is typically performed by adding 50 μl of the TRAP reaction solution onto the wax barrier. I went. The reaction solution was 20 mM Tris-HCl, pH 8.3, 1.5 mM MgCl2, 63 mM KCl , 0.005% Tween 20, 1mM EGTA, 50mM each dNTP, 0.1μg TS oligonucleotide , 0.5 mM T4 gene 32 protein, 0.1 mg / ml BSA, 2 units of Taq DNA polymerase (Optionally, an equivalent amount of TaqStart from Clontech to facilitate warm-start PCR. A Taq 2 unit treated with a registered trademark antibody is used. ) And 1-2 μl of CHAP S cell extract was included. For radiolabeling of the product, 10 μCi / μl of 32P-dGTP and 0.2-0.4 μl of 32P-dCTP (3000 Ci / mmol) was added to the reaction. terrorism After extending oligonucleotide TS for 10 minutes at 20 ° C with merase, Test tubes, heat Transfer to cycler (96-well Singleblock® system, Ericomp) Then, 27 cycles were performed, and in each cycle, the incubation temperature and time were 1.5 min from 94 ° C / 30 sec, 50 ° C / 30 sec, and 72 ° C / 30 sec. This CX primer -(0.1 μg) was released when the wax barrier melted below 70 ° C. For the convenience of the practitioner, the reaction times, temperatures, and buffers described in this example -And the specific substrates and primers used, as well as extracts and DNA polymers One skilled in the art will recognize that the origin of the protease can be altered (Example 4). reference). For example, this telomerase extension reaction can be carried out at a temperature of about It can be performed in the range of 10 to about 42 ° C. The telomerase reaction time depends on the primer used. The number of mer extension steps, the expected amount of telomerase in the sample, and the Can vary greatly depending on the time taken. Typically, this telomerase reaction The response time is between 5 and 60 minutes, but can extend over several hours. Similarly, this PC The R cycle consists of widely varying cycle times and temperatures. Simplest The PCR cycle consists of a duplex nucleic acid denaturation step followed by primer annealing And elongation steps. Denaturation is typically performed by heating the reaction mixture. However, other methods such as helicase treatment can also be used, and the heating method It is large enough and in sufficient time to denature, but not damage, DNA. Done in the degree range. Similarly, the time and temperature of the primer annealing step Reaction buffer, primer sequence, concentration, and composition, as well as the requirements of the practitioner While highly dependent on specificity, the time and temperature of the primer extension step Greatly depends on the type of DNA polymerase used. One skilled in the art will appreciate that the present invention Variations in time, temperature, and buffers and other reaction components that can be used It will be appreciated and understood that this is not intended to be limiting. For analysis of the sample, halve the reaction mixture with 15% polyacrylamide non-denaturing gel. Was analyzed by electrophoresis in a 0.5 × TBE on a plate. Visualization of these products was performed on gel Is stained with ethidium bromide, silver, SYBR (registered trademark) Green (Molecular Prob es) staining, autoradiography, or Phosphorimager® analysis (M (olecular Dynamics, Sunnyvale, CA). The control sample was Assays were performed using: samples without TS oligonucleotides; cell extracts Sample removed; TRAP assay sample of immortalized 293 cell extract; Heat of telomerase For 10 min incubation at 65 ° C for inactivation by 293 Extract sample; RNase (not DNase) to destroy RNA components of telomerase (Boehringer Mannheim) 0.5 μg, incubation at 25 ° C for 10 minutes 293 extract sample, pretreated with phenol; phenol-extracted 293 extract sample (Mix with an equal volume of a 1: 1 mixture of phenol: chloroform and stir vigorously for 30 seconds The mixture was centrifuged for phase separation and the aqueous phase was collected. ); 293 extract (50 μl ) With 5 μg of Bromelain protease (Boehringer Mannheim) at 37 ° C for 10 min. After incubation for 2 minutes, α2-macroglobulin (Boehr inger Mannheim) at 25 ° C for 30 minutes with shaking. And centrifuged at 10,000 xg for 10 minutes (precipitation is α2-macroglobulin / Brom elain complex), and by collecting the supernatant for analysis, 293 extraction pre-treated with protease by removing the protease Sample; normal fibroblast BJ cell extract, which is deficient in telomerase activity; Telomerase-rich cells by DEAE chromatography Vesicle extract (Morin, Nature, 353: 454-456 (1991)). The results of these multiple control experiments are based on the TRAP (telomerase repeat sequence amplification protocol). The positive signal in the assay is that two or more 5'-TTAGGG-3 'repeats In the immortalized cell extract, which allows the extension of the TS oligonucleotide, This assay indicates that ribonucleoprotein is required and this assay It proved to be specific for detection. To more closely test the sensitivity of the TRAP assay, another set of assays The limits of detergent extraction and TRAP detection under the conditions used were tested. The lysis buffer volume was kept constant at 100 μl for extraction of various numbers of cells . Ten⁷About 10 from normal fibroblast BJ cell extract^FiveFor cell equivalent assays, No activity was observed, as indicated by the absence of Dorada. Telomerase The activity is 10⁶About 10 from the immortalized 293 cell extract^FourAssay of cell equivalents of Ten^FiveAbout 10 from 293 cell extracts^ThreeCell equivalent assays, and 10^Four293 cell extraction About 10 from birth^TwoFound in cell equivalents. Ten^ThreeAbout 293 cell extracts from For assays of 10 cell equivalents or control assays with lysis buffer only, No activity was observed. Ten^TwoThe limit of telomerase detection in cells is 10⁶Series of extracts of 293 cells Of the dilutions were confirmed by TRAP assay. This limit depends on the TRAP assay used. Is a function of the conditions, and rather than the absolute limit of the sensitivity of the current method Should be considered a practical limit under these conditions. Example 15 shows that one cell It is a detailed example describing the detection of telomerase activity. Those skilled in the art It will be appreciated that other methods of increasing the sensitivity are available. For example, CX Instead of primer CTR3 [(5'-CCCTAA-3 ')_Three( SEQ ID NO: 17)] or CTR4 [(5′-CCCTAA-3 ′)_Four(SEQ ID NO: 18)] At increased sensitivity, these primers are probably more compatible with the non-extended TS primer. Will interact. The sensitivity limit is the synthetic telomerase product TS +4 (this is It contains a go nucleotide TS followed by four telomeric repeats. ) By titration Even analyzed. TS + 4 oligonucleotide dilutions were heat treated (telomere (Inactivated) 293 extract and analyzed by TRAP assay. This analysis In this assay, 10+ of TS + 4⁶The molecule produced a clear positive signal. In addition to this, telomerase activity from mouse tissue and cell extracts (telomerase The activity is present in mouse somatic cells. ) Was detected by TRAP assay, Assay shows mouse telomerase is almost non-advancing (Ie, only one repeat sequence is added; Prowse et al., Proc. Nati. Acad. . Sci. USA 90: 1493-1497 (1993)). Has a very low level of advanced mouse telomerase activity that cannot be visualized Levels were detected or mouse telomerase was earlier under TRAP conditions It was shown to be advanced. For the convenience of the practitioner, the following product information is provided: Reaction tubes are RobbinsS cientiiic (Sunnyvale, CA) 0.2 ml Strip-ease® test tube, Sterilized before use. All oligodeoxyribonucleotides are from Keystone Labor Ultrapure grade (HPLC purification) obtained from atory (Menlo Park, CA) In DEPC-treated water or TE buffer (10 mM Tris.Cl, pH7.6; 1 mM EDTA, pH8.0) Was suspended at a concentration of 1 mg / ml. Taq DNA polymerase, Tween 20, and T4 gene 32 Protein was purchased from Boehringer Mannheim. The radioisotope is NEN- Purchased from Dupont. dNTP, Phar Purchased from macia, store aliquots at -20 ° C and thaw before use (less than 2 times) Do not defrost the top). All other reactants were used for molecular biology unless otherwise noted. And purchased from Sigma. Treated with diethyl pyrocarbonate (DEPC), Deionized, sterile water was typically used.Example 3 TRAP And relative sensitivity of conventional telomerase assays-normal somatic cells and immortalized cells Vesicle telomerase activity assay This example demonstrates immortalized cell lines and normal somatic cells from various tissues and individuals. The telomerase assay in the cell samples of the cultures was described. BJ cell Such an adherent cell culture, a normal somatic cell culture of human dermal fibroblasts, Previously, it grew to 80% confluency. This assay (10^FiveCell equivalent / reaction) Performed according to Examples 1 and 2 above and the results of the assay are summarized in Table 1 below. A The assay was performed on the same 10-cell extract, using the CHAPS detergent lysis method. (See Examples 1 and 2). Control samples are pretreated with RNase to remove any telomerase activity in the sample. Assayed extract. Breast cancer MCF-7 / ADR-RES, pancreatic cancer AsPC-1, prostate Adenocarcinoma PC-3, melanoma M14, normal foreskin fibroblast culture BJ, lung cancer NCI-11 23, normal somatic fibroblast culture 31Y0, normal lung fibroblast culture IMR-90, egg Ovarian cancer cell line OVCAR-3, colorectal cancer cell line C0L0205, and immortalized renal cell line 293 Assayed. A typical assay is 10 per reaction.