JPH11507824A

JPH11507824A - 食作用を阻害する方法

Info

Publication number: JPH11507824A
Application number: JP9502301A
Authority: JP
Inventors: シュライバー、アラン・ディー; パーク、ジョン−グ
Original assignee: ユニバーシティー・オブ・ペンシルバニア
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-07-13
Also published as: EP0831875A1; EP0831875A4; AU6386996A; IL122338A0; CA2223402A1; WO1996040199A1; CA2223402C; AU723595B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般に、免疫複合体とＦｃレセプターとの間の相互作用から生じる疾患を治療する方法に関する。特に、本発明は、食作用を阻害することによって、循環系からの抗体被覆細胞のクリアランスを調節する方法と、免疫複合体と組織Ｆｃレセプターとの相互作用を調節する方法に関する。更に、本発明は、抗体-抗原／レセプターの相互作用から生じるＦｃレセプターの活性化に媒介された、免疫学的プロセスの活性化を調節する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】食作用を阻害する方法この出願は、1995年６月７日に出願された出願番号08/483,530の一部継続出願であり、この親出願は1994年９月30日に出願された出願番号08/316,425の一部継続出願であり、これは更に、1993年９月30日に出願された出願番号08/129,381の一部継続出願である。これら出願の内容は、ここでの引用により本明細書中の一部とされる。〔技術分野〕本発明は、一般に、免疫複合体とFcレセプター間の相互作用から生じる疾病の治療法に関する。特に、本発明は、食作用阻害により抗体で被覆された細胞(ant ibody-coated cells)、ウィルス、もしくは可溶性抗体のクリアランスを調節する方法、及び、免疫複合体と細胞または組織のFcレセプターの相互作用を調節する方法に関する。本発明は、また、抗原-抗体複合体とFcレセプターとの反応が重要な開始段階であるような免疫反応の調節に関する。〔発明の背景〕ある種の免疫学的な疾患は、単球もしくはマクロファージFc(IgG)レセプターの発現が乱されることを特徴とする。Fcレセプター数の増加は、ガンマーインターフェロンのようなFcレセプターメディエーターのレベルの上昇、感染または細菌性産物の分泌から生じ得る。IgGを結合できるFcレセプター数の減少は、機能的レセプター(functional receptors)の実数の減少だけでなく、Fcレセプターが免疫複合体によって飽和された結果として生じ得る。全身性紅斑性狼瘡のようなある種の自己免疫性疾病では、循環している免疫複合体のレベルが高くなり、そのためレセプターの飽和が生じ得る。自己免疫性疾病では、自己自身と外来侵入者を区別するための身体機構が正常に機能しない。典型的には、身体は自己のある部分に対する抗体を作り始める；これらの抗体は免疫システムを誘発し、該免疫システムは、この異常な抗体によって認識された組織を破壊する。自己免疫性疾病は、攻撃の標的(focal points)を変更してきた。自己免疫性溶血性貧血は、個々の疾患がそれら自身の赤血球膜抗原の１つもしくはそれ以上に対する抗体を生成するような疾患のグループの代表例である。異常な抗体によって赤血球が被覆されると、次にその赤血球が脾臓のマクロファージにより循環系からクリアランス（clearance）され、引き続いて脾臓内で破壊される。このクラスの典型的な疾病としては、免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫斑病及び自己免疫性好中球減少症があげられる。別の種類の自己免疫性疾病には、全身性紅斑性狼瘡やリウマチ様関節炎により代表されるタイプのものがある。これらの疾病では、関節、腱、腎臓、肺、心臓そして他の器官に慢性炎症を生じる。例えば、リウマチ様関節炎では、関節軟骨の関節の滑液への分解が、疾病の後期の段階で生じる。しかしながら、全身性紅斑性狼瘡では、軟骨もしくは骨の分解は通常見られない。全身性紅斑性狼瘡やリウマチ様関節炎は、しばしば別のタイプの自己免疫性疾病と関連して起こる。全身性紅斑性狼瘡およびリウマチ様関節炎では、組織破壊は循環中のIgG含有複合体の有無に関連している。Fcレセプターを有する細胞によって組織内でこれらの複合体が識別されると、マクロファージ及びおそらくこれらの組織内の多形核白血球のような他の細胞による組織破壊が開始されるか、もしくは増加すると信じられている。これらのFcレセプターによる反応は、ある一定範囲の免疫関連反応を引き起こし、Fcレセプターを有する細胞の近接した体組織を傷つける可能性がある。 IgG含有の免疫複合体とマクロファージのFcレセプターとの相互作用を伴う疾病は、副腎皮質ホルモンもしくは免疫抑制剤で治療される事が多い。これらの治療では多様かつ重篤な副作用がおこりうる。本発明は、単独で用いるか、もしくは従来の薬物治療との組み合わせで用いることができる代替の治療方法を提供する。〔発明の概要〕本発明の一般的な目的は、例えば、Fcレセプターを担時する細胞の食作用能力を阻害することにより、抗体で被覆された細胞もしくは免疫複合体のクリアランスを調節する方法を提供することである。本発明の具体的な目的は、哺乳動物由来の免疫複合体のクリアランスを調節する方法を提供することである。加えて、本発明の具体的な目的は、膜結合Fcレセプターへの免疫複合体の結合を阻害する(及び／またはそのような複合体の取り込みを阻害する)ことにより、好ましくない組織損傷の続発症を阻害する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、上記の方法で用いられる適切な構築物および化合物を提供することである。ひとつの態様では、本発明は、免疫複合体(例えばIgG含有免疫複合体)の食作用、および／または、免疫複合体と相互作用する細胞による細胞内生化学的活性産物の分泌を防止する方法に関する。この方法の例として、免疫複合体(例えばI gG含有免疫複合体)と接触している哺乳動物の食細胞内へ、該細胞膜上に存在するFcレセプターを活性化する細胞に内在的なキナーゼの阻害剤を導入することをからなる方法があげられる。もうひとつの態様では、本発明は、哺乳動物由来の免疫複合体(例えばIgG含有免疫複合体)のクリアランスを防止する方法に関する。この方法は、免疫複合体と接触している哺乳動物の造血細胞（例えば、食作用細胞）内へ、細胞膜上のFc レセプターの発現を特異的に阻害する分子を導入することを含む。さらに別の態様では、本発明は、哺乳動物に存在する免疫複合体(例えばIgG含有免疫複合体)が、膜結合性のFcレセプターに結合するのを阻害する方法に関する。この方法は、その哺乳動物中に、免疫複合体への結合について膜結合性Fcレセプターと競合する可溶性Fcレセプターを導入することからなる。この導入は、膜結合性Fcレセプターへの免疫複合体の結合が阻害されるような条件下でなされる。また、さらに別の態様では、本発明は、Fcレセプターを有する哺乳動物細胞の食作用能力を阻害する方法に関する。この方法は、５´末端から３´末端への転写方向で、 i）細胞内で機能的なプロモーター、 ii）２本鎖DNAのセグメント、その転写された一本鎖がFcレセプターをコードする内在的なmRNAに相補的な配列を含むもの、および、 iii）細胞内で機能的な終止配列（ポリアデニレーション信号）を具備する構築物を細胞へ導入することを含む。この構築物は、相補鎖が転写されかつ内在的なmRNAに結合することによりFcレセプターの発現を減少させ、細胞の食作用能力を阻害するような条件下で導入される。本発明のさらなる目的または利点は、以下の説明から明らかになるであろう。この開示は、Fcγレセプターの３つのクラス(Fc γ RI，Fc γ RIIおよびFc γ RIII)の単離およびクローニングに関する技術で得られる教示を考慮して読むことが好ましいであろう。例えば、Allen and Seed，Science 243:378(1989);Hibb s et al，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:2240(1988); J．Exp．Med．166:1668 (1987);van de Winkle et al，FASEB J.，5:A964(1991); Brooks et al，J.，Ex p.Med.170:369(1989); Stuart et al，EMBO J．8:3657(1989); Qui et al，Scie nce 248:732(1990); Simmons and Seed，Nature 333:568(1988)を参照のこと；S chreiber et al，Clin．Immunol．Immunopath．62:S66(1992)も参照のこと。〔図面の簡単な説明〕図１は、Fc γ RIIIA γ野生型および突然変異体の概略図を示す。シグナル配列(S)、外来ペプチド(E)，トランスメンブレンドメイン(TM)、及び細胞質ドメイン(CY)をγ鎖の概略図の上に記す。拡大された領域は、保存されたモチーフを含むγ鎖のヌクレオチド配列の領域を示す。この図には、ネズミγ鎖が示されている。γ鎖及びζ鎖遺伝子の遺伝子ファミリーの保存されているアミノ酸配列は、下線で示されている。ヌクレオチド235-237のTACコドンによりコードされている N末端に近接したチロシン(Ra et al，J．Biol．Chem．264:15323(1989))は、TTC によりコードされたフェニルアラニンで保存的に置換された(クローン M1A及びクローンM1B)。同様に、TAT(168-270)によりコードされているC末端に近接したチロシンは、TTTによりコードされたフェニルアラニンで置換された（クローンM 2A及びクローンM2B)。チロシン二重置換変異体については、N末端側及びC末端側の両方のチロシンがフェニルアラニンで置換された(クローン DMA及びクローンD MB)。変異体の実線は、野生型γ遺伝子の配列と同一の配列を示す。図2Aおよび図2Bは、トランスフェクトされたCOS-1細胞によりIgG感受性化されたRBCs(EA)の結合および食作用を示す。トランスフェクションされたCOS-1細胞によるEAの結合(左図;A，C，E及びG)。トランスフェクションされたCOS-1細胞によるEAの食作用(右図;B，D，F，及びH)。(A)及び(B):Fc γ RIIIA α及び野生型 γをトランスフェクトされたCOS-1細胞の結合及び食作用。野生型γを用いて示された３つの貧食されたBCs(phagocytosed RBCs)を、図(B)，(C)，及び(D)中で矢印により示した：α及びγを含有するトランスフェクタント(transfectants)( MIA)。(E)及び(F):α及びγを含有するトランスフェクタント(M2A)。(G)び(H)： α及びγを含有するトランスフェクタント(DMA)。EAの食作用はD,F及びHでは見られない。写真は1000倍の拡大像を示す。図３は、生体外（in vitro）でのキナーゼアッセイによる野生型および変異体 γ鎖のチロシンのリン酸化を示す。このγ鎖を、COS-1トランスフェクタントの溶解物由来の抗-γ抗血清を用いて免疫沈降させた。生体外でリン酸化された試料を、12.5%還元化(reducing)SDS-PAGEゲルで泳動させた。