⁶Cell equivalents were used. Several immortalized cell lines (293, MCF-7 / ADR-RES, NCI-H23, OVCAR-3, C 0L0205, M14) showed activity in both assays and the others (AsPC-1 and PC- 3) shows activity only in TRAP assay, And normal somatic cell cultures (BJ, IMR-90 and 31Y0) were used in all assays. Showed no detectable activity. These results indicate that the TRAP method Can detect telomerase activity in extracts that are negative It is shown that. This study involved 74 immortalized cell lines and 22 normal cells from 18 different tissues. The results were expanded to include cell cultures and the results are summarized in Table 1 below. Each individual Cell cultures were extracted with detergent and telomeres were extracted using the TRAP assay. The protease activity was examined. This specific immortalized cell line and normal somatic cell culture Of the organization. The immortalized cell lines and normal somatic cell cultures tested were: (1) skin Skin-melanoma (LOXIMVI, M14, Malme-3M, UACC-62), normal fibroblasts (GFS, S37b, Malme-3, BJ), normal keratinocytes (primary foreskin); (2) connective tissue-fibrosarcoma (HT-1080); (3) adipocyte-liposarcoma (SW872); (4) breast-adenocarcinoma (MCF7, MCF-7 / A DR-RES, MDA-MB-231), ductal carcinoma (T47D, MDA-MB-435), carcinoma (MDA-MB-157, MD) A-MB-175-VI, MDA-MB-436, MDA-MB-468, ZR-75-1, ZR-75-30, UACC-812, UACC-8 93, BT-20, BT-474, BT-483, BT-549, HS578T, SK-BR-3, SCC70, SCC38, SCC202 ), Normal epithelium and stromal cells (HME: 15, 17, 31, 32, 35); (5) lung-carcinoma (NCI-H522) , NCI-H23, A549, EKVK, 1299, H146, H69, NCI-H460, H358, H182), SV40 T- Antigen transformants (IDH4, SW26-IG, SW-26-C4), normal fetal fibroblasts (GFL, IMR-90 (6) Stomach-gastric carcinoma (KATO-III); (7) Pancreatic-pancreatic ductal carcinoma (SU.86.86), adenocarcinoma ( (8) Ovarian-carcinoma (OVCAR-3, OVCAR-5, IGROV-1), adenocarcinoma (OPCA, Capan-1); (9) cervix-carcinoma (HeLa S3, C-33A, HT-3), normal primordial epithelial cells; 0) Uterine-normal primordial epithelial cells; (11) Kidney-carcinoma (A498, CAKI-1), Ad5-transformed Embryonic kidney cells (293); (12) bladder-carcinoma (5637), transitional cell carcinoma (T24), squamous Skin cancer (SCaBER), normal fetus (FHs 738B1); (13) Colorectal-adenocarcinoma (COLO 205, SW-620 (14) Prostate-adenocarcinoma (PC-3, DU 145), SV40-transformed BPH fibroblasts. Vesicle (BPH-1), normal stromal fibroblast (31YO), BPH fibroblast (S52); (15) CNS-carcinoma (U251, SNB-75), glioblastoma (SF268); (16) blood-leukemia (Molt4, HEL), T- Cell leukemia (Jurkats), acute promyelocytic leukemia (HL-60), chronic myeloid leukemia (K-562) Retinal sarcoma (U-937); (17) Retinal-SV40 transformed pigmented epithelial cells (AGO6096 A); and (18) Joint: Normal synovial fibroblast (HSF). Normal somatic cell cultures detect detectable telomerase in this TRAP assay. No activity was shown. Of the 74 immortalized cell lines, 68 are tumor-derived, Six were cell lines transformed with the oncoprotein of the virus. 68 all The tumor line had telomerase activity. Two of the six transformed lines Was negative for telomerase activity. If these two systems are immortal No detectable telomerase activity deficiency was expected. But these systems Studies of telomere length in humans have shown that these telomeres are Longer than that of the vesicles, indicating that these cells have telomerase activity. May have experienced a transient outbreak. This telomerase activity starts again If not, then these cells will not replicate indefinitely.Example 4 Standard Procedure for Telomere Repeat Amplification Protocol (TRAP) This example describes a five-step protocol for performing the TRAP assay of the present invention. Provide: (A) Workplace location; (B) Precautionary measures; (C) Microextraction; (D) Quantitative assay And (E) analysis. The method described here provides a quantitative analysis of this activity and is recommended Values, but depending on the conditions used and the nature of the desired result, It will be appreciated by those skilled in the art that not all recommendations need to be followed in a situation. There will be.(A) Workplace layout An important factor in this configuration of the TRAP assay is performed prior to the PCR step This is the environment for preparing the first reaction mixture. This ideal environment, by mistake Ribonuclease and PCR amplification that can produce negative and positive results Contains no contaminants of the DNA product. Major sources of PCR product (and RNase) contamination The source of the experiment May be by the practitioner, maintain high personal hygiene standards, and Aerosol generation or PCR generation of PCR products when opening or pipetting the product The gel buffer should be discarded after electrophoresis of the product. For researchers A positive pressure ventilation hood that filters and blows air over the sample is ideal. Always use individual solutions, pipettes, test tubes, and tips in the hood. I have to work. Work area should be wiped with 10% bleach before preparing for reaction, and The hood is regularly irradiated with UV when not in use. In addition, the body of the pipette Even when using aerosol-resistant tips, regularly Must be soaked in 0% bleach. Researchers put on gloves and put rubber straps on their wrists. Wear worn disposable lab clothes; these lab clothes must be changed regularly. Must. The area designated for preparation of the TRAP reaction should be placed on a standard drawer desk, with VW Acrylic shield measuring 45.7 cm (L) x 30.5 cm (W) x 61 cm (H) (Cat. 56615-848). Cover the desk with either a board or a heavy cloth and the front Protect with the shield. This arrangement creates a space where air is stagnant, Leaks out of the workplace and these samples are physically Protected. All solutions, pipettes, tips, and test tubes should be The workplace is equipped with a short wavelength UV lamp mounted on the ceiling of the workplace. UV irradiation (Black Ray UV lamp, XX-1SS, VWR, catalog number 36575-059).(B) Precautionary measures As described above, the TRAP assay is based on PCR amplification and ribonucleoprotein (telomere). Ze) incorporates both the use of the in vitro activity, PCR-product (DNA) contamination, which can be harmful Special care must be taken to prevent Rnase contamination. Take the following basic precautions: All steps of the assay protocol, including telomerase extraction and PCR amplification steps To avoid problems: (1) All solutions should be treated with DEPC-treated H20 or commercially available Use nuclease-free water (Sigma) and separate into small volumes before use. (2) This assay solution (PCR buffer, CHAPS extraction buffer, dNTP , Taq polymerase, etc.) separately from other reagents in the laboratory; (3) Put bag; (4) Pipettor set and aerosol resistant designated for this assay And (5) the amplified sample should be in the area where the sample was prepared. Do not analyze in the same area (ie, PCR tubes will Do not open on the same bench where reagents and pipette / tip are located; this PCR Use another pipettor instead of the bench (optionally without ART) ). ).(C) Micro extraction The requirements for the material of the lysis buffer used in this micro extraction method are shown below. Lysis buffer (0.5% CHAPS or CHAPSO) * 0.1 M benzamidine (1 μl) and β-mercaptoethanol (0.35 μl) were extracted. Immediately before performing the extraction step, PMSF or AEBSF was added to 1 mM lysis buffer: It can be used in place of zuamidine. This micro-extraction method comprises the following steps; 1. Determine cell numbers by counting or extrapolating from tissue weight. 2. Precipitate cells or tissues, wash twice in PBS (free of Ca and Mg), and precipitate again And remove PBS. The cells or tissues are now stored at -80 ° C. 3. Resuspend cells in cell 10⁶~Ten^Five200 μl (per application) Precipitate in lysis buffer. For tissues, add 200 μl lysis buffer Used for 20-100 mg of weave. The organization shall process in one of the following ways (a, b or c): Can be a) Soft tissue is a motorized disposable inner cylinder (VWR, Catalog No.KT749520-0000, KT7495 40-0000). First, place the tissue sample in a smooth Slice with sterile blade until stencil is reached. This sample is centrifuged at 1.5 ml. Transfer to tube and add lysis buffer. The sample is then placed in a uniform Homogenize on ice in a motorized inner cylinder until tension is obtained (less than 10 seconds) . b) Connective tissue is placed in a sterile mortar and by adding liquid nitrogen to freeze. The sample is then ground with a suitable pestle to a fine powder. Then unpacked Transfer the sample to a sterile 1.5 ml centrifuge tube and resuspend in lysis buffer. c) Connective tissue is mixed with lysis buffer and the mixture is homogenized On ice using a mechanical homogenizer until a consistent consistency is obtained. Modify (eg, PowerGen® Mode1 35 homogenizer, Fishe r company, catalog number 15-338-35H) (5 seconds or less). Homogenization of this sample on ice Protects the sample from heat that can destabilize the protein. 4. The cells or treated tissue are incubated on ice for 30 minutes. 5. 12,000 g of the cells or the treated tissue was collected using a microcentrifuge (Eppendorf). And spin at 4 ° C. for 30 minutes. 6. Remove extract to another tube and use 1-2 μl per TRAP assay Snap-freeze the rest on dry ice and store at -70 ° C if desired . Typical protein concentrations are between 1 and 10 μg / μl.