このゲルは、フォスフォセリンおよびスレオニンを除去するために、1NのKOHで処理され、乾燥され、４日後にオートラジオグラムが検査された。レーン１：Fc γ RIIIA-αとγ c DNAを挿入していないpSVL ベクターを用いた擬似トランスフェクタント(Shamtra nsfectants)。レーン２:Fc γ RIIIA α＋野生型ヒトγ。レーン３:Fc γ RIIIA α+野生型マウスγ。レーン４:Fc γ RIIIA α+M1A。レーン５：Fc γ RIIIA α ＋M2A。レーン６:Fc γ RIIIA α+DMA。リン酸化されたγ鎖を矢印により示す( 右下側に示す)。星印を付けた矢印（右上部に示す）は、約4OKDaの特異的なチロシンリンタンパク質のバンドを示している。図4A-4Dは、Fc γ RIIIA刺激に引き続いて起こるCa²⁺の可動化(mobilization) を示す。それぞれの細胞内での[Ca ²⁺]iの計測は、Fc γ RIIIAの架橋(crossli nking)の間に行われた。抗Fc γ RIIImAb、エピネフリン(ポジティブコントロール)及びカルシウムイオノフォアが添加された時点は、それぞれの図中に矢印により示されている。像は340nmもしくは380nm励起のいずれかで得られた(発光(em isson)=510nm)。340/380比は、Fura-2を用いた補正に基き、[Ca²⁺]iに転換された。M1A、M2A及びDMAトランスフェクタントの反応は、WTトランスフェクタントと比較して大きく低下した。図５は、ステムループアンチセンスＯＤＮについてのターゲット配列(ターゲットIII)の選択を示す。全Syk mRNA配列は、二次構造のない配列を見出すために、３回、ＲＮＡ二次構造予報プログラム（ＲＮＡ secondary structure predict ion program）によってスキャンされた。個々のスキャニングは、９９ヌクレオチドフレーム（フレームＡ，Ｂ，およびＣと呼称する）中で３３塩基離して連続して行なわれた。三回のスタガード(staggered)スキャニングでもっともオープンな配列が標的配列として選ばれた。点線の施してある上部の長方形は、ヒトSy k mRNAのｃＤＮＡ配列を示す(Law et al，J.Biol．Chem．269;12310(1994))。ステムループSykアンチセンスＯＤＮについて３つの標的部位が、Syk ｍＲＮＡ配列線の上方に、３本の短い実線（I，II，III）として示される。標的部位I，II ，およびIIIは、ヌクレオチド番号１５９から１７３（転写開始コドンを囲む領域）、ヌクレオチド番号４５１から４６３、および８０２から８１６に夫々対応する。標的IIIがこの図では例として示される。ターゲットI，II，も同じように選択された。標的III配列を含むSyk mRNA領域にある推定される二次構造が、夫々９９ヌクレオチドからなる三つのスタッガード(staggered)フレーム、フレームＡ，Ｂ，およびＣに示される。三つのスタッガード(staggered)フレーム中、円になったヌクレオチドは、最小の二次構造を持つ標的IIIの共通配列である。図６は、ステムループSykアンチセンスＯＤＮの二次構造を示す。該７ヌクレオチド長のステムドメインが、その５´および３´末端に、GおよびＣのみからなるヌクレオチドを含む相補的終止配列によって形成される。ループドメインは、３つのアンチセンス配列；四角で示される５´-CTGTCAGCCATGCCG-３´配列は、Syk mRNA（図５参照）中の標的Iに対して相補的であり、また三角形で示される５´-GCTTCTTGAGGAG-３´配列は、標的IIと相補的であり、また、丸印を施された５´-TGTCTTGTCTTTGTC-３´配列は、図５中でも丸印を施されて示された標的IIITと相補的である。該三つの異なるアンチセンス配列は、標的I、III、II の夫々について５´から３´の順に、縦列に連結されている。●Ｓは、ホスホロチオレート(phosphorothiorate)の修飾を示し、５´末端はホスホロチオレートの修飾が一つ及び３´末端は二つ担時する。図７は、単核球における食作用に対するSykアンチセンスODNsの阻害を示す。単核球（１ x １０⁵細胞／ｍｌ）は、リポフェクタミン（LIPOFECTAMINE）４μg ／ｍｌとODNs(線形コントロールまたは線形SykアンチセンスODNsの夫々は1.0μ Ｍ、ステムループコントロールまたはステムループSykアンチセンスODNは夫々2. 0μＭ)の複合体を２日間インキュベートし、IgG感受性化した赤血球（ＥＡ）の食作用を調べた。食作用指標（ＰＩ）＝100細胞につき取り込まれたＲＢＣｓの数。各バーは三つの個別実験の平均±ＳＥＭを示す。図８：単核球におけるSykアンチセンスODNsのSyk mRNAへの影響全RNAは、４μg／ｍｌのリポフェクタミン（LIPOFECTAMINE）およびODNs（線形コントロールまたは線形SykアンチセンスODNsの夫々は1.0μＭ、ステムループコントロールまたはステムループSykアンチセンスODNは夫々2.0μＭ）の複合体２日間処理した単核球（１ x １０⁵細胞／ｍｌ）から単離され、cDNAが任意の６ヌクレオチド・プライマーによって全RNAから合成された。PCRをSyk DNAをテンプレートとして、二つのSkyプライマー(Syk−HおよびSyk−M)によって実施された。PCR産物は、サザンハイブリデイゼーションによって分析され、ハイブリダイズされたバンドは、化学蛍光検査試薬によって視覚化された。図９：ラットおよびヒトＳｙｋアンチセンスの比較図１０：RBL−2H3細胞におけるSykキナーゼ発現のステムループ・ラットSykアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ODN）による阻害。 A.ラットSykプラーマーを使用したRT−PCRによるSyk発現の調査。レーン１：ＳｙｋアンチセンスODNで処理された細胞、レーン２：SykセンスODNで処理された細胞、レーン３：試薬コントロール、レーン４：無処理、レーン５：分子量マーカー。 B.ラットβアクチン・プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによるβアクチン発現の調査。レーン１：ＳｙｋアンチセンスODNで処理された細胞、レーン２：SykセンスODNで処理された細胞、レーン３：試薬コントロール、レーン４：無処理、レーン５：分子量マーカー。→＝βアクチン。 C．ラットＳｙｋアンチセンスＯＤＮで処理されたRBL−2H3細胞におけるγ鎖プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによるFc_εＲＩγ鎖発現の調査。レーン１：ＳｙｋアンチセンスODNで処理された細胞、レーン２：SykセンスODNで処理された細胞、レーン３：試薬コントロール、レーン４：無処理、レーン５：分子量マーカー。→＝γ鎖。図１１：ヒトSyk/ZAP−70キメラの構造〔発明の詳細な説明〕本発明は、少なくとも部分的には、抗体で被覆された細胞を哺乳動物から(例えば、哺乳動物の循環系からの)クリアランスを調節する方法に関する。従って本発明は、Fcレセプター(例えばマクロファージの表層に存在するもの)と免疫複合体(例えばIgG含有免疫複合体)との相互作用により特徴づけられる自己免疫性疾病といった免疫学的な疾患、および喘息のような免疫媒介性疾病を治療する方法を提供する。本発明の方法は、結果として、IgG抗体で被覆された細胞の食作用を減少させるように、Fcレセプターの発現及びまたは機能を変化させることになる（紅斑性狼瘡やリウマチ様関節炎のような免疫複合体疾病(immune complex diseases)罹患者が、肝臓や脾臓内に循環している免疫複合体のクリアランスが増強され、それにより、腎臓のような組織中および関節内での免疫複合体の沈着を防ぐように設計された手順により恩恵をうけ得ることは、当業者により評価されるだろう。この免疫複合体のクリアランスの増強は、本願と同時に出願された「食作用を刺激する方法」と題する同一人の所有になる出願に記載のレセプターをコードする配列を導入するための手順を用いて、肝臓および脾臓のマクロファージを刺激することによりもたらされうる。その別途出願の開示内容の全ては、引用によりこの明細書中に取り込まれる。より具体的には、本発明は、食細胞の信号伝達に際して必要とされるFcレセプター構成成分および会合された分子のリン酸化を阻害し、免疫複合体(例えばIgG 含有免疫複合体)の結合用の膜結合性レセプターと競合する可溶性Fcレセプターを循環内に導入することにより、Fcレセプターの機能を阻害する方法を提供する。また本発明は、レセプター生成細胞内にFcレセプターアンチセンス構築物を導入することにより、Fcレセプターの発現を阻害する方法を提供する。また、本発明は、例えばリボザイムを用いてFcレセプターRNAを分解する方法を提供する。Fc レセプター媒介性信号伝達の阻害：一つの態様においては、本発明は、Fcレセプターの細胞質ドメイン内のコア配列(core sequence)のリン酸化を阻害することにより、免疫複合体(例えばIgGで被覆された細胞)の取り込み(例えば食作用)を防止する方法に関する。Fc γ RII Aの細胞質残基及びFc γ RIIIAのγサブユニットのリン酸化は、食作用に関係した信号伝達事象には不可欠であることがわかっている(Indik et al，Trans．Ass ．Amer．Phys．105:214(1992);Park et al，Clin．Res．41:324A(1993);Darby e t al，Blood 79:352A(1992);Mitchell et al，Clin．Res．41:189A(1993);Huang et al，J．Biol．Chem．267:5467(1992);Hunter et al，Clin．Res．41:244A(1 993);Park et al，J.Clin．Invest．92:2073(1993))。より具体的には、Fc γ R IIAの細胞質ドメインに存在するモチーフE-X8-D-X2-Y-X2-L-X12-Y-X2-L及びFcRI IIAのγ及びζ鎖の細胞質ドメインに存在するモチーフ D/E-X2，7-D/E-Y-X2-L-X 7-Y-X2-L内に存在するチロシン残基のリン酸化は、食作用の信号伝達に必要である（文字Xの後の数字は、その位置でのアミノ酸の数を示す；Xはいかなるアミノ酸でもよいが、Y-X2-L内のX2はFc γ RIIAの細胞質ドメインあるいはFc γ RIII のγ鎖のY-X2-L配列内に存在するアミノ酸であることが好ましい）。これらのコア配列(モチーフ)の２番目のY-X2-Lが、食作用に特に重要であるようだ。本発明は、リン酸化に関与するキナーゼの阻害剤を標的細胞中に導入することを意図する。具体的な態様では、阻害剤は、少なくともチロシン含有モチーフの機能的な部分と、同一でない場合でも類似の配列を含むペプチド(例えば、先に示した一連のモチーフの下線の部分に注目のこと)であり、そのためキナーゼの拮抗的な阻害剤として作用する。一例として、阻害剤は、細胞外ドメインが欠けたFcレセプター、もしくは細胞外ドメイン及びトランスメンブレンドメインが欠けたFcレセプターの形態をとることができる。代わりに、阻害剤は、上記のモチーフ、あるいはその機能的な部分と構造的に異なっても良く、それらは、拮抗的もしくは非拮抗的にリン酸化を阻害しても良い（例えば、活性ペプチドの結合部位と同様な構造形態を有する擬似活性ペプチドを用いることができる）。マスト（肥満）細胞、またはFc_εレセプターを持つ細胞では、メディエーター(例えば、ヒスタミン、サイトカインまたはロイコトリエン)の分泌に必要なFc_εRIのγ鎖の配列は、この方策を用いて阻害され得る。本発明のペプチド阻害剤もしくはその擬似物（mimetic）は、例えばリポソームを用いて標的細胞中に直接導入され得る(Science 26:1877(1993)に記載された、細胞の脂質膜を横切ることが可能なように修飾されたペプチドを投与する方法も参照のこと)。または、ペプチド阻害剤をコードするDNA配列を、このペプチドが細胞内で生成されるように、遺伝子療法の手順を用いて導入することができる。この阻害剤もしくは阻害剤をコードする配列は、マクロファージを含む肺の細胞にエアロゾルの形態で投与され得る。阻害剤もしくは阻害剤をコードする配列は、肺のマクロファージにより貧食される粒子(例えばリポソーム、もしくは、もし阻害剤をコードする配列の場合には例えばリステリア（Listeria）のような非感染性細菌)としてエアロゾル中に存在させることも可能である。食作用の結果、阻害剤もしくは阻害剤をコードする配列は、マクロファージへ導入される。ウィルス性ベクターもまた本発明のペプチド阻害剤をコードする配列を、肺の樹状(pulmonary tree)細胞中へ導入するのに用いることができる。ベクターは、エアロゾルとして導入することもでき、複製不良のヘルペスもしくはアデノウィルスベクターの形態をとることもできる。レトロウィルスベクターも使用することができる（概略としては、バジョッキーら(Bajocchi et al)，Nat．Genet．3:22 9(1993); レマーチャンドら(Lemarchand et al)，Circ．Res.，72:1132(1993); ラムら(Ram et al)，Cancer Res.53:83(1993);クリスタル(Crystal)，Am．J．Me d．92:445(1992); ヨシムラら(Yoshimura et al)，Nucl．Acids Res．20:3233(1 992);モレッキーら(Morecki et al)，Cancer Immunol．Immunother．32:342(199 1); カルバーら(Culver et al)，Hum，Gene Ther．1:399(1990); カルバーら(Cu lver et al)，Transplant．proc.，23:170(1991)を参照のこと）。血液単核球は、本発明のペプチド阻害剤をコードする配列を用いて生体外(ex vivo)で形質転換され、その後、阻害剤が生体内で生成されるように患者に再導入されてもよい。リン酸化阻害のもう一つのアプローチには、Fcレセプターリン酸化部位(例えばFc γ RIIA中及び／またはFc γ RIIIAのγサブユニット中)を特定するRNA配列および酵素活性部位を特定するRNA配列を認識するリボザイムの利用が包含される。リボザイムの導入は、IgGで被覆されたリポソームのような担体を用いて、Fc γレセプターを有する細胞に直接挿入させるように実行される。または、I gEで被覆されたリポソームは、マスト細胞もしくは好塩基細胞または会合したγ サブユニットを持つIgEレセプターFc_εRIを有する他の細胞に向けられる。この方法は、アレルギー性疾患の治療での利用に際し、適切なアプローチであることが当業者に評価されるだろう。IgEレセプターのγサブユニットは、マスト細胞のようなFc_εRIレセプターを有する細胞によって細胞内メディエーターの分泌を誘導するシグナルの伝達に関与する。γ鎖RNAの破壊により、これらの生物活性産物の分泌は阻害されることが予測される。上記のアプローチに従って、上記の通りに投与されたリボザイムは、幾つかの選ばれた配列(例えば、Fc γ RIIAもしくはFc γ RIIIA γ鎖RNAにおいて特異的なRNAスプライシング配列または５´末端の未翻訳配列)に結合し、リボザイムに関わる酵素活性により、食作用の信号伝達に必要なレセプターの機能的な配列を特定するRNAが消化されて除去されこととなる。メディエーター(例えばヒスタミン、サイトカインまたはロイコトリエン)の分泌に必要なFc_εRIのγ鎖の配列を特定するRNA配列は、このストラテジーを用いて除去することができる。この方法の有利な点は、リボザイムの生体内での連続的な生産が、生体外で構築されたパッケージング細胞(例えばPsi2様細胞;ミラーとロスマン(Miller and Rosman)，Biotechnique 7:980，1989および分子生物学における最近の手法(Curr ent protocols in Molecular Biology)，III:9.1 1992(supp．17)を参照のこと) を用いて実行できることである。リボザイムの生産を停止させるように、それらの細胞中には自殺遺伝子を含ませることが可能な点は、当業者に評価されるだろう。レセプターのリン酸化を阻害するためのさらなるアプローチには、SyKをコードしている配列（実施例５参照）を標的とするアンチセンス構築物またはリボザイムの使用が含まれる。SykキナーゼファミリーのZAP-70の遺伝子産物以外のSyk 遺伝子産物は、γ鎖とζ鎖の両方により媒介されたFc γ RIおよびFcRIIIAの食作用を刺激することが明らかにされている。（ある種のSrc関連チロシンキナーゼ存在下ZAP-70は、Fc γ RIおよびFcRIIIAの食作用を刺激することができる。）すなわち、Syk配列を標的とすることにより、Syk発現の阻害および従属したリン酸化の阻害を実行できる。この方法での利用に適した構築物とリボザイムは、当業者により容易に選択されうる(Syk遺伝子配列に関しては、ヤギら(Yagi et al) ,Biochem．Biophys．Res．Comm．200:28(1994)、Law et al，J．Biol．Chem．26 9:12310(1994)を参照のこと)。 SykおよびZAP-70のキメラは、SykとZAP-70間のシグナリングにおける相違に関わる配列を決定するために使用されてきた。ZAP-70変異体は、ZAP-70SH2ドメインおよび第二SH2ドメインおよび触媒ドメインの間にあるZAP-70中間領域がSykSH 2ドメインおよび中間領域（図１１）によって置換されている。該研究によって、本キメラが、Fc γレセプターに媒介される食作用のシグナリングを高める点でSyk様に作用する事が示される。平行して、SykSH2ドメイン及びSyk中間領域が ZAP-70SHドメイン及び中間領域で置換されたSyk変異体が構築された。該キメラは、Fc γレセプターに媒介されるシグナリングを高めない点で、ZAP-70様に作用する（COS-1細胞トランスフェクタントおよび食作用シグナリングを除く）。さらに、ＳｙｋおよびZAP-70のキメラが生成された。Syk変異体は、そのSH₂ドメインがZAP-70のSH₂ドメインで置換されて構築された。本キメラは、Sykキナーゼ様に作用する。同様に、ZAP-70変異体が、そのSH₂ドメインをSykキナーゼのSH₂ ドメインで置換されて構築された。本キメラは、ZAP-70様に作用する。 Syk変異体は、第二SH2ドメインおよび触媒（キナーゼ）ドメインの間にある中間領域がZAP-70および中間領域によって置換されて構築された。本キメラは、ZAP- 70様に作用する。同様に、ZAP-70変異体が、ZAP-70の中間領域をSykキナーゼの中間領域と置換されて構築された。本キメラは、Syk様に作用する。SykおよびZA P-70のキメラによるこれらの実験から、第二SH2ドメインおよび触媒(キナーゼ) ドメインの間にある中間領域にある配列がFc γレセプターのシグナリングと相互作用するSykの能力に関与することが分かった（Park and Schreiber，Proc．N atl．Acad．Sci．USA 92: 7381(1995)および領域／ドメインの記述についてのそこに引用された参考文献を参照の事）。キメラ類は、野生型ＳｙｋおよびZAP−7 0を使用したオーバーラップＰＣＲを使用して生成された。 Sykキナーゼの中間配列が、食作用に関与するものも含めた信号伝達事象に関係している確認する事によって、このようなトランスダクション事象を選択的に阻害する能力による化合物（ペプチドまたは模擬物）テストを可能にするスクリーニング（篩い分け）ができる。たとえば、テスト化合物を、Syk中間領域もしくは少なくとも３、５、７、またはそれより大きなアミノ酸、例えば、少なくとも20、30、50、または100アミノ酸からなるSyk中間領域の一部（例えば、ZAP−70SH2ドメインおよびキナーゼドメインとSyk中間配列とからなるキメラ）からなるポリペプチド、およびZAP− 70中間領域配列（例えば、SykSH2ドメインおよびキナーゼドメインおよびZAP−7 0中間領域配列）からなるポリペプチドと接触させてもよい。後者ではなく前者のポリペプチドと結合する化合物類は、Syk中間配列によって媒介されるシグナリング事象（食作用および肥満細胞およびＦｃ_εレセプターを担時する細胞からのメデイエーター分泌を含めたもの）の選択的阻害剤と推定される。このような化合物はまたSyk欠損の食作用細胞と思われる細胞（例えば、Fc γレセプターを担時するCOS細胞等のFc γレセプターを担時する細胞）中に、Syk中間配列からなるポリペプチドをコードする構築物（例えば、上記記載のキメラをコードする構築物）を導入し、その細胞をテスト化合物と接触させ、細胞の食作用を遂行する能力について分析することによって、食作用がSykキナーゼによるシグナリングが解読される。食作用を阻害する化合物は、Syk中間領域配列によって媒介される他のシグナリング事象を阻害するものと予想される。そこで、Syk中間領域を発現する細胞の食作用能力を阻害する化合物が、安定性、毒性等について標準手順に従ってテストされても良い。このアプローチはまた肥満細胞もしくは他の Fc_εレセプターを担時する細胞、メデイエーター分泌(例えば、ヒスタミン分泌) を阻害する化合物（ペプチドおよび模擬物）をスクリーニングするためにも使用できる。上記のスクリーニングを使用して同定された、もしくは他の方法で同定されたペプチドおよび模擬物は、薬剤組成として製剤化され、例えば全身的にまたは直接肺に（例えば、エアゾールで）投与してもよい。デリバリーは、本明細書に記載の技術を使用して実行され得る。至適投与量は容易に決定することができる。（例えば、第二SH2ドメインと触媒（キナーゼ）ドメイン（例えば精製形態または単離形態にあるもの））の間のSky中間配列、もしくは少なくとも５あるいは６のアミノ酸からなるその一部またはその模擬物は、本願の範疇にあり、製剤化されて上記に記載のように使用され得る。下記記載のように、本発明は、肥満細胞等（実施例ＶＩ参照）のFc_εレセプター担持する細胞からのメデイエーター（例えばヒスタミン）分泌を阻害するためにSykアンチセンス構築物の使用をも意図している。ヒスタミン（肥満細胞メデイデータ）分泌の阻害は、例えば、喘息治療において治療学的重要性を持つ。 Sykアンチセンス構築物の好ましい標的は、下記に記載される（実施例VおよびＶＩも参照）。該構築物は、全身的または直接肺（例えば、エアゾール投与）に投与されることが可能である。デリバリーは、本明細書に記載の技術（リポソーム製剤化を含む）を使用して実行され得る。至適投与量は患者、構築物および使用する投与形態に依存しよう。可溶性Fcレセプターさらなる態様では、本発明は、免疫複合体(例えばIgG含有免疫複合体)と膜会合性Fcレセプター間の相互作用を阻害することにより、食作用によるそれらの複合体のクリアランス(または、細胞内のメディエーターの分泌を引き起こす事になるFcレセプターを介したシグナリング)を阻害する方法に関する。この方法には、免疫複合体結合に関して、膜に結合した形態のFcレセプターと競合する、可溶な形態のFcレセプターを循環中に導入することが含まれる。