(D) Quantitative assays The following materials are recommended for this assay: TS primer (5'-AATCCGTCGAGC AGAGTT-3 ′; SEQ ID NO: 3; HPLC purification, 1 μg / μl); ACX primer (5′-GCGCGG [CT TACC]_ThreeCTAACC-3 ′; SEQ ID NO: 4; HPLC purification, 0.1 μg / μl); NT primer (5′-ATCGC TTCTCGGCCTTTT-3 ′; SEQ ID NO: 6; HPLC purification, 0.1 μg / μl); TSNT internal control (5′-AA TCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3 '; SEQ ID NO: 5; HPLC purification, 0.01 amol / μ l); TSR8 quantitative standard (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTAG [GGTTAG]₇-3 '; SEQ ID NO: 19; HPLC Purification, 1 amol / μl); 2.5 mM dNTPs (Pharmacia); Taq DNA polymerase (Perkin Elmer, AmpliTaq®); and 10 × TRAP buffer.Ten × TRAP buffer component 5ml about 200 mM Tris-HCl, pH 8.3 1 mM (1 M Tris-Cl, pH 8.3) 15mM MgCl_Two 75μl (1M MgCl_Two) 630mM KCl 3.15ml (1M KCl) 0.5% Tween 20 250 μl (10%, Boehringer Mannheim) 250 mM 10 mM EGTA (0.2 M EGTA) 1 mg / ml BSA 250 μl (20 mg / ml) Boehringer Mannheim fraction 5) Water (Protease, RNase and DNase-free) 25μl For quantitative assays, a terminally labeled TS substrate can be used, Substrates / primers are described below, depending on the particular detection and quantification system used. Reaction mixture, [³²P] γATP, or other reagents such as 5′-biotin, digoxige The ends can be labeled with nin, fluorescent dyes or other fluorophores. End labeling reaction mixture (³²P) γATP (3000Ci / mmol, 10μCi / μl) 2.5μl TS primer (1 μg / μl) 1.0 μl 10 x OPA buffer (Pharmacia) 1.0 µl T4 polynucleotide kinase (9.7 U / μl) 0.5 μl DEPC water 5.0μl The end-labeling reagents are combined in a reaction vessel and pulled at 37 ° C for 20 minutes. Then incubate at 95 ° C for 5 minutes. One skilled in the art will recognize the conditions of end labeling (eg The amount of radioactive nucleotides or oligonucleotides) depends on the specific application and It will be clear that this can be changed as needed. For example, this To increase the sensitivity of the assay, the ratio of labeled primers was This can be achieved by increasing the activity. To prepare the telomerase assay reaction mixture: Is mixed in a PCR reaction tube.material 50 μl total volume 10μTRAP buffer 5μl 2.5 mM dNTPs (Pharmacia) 1 μl End-labeled primer (0.1 μg / μl TS) 1 μl ACX primer (0.1 μg / μl) 1 μl NT primer (0.1 μg / μl) 1 μl TSNT internal control (0.01 amol / μl) 1 μl Taq polymerase (AmpliTaq, Perkin Elmer) 0.4 μl (2 units) H with DEPC treatment_TwoO 37.6 μl Telomerase extract 2μl Optional component, T4 gene 32 protein 0.2 μl (5 mg / ml, Boehringer Mannheim 0.4 μl of TaqStart® antibody (obtained from Clontech); Are mixed with the antibody before the assay. )including.Contrast In the reaction mixture, the telomerase extract is replaced with one of the following. Can be: negative control RNase-inactivated or heat-inactivated extract (extract Inactivated by heat by incubating at 75-85 ° C for 10 minutes I do. ); Positive control cell extract; CRAPS lysis buffer (primer-dimer / PC R contaminant control); and TSR8 (0.1 amol quantitative control). The reaction is performed in the following steps: 1. Incubate the reaction mixture at 30 ° C for 10 minutes (this step was used in step 2) This is performed using the same equipment as the above. ); 2. Incubate the reaction mixture at the temperature for Perform R: 94 ° C./30 seconds, then 60 ° C./30 seconds; repeat this for 25-30 cycles; 3. A dye containing bromphenol blue and xylene cyanol (50% 0.25% in cerol / 50 mM EDTA, respectively), 10-15%, preferably 12.5% of non-denaturing PAGE using Expose until the gel passes through the gel (Boehringer Mannheim molecular marker V It is a good DNA marker in this gel. );as well as 4. Suitable for eg Phosphorirmager® (for radiolabels) and other detections By means of visualizing the formation of the product. The TSNT internal control is independent of the RNase treatment or extraction control, regardless of the TRAP assay. Gel of the first product of the PCR product Occurs. This internal control band was used to normalize PCR amplifications from various samples. End-labeled TS oligonucleotides as described below. Calculate the number of telomerase products generated when used with substrates / primers can do.(E) analysis i) Unheated (x) and heat-treated sample extract (Xo), CHAPS lysis buffer only Teru (r_o), And the ladder of TRAP products from all samples, including the TSR8 quantitative control (r). The signal in the region of the gel row corresponding to the -band; ii) TSNT internal control (c) and TSR8 quantitative control (c_R) Measure; iii) Quantify the amount of telomerase product using the following formula: TPG (unit) × ((x−x_o) / C) / ((r-r_o) / C_R× 100 (1 μl of TSR8 (0.1 amo l) Each unit of TPG (total product generated) is activated by telomerase in the extract Extended with at least 3 or 4 or more telomeric repeats, TS Number of primers (1 × 10^-3amole or 600 molecules). Typically, this The assay has a linearity range of 1-1000 TPG, which is at 30 ° C. for 10 minutes. Equal to the telomerase activity of about 10 to 10,000 control cells. This calculation is only invalid if the TS substrate is end-labeled, and TRAP protocols such as direct uptake of radioactive dNTPs or non-radioactive assays Calls should be applied since in this case the signal depends on the length of the product. I can't do that. These primers are more expensive than the template for accurate quantitative analysis. Must be in excess. Therefore, the sample has very high levels of telomerase activity. If so, dilute the extract and do not limit the PCR primers. Or The control nucleic acid of any sequence can be added to the reaction mixture in a predetermined amount. And different from those used to amplify the extended telomerase substrate Amplify this control with the appropriate primers. The control oligonucleotide and / or The primers used to amplify the control oligonucleotide were telomerase extension products. It is the same or different from the label used in the composition.Example 5 In situ detection of telomerase activity This example demonstrates the use of the in situ telomerase assay of the present invention. Is explained. This method involves the internalization of telomerase substrates by cells. Extended telomerase groups when telomerase is present in the cell Related to quality detection. One skilled in the art will recognize that numerous methods are available for Available for personalization and for the purposes of this application It will be understood that it can be used for the detection of telomerase substrates . The use of telomerase substrates comes from the particular detection method used. There are no restrictions other than the ones listed. In certain embodiments, the plasmid telomerase A substrate is used. Preferred plasmid telomerase substrates are selectable, mammalian A plurality of replication vectors having a class of origins of replication, Non-telomeric telomeres adjacent to restriction sites not present in the system (eg Isce I) Substrate sequence (for example, TS sequence, 5′-AATCCGTCGAGCAGAGTG-3 ′) (SEQ ID NO: 3) Including. In this embodiment, the restriction endonuclease specific for this restriction site is , Provided by the provision of a linear telomerase substrate. For example, specific restrictions A gene that encodes an enzyme (for example, Isce I) and is inducible by manipulation The second plasmid, linked to the promoter, transfers the first plasmid to the target cell. Along with that, they are coinfected. During induction, it encodes a unique restriction enzyme Plasmids are subject to specific restrictions at the insertion site of the telomerase substrate plasmid. Express a restriction enzyme that cuts the site. This means that telomerase A linear telomerase substrate plasmid that can be extended with TTAGGG repeats Is generated.A. DNA Substrate internalization Internalization of these substrates is based on passive internalization (eg, For example, add the target oligonucleotide or DNA to the cell medium at a concentration of 10-100 μM. I do. ) Or detergent or Staphylococcus alpha toxin (BRL, according to manufacturer's instructions) ) Or liposomes (eg, LipofectAminem®, Lip ofectin®, LipofectAce®, BRL, according to manufacturer's instructions ) Or electroporation (eg, in DMEM medium, 0.8 ml total volume) , V = 0.25KV, capacitance = 960 μF, electroporation cuvette with 0.4cm gap (No resistance in the unit). The target nucleic acid is After the internalization, the cells are incubated at 37 ° C for 1-6 hours. I did it. For solid tissue samples, use frozen unfixed tissue Cut into thin sections with a tart, place on a sterile microscope slide, and place the DNA Contains a telomerase substrate or a telomerase-loaded DNA telomerase substrate The medium was incubated at 37 ° C for 1 to 6 hours. incubation Thereafter, the tissue was gently washed with PBS and fixed using the following method. Active terrorism In the presence of merase, this DNA substrate is used for de novo synthesis of TTAGGG repeats. More elongated.B. Sample fixation and permeabilzzation After internalization and incubation of the substrate, the cells or Treat the flaky tissue to stop the telomerase reaction and any degradation reactions And permeable for detection. For example, these samples may be washed twice with PBS or Rinse and secure in any of the many ways known in the art This can include, for example, methanol: acetic acid (3: 1 ratio, ink at -20 ° C overnight). 10% buffered 10% formalin (4-15 hours at room temperature), 3% paraforma Aldehyde (4-15 hours at room temperature), 4% formaldehyde (4-15 hours at room temperature), Alternatively, use a commercially available fixative such as Permeafix (ORTHO, 1-5 hours at room temperature). Can be These cells are then transferred to Cytospin® (Shandon). Were fixed on a microscope slide and dried overnight at room temperature. This fixed The sample thus obtained is then subjected to protease (eg, proteinase K, proteinase, Lipsin, pepsin [2 mg / ml]) for 10-60 minutes at room temperature It was made transparent by processing. The samples are then incubated with PBS for 10 minutes at room temperature. In the meantime, wash or rinse, wash briefly with 100% ethanol and dry.C. Detection of extended telomerase After permeabilizing these samples, if an extended telomerase substrate is present, , Which can be detected in various ways. In one aspect of the invention Used PCR detection. TS and CTR5 primer ([5'-CCCTAA-3 ']_Five(SEQ ID NO: 20) Various in situ PCR conditions using are shown below. As known to those skilled in the art, Other primer pairs and reaction conditions can also be used. GeneAmp® i n situ PCR System 1000 and GeneAmpm® in situ PCR core kit (Per Kin Elmer), 50 μl of the reaction mixture (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 8.3; 2. 5mM MgCl_Two200 μM dNTPs; 1 μM TS and CTR5 primers; 10 U AmpliTaqm (registered (Trademark) DNA polymerase) is added to the sample heated to 70 ° C, Seal with clips and clips (per manufacturer's protocol, Perkin Elmer) The amplification was carried out at 94 ° C./40 seconds and 55 ° C./90 seconds for 30 cycles. Detection of amplified products Use labeled dUTP or primer (fluorescent label, radioisotope, bio Marked with tin or dioxygenin, the ratio of dUTP to dTTP is T-dUTP94μ M: dTTP was 106 μM. ), Can be incorporated during PCR amplification. Last PCR After the completion of the process, the sample was washed with a washing buffer (4 × SSC; 0.05% Tween 20) at 70 ° C. And washed three times for 2 minutes. Background caused by direct incorporation of marked dNTPs into cellular DNA Before in situ PCR amplification, reduce the sample to dNTPs and primers to reduce signal. Ligase-free DNA polymerase and optionally DNA ligase. This DNA port The limerase is preferably Taq DNA polymerase, which comprises cellular DNA and the ligase, preferably Form a complementary copy of the single-stranded region in the heat-stable ligase and obtain the resulting product. There is no break in the product. Therefore, the DNA polymerase in this amplification step Is not necessary if pre-treated with a thermostable DNA polymerase.D. Signal detection Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a mixed assembly of cells or tissues Can be used to identify telomerase positive cells. Microscopic After penetration of the tissue or cells fixed on the mirror slide, these nucleic acids are 2% in 70% deionized formaldehyde / 2 × SSC solution pre-warmed to 70 ° C. Soaked for ~ 3 minutes to denature. Transfer the slide to ice-cold 70% ethanol After that, they were transferred to 100% ethanol (4 minutes for each solution). Labeled probes (eg For example, 100-200 ng of the plasmid insert containing about 500 bp of the 5'-TTAGGG-3 'repeat sequence Can be used per slide. This probe is biotin, digo It can be labeled with xigenin, a radioisotope, or a fluorescent label. Mark After recognition, dry the probe and resuspend in 100% deionized formaldehyde. And denatured by incubating at 75 ° C for 8 minutes, and quickly cooled on ice. to this, 10 μl of 2 × hybridization buffer (4 × SSC; 4 × Denhardt solution; 20 % Dextran sulfate; 100 mM Tris, pH 7.5) was added. This probe / hive Add the redidation mixture (20 μl) to the fixed sample described above and cover Cover glass with rubber cement or manicure. Sealed around, then samples were incubated at 37 ° C. for 8-48 hours. So After removing the cover glass, the sample is washed with 2x SSC / 50% formaldehyde. Wash twice at 37 ° C, 2 × SSC at 37 ° C (Washing once was 5 minutes). If this DNA probe is labeled with a fluorescent label or a radioactive isotope , Samples in antifade solution (VectaShield®, VectaLab) Or developed using a photographic emulsion and observed with a microscope. Digoxy The genin-labeled probe was conjugated to an anti-digoxigenin antibody (Boehringer Mann. heim) according to the manufacturer's instructions. Probe labeled with biotin If so, the slides were blocked with 2xSSC / 1% BSA for 10 minutes at room temperature. Avidin / 2 × SSC / 1% BSA (final avidin concentration) : 5 μg / ml) for 1 hour at room temperature. This slide, below Washed for 5 minutes at room temperature using: 4 × SSC, 4 × SSC / 0.1% Triton X-100, 4 × × SSC, PN buffer (0.1 M Na_TwoHPO_Four; 0.1M NaH_TwoPO_FourAnd 0.1% Nonidet P40). This Of the samples are fixed to prevent fading and observed under a microscope. About signal amplification Shows this slide in PNM buffer (PN buffer + 5% [w / v] skim dry milk) Biotin in PNM buffer for 10 minutes at room temperature Incubate for 20 minutes at room temperature in a solution of treated anti-avidin antibody (5 μg / ml) did. The slides are then washed in the four washing steps described above and re-washed with PNM buffer. Conjugated adivine (5) μg / ml) for 20 minutes at room temperature. Repeat this slide 4 times After washing, the sample was fixed to prevent discoloration and observed under a microscope. Those skilled in the art will recognize various modifications of the in situ hybridization protocol described above. It will be appreciated that further modifications are applicable to the method of the invention. For example, Changing the in situ hybridization detection method is the best in situ labeling method (PRIN S; Koch, J., “Nonradioac tive in situ Hybridization Application Manual ”(1992), Boehringer Mannhe im, Co., pp. 31-33). Detection of telomere repeats by PRINS is Obtain oligonucleotide probes specific for the reverse sequence and labeled nucleotides. Includes extended chains that nest. PRINS mixture (10 μl) using 5% (v / v) glycerol as a solvent; 10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 100 mM KCl; 0.05% (w / v) Tween 20; 0.75 mM EGTA; 2.5 mM MgCl2; 0.4 μ M return primer [eg CTR4]; 200 μM dATP, dGTP, dCTP; 110 μM dTTP; And 90 μM labeled dUTP is placed on a fixed, permeabilized sample and covered. Seal with lath, secure with manicure, overlay with mineral oil and at 70 ° C for 30 minutes to 3 hours Incubated. After PCR is completed, the sample is washed with washing buffer heated to 70 ° C. (4X SSC; 0.05% Tween 20), wash 3 times for 2 minutes, and signal as described above. I was able to observe it. Background signal resulting from direct incorporation of fluorescent labels during PCR amplification To minimize PCR amplification using unlabeled dNTTs and unlabeled primers. A series of indirect detection methods were used. Then using in situ hybridization The PCR-amplified product is then hybridized with a Detected by the solution probe.E. in situ PCR Product extension In situ PCR improves by minimizing leakage of PCR amplification products from cells. Can be The reason is that this PCR product is typically larger than 200bp. Preferably greater than 500 bp, and more preferably greater than 700 bp. And Alternatively, PCR products smaller than 200 bp from the cell matrix Leaks are caused by "high" dNTPs (eg, biotin-labeled dNTPs, fluorescently-labeled dNTPs, Or digoxigenin-labeled dUTP. ) Incorporation into PCR products Mix product extension primers, or to in situ PCR protocol Can prevent it. Specifics on such protocols The primer has a 6 bp repeat incomplete (or mismatched) tag at its 5 'end. Roman sequences (eg, [5'-TTTCCC-3 ']_3-4) (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22) Plasmids containing a number (3 or 4) of copies, followed by specific sequences for the target Immer, a suitable return primer, the third primer is an incomplete Repeatability (eg, [5'-TTTCCC-3 ']_Four) (SEQ ID NO: 22). These primers In in situ PCR, it can be used to amplify specific targets. Third step The presence of the primer is not sufficient to bind stably to the 3 'end of the target PCR product. For this purpose, extend this PCR product. This extension of the PCR product is further extended by the first PCR step. In this case, the annealing temperature is lowered. For example, the temperature for annealing the first primer to the target sequence is 60 ° C. This sample was initially amplified at 94 ° C / 45 s and 60 ° C / 45 s for 15-20 cycles. After that, amplification is performed at 94 ° C / 45 seconds and 50 ° C / 45 seconds for 15-20 cycles. Second PC The lower annealing temperature in the R step leads to the repetitive sequence of the third primer Is preferred for labile binding and thus produces an extended PCR product. Got Extended PCR products rarely leak through the cell matrix, Results in improved signal retention time in in situ PCR analysis.Example 6 TRAP Preparation of reaction beads This example ensures more specific nucleobase pairs during TRAP assays Only at temperature will the return primer be ligated with DNA polymerase and any Approached telomerase substrate, resulting in Can reduce non-specific primer extension and primer-dimer formation To ensure that PCR return primers are distinguished from other reagents, The use of a wax barrier is