ある可溶な形態の転写物(transcripts)が、巨大核細胞および単球／脊髄系統の細胞において同定されている(ラパポートら(Rappaport et al)，Exp.Hemotol．21:689(1993);ワーマーダムら(Warmerdam et al)，J．Exp．Med．172:19(1990))。これらの転写物は、トランスメンブレンレセプター領域をコードする配列を欠いているが、細胞質のドメインをコードする配列は保持している。本発明は、細胞外ドメイン単独もしくは細胞質ドメインとの組み合わせを含む可溶性Fcレセプターの生産と使用を意図する。IgGで被覆された細胞との結合に関して膜結合性Fcレセプターと競合できるレセプターがふさわしい。本発明の可溶性レセプターは、Fc γ RI、Fc γ RIIもしくはFc γ RIII細胞外ドメイン単独か、それらの結合部分の形態をとることができる(または、細胞外ドメイン単独かもしくはそれらの結合部分の形態をとるFc_εRIの可溶性レセプターが供される)。すでに指摘したように、細胞質ドメインもしくはそれらの一部分が存在していてもよい。次に可能な可溶性レセプターの例を示す。ここで″I ″及び″IIA″はFc γ RI及びFcR γ IIAにそれぞれ相当する。また、αとγはF c γ RIIIのα鎖およびγ鎖に相当する。初めの記号は、細胞外ドメインの起源を示しており、２番目の記号は、細胞質ドメインの起源を示している:I:I，I，I IA，IIA:IIA，I:IIA，α:γ，α，α:IIA、Ｉ：γ。可溶性レセプターは、それらの特性に依存して、化学的にもしくは組み換え技術を応用して調製できる（ホートンら(Horton et al)，Biotechniques 8:528(19 90))。可溶性レセプターは、レセプターのリン酸化阻害剤に関して上記に述べたように、全身的にもしくは肺に投与することができる。同じのものをコードしている配列からの可溶性レセプターの合成が生体内でなされる場合、そのような配列は適切なベクター(上記参照のこと)中に挿入され、標的細胞内の機能的な調節配列にリンクする操作が可能である。アンチセンス構築物：さらなる態様として、本発明は、哺乳類宿主細胞中におけるFcレセプターの発現を阻害する方法であって、i)細胞内で機能的なプロモーターと、ii）２本鎖DN Aの断片（その転写された一本鎖は、発現が阻害されるべきFcレセプターの内在的なmRNAに対して相補的な配列を含む）と、iii)宿主細胞内で機能的な終止配列からなるアンチセンス構築物とを５´末端から３´末端への転写方向で具備しているアンチセンス構築物を、該細胞中に導入する方法に関する。この本発明の態様により、多くのクラスのレセプターを産生する細胞内において、特定のFcレセプターの発現を調節することが可能となる。この特異性は、内在的なFcレセプターのmRNAに特有の配列を、DNAセグメント(上記の(ii))中への封入のために選択することにより達成される。上に示したように、本発明はまた、Sykキナーゼをコードする配列をターゲットとするアンチセンス構築物に関する。このような構築物において、上記（ii）は二本鎖ＤＮＡのセグメントであり、その転写された一本鎖には、Sykキナーゼの内在的なmRNAと相補的な配列が含まれる。アンチセンス・オリゴヌクレオチドの有効性に影響する因子には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性、細胞の細胞原形質へのデリバリー、および目的とするmRNAへの接近の容易さがあげられる。本発明のSykアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、これらの課題を達成するために三段階で変更される。まず、５ ´または３´末端、好ましくは両末端におけるホスホジエステル連結が、例えば、ホスホロチオエートで修飾される。第二に、ステムループ構造を使用して、ヌクレアーゼからのループドメイン内のアンチセンス配列を保護する。該ステムは、例えばGおよびＣのみからなる相補的終止配列である。ループドメインは、例えば、Syk mRNAの異なる部位をターゲットする３つのアンチセンス配列を担持する。mRNAは、分子内ハイブリデイゼーションにより二次構造を形成しており、mR NAの二次構造が、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの標的への接近を阻害するのかもしれない。アンチセンス・オリゴヌクレオチドへ接近をしやすくする開放 “open”構造を持つ配列を同定するために、全Syk mRNA配列がＲＮＡ二次構造予測プログラムで走査（scan）された。Syk mRNAは、３つのずらし枠内(staggered frame)で走査(scan)され、最小の二次構造を持つ、もっとも開放された(“open ”)構造が選ばれた。ループ・アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、３つの線形アンチセンス。オリゴヌクレオチドの混合物よりも食作用信号が劇的に減少した。ステムループSykアンチセンス・オリゴヌクレオチドがの効率が高いのは、ヌクレアーゼ消化からの安定性が良好であることに起因するのかもしれない。第三に、Sykアンチセンス・オリゴヌクレオチドはまた、細胞へのデリバーを改善するため例えばカチオン性リポソームと複合化された。リポソームと複合化されると、ステムループSykアンチセンス・オリゴヌクレオチドの安定性は著しく改善した。Fc γ RIIIA γサブユニットmRNAに向けられるステムループ・アンチセンス・オリゴヌクレオチドもまた使用された。末梢血単核球およびステムループ γ鎖アンチセンス・オリゴヌクレオチドの使用と共に、RT−PCRによって評価される単核球のγ鎖のメッセージは＞80％減少した。リポソームは、単核球／マクロファージが主要な在住細胞集団である細網内皮細胞系にデリバーされる。リポソームとステムループSykアンチセンス・オリゴヌクレオチドの複合体は、単核球／マクロファージ中でFc γレセプターが媒介する作用のダウンレギュレートが必要な免疫性疾病用治療剤として使用することが有益である。Syk キナーゼはまた、Fc_ε ＲＩおよびB細胞抗原レセプターに連結している。ステムループSykアンチセンス・オリゴヌクレオチドはまたこれらのレセプターを通じての細胞内シグナリング事象の調査およびこれらのレセプターによって媒介されるシグナルを調整するための治療剤を開発するために有用である。本願のアンチセンスの態様によると、内在的なmRNAターゲットに相補的な配列は、長さにして少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも30ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも50ヌクレオチドのものである。この配列は典型的には5000ヌクレオチド未満の長さ、好ましくは2000未満、またより望ましくは1000未満の長さのものである。この配列は、目的のmRNAの転写された領域もしくは未転写領域に相補的でありうる(例えば、マッケンジーら(McKenzie et al) ，Molec．Immunol．29:1165(1992)，Mastuda et al，Mol．Biol．Cell 7: in pr ess，July(1996)を参照のこと)。アンチセンス配列の長さもアンチセンス配列が結合するmRNAの部位はいずれも、アンチセンス配列の性質、mRNA部位、求められる阻害の程度に依存して変わり得る。これらのパラメーターの最適化は余計な（ undue）実験をしなくても実行可能である。適当な調節配列やベクターが、当該技術分野で公知のものから選択可能である。例えば肺や脾臓へのアンチセンス構築物の投与は、上述の通り、生体内と生体外の両方での形質転換手順を用いて実行可能である。アンチセンス転写物自体を、上記の方法を含めた当該技術分野で公知の方法を用いて標的細胞中に直接導入しうることは、当業者に評価されるだろう（実施例５− ホスホロチオレート修飾された線形、ステムループ(stem loop)Ｓｙｋアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮｓ）は、血清ヌクレアーゼに対する部分的な抵抗を示す−も参照のこと）。リポソームにより複合化されると、５´末端−３´末端でホスホロチオレート修飾されたアンチセンスＯＤＮｓは、よりいっそう安定である。ホスホロチオレート修飾されたステムループＳｙｋアンチセンスＯＤＮは、血清中で非常に安定性を示す。食作用を阻害する上記アプローチに加えて、本発明は、Fc γ RIIＡ(Hunter e t al，FASEB J.June 1996，New Orleans，LA)を含めた、Ｆｃ γレセプターの作用を阻害する事ができる食作用のポテンシャルを有するFc γ RIIB(例えばFc γ RIIB2)を持つ細胞を導入することによって阻害を行う方法にも関与する。 Fc γ RIIBの導入は、阻害に影響するFc γ IIBをコードする配列もしくはその一部分を包含する構築物を用いて、標的細胞をトランスフェクション／形質転換 (transfecting/transforming)することにより達成される(ブルックスら(Brooks et al)，J．Exp．Med．170:1369(1989); インデックら(Indik et al)，Blood 83 :2072(1994))。適当な構築物が当業者により選択可能である。以下の例は、本発明のある態様をさらに詳細に示すが、本発明を限定するものではない。実施例１：組み換え可溶性Fc γ RIIIの生産組み換え可溶性Fc γ RIIIのタンパク質は、以下に示すような発現ベクターを用いて生産することができる。該可溶性タンパク質は、トランスメンブレン・ドメインが除かれたFc γ RIIIに相当する。この構築物は、レセプターをコードしている配列の発現が生じるような条件下で哺乳動物細胞に導入される。このようにして生産された組み換えタンパク質は、細胞溶解物及びその上清の両方から単離される。付着細胞もしくは懸濁液中の細胞のトランスフェクション：付着細胞（例えばCHO細胞もしくはCOS細胞）、または、適切な懸濁細胞系のトランスフェクションを行うことができる。可溶な形態のFc γレセプターを発現する永続性のトランスフェクタント(permanent transfectant)は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法もしくは他のすでに確立された方法により達成されうる。形質移入された細胞は48時間培養され、2mg/mlのジェネティシン(Gen eticin)(Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland)もしくは他の選択薬剤を含む培地中で選抜されうる。約12週間後、ポジティブコロニーが単離され、クローンをさらに特徴づけるために増殖される。単離されたクローンは、可溶性レセプターを最も多量に発現させているトランスフェクタント細胞系を選抜するために、 ELISAプレート(Dynatech，Alexandria，Virginia)を用いて酵素を固相免疫定量法(ELISA)により調べられる。付着感染体(adherent transfectants)の大量培養は、中空繊維組織培養系を用いることにより達成される。実施例２：可溶性Fc γ RIIIの機能可溶性Fc γ RIIIタンパク質の機能は、生体外と生体内の両方で評価される。細胞膜結合性レセプターへのIgG免疫複合体の結合に及ぼす可溶性Fcレセプターの影響は、リガンドと可溶性レセプターの局在的濃度、膜結合性レセプターの表面密度、リガンドの結合価、及び、２つの形態のレセプターのリガンドに対する相対的親和性等の幾つかの因子に依存している。