described. Primer solution containing traces of Promophenol Blue (e.g., ACT; 5-10 ng / μ g) with clean, sterile glass beads (e.g., , Purchased from Sigma). This Promophenol Blue is heat cycled Previously, to enable monitoring of leaks through this wax barrier Can be added. For the practice of the present invention, it is necessary to add a dye for this purpose. Although it is not necessary, the addition of dye can be used to monitor the rigor of the manufacturing process. This is the usual method. In this mixture, the beads were mixed with an appropriate amount of dry primer (see Example 2). The primer coated beads are dried until warm Mix with molten wax. Pipette the bead / wax mixture with vigorous stirring. Dispersed on a clean surface by setting and then solidified. One drop of beads Added to PCR tubes and used in the TRAP assay using the conditions described in Example 2. Alternatively, this primer solution (eg, ACT; 5-10 ng / μl) is (1000 microns or less in diameter). Aliquots of warm molten wax (less than 5μl) Was placed in a plug mold having a coated bottom and cured. These beads Place on the surface of the cured wax layer and add a second warm molten wax (5 μl or less) , Placed in a mold above the beads and cured. Remove the bottom cover The finished plug was pressed through the mold. 1 About the TRAP assay 1 plug is used in place of a normal reaction tube, and the TRAP assay is Performed as shown in FIG. Those skilled in the art will recognize this problem, such as the use of various primers and surfaces other than glass beads. Obviously, many modifications of these two embodiments are possible.Example 7 Wax-free / warm start TRAP assay Methods for reducing primer-dimer artifacts are described in detail in Example 6. In addition to using a wax barrier, there are various choices such as selection of reaction conditions. For example, limited Although not intended, about 5% dimethyl sulfoxide (D MSO) can reduce the generation of primer-dimer artifacts. Addition of glycerol in combination with DMSO may have caused Compensate for destabilization of certain enzymes. Therefore, a TRAP buffer containing about 5% DMSO The addition of about 5% glycerol to the sample in It is useful when Appropriate primer design can also be used to reduce primer-dimer formation. used. A specific primer is an ACT primer (5'-GCGCGG) at its 5'-end. -3 ') having an anchor sequence of (SEQ ID NO: 2), is a chimeric oligonucleotide, ACX return primer (5'-GCGCGG [CTTACC]_ThreeCTAACC-3 ', SEQ ID NO: 4) This is followed by a mismatch in the 3/4 complementary telomere repeat (5'-TAACCC-3 '). Match (5 '-[CTTACC]_ThreeCTAACC-3 ', SEQ ID NO: 23) Followed by the sequence. TRAP assays are performed with TX and ACX or TS in the presence of about 5% DMSO. Using 293 extracts of either ACT or ACT, essentially as in Example 2. Using cold starting conditions (ie, no wax barrier), the product was Separated on a acrylamide gel. No extract was added to the control sample and the control sample One set contains a synthetic telomerase product (TSR8; 5'-AATCCGTCGAG CAGAGTTAG (CGGTTAG)₇-3 '; SEQ ID NO: 19). 293 No input or synthetic product The result is that the combination of TS and ACT results in a primer-dimer artifact On the other hand, for TS and ACX primers, primer-dimer artifacts were observed. It was not shown. To test the robustness of ACX primers, use a TRAP assay containing TS and ACX. B) Incubate the mixture on ice, without a wax barrier, then preheat Initiate PCR amplification in a thermal cycler block that does not An attempt was made to induce the formation of primer-dimer artifacts by the mer. TS And ACX primer combinations are consistently primer-dimer artifacts And did not have a deleterious effect on the efficiency of the TRAP reaction. Further TS and ACX primers form primer-dimers in the absence of DMSO. Shows a similar resistance. Therefore, the use of TS and ACX primers in TRAP assays Can replace the wax barrier method for the TRAP assay, Performing this analysis, making it, and making the performance of the TRAP assay components more reproducible, To be reliable. However, as will be apparent to those skilled in the art, Limers can be used in various embodiments, including the wax barrier method. .Example 8 TaqMan Detection of TRAP products with the TM detection system This method is a non-radioactive TaqMan (registered) modified for use in the TRAP assay. ® Extended Telomerase Substrate Using Detection System (Perkin Elmer) Related to the detection of Ta, having both a fluorescent reporter dye label and a quenching dye label Mix the qMan® probe in a primer extension reaction (eg, PCR amplification). Was. There were no exact restrictions on the location of these signs, but certain locations were It will be apparent to those skilled in the art that the labeling is more preferred; It is preferably located at the tide portion. The specific probe used in this detection system is a repetitive CTR (5'-CCCTAA-3 ' ) Contains an array. In a typical form, a CTR probe and a return primer (e.g., ACT ) Are both wax barriers used in the warm-start method described in Example 2. Separated by. A second specific probe comprises a sequence complementary to the telomerase substrate, Does not compete with either TS or ACT primers and therefore primer-dimer formation Does not occur. For this artifact, between the TS primer and such a probe There is a concern that duplex formation may significantly reduce the efficiency of PCR. In an assay using PCR detection as described above, telomerase may It was shown to recognize and extend the main-chain substrate. Duplex DNA (GTSI-1) is prepared using an equal amount of M2A telomerase substrate primer (modified TS: 5'-GCCCAATCCGTCGAGCAGAGTTAG-3 '; SEQ ID NO: 25), and its complementary sequence Hybridization with CM2A (5'-CTAACTCTGCTCGACGGATTGGGC-3 '; SEQ ID NO: 26) It was configured by GTSI-1 is essentially as shown in Example 2. Return primer under cold start conditions (ie without wax barrier) , HKC (Anchor CTR primer mutant: 5'-CTCGGTACCAAGCTTCTAACCCTAACCCTAACC -3 '; SEQ ID NO: 27), and 293 extracts. This The TRAP product is recognized by this combination of primers and Telomerase activity, and thus in detecting telomerase activity, This suggests the use of a probe that is complementary to the zeolite substrate. Therefore, CM2A is TaqMan (Registered trademark) can be used as a probe. Modification of the probe design can be easily performed by those skilled in the art. For example, a sequence complementary to the 3 'region of the TS primer, followed by a CTR sequence (eg, , 5′-AACCCTAACCCTAACTCTGCT-3 ′; SEQ ID NO: 7), and a reporter dye at the 5 ′ end And a quenching dye inside the 5 ′ end, preferably about 7 nucleotides inside the 5 ′ end. Accordingly, probes can be used. This primer is a TS primer and Specifically hybridizes at the junction between telomere repeats, Reduces the competitive effects of ACT-probe and TS-probe duplex formation Less. Probes containing the TS sequence and at least one TTAGGG repeat are also described in Taqman (registered (Registered trademark) detection system, preferably using the warm-start method of Example 2. Used.Example 9 Multiplex electrophoresis separator (MES) The Multiplex Electrophoretic Separator (MES) Is an apparatus for analyzing many samples simultaneously. This device has the same shape, Includes two conductive sheets (eg, copper) with multiple wells. These two The sheet acts as an electrode (FIG. 1). 15% non-denaturing polyacrylamide gel Prepared in a temporarily encapsulated, bottomless, multi-well plate and run the gel Polymerized. After removing the seal, this multiple gel unit is equidistant from the two electrodes. And the entire apparatus is placed in an electrophoresis buffer (for example, 0.5 × TBE; s-boric acid, 0.001M EDTA). The method using this device will be described in detail. As described qualitatively in Example 2, 293 cell extracts (10^Five~Ten¹Cell equivalent ) As a substrate for the TRAP assay using a series of 10-fold dilutions. As a control, A series of 5-fold dilutions of 10 fmol to 16 amol of the synthetic TSR8 product (see Example 7) were also prepared. Inclusive. Each assay / dilution was prepared in triplicate. After the TRAP reaction, place each sample at the top of the MES well and apply an electric field across the gel. I took it. After separating the product from unincorporated dNTPs and primers, The gel is washed with water, and the product inside the gel is analyzed using a PHOSPHORIMAGER (registered trademark) device. (Molecular Dynamics). In this detailed example, the city A commercially available microtiter plate was used. This plate material is the most suitable for this assay. Not optimized, so the radioactive scattering by the plastic wall of the MES gel unit Turbulence caused this signal to become cloudy. However, this device does not work for negative samples (RNas e control and no extract) can be used to distinguish from positive samples. Lomerase activity is linear over a wide range and is determined at 10,000-fold dilutions. Can be detected. As will be apparent to those skilled in the art, various substances And the assay conditions can be changed according to its specificity it can.Example 10 TRAP-SYBR Detection of telomerase activity by green This TRAP assay was performed using a telomere essentially as described in Example 4 above. This procedure is performed on lysate samples, typically using unlabeled primers in a total volume of 50 μl. It is performed using. Typically, PCR parameters for the TRAP-SYBR Green assay The meter reads two steps of 22-35 cycles: 94 ° C / 30 seconds and 60 ° C / 30 seconds. is there. After electroporation, the gel was stained with SYBR green to visualize the product. . In another embodiment, the reaction mixture is reduced to reduce background. With a 0.3 M acetate buffer containing 500 ng of RNase and 10 units of S1 nuclease. Treat with 25 μl of pH 4.5 and incubate at 37 ° C for 15 minutes. Excess ply in ze extract And RNA were digested. Instead of electroporation, use SYBR green dye (Molecular P aliquots (50 μl) of a 1: 2000 dilution of S. robe) into microtiter plate wells In addition, a 50 μl aliquot of the digested TRAP assay described above was used for telomerase activity. It was mixed with the dye for measurement. This double-stranded DNA / dye complex has an excitation wavelength of 497 nm. And a fluorescent plate measuring device using an emission wavelength of 520 nm. Such non-release The radioactive telomerase assay is easy, inexpensive and, if desired, High-throughput screening in labs or telomerase inhibitory compounds Potential in screening, as well as easy quantification of DNA products in samples Is possible.Example 11 Single cell telomerase repeat amplification protocol (STRAP) This example demonstrates single cell telomere to illustrate the sensitivity of the TRAP assay. It describes a method for detecting protease activity. One cell can be obtained by various methods For example, by serial dilution or whole cell lines or specifically marked cells A fluorescence activated cell sorter (FACS) is used to sort any of the populations. The latter The method is described in detail in this example. The cells may be fluorescently labeled or labeled. Marked with a recognizable antibody, which recognizes the specific marker. This marker Cells identify cells of various life spans and functions and are differentially expressed Can be Cells were 20 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl_Two, 63mM KCl, 1mMEGTA, 1mg / mL B SA, 0.5% Tween 20, 50 mM dNTPs, 100 ng TS oligonucleotide, and DEPC-treated Immerse in 25 μl of preparative buffer containing treated water. This buffer is 8-ch The tubes were placed in microtiter PCR strips. Tween20 concentration lyses cell membranes Was enough to do. The reaction time used in this example was 60 minutes at 30 ° C. However, it is not limited to this. This incubation is performed with Pe for microtitration. Performed in a rkin Elmer 9600 thermal cycler block. Use heat block or water bath can do. After incubation, 25 μl of amplification buffer was added to each reaction tube. This amplification buffer contains 100 ng of gamma-end labeled It contained the same components as described above except that the primers and ACX were used. this ACX oligonucleotide is a T4 polynucleotide kinase (NEB), 10x PNK buffer (NEB) and γ-³²The ratio of PATP / 1 μg ACX is 100 μCi / 3000 Ci / mmol. Labeled with reactions including T4 kinase is used at a ratio of 40 U / μg ACX Incubate at 37 ° C for 30 minutes and heat at 65 ° C for 15 minutes. Was inactivated. Taq DNA polymerase (2U; Boehringer Mannheim Was added to this amplification buffer, and the Perkin Elmer 9600 thermal cycler was added. The amplification was carried out in 32 cycles of 94 ° C./30 seconds and 60 ° C./30 seconds. The product is 15% poly The gel was electrophoresed on a non-denaturing acrylamide gel in 0.6 × TBE and analyzed. Skilled person The ratio of radiolabel to primer increases the strong signal from the amplification product. Preparation of high specific activity primers resulting and terrorism at the single cell level It will be appreciated that this results in the detection of merase activity.Example 12 Method for detecting telomerase activity in body fluids This example demonstrates the use of terrorism in a non-invasive and convenient manner, especially for clinical use. Provides collection of cells from a body fluid used in a merase activity assay. concrete For the purpose, this method describes the collection of cells from the ureter; However, this method is not limited to use in urine, but may be used in other bodily fluids such as saliva. Liquid, mucus, sputum , Blood, tumor (breast tumor, prostate tumor, or other It should be noted that it may be a fine needle aspirate from the (tumor). Further, it will be apparent to those skilled in the art that many other modifications of the method are possible. U.(A) Sample preparation and storage Method 1: 1. Collect urination (30-40 ml) in a 50 ml centrifuge tube. 2. Centrifuge at 1000 g for 15 minutes. 3. Carefully discard the supernatant so as not to disrupt the precipitate. 4. The precipitate is resuspended in 30 ml of PBS and re-suspended by centrifugation. 5. Transfer the resuspended precipitate in 1 ml PBS to a 1.5 ml centrifuge tube and centrifuge. And settle again. 6. Count cells using a Coulter counter or hemocytometer. 7. Carefully discard all supernatant. This cell pellet should be frozen on dry ice for transport if desired. At this point, it can be stored at -80 ° C. Method 2: 1. Collect urination (30-40 ml) in a 50 ml centrifuge tube. 2. Add 100% glycerol to the collected urine to a final concentration of 20% Alternatively, add 100% DMSO to the collected urine to a final concentration of 10%. Treated samples should be frozen on dry ice for transport if desired At this point and can be stored at -80 ° C. Before use, remove this sample Process as described in steps 2 to 7 of Method 1. Manage. Method 3: 1. Collect urination and count cells using a Coulter counter or hemocytometer . 2. Filter the urine (30-40 ml) through a 0.45 micron filter. 3. Pass 10 ml of PBS through the same filter. The filtrate is sealed in a sterile plastic bag and, at this point, Transport in dry ice or store at -80 ° C. Can be.(B) Extraction method Extraction method for precipitated cells 1.1 × 10⁶20 μl of CHAPS lysis buffer was added to the following cells. Cell count If not known, an equivalent volume of lysis buffer was added to the cell volume contained. 2. The extract was obtained according to the standard CHAPS extraction method described in Example 1. To extract cells collected on the filter: 1. The filter was cut into small pieces (less than 2 square mm). 2. This filter piece was added to CHAPS lysis buffer (1 x 10⁶20 μl CH per cell APS lysis buffer) and reconstitute the volume of the lysis buffer Was equal to or greater than the encapsulated amount of 3. The extract was obtained according to the standard CHAPS extraction method described in Example 1.(C) TRAP analysis of urine-derived extracts Extracts (2-5 μl) were subjected to 30-35 PCR as described in Example 2. Used for standard TRAP assay by cycle. Sensitivity is one or more radiolabeled It was sensitized by the addition of dNTP and the end-labeled primer. Telomere The presence of Ze activity was associated with the presence of cancer cells in the urine sample and the diagnosis of urogenital cancer. As mentioned above, this method can be used on any bodily fluid or fine needle aspirate. And therefore correlate the presence of telomerase activity with the presence of cancer cells in the fine needle aspirate. Specific cancers, such as lung cancer when sputum or mucus is the test fluid, and Breast cancer diagnosis when examining fine needle aspirates or other tissues of the breast (eg, prostate) I can make a decision.Example 13 TRAP Assay reagents and kits In this example, for the convenience of the practitioner when performing a TRAP assay, Various reagents and kits were provided. In Part A, the CHAPS dissolution buffer I wrote about it. Part B describes the TRAP internal control. Par In case C, the description of a set of various kits is described. Depending on the intended use, It will be appreciated that various modifications of the drugs and kits are possible.(A) CHAPS Lysis buffer A preferred CHAPS lysis buffer has the following composition: 10 mM Tris-Cl, pH 7.5; 1mM MgCl_Two1 mM EGTA; 0.1 mM benzamidine; 5 mM β-mercaptoethanol 0.5% CHAPS; 10% glycerol. Concentrate KCl in this CHAPS lysis buffer. When 1 mM is added and the concentration of CHAPS surfactant is increased to 3%, telomere The effect of the extract is enhanced by a factor of 2 to 5 times. Therefore, it is used in TRAP assays The modified CHAPS lysis buffer is 10 mM Tris-Cl, pH 7.5; 1 mM MgCl_Two; 1mM E GTA; 0.1 mM 4- (2-aminoethyl) -benzenesulfoni Fluoride (AEBSF) or benzamidine; 5 mM β-mercaptoethanol; 0.5 -3% CHAPS; and 1 mM KCl.(B) TRAP Internal control (TSNT) This internal control TSNT has the sequence 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGATAT ' SEQ ID NO: 5), which is a TS telomerase substrate primer, and the sequence 5'-ATCGCTT Amplified by the return primer NT having CTCGGCCTTTT-3 '(SEQ ID NO: 6) You. This NT is not a substrate for telomerase. This control is a TRAP assay kit And optionally in 10x TRAP buffer (concentration 0.002amol / μl or less) ) Or contained in the primer mixture (0.01 amol / μl) to produce a 36 bp TRAP product. I will. The primer pairs and internal controls described above are for illustration only. It can be exchanged for any primer and a complementary control.