可溶性Fc γ RIIIレセプターとリガンドおよび細胞膜との相互作用における制限因子は、入手可能なモデル系を用いて解読することができる。生体外でのアッセイシステムは、標識されたIgGリガンドとIgGで被覆された赤血球(EA)に対する可溶性レセプターと細胞膜レセプターとの競合を基にしている。Fc γレセプターをもたない細胞(Fc γ receptor-negative cells)には、IgG 含有免疫複合体および抗体で被覆された細胞と結合し取り込む機能的能力を保持するトランスメンブレンFc γ RIII分子が形質移入させられている(ルイズとシュレイバー(Ruiz and Schreiber)，J．Clin．Invest 88:149(1991))。これらのアッセイを使用して、可溶性レセプターの機能及び可溶性レセプターが膜レセプターによるEAおよびIgGのオリゴマー体の検出を妨げる能力が調べられる。可溶性Fc γ RIIIの機能はまた生体内においても調べられる。これらの研究では、確立された実験動物モデルを使用して、生体内で投与された可溶性Fc γ RIIIが抗体で被覆された細胞のクリアランスに変化をもたらすかどうかが調べられる(ルイズおよびシュレイバー(Ruiz and Schreiber)，J.Clin．Invest 88:149(1991)) 。可溶性Ｆｃ γ RIIIの免疫調整能が同様な方法で調べられる。実施例３：食作用のシグナルメディエーションに必要な細胞質チロシン残基実験の手順：プラスミド構築とポイント変異の導入： pSVL真核発現ベクター(Pharmacia LKB，Piscataway，NJ)が、COS-1細胞内での Fc γ RIIIAの発現に用いられた。huFc γ RIIIA α cDNAが、pSVLのXbaIおよび BamHIクローニング部位にクローニングされた。同様に、muFc γ RIIIA γ cDNA が、XhoIおよびBamHIクローニング部位にクローニングされた。TCR/Fc γ RIIIA ζは、pSVLのXbaIおよびBamHIクローニング部位にクローニングされた。γ鎖の細胞質チロシンのフェニルアラニンによる保存型置換は、２段階重複伸張ポリメラーゼチェインリアクション(PCR)(ホートンら(Horton et al)，Biotechniques 8:528(1990))を用いて行われた。二重チロシン置換変異体(double tyrosine sub stitution mutants)は、N末端のチロシン残基の置換に続いてC末端のチロシン残基を置換することにより、連続的に構築された。それぞれの突然変異体から６つのクローンが単離され、DNAシークエンシングにかけられた。正しいDNA配列をもつ幾つかのクローンのうち、さらに研究を進めるためにそれぞれのチロシン置換（体）から２つのクローンが無作為に選択された。一過性トランスフェクション(transient transfection)： Fc γ RIIIAイソ型(isoform)、Fc γ RIIIA-γγ、Fc γ RIIIA ζζは、Cos- 1細胞へのγもしくはζのcDNA及びαのcDNAを同時トランスフェクション(cotran sfection)することにより生成された。cDNAのトランスフェクションは改良 DEAE -デキストラン(DEAE-Dextran)法を用いて行われた。すなわち、300,000個のCOS- 1細胞がトランスフェクションの24時間前に35mmウエルプレートに接種された。7 0-80%の集密(confluence)プレートは二度洗浄され、トランスフェクションに先だってダルベッコ改良イーグル培地(Dulbeco's Modification of Eagles's Medi um)(DMEM，Gibco BRL，Grand Island，NY)中で30分間インキュベートされた。４ μgのプラスミドDNA(0.5μg/μl)がNu培地(10%のNu血清[Collaborative Biomedi cal，Two oak Park，Bedford，MA]、1mg/mlのDEAEデキストランと100μMのクロロクイン(Chloroquine)を加えたDMEM)を含む1mlのトランスフェクション緩衝液にゆっくりと加えられた。DNAを含むトランスフェクション緩衝液がCOS-1細胞に加えられ、37℃で４時間インキュベートされた。細胞はその後、リン酸緩衝食塩水(PBS)中で10% DMSOにより２分間ショックを与えられ、DMEMで２度洗浄され、Nu血清が補われたDMEM中で生育された。細胞はトランスフェクション後48時間で調べられた。免疫蛍光染色とフローサイトメトリー：トランスフェクションさせた細胞は転移ピペットを用い染色緩衝液(0.02%の窒化ナトリウムと0.1%のBSAを含むPBS)中に回収された。細胞は遠心分離され、60 μｌの染色緩衝液中に再懸濁され、抗-Fc γ RIIIA mAb，3G8(アンケレスら(Unk eless et al)，Annu．Rev．Immunol．6:251(1988))、もしくはイソ型対照(isoty pe control)のいずれかとともに４℃で30分間インキュベートされた。細胞は洗浄され、フルオレセインと結合させたヤギ抗マウスIgG(Tago Inc．Burlingame， CA)を用いて染色された。染色された細胞はファックスター(FACstar)フローサイトメーター(Becton Dickinson Co.，Mountain View，CA)を使用して測定された。 IgG感受性化させたRBCs(EA)の結合と食作用：カルシウムとマグネシウムを含まないPBS中の滅菌ヒツジ赤血球細胞(109/ml) は亜凝集する(subagglutinating)力価と等量のウサギ抗ヒツジRBS抗体(Cappel L aboratories，Cochranville，PA)とともにインキュベートすることにより、感受性化させられた。IgG感受性化させたRBCs(EA)はPBSで二度洗浄され、トランスフェクションさせたCOS-1細胞を覆う(overlaying)ために最終濃度10⁹/mlになるよう再懸濁された。細胞は以前に示されたように(インディックら(Indik et al)， J．Clin．Invest．88:A66(1991))、ロセッティング(COS-1細胞あたり＞10EA)と食作用について調べられた。食作用の分析のために、EAと結合したCOS-1細胞(３度の洗浄後)は表面に結合したEAを除くために、低浸透圧性PBSを用いた短時間の低浸透圧ショック(35秒)を与えられた。その後、細胞はライトーギムザ染色溶液で染色され、食作用(摂取されたEA)が光学顕微鏡にて検査された。得られた結果はスチューデントのＴ-検定により解析された。生体外でのキナーゼ分析：トランスフェクションさせた細胞(2x10⁷細胞)はPBSで一度洗浄され、５μg/ml の抗-Fc γ RIIIA mAbとヤギ抗マウスIgGのそれぞれとともに10分間氷上で連続してインキュベートされた。細胞はPBSで一度洗浄され、フォスファターゼとプロテアーゼの阻害剤を含む溶菌緩衝液(150mM塩化ナトリウム、25mM ヘペス[pH 7.4]と1%ポリオキシエチレン10オレイルエーテル[BRIJ-96; Sigma，St.Louis MO ])を1.5ml添加する前に、室温で３分間インキューベートされた。フォスファターゼとプロテアーゼの阻害剤(1mM EGTA,1mMオルソバナジン酸ナトリウム(Naorth ovanadate)，1mM PMSF，10μg/mlのアプロチニン、50μg/ml ロイペプチンと10 0μg/mlの大豆トリプシン阻害剤)が溶菌緩衝液に新たに加えられた。氷上で15分間溶菌（反応）させた後、細胞溶解物は清浄化するために４℃で30分間遠心分離された。Fc γ RIIIA-γ鎖は溶菌緩衝液中で抗ヒトγ抗血清(ジーン-ピエールキネット(Jean-Pierre Kinet)提供，NIAID-NIH，Rockville，MD)とタンパク質 A-セファロースCL4B(Sigma，St．Louis，MO)を用いて免疫沈降させられた。ペレットは溶菌緩衝液中で三度洗浄され、低塩緩衝液(100mM塩化ナトリウム，25mMヘペス，pH7.4と5mM塩化マンガン)中で一度洗浄された。ペレットは25mMヘペス，p H7.4，5mM塩化マンガン，5mMリン酸p-ニトロフェニル，１μM寒冷(cold)ATP(Boe hringer Mannheim，Indianapolis，IN)と５μCi γ-[32p]ATP（6000 Ciもしくは 222 TBq/mmol; Dupont NEN，Boston，MA）を含む30μｌの混合物とともにインキュベート(20℃、10分間)された。還元化(reducing)SDS-PAGE試料緩衝液を添加することにより反応は停止させられ、標識されたタンパク質は12.5%の還元化(redu cing)SDS-PAGEゲルで分離された。そのゲルはメタノール／酢酸溶液中で固定され、フォスフォセリンとスレオニンを除くために１Ｎ水酸化カリウムで処理され (55℃で２時間)、乾燥され、４日間オートラジオグラフィーにかけられた。 [Ca²⁺]iの可動化(Mobilization)：カバーグラスにのせられた COS-1細胞は２μM Fura-2/AM(Calbiochem．San Di ego，CA)とともに30分間インキュベートされ、二度洗浄された。その後、そのカバーグラスは[Ca2+]iの単一細胞多重測定（multiple single-cell measurements)のためレイデム細胞チャンバー(Leidem cell chamber)(Medical S ystems，Greenville，NY)に移された。Fc γ RIIIAレセプターはビオチニル化された抗-Fc γ RIIIでクロスリンクされストレプトアビジンを添加されるか、もしくは抗-Fc γ RIII mAB 3G8全IgGでクロスリンクされた。正の対照として、10 μMのエピネフリンがCOS細胞上で発現したエピネフリンレセプターをクロスリンクするために添加された。カルシウムイメージングは、イメージ1AT定量蛍光システム(Universal Imaging，West Chester，PA)を用い、ニコンダイアフォトマイクロスコープ(Nikon Diaphot microscope)上で4Ox蛍光対物レンズを使用して行われた。像は340nmもしくは380nm励起のいずれかで得られた(発光(emission )=510nm)。340/380比の像は１画素x１画素（の大きさ）を基準にして計算され、それぞれの細胞内での平均340/380比が各時間ごとに決定された。340/380比は遊離Fura-2酸を用いた溶液補正に基づき[Ca²⁺]iに転換された。Fc γ RIIIAαおよび会合するγおよびζ鎖により媒介される食作用 Fc γ RIIIAの野生型γおよびζcDNAは，Fc γ RIIIAα鎖と共にCOS−1細胞に同時トランスクションされ、ＥＡ（感作ＲＢＣ）の食作用を誘導する能力が測定された。Fc γ RIIIAの表面発現は、フロー血球計算により求められ、γまたは ζのいずれでコトランスフェクションを行なっても効果は等しかった（表１）。抗Fc γ RIIIAmABで染色された被コトランスフェクト細胞についての平均蛍光強度（ＥＭＩ）は、ＩｇＧイソ型コントロールで染色された細胞と比較して、あるいは、抗γ RIIIA mABで染色された擬似被トランスフェクト細胞に比較して、15 倍だけ増加した（表１）。トランスフェクタントは、ＩｇＧ感作RBCs（EA）を結合し、食作用を示す能力について調査された。約50％のCOS−1トランスフェクタントがEAを食作用によって結合した（表１）。野生型γによってトランスフェクトされたCOS−１細胞の顕微鏡観察では、EAの取り込みが一貫して被検査細胞の2 0±5％を示した(p＜0．02)。このように、EAの食作用は、EAに結合したCOS−1細胞トランスフェクタントの約40％において検出された。対照的に、ζ鎖を含むコトランスフェクタントでは、EAが取り込まれた細胞が３．８％であった（p＜0． 02）（表１）。さらに、食作用を示したζ含有細胞においては、細胞当たりの取り込まれたEAの平均数は減少し、γで観察されたレベルの半分に満たなかった。３つのcDNA，α、γおよびζが全てトランスフェクトされたCOS−1細胞では、EAを取り込んだ細胞は16％を示し、食作用を一貫して減衰させることが分かった（表１）。対照的に、EAを担持する擬似トランスフェクタントも、Ｅ(非感作R BC)を担持するトランスフェクタントも何の結合も食作用も示さなかった。トランスフェクションの効率はフロー血球計算で決定された。平均蛍光強度（ MFI）は、同様の結果を示した３つの実験の内の一つについて示した。内在化したPBCsは顕微鏡で観察した（１０００ｘ）。結果は、EAの食作用および結合（ロゼット形成）についての平均SEMとして示される。各クローンについて少なくと３つの別個の実験が遂行された。各実験につき、1500細胞が５つの無作為に選択された部位で計測された。＊平均蛍光強度。^§-ＰＩ（食作用指標）：COS−1細胞100個当たりの内在化RBCsの数。２つのγ鎖の細胞質チロシンは食作用に必要とされる２つの保存γ鎖チロシンのFc γ RIIIAに媒介される食作用への影響を研究するため、Ｎ末端（クローンM1AおよびM1B）近傍もしくはＣ末端（クローンM2AおよびM2B）近傍チロシンを夫々フェニールアラニンで置換した。２チロシン置換を持つ変異体については、両チロシンをフェニールアラニンで置換した（DMAおよびDMB）（図１）。フロー細胞蛍光測定法により測定されたMFIおよびロゼット形成陽性細胞のパーセントによって、γ変異体および野生型γを担持するすべてのトランスフェクタントにおいてレセプター複合体の表面発現は類似している事が実証された（表２）。これらの発現のレベルを比較して、γ鎖の細胞質内尾部中のチロシン残基は、表面発現に必要なFc γ RIIIAレセプター複合体の形成に必要のないことが分かった。表２に要約された結果は次の通りである。M1 γ変異体は、食作用指標（ＰＩ）で表されたように、99％を超える食作用活性減少を示した（食作用細胞当たりの取り込まれたEAおよび最小の取り込まれたEAを担持するトランフェクタントの≦１％）（ｐ＜0.02）。Ｍ２およびDM γの変異体は、実質的に食作用を示さなかった（調査細胞5000中１）（表２、図２）チロホスチン23による食作用阻害食作用がチロシン残基のりん酸化を必要とするかを調査するために、Fc γ RIIIAと野生型γでコトランスフェクトされたCOS−1細胞をチロホスチン(tyroph ostin)２３（tyr２３）、つまりチロシンキナーゼの阻害剤の濃度を上げながらインキュベートした(Yaish et al，Science 242:933(1988))．Tyr23は、投与量に応じて食作用を減少させ、25μＭでは50％阻害および200−400μMでは完全な阻害を示した（p<0.01）（表３）。対照的に、tyr23は、EAの結合に影響しなかった。tyr23（400μM）で前処理された後洗浄されたトランスフェクタント食作用活性を部分的に、もしくは完全に、回復したので、食作用の阻害は生存率の減少とは関連していなかった。（一晩洗浄、データ表示せず）。 γサブユニットのチロシン残基は生体外でリン酸化される γ鎖のチロシン残基がリン酸化される可能性をCOS-1 トランスフェクタントを使用した生体外キナーゼ分析によって調べた。表４に示した結果は、野生型γ鎖のチロシン残基は生体外でリン酸化される事を実証している。対照的に、変異体 γ鎖トランスフェクタントおよび擬似トランスフェクタントは、検出可能なリン酸化を示さなかった。単一チロシン置換変異体（M1AおよびM2A）では、残りのチロシン残基にリン酸化が生じなかったので、この２つのチロシン残基のうちどちらか一つのリン酸化は他の一つのチロシン残基が完全であることを要するようだ（表３）。これらのリン酸化データは、二つのチロシン残基のどちらか一つの代替によって食作用が大幅にクリアランスされるので、食作用シグナルを誘導する γ鎖の能力とよく相関している（表２、図２）。生体外キナーゼ分析では、擬似トランスフェクタントを除いたすべてのレーンで約40kDaの明瞭なバンドを示した。このバンドは、γと共沈殿する結合リン酸蛋白を示すのかもしれない。γの細胞質チロシンは、Ｃａ²⁺の可動化に必要である γ鎖チロシンがカルシウムの可動化に必要かどうかを調べるため、個々のトランスフェクト細胞（WT，M1A、M2A、または DMA）で、デジタルビデオ顕微鏡を使用してFc γ RIIIA架橋の後カルシウム応答を測定した（表４）。ＣＯＳ細胞でＣａ²⁺シグナルを惹起するエピネフリンがすべての実験で陽性コントロールとして使用された。ＷＴレセプター複合体を持つトランスフェクタントは、ビオチニル化された抗FcγmRIIIで架橋し、ストレプトアビジンを添加した後、あるいは抗Fc γ RIII全ＩｇＧで架橋した後、典型的な一過性のカルシウム上昇を示した。5つの連続した実験（169細胞）で、58％の細胞が、10μＭエピネフリンで誘導されるものの少なくとも５０％カルシウムシグナルによって、抗Fc γ mRIIIに応答した（表４、図４）。対照的に、M1A、M2A、あるいはDMAのいずれかでトランスフェクトされたCOS細胞は、抗Fc γ RIIIに対するカルシウム応答を著しく減少させたが、４つの実験のうち一つにおいて、M1AトランスフェクトCOS-1細胞では著しいカルシウムの可動化が起こった。実施例ＩＶ：マクロファージFC γ RIIIシグナリングは蛋白チロシンキナーゼ活性化を誘導する細胞内FC γ RIII γサブユニット内の特定のチロシン残基は、信号伝達および引き続くエフェクター作用に必要である事が、キメラまたは変異レセプターでトランスフェクトされたNK細胞およびリンパ球または繊維芽細胞を用いて確認されている（Darby et al．Blood 79: 352A Nov(1992)）。マクロファージ信号伝達中に生理学的関わる蛋白チロシンキナーゼ(PTK)およびホスホチロシンを含有する基質を研究するために、肺のマクロファージまたは培養された単核球（M）上の自然状態でのFc γ RIIIが調べられた。Fc γ RIIIがFab抗体と架橋した後数秒以内のウエスタンブロットでは、ホスホチロシン基質の特徴的なパターンが現れた。この応答は一過性で、多くの基質では5分目にピーク、10−20分後には減少する。ホスホチロシンのパターンは新しいマクロファージおよび培養された単核球では区別できなかった。これによって、後者が有用な生体外モデルとして実証された。ＧＡＰ自身ではないけれどp120^rasＧＡＰと結合している蛋白であるＰ６２は、これらホスホチロシン基質の一つとして特異的免疫沈殿によって確認された。第二の基質は、造血発癌性産物であるｐ９５^vavであり、ｐ９５^vavは、TCR、slgおよびFc_εRI活性化の後リン酸化されたチロシンでもあることが分かった。キナーゼPTK72／Syk、は今までB細胞Slgおよび肥満細胞Fc_εＲＩシグナリングにおいてのみ確認されてきたが、マクロファージFc γ RIII活性化後の主要なホスホチロシン基質でもある。抗Syk免疫複合体の生体外キナーゼ分析では、レセプター連結後5−10分でSyk自動リン酸化に、3−4倍の増加が示された。Skyはまたγ鎖Fc γ RIIIAの免疫沈殿物中に存在しているのが発見されている。この事から、Skyがリン酸化されたγ鎖と結合している事が示唆される。実施例Ｖ：アンチセンス・オリグヌクレオチドヒトSyk mRNA用に２つのアンチセンス・オリグヌクレオチド（ODN）がデザインされた。転写開始コドンを囲む領域をターゲットする線形アンチセンスODNを使用した。他のアンチセンスODNは、ヒトSky mRNAの３つの異なる部位とハイブリダイスできるステムループ構造を持つようにデザインされた。これらのSkyアンチセンスODNsは、培養された単核球中でのFc γレセプターに媒介される食作用信号中でのSykチロシンキナーセの作用を調査するために使用された。アンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチドの構築：アンチセンスまたは交差（スクランブル）ODNsは、これをヌクレアーゼから保護するために修飾された。５´末端にある一つのホスホジエステルのバックボーン、３´末端にある二つホスホジエステルのバックボーンを、ホスホロチオエートを用いて修飾した。Syk mRNAおよびODNsの二次構造(Law et al．J．Biol．Che m．269:12310(1994))の予測が、マキントッシュコンピューター上でのＭａｃＤＮＡＳＩＳプログラム(Hitachi，Software，San Bruno，CA)を用いて実施された。５´−CGCTGTCAGCCATGCCG-３´の配列を有する線形の１７mer SykアンチセンスＯＤＮは、Syk mRNAの転写開始コドンを囲む領域をターゲットする。ステムループ・アンチセンスＯＤＮは、Syk mRNA３つの異なるターゲット部位: ターゲットＩ（転写開始領域、ヌクレオチド番号１５９から１７３）、ターゲットII（４５１から４６３）、およびターゲット III（８０２から８１６）に対して相補的な配列を含む５７merである（Law et al．J．Biol．Chem．269:12310(1994)）（表５）。ステムループSykアンチセンスODNは、それ自身で茎（ステム）と輪（ループ）構造を形成し、ループドメイン中で最小の分子内二次構造を含むようにデザインされている（図６）。ステムループSykアンチセンスODNは、５´-GGG GGGGCTGTCAGCCATGCCGTGTCTTGTCTTTGTCGCTTCTTGAGGAGCCCCCCC-３´である。線形１７mer SykアンチセンスＯＤＮは任意の配列５´-GCCCAAGATGATTCCAG-３´を持つ。ステムループ６１merコントロールODNは、ループドメイン内に任意の配列５ ´-ATGGAATCATCTTGGGCATTCATTCGTTCCTCAAAGAAGAATATGAA-３´を持つ。該線形およびステムループコントロールODNもまた５´末端および３´末端をホスホロチオエートで修飾された。リポソームの調製コントロールのスクランブルホスホジエステルODNs、線形およびステムループＳｙｋアンチセンスODNs各１μｇを、ＰＢＳ５０μｌ中で、４μg（２μｌ）のリポフェクタミン（LIPOFECTAMINE^TM（GIBCO BRL、Life Technologies Inc．Gai thersburg,MD）と共にインキュベートした。該ODNリポソーム複合体を室温で４５分間で形成させた。単核球の単離および培養：健康な個人からの末梢血単核球細胞が標準付着手法（standard adherence pro cedure）(Darby et al．J．Immunol．152;5429(1994))によって単離された．すなわち、ヘパリン化血をフィコールーハイパーク法(Lymphocyte Separation Med ium; Organon Teknika，Durham，NC)で遠心分離し、界面細胞を二回ＰＢＳで洗浄した。単核球細胞を10％の熱失活されたFCSおよび２mM Ｌグルタミンと共にRP MI1640（GIBCO、Life Technologies Inc．Gaithersburg,MD）を含む完全培地中に再懸濁させた。細胞を３７℃で、予めＦＣＳで被覆した組織培養フラスコ上に付着させた。４５−９０分後、非付着細胞をＨＢＳＳ中で粗放洗浄によって除去した。激しく攪拌することによって細胞を収穫した。単核球の収量は、２−６ｘ１０⁷細胞／５００ｍｌ血であった。単核球は、常にトリパンブルークリアランス法によって判定されたところ９８％を超える生存であった。単離された単核球は、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）及び１０％熱失活されたＦＣＳを補給されたRPMI 1640中で37度5％ＣＯ₂で保持した。細胞のオリゴデオキシヌクレオチド処理１ｘ１０⁵単核球を、２μg／mlのリポフェクタミン、0.5μＭの線形コントール、0.5μＭの線形SykアンチセンスＯＤＮまたは0.1μＭのステムループコントロール、0.1μＭステムループSykアンチセンスODNを含むODN-リポソーム複合体と共に、２４ウエルプレート（Falcon; Becton Dickinson Labware、Lincoln Pa rk，NJ)中無ＦＣＳ0.3ｍｌRPMT1640培地中で37℃４時間インキュベートした。同量のODNリポソーム混合物もまた各ウエルに二日目に添加した。培地を、１０％ＦＣＳを含むRPMI1640と共に最終容量１ｍｌとなるように加えて、細胞を３７℃ ２日間インキュベートした。これにより、1x １０⁵単核球は、４μg／ｍｌのリポフェクタミンおよび１.０μＭの線形コントロール、１.０μＭの線形SykアンチセンスODNまたは0.2μＭのステムループコントロールまたは0.2μＭ SkyステムループアンテセンスODNを含むＯＤＮリポソーム複合体と共に２日間インキュベートされたことなる。ＩｇＧ感作された赤血球細胞（EA）の調製： 1x １０⁹ シープ赤血球細胞(RBCs)／ｍｌ（Rockland Inc.，Gilbertville，P A）を同量のラビットの抗シープＲＢＣ抗体（Cappel Laboratories，West Chest er PA）の最高サブ凝集濃度（subagglutinating concentration）で３７℃30分感作した。ＩｇＧ感作されたＲＢＣｓを二回洗浄し、先に記載のようにＰＢＳ中に最終濃度1x １０⁹ＲＢＣｓ／ｍｌ（Schreiber et al，J．Clin．Invest．56:1 18981975)）となるように再懸濁した。IgG 感作されたＲＢＣｓ（EA）の食作用：アンチセンスODNsで処理された単核球を３７℃30分EA（EA対単核球の比率100 ：1）と共にインキュベートした。細胞を低張液ＰＢＳに短時間接触させ、付着性ＥＡを除去した。次に該細胞をライトギムザ染色し、食作用で取り込まれたRB Csを顕微鏡で計測した（x1000）。100の単核球を無作為に選択し、内在化されたＥＡを食作用指標として表した。フローサイトメトリー分析：単核球を抗Fc γ RI（32.2）Indik et al，Blood 83:2072(1994)）または抗Fc γ RII（IV.３）（Indik et al，Blood 83:2072(1994)）もしくは抗Fc γ RIII （3G8）moAb(Park et al，J．Clin．Invest．92:1967(1993))，Park et al，J． Clin.Invest．92:2073(1993))で４℃30分でインキュベートし、0.1％子牛血清アルブミン（ＢＳＡ）および0.02％窒化ナトリウムを含む無カルシウム・マグネシウムＰＢＳで二回洗浄し、ＦＩＴＣ抱合ゴート抗マウスＦ（ａｂ´）2IgG(Tago Burlingamne，CA)で４℃30分で標識を施した。次に細胞を洗浄し、1％のパラフォルムアルデヒドで固定した。蛍光をFACSar(Becton Dickinson，Mountain View ，CA)および平均蛍光強度データおよび概略プロットをコンソート（Consort）30 ソフトウェアを使用して得た。すべてのサンプルに対して10、000事象が対数蛍光スケール上に記録された。逆転写されるポリメラーゼ・チェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）：全RNAをスクランブル・コントロールおよびSykアンチセンスＯＤＮｓで処理された単核球から単離した。ｃ DNAを任意の６ヌクレオチド・プライマー（Boehri nger Mannheim，Indianapolis，IN）によって全RNA から合成した。ＰＣＲを、合成されたcDNAをテンプレートとして、下記の二つのプライマー： Syk mRNA(Law et al，J．Biol．Chem．269:12310(1994))のヌクレオチド番号122から139に対応するSyk−Hプライマー：５´−ＧＧＴＧＴＧＴＧＣＣＣＴＣＣＧＧＣＣ− ３´、および Syk−Mプライマー：５´−ＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＣＡＴＧＴ−３´（ヌクレオチド番号 550−564）を使用して実施した。ＰＣＲ産物は、サザン・ハイブリデイゼーションによって分析された。サザン・ハイブリデイゼーションＲＴ−ＰＣＲ産物は、1.5％アガロースゲル上で電気泳動された。DNAはナイロン膜（NEN Research Products，Boston，MA）上に移植された。移植された膜は、6 X SSPE及び50%のフォルムアミド中、ビオチン化された内部プローブ（Ｓｙｋ-ｐＳ：5´-GGGAGTGGTAGTGGCAGAGG-3´、ヌクレオチド番号408−427）でハイブリダイズされた。0．1ｘＳＳＣ中５０℃で膜を洗浄した後、ハイブリダイズしたバンドは、化学蛍光検出試薬（PROTOGENE^TM，Nucleic Acid Detection System ，GIBCO BRL Life Technologies Inc．Gaithersburg，MD）で視覚化された。結果線形ＳｙｋアンチセンスＯＤＮ（１μＭ）でインキュベートされた単核球は、食作用のレベルの低下が見られた。食作用は、食作用指標（ＰＩ、220±8.8から 113±12.3へ）に見られるように４９％だけ低下した。単核球をステムループSyk アンチセンスODN(0.2μＭ)でインキュベートすると、食作用が更に大きく８９％も減少した（ＰＩ、220±8.8から24±4.2へ）（図７）。スクランブルド・コントロールODNs、線形またはステムループ（0.2μＭ）ODNもどちらもFc γ RIIAに媒介される食作用に重篤な影響を与えなかった。同様に、リポソーム単独でも、 Fc γ RIIAに媒介される食作用を減少させはしなかった。Fc γ RIIA発現は、培養された単核球におけるフローサイトメトリー分析によって測定されたように、いかなる処理によっても変化しなかった。この結果によって、Syk チロシンキナーゼは、単核球におけるFc γ RIIAに媒介される食作用についての主要なシグナル・トランスデューサーであることが実証され、またIgG被覆細胞の食作用において、Fc γ RIIAとSyk キナーゼ（チロシンリン酸化も同様に）間の関わり合いが重要である事が示された。次に、単核球中で減少した食作用は、Syk mRNAレベルと相関しているかどうかが決定された。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写されたポリメラーゼ・チェイン反応）を使用し、単核球中でのSyk mRNAの細胞質内レベルを決定した。全RNAをSykアンチセンスODNsで処理された単核球（1x １０⁵細胞／ｍｌ）より単離し、第一鎖ｃＤＮＡを合成するのに使用した。図８に示すように、線形SykアンチセンスODN （1.0μＭ）は、実質的にSyk mRMAを減少させた。ステムループSykアンチセンス ODN（0.2μＭ）によって、Syk mRMA（図８）は完全に除去された。対照的に、二つのスクランブルドコントロールＯＤＮｓ（1.0μＭの線形コントロール、または0.2μＭステム・ループコントロール）およびリポソーム単独でもSyk mRMA を減らなかった。これらの結果によって、SykアンチセンスODNsは、線形もステムループも共に、単核球中で配列特異的なマナーでSyk mRMAを分解することができる事が分かった。更に、ステムループSykアンチセンスＯＤＮは、mRNAをターゲットするについて線形アンチセンス分子よりも有効性を示した。実施例ＶＩ：ステムループSykアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮｓ）によるヒスタミン分泌の阻害実験デザイン細胞培養：ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ヒスタミン配合ラット肥満細胞）は、１７％子牛胎児血清、１００Ｕのペニシリンおよびｍｌ当たり１００μｇのストレプトマイシン、および４ｍＭのグルタミンを補給した最小必須培地中で、３７℃５％ＣＯ₂中で育生させた。細胞を分析の２４時間前に1.6ｃｍプレート上または２４ウエルプレートに1x10⁵細胞／ウエルの濃度で播種した。アンチセンスODNsの構築：ヌクレアーゼ消化から保護するために、アンチセンス及びセンス、コントロールＯＤＮｓは、ホスホジエステルバックボーンの５´ 末端にホスホロチオエート一つを、二３´末端に二つを付加することによって修飾した。３つの線形SykアンチセンスODNS：ターゲットＩ線形SykアンチセンスＯＤＮ（５´ATTGCCCGCCATCTCT３´，Syk mRNAの翻訳開始コドンを含むヌクレオチド319から333）、ターゲットII（5´GATTTGATTCTTGAG3´，ヌクレオチド1175-11 89）、ターゲットIII（5´ATTTGGTAGTATCCCT3´、ヌクレオチド1465から1479）がデザインされた。ステムループSykアンチセンスＯＤＮは、該３つのターゲット部位と相補的な配列からなる60merである（図９）（上記実施例Ｖも参照）。細胞のＯＤＮ処理：リポフェクション項目(details)の前に、５ x １０⁴または 1x １０⁵ＲＢＬ−２Ｈ３細胞が、24ウエルプレートの各ウエルに播種された。二日目に一回三日目に一回の二回、ＯＤＮリポソーム複合体を添加した。毎回、４μlのＤＯＴＡＰ（リポフェクタミン）（１μg／μlストック）及び２ μl ODN（１μg／μl）の複合体を、ＥＭＥＭ（７５μl全量）中で形成させた。ＯＤＮリポソーム複合体は、１７５μlの無血清培養培地を含む各ウエルに添加された。該細胞は３７℃２４時間インキュベートされた。二回目のＯＤＮリポソーム複合体（７５μl）を添加し、培養培地を５％ＦＣＳ（最終容量 1.0ml）に調整し、トランスフェクトされたＲＢＬ−２Ｈ３細胞は３７℃で、ヒスタミン分泌分析の前に、もう一日インキュベートされた。逆転写されるたポリメラーゼ・チェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）：全ＲＮＡをSykセンスコントロールまたはSykアンチセンスＯＤＮで処理されたＲＢＬ−２Ｈ３から単離した。ｃDNAを任意の６ヌクレオチド・プライマー及びオリゴ（ｄ）Ｔによって全RNAから合成した。ＰＣＲを合成されたcDNAをテンプレートとして二つのプライマー：ラットー５Syk ５´−ＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＧＣ−３´（ヌクレオチド番号３６８−３８６）及びラット−３Sy kプライマー：５´−ＡＣＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＧＣＴＣ−３′（ヌクレオチド番号748−762）を使用して実施した。γ鎖及びβアクチンプライマーをコントロールとして使用した。ヒスタミン分泌分析：ヒスタミン分泌分析を下記記載のようにラットＲＢＬ− ２Ｈ３細胞ＩｇＥレセピターFc_εＲＩを架橋し、酵素免疫分析キット（immunote ch，France）を使用してヒスタミンの分泌を測定するにより遂行した。