(C) TRAP Complete kit A variety of kits and components can be used depending on the intended use of the kit and the specific needs of the user. Accordingly, it can be prepared according to the present invention. Specifics for performing a TRAP assay A typical kit is provided as follows. Such kits are readily available Prepared from materials and reagents and easily modified as will be apparent to those skilled in the art. it can. In its simplest form, the kit includes a telomerase substrate with or without instructions. Including. In yet another embodiment, the kit comprises a telomerase substrate and a return plate. Including limers. In another embodiment, the kit comprises a telomerase substrate, a litter Primers and one or more buffers. This buffer, for example, Cell lysis buffer, end labeling buffer, or TRAP reaction buffer it can. The TRAP reaction buffer optionally contains a control reagent, such as TSNT or TSR8. Can contain such control oligonucleotides However, such control reagents are provided separately in the kit. This kit is updated Cell extract or sediment, negative cell extract or sediment, reaction vessel, water, Otides, labeling reagents or enzymes. Positive cell pellets, 293 cells, Hela cells, or Either one of the other telomerase positive cell pellets or a different telomerase activity It can be a panel of multiple cell types. This kit can be used with instructions or Can be provided without accompanying. Preferably, the instructions are for the test described in Example 4. It describes how to use the drug. A preferred kit contains the following reagents: 1. CHAPS lysis buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7.5; 1 mM MgCl_Two; 1mM EGTA; 0.1m M benzamidine; 5 mM β-mercaptoethanol; 0.5% CHAPS; 10% glycero ) 2. 10 x TRAP reaction buffer (200 mM Tris-Cl, pH 8.3; 15 mM MgCl_Two; 630mM KCl; 0.5% Tween20; 10mM EGTA; 1mg / ml BSA) 3. 50 × dNTP mixture (2.5 mM dATP, 2.5 mM dGTP, 2.5 mM dCTP, and 2.5 mM dTTP) 4. TS primer (0.1 μg / μl) 5. Water (PCR grade; free of protease, DNase and RNase-) 6. Positive control cell pellets (106 cells) or multiple cells with different telomerase activities Cell type panel. One skilled in the art can vary the concentration of a particular reagent without adverse effects, Furthermore, variations in storage solutions may or may not reflect variations in reagent concentrations during use. It will be clear what can be done. A particularly preferred kit set is a TRAP primer mixture (e.g., ACX 0.1 μg / μl NT 0.1 μg / μl; TSNT 0.01 amol / μl) and optionally a quantitative standard (eg TSR8; 0.1 a mol / μl). In another embodiment, the kit comprises CHAPS lysis buffer, TS 10 × TRAP reaction buffer containing NT (0.002 amol / μl), 50 × dNTP mixture, TS Immer (1 μg / μl), water (PCR grade; protease, DNase and RNase-free) , Positive control cell pellet (10⁶Cells) or multiple cells with different telomerase activities Mold panel, TRAP reaction tube (sealed with 0.1 μg ACT wax), Taq DNA polymer Rase (5 U / μl), optionally 10 × end labeling buffer (100 mM Tris-OAc; 100 mM MgO Ac; 500 mM KOAc), polynucleotide kinase (1 U / μl), and dye to be loaded on the gel including. Alternatively, the TRAP reaction tube contains an ACX primer (50 × concentration, 0.1 μg / μl).Example 14 Detection of telomerase activity with a branched DNA (bDNA) probe This example is for detecting telomerase activity in a microplate format. Illustrates a bDNA probe. The bDNA probe in the method of the present invention is The bDNA probe is not limited to such a format, It can be used in various ways, such as in situ detection of ze extension products. Real For the convenience of the practitioner, bDNA is available from Chiron Corp., CA. From Oligonucleotide Otide is available from Synthetic Genetics Corp., CA. Note that it is available from. is there Alternatively, nucleic acids can be prepared using conventional conjugation chemistry techniques such as amide or ester bonds. And can bind to a solid surface. In some embodiments, the multi-web plate has a telomere attached to the plate at the 5 'end. Rase substrate oligonucleotide, TS, (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 '; SEQ ID NO: 3) Is prepared. Cell extracts were prepared as described in Example 1. Telomerase Buffer (100μl; 20mM Tris-Cl pH8.3, 1.5mM MgCl_Two, 63 mM KCl, 0.05% Twe en 20, 1 mM EGT A, 0.1 mg / ml BSA, 50 μM dNTP) and 5 μl CHAPS telomere The lase cell extract is added to the microtiter plate with TS and at 30 ° C. Incubated for minutes to 2 hours. The reaction mixture is then removed from the well And 200 μl of 1 × SSC (8.76 g / 1 NaCI, 4.41 g / l sodium citrate) Washing was performed twice at room temperature using thorium (pH 7). After that, the telomere repeat sequence That is, it contains at least three 5 '-(CCCTAA) -3' repeats, specific to SEQ ID NO: 17) Add 50 μl of 1 × SSC containing 15 mM or less of bDNA probe to the well, and slowly The mixture was incubated at 55 ° C or lower for 30 minutes with shaking. Next, this bDNA probe The mixture was removed from the wells and the wells were removed using 200 μl of 0.1 × SSC. Washed twice at ° C. A second probe specific to the branched arm of the bDNA (eg FITC 50 μl of 1 × SSC containing 50 pmol or less of labeled 18-mer oligonucleotide) (U.S. Pat.No. 5,124,246, Urdea, 1994) and shake slowly. Meanwhile, the mixture was incubated at 55 ° C. or lower for 30 minutes. Remove this solution from the well And the wells are washed twice with 0.1 × SSC at 37 ° C., then 200 μl of 0.1 × SSC Was added. The telomerase product is then used, for example if a fluorescent label is used. Was detected by an appropriate method such as using a fluorescent plate measuring instrument. Another specific format is a telomere for microtiter plates using complementary nucleic acids. Related to the immobilization of the enzyme substrate. Telomerase ba containing 15 pmol of TS primer Buffer (100 μl; 20 mM Tris-Cl pH8.3, 1.5 mM MgCl_Two, 63 mM KCl, 0.05% Twee n 20,1 mM EGTA, 0.1 mg / ml BSA, 50 μM dNTPs) with 5 μl CHAPS telomerase It was added to a sterile standard microtiter plate along with the cell extract. , Can be 50% of the total reaction volume. ). Place the plate at 30 ° C for 30 minutes. After 2 hours of incubation, the solution was added to its 5 'end with a TS primer (eg, If 5'-AACTCTGCTCGACGGATT; SEQ ID NO: 24 One or more replicates) were bound and transferred to a second microtiter plate. afterwards Incubate the second plate at 55 ° C or lower for 30 minutes with gentle shaking. And then remove the solution from the wells and remove 200 μl of 1 × Washed twice with SSC. Subsequently, 15 of the bDNA probes specific for telomere repeats 50 μl of 1 × SSC containing up to pmol was added to the wells. This plate slowly Incubate for 30 minutes at 55 ° C or lower with shaking, and then Removed from the The wells are then washed twice with 200 μl 1 × SSC at 37 ° C. did. 15pm of a second probe labeled with rhodamine specific for the branched arm of bDNA 50 μl of 1 × SSC containing no more than ol was added to the wells. 55 with gentle shaking Incubate at or below 30 ° C. for 30 minutes, remove the solution, and then remove the wells by 1 × Washed twice with SSC at 37 ° C. After adding 200 μl of 0.1 × SSC, the fluorescence was , Using a fluorescent plate measuring instrument, but easily detected, but other visualization directly Methods can also be used. Various modifications of these formats, such as in complementary TS-linked microtiter plates A telomere that performs the telomerase reaction described above and thus eliminates the transfer step. Immobilization by nucleic acid complementary to telomerase repeat after telase extension reaction, or telomerase Immobilization before a telomerase reaction using a nucleic acid complementary to a zeosubstrate is possible. Change A wide variety of labels other than fluorescent labels can be used, and such The signal from the label is transcribed with a second bDNA probe specific to the first bDNA branch. Enhancement by using bDNA specific to the lomerase extension product as a probe In this case, the second bDNA probe is labeled (with another probe). Directly or indirectly). All publications and patent specifications mentioned in this specification are trademarks or individual publications. The patent application is specifically and individually incorporated by reference To the same extent as has been shown to be incorporated herein by reference. Enough here The invention as described does not depart from the spirit or scope of the appended claims. It will be apparent to those skilled in the art that many changes and modifications can be made.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０８／６３２，６６２ (32)優先日 1996年４月15日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ウェインリッチ，スコット，エル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94123, サンフランシスコガウ＃５ 2929────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (31) Priority claim number 08 / 632,662 (32) Priority date April 15, 1996 (33) Priority country United States (US) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), AU, CA, JP, U S (72) Inventors Weinrich, Scott, El. United States of America, California 94123, San Francisco Gau # 5 2929

Claims