ウエル当たり1x １０⁵RBL−2H3細胞を含む２４ウエルプレートを１.０ｍｌＥＭＥＭ中で一晩３７℃でインキュベートした。該細胞をPBS で一度洗浄し、氷上で１.０ｍｌのPAGCM（標準ヒスタミン分泌緩衝液）及び１００μlのFc_εRI抗体と共に30分間インキュベートした。PBSで一回静かに洗浄した後、RBL−2H3細胞を次の様に、つまり、1.0mlのPAGCM緩衝液単独（ネガテイブコントロール）、10μlのカルシウムイオノフォア（50μg/ml ストック）を含有する1.0mlのPAGCM緩衝液（ポジテイブコントロール）、または10μlのゴート抗マウス抗体（1mg/ml）含有する1.0mlのPAGCMで30分３７℃で、インキュベートした。ヒスタミンを含有するPA GCM緩衝液を該細胞から除去し、酵素分析よって分析した。標準カーブを作成するために100μlの標準を含めた。結果図10Ａに提示した結果によって、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるSyk発現が、Syk センスODNの存在ではなくアンチセンスＯＤＮの存在によって著しく阻害される事が実証される。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞をSykアンチセンスODNで処理してもβアクチン発現には影響を与えない（図１０Ｂ）。同じく、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞をSyk アンチセンスODNで処理してもγ鎖の発現には影響を与えない。 Fc_εＲＩ及びゴート抗マウス抗体を架橋した後、ステムーループSyk アンチセンスＯＤＮｓで処理したＲＢＬ−２Ｈ３細胞は、センスDNAで処理したコントロール細胞と比較して、７４％も少なくヒスタミンを分泌した。アンチＦｃ_εＲＩ及びゴートアンチマウス抗体センスDNA 1.9ngのヒスタミン分泌アンチセンス 0.5ngヒスタミン分泌（７４％阻害）上記に引用したすべての文献は、参照によりこの明細書に取り込まれている。本発明は最も実践的でかつ好ましい態様であると目下考えられるものと関連して記載されているが、本発明を開示された態様に限定するものではない。しかしながら反対に添付された請求の範囲の精神及び範疇内に包含される様々な変形例及び等価な脚色は、カバーされるものと意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＧＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＤ (72)発明者パーク、ジョン−グアメリカ合衆国、ペンシルバニア州 19026、ドレクセル・ヒル、ドレクセルブルック・ドライブ 6813

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳類における免疫複合体の食作用を防止する方法であって、該免疫複合体と接触している哺乳類の食細胞中に、該細胞の膜に存在するＦｃレセプターと会合た該細胞に内在するキナーゼの阻害剤を導入することを具備し、該導入は食作用能力が阻害されるような条件下で実行される方法。２．請求項１に記載の方法であって、該免疫複合体はＩｇＧ含有免疫複合体である方法。３．請求項１に記載の方法であって、該阻害剤は、ペプチドもしくは擬似物デアル方法。４．請求項３に記載の方法であって、該ペプチドは、該細胞中に直接導入される方法。５．請求項３に記載の方法であって、該ペプチドは、該細胞中への導入に先立ち、リポソーム中に取り入れられる方法。６．請求項３に記載の方法であって、該ペプチドをコードするDNA配列が、該ＤＮＡ配列が発現されることにより該ペプチドが産生されるような条件下で該細胞中に導入される方法。７．請求項３に記載の方法であって、該ペプチドは、細胞質ドメイン Fc γ RIIAまたはFc γ RIIIAもしくはFC_εRIのγ鎖のチロシン含有モチーフに対応する配列を含んでいる方法。８．請求項３に記載の方法であって、該ペプチドは、配列Y−X２−L（X ２が任意の２つのアミノ酸である）を含んでいる方法。９．請求項８に記載の方法であって、X２が、Fc γ RIIAまたはFc γ RIIIA しくはFC_εRIのγ鎖の細胞質ドメインのY−X２−Ｌのアミノ酸類を示す方法。１０．哺乳類から免疫複合体のクリアランスを防ぐ方法であって、免疫複合体と接触している該哺乳類の食細胞中に、該細胞の膜に存在するFcレセプターをコードしている転写物を特異的に分解する分子を導入することを具備する方法。１１．請求項１０に記載の方法であって、該免疫複合体はＩｇＧ含有免疫複合体である方法。１２．請求項１０に記載の方法であって、該分子は、リボザイムである方法。１３．哺乳類に存在する免疫複合体の膜結合Ｆｃレセプターに対する結合を阻害する方法であって、該哺乳類に、該免疫複合体への結合に対して膜結合Ｆｃレセプターと競合する可溶性Fcレセプターを導入することを具備し、該導入は、該膜結Ｆｃレセプターに対する免疫複合体の結合が阻止される条件下で実行される方法。１４．請求項１３に記載の方法であって、該免疫複合体はＩｇＧ含有免疫複合体である方法。１５．請求項１３に記載の方法であって、該可溶性レセプターは、本質的に Fcγレセプターもしくはその結合部分の細胞外ドメインからなることを特徴とする方法。１６．請求項１３に記載の方法であって、該可溶性レセプターは、第一Fcγ レセプター型もしくはFc_εレセプター型由来の細胞外ドメイン及び第二のFc γ レセプター型由来の細胞質ドメインからなることを特徴とし、該第一及び第二レセプター型の少なくとも一つがFC γ RIまたはFc γ RIIIのα鎖もしくはγ鎖である方法。１７． Fcレセプターを発現する哺乳類細胞の食作用能力を阻害する方法であって、該細胞中に、5´末端から3´末端への転写方向で、 i）該細胞内で機能的なプロモーターと、 ii）２本鎖DNAのセグメントであって、その転写された一本鎖がFcレセプターをコードする内在的なmRNAに対して相補的な配列を含むものと、 iii）細胞内で機能的な終止配列とを含んだ構築物を導入することを具備し、該構築物は、該相補的鎖が転写されて該内在的mRNAに結合し、これにより該Fcレセプターの発現を減少させ、該細胞の食作用能力を阻害するような条件下で導入される方法。１８．請求項17に記載の方法であって、前記内在的ｍＲＮＡと相補的である配列が、該mRNAの未翻訳領域と相補的である方法。１９．Ｆｃレセプターを発現する哺乳類細胞の食ポテンシャルを阻害する方法であって、該細胞中に、5´末端から3´末端への転写方向で、 i）該細胞内で機能的なプロモーターと、 ii）２本鎖DNAのセグメントであって、その転写された一本鎖がSy kキナーゼをコードする内在的なmRNAと相補的な配列を含むものと、 iii）該細胞内で機能的な終止配列とを有する構築物を導入することを具備し、該構築物は、該相補的鎖が転写されて該内在的mRNAに結合し、これによって該Skyキナーゼの発現を減少させて、該細胞のシグナルリングポテンシャルを阻害されるような条件下で導入される方法。２０．請求項19に記載の方法であって、該方法は、該FcレセプターはFc γ RI、Fc γ RIIAまたはFc γ RIIIAである方法。２１．Ｆｃレセプターを発現する哺乳類細胞の食作用のポテンシャルを阻害する方法であって、該細胞中にSykキナーゼをコードする内在的mRNAと相補的である核酸を導入することを具備し、該核酸は、該mRNAと結合しそれによって該mR NAのSykキナーゼへの転写を阻害するような条件下で導入される方法。２２．請求項21に記載の方法であって、該Fcレセプターは、Fc γ RI、Fc γ RIIAまたはFc γ RIIIAである方法。２３．請求項19記載の方法であって、該配列は、二次構造を持たない該内在的mRNAの領域と相補的である方法。２４．請求項21に記載の方法であって、該核酸は、二次構造を持たない該mR NA領域と相補的である方法。２５．請求項21に記載の方法であって、該核酸はステムループ構造を有している方法。２６．請求項21に記載の方法であって、該核酸は、図５及び６に示された配列を有している方法。２７．Ｆｃレセプターを発現する哺乳類細胞の食作用能力を阻害する方法であって、該細胞に、Ｆｃレセプターをコードする内在的mRNAと相補的な核酸を導入することを具備し、該核酸は、該核酸が該mRNAと結合し、それによって該 mRNAの該FCレセプターへの転写を阻害するような条件下で導入される方法。２８．請求項27に記載の方法であって、該核酸はRNA分子である方法。２９．請求項27に記載の方法であって、該核酸は該mRNAの未翻訳領域と相補的である方法。３０．ＩｇＥレセプターFc_εRIのγサブユニットの信号伝達を阻害する方法であって、該レセプターを担時する細胞中に、該Fc_εRIレセプターもしくはその γサブユニットの信号伝達を活性化させる該細胞の内在的なキナーゼの阻害剤を導入することを具備し、該導入は、該信号伝達が阻害されるような条件下で実行される方法。３１．請求項30に記載の方法であって、該阻害剤は、ペプチドまたはその擬似物である方法。３２．請求項31に記載の方法であって、該ペプチドは、配列Ｙ−２Ｘ−Ｌ(X 2が任意のアミノ酸を示す)を含んでなる方法。３３．請求項32に記載の方法であって、X２が、γ鎖FC_εRIの細胞質ドメインのY−X２−L配列のアミノ酸を示す方法。３４． i）プロモーターと、 ii）２本鎖DNAのセグメントであって、その転写された一本鎖がFc レセプターmRNAと相補的な配列を含むセグメントと、 iii）終止配列とを、5´末端から3´末端への転写方向で具備する構築物であって、該プロモータ、二本鎖ＤＮＡ及び終始配列は機能可能に連結されている構築物。３５．請求項34に記載の構築物を含む細胞であって、該プロモータ及び該終始配列は該細胞中で機能的である構築物。３６．本質的に、FcγまたはFc_εのレセプターまたはその結合部位の細胞外ドメインからなる可溶性Fcレセプター。３７．第一Fcγレセプター型由来の細胞外ドメイン及び第二のFcγレセプター型由来の細胞質ドメインからなる可溶性レセプターであって、該第一第二レセプター型の少なくとも一つは、FcγRIまたはFcγRIIIのαもしくはγ鎖である可溶性レセプター。３８．請求項36に記載の可溶性レセプターをコードするDNA分子。３９．請求項37の可溶性レセプターをコードするDNA分子。４０．本質的に、Fc _γ RIIAまたは、Fc γ RIIIAもしくはFc_εRIのγ鎖の細胞質ドメインあるいはその機能的部分のチロシン含有モチーフからなるペプチド。４１．請求項40に記載のペプチドをコードするDNA分子。４２．請求項40に記載のペプチドを含む細胞。４３．食作用もしくは肥満細胞から分泌されるメデイエータを阻害するペプチドであって、配列Y−X2−L（X2は、Fc _γ RIIAもしくはFc _γ RIIIAあるいはF c_εRIの_γ鎖の細胞質ドメインの−X2−L配列の二つのアミノ酸を示す）を含むFc γ RIIAもしくはFc γ RIIIAあるいはFc_εRIのγ鎖の細胞質ドメインの部分を含んでなるペプチド。４４．請求項１に記載の方法であって、該阻害は、単核球または好中球活性から生じる局部的組織損傷を減らすかまたは防止する方法。４５． Syk産生細胞の食作用を阻害する方法であって、該細胞に、該細胞に存在するsykをコードする配列をターゲットとするアンチセンス構築物またはリボザイムを、Sykの産生を阻止するような条件下で導入することを含んでなる方法。４６．細胞の食作用能力を阻害する方法であって、該方法は、該細胞中に、該阻害が実行されるような条件下でFc _