[Claims] 1. A method for determining whether a cell specimen contains telomerase activity. What follows: (A) collecting a cell specimen or cell extract; (B) Telomerase is extended telomerase substrate by addition of telomere repeat sequence In a reaction mixture containing the telomerase substrate under conditions that can catalyze Incubating said cell preparation or said cell extract; (C) replicating the extended telomerase substrate; and (D) determining the presence of telomerase activity in the cell sample Quality and the absence of telomerase activity in the cell preparation. A method comprising correlating with the absence of a lomerase substrate. 2. The telomerase substrate lacks the telomere repeat sequence and the replication step The reaction mixture contains a template-dependent DNA polymerase and an extended telomerase substrate. When present in the reaction mixture, it is hybridized with the extended telomerase substrate. Soybean, extended by the DNA polymerase and extended telomerase substrate And a primer that produces a complementary copy of Method. 3. The replication step further includes the following: (1) heating the reaction mixture to denature the double-stranded DNA molecule; and (2) When an extended telomerase substrate is present, the complementary nucleic acid hybridizes And cool the reaction mixture to a temperature at which the primers can be extended. 3. The method of claim 2, comprising the step of: 4. The heating and cooling steps are repeated at least 5 times, and the primer 4. The method of claim 3, wherein said amount is present during said rejecting step in an amount sufficient to form an extended primer. 5. The DNA polymerase is a thermostable template-dependent DNA polymerase. Wherein the primer is the primer of the nucleotide by the DNA polymerase 4. The method of claim 3, wherein the method is extended by addition to the key. 6. The telomerase substrate lacking a telomere repeat sequence is 5'-AATCCGT The method according to claim 2, which is CGAGCAGAGTT-3 '(SEQ ID NO: 3). 7. The reaction mixture contains a labeled telomerase substrate or a labeled primer. 3. The method of claim 2, wherein 8. The primer includes a fluorescent label and a quenching dye, and further includes the primer 8. The method of claim 7, comprising a non-complementary sequence at the 3 'end of the sequence. 9. The primer includes a non-telomere repeat sequence at the 5 'end of the primer 3. The method of claim 2, wherein the method comprises: 10. The primer is 5'-CCCTTACCCCTTACCTCTACCC TAA-3 '(SEQ ID NO: 1), 5' GCGCGGCTAACCCTAACCC TAACC-3 '(SEQ ID NO: 2), or 5'-GCGCGGCTTACCCT 3. TACCCTTACCCTAACC-3 '(SEQ ID NO: 4). the method of. 11. Further, the reaction mixture is hybridized with the extended telomerase substrate. And the above oligonucleotide is fluorescently labeled and quenched. 3. The method of claim 2, comprising including a charge. 12. The above-mentioned replication step further reacts with the control oligonucleotide 3. The method according to claim 2, comprising adding a mixture. 13. Radiolabeled, fluorescent, phosphorescent, Group consisting of chromogen, enzyme, enzyme substrate, biotin, avidin and digoxigenin 3. The method of claim 2, wherein the method is detected using a label selected from the group consisting of: 14． The presence of an extended telomerase substrate is detected using a branched DNA probe. 3. The method of claim 2, wherein 15. The replication step comprises adding a thermostable template-dependent DNA ligase to the reaction mixture; If an extended telomerase substrate is present in the cell preparation, Oligonucleotide ligomer that hybridizes with a merase substrate, and the above extension Hybridized with the telomerase substrate, and A primer extended by ligation of the nucleotide ligomer with the above primer. The method of claim 1 comprising adding. 16. The cell extract is in a buffer containing a non-ionic or zwitterionic detergent. The method according to claim 1, which is prepared by lysing cells in the cell preparation. 17． The method according to claim 1, wherein the cell specimen is a human cell specimen. 18. A method for determining whether a cell specimen contains telomerase activity And the following: (A) telomerase is converted to the telomerase substrate by adding a telomere repeat sequence Cell standards in a reaction mixture containing a telomerase substrate capable of catalyzing elongation and a buffer Incubating the book or cell extract; (B) a promoter that optionally binds to the telomerase substrate in the reaction mixture Adding a template-dependent RNA polymerase that recognizes the sequence; (C) when an extended telomerase substrate is present in the above reaction mixture In some cases, RNA polymerase produces an RNA copy of the extended telomerase substrate. Let me; (D) determining the presence of telomerase activity in the cell sample by using the extended telomerase substrate And the absence of telomerase activity in the cell preparation. Correlating with the absence of said RNA copy. 19. A template-dependent DNA polymerase, as well as a specific Is sufficiently complementary to the telomere repeat to hybridize to It is extended by adding nucleotides to the above primer by polymerase 19. The method of claim 18, further comprising adding a primer. 20. Claim: The primer comprises at least one telomere repeat sequence. 19. The method according to 19. 21. 19. The method of claim 18, wherein said RNA polymerase recognizes a single-stranded nucleic acid substrate. Method. 22. 22. The method according to claim 21, wherein the RNA polymerase is N4 RNA polymerase. The method described. 23. The RNA polymerase is SP6 RNA polymerase, T7 RNA polymerase. 20. The method of claim 18, wherein the member is selected from the group consisting of limase and T3 RNA polymerase. The described method. 24. The cell extract is in a buffer containing a non-ionic or zwitterionic detergent. 19. The method according to claim 18, wherein the method is prepared by lysing cells in the cell preparation. 25. A method for determining whether a cell specimen contains telomerase activity And the following: (A) a telomerase substrate lacking a telomere repeat sequence and telomerase Extension of Telomerase Substrate by Addition of Mare Repeat Sequence Incubate the cell preparation or cell extract in a reaction mixture containing a catalysable buffer. Bate; (B) immobilizing the telomerase substrate; (C) if an extended telomerase substrate is present in the reaction mixture, Under conditions such that the lobes hybridize with the extended telomerase substrate, Complementary to telomerase substrate extended sufficiently to specifically hybridize with A probe containing to the reaction mixture; and (D) the presence of telomerase activity in the cell sample, The presence of the hybridized probe and the telomere in the cell preparation The absence of protease activity was correlated with the absence of hybridization of the probe. Let A method consisting of steps. 26. The cell extract is in a buffer containing a non-ionic or zwitterionic detergent. 26. The method of claim 25, wherein the method is prepared by lysing cells in the cell preparation. 27. 26. The method of claim 25, wherein said probe is a branched DNA probe. 28. 26. The method of claim 25, wherein said probe is a labeled probe. 29. 3. The method according to claim 2, wherein the hybridization probe is detected using a nucleic acid dye. 5. The method according to 5. 30. 26. The probe of claim 25, wherein the probe comprises a sequence complementary to a telomere repeat. The described method. 31. The probe is a biotinylated probe, and the probe is tyramide. 26. The method of claim 25, wherein the method is detected by signal amplification. 32. Wherein said telomerase substrate is incubated with said cell extract; 26. The method of claim 25, wherein the method is fixed after the batting step. 33. The telomerase substrate is used during the incubation step. 33. The method of claim 32, wherein the method is immobilized by telomere repeats added to the substrate. 34. 33. The probe of claim 32, wherein said probe is complementary to said telomere repeat. Method. 35. below: (A) a telomerase substrate; (B) a primer containing a sequence complementary to the telomere sequence; and (C) Instruction manual A kit for detecting telomerase activity, comprising: 36. 4. The kit of claim 3, wherein said kit further comprises a cell lysis buffer and an assay buffer. The kit according to 5. 37. The kit further includes a control oligonucleotide and a cell pellet. 36. The kit of claim 35, wherein 38. The above kit further comprises a control oligonucleotide and a cell specimen or cell extraction. 36. The kit of claim 35, comprising a product. 39. The primer is 5'-CCCTTACCCCTTACCTCTACCC TAA-3 '(SEQ ID NO: 1), 5'-GCGCGGCTAACCCTAACC CTAACC-3 '(SEQ ID NO: 2), and 5'-GCGCGGCTTACCC Selected from the group consisting of TTACCCTTACCCCTACC-3 '(SEQ ID NO: 4). 36. The kit of claim 35, which is selected. 40. The telomerase substrate is 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT -3 '(SEQ ID NO: 3), and the primer is 5'-GCCGCGCTTA CCCTTACCCCTTACCTACACC-3 '(SEQ ID NO: 4) And the above kit is C HAPS lysis buffer, 10xTRAP reaction buffer, dATP, dGTP, dCTP And dTTP stock solution, 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTA AAAGGCCGAGAAGCGAT-3 '(SEQ ID NO: 5), 5'-TAAC ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3 '(SEQ ID NO: 6), 5'-AAT CCGTCGAGCAGAGTTAGGGGTTAGGGTTTAGGGTAGG GTTAGGGGTTAGGTTAGGGTTTAG-3 '(SEQ ID NO: 19), 36. The method of claim 35, comprising water and a positive control cell pellet. 41. The oligonucleotide is 5'-AATCCGTCGAGCAGAGT TAAAAGGGCCGAGAAGCGAT-3 '(SEQ ID NO: 5), 5'-TA ACATCGCTTCTCGGCCTTTTT-3 '(SEQ ID NO: 6), 5'-A ATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGGTTAGGGTTTAGGGTTA GGGTTAGGGGTTAGGGTTTAGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 19) A) a purified preparation of an oligonucleotide selected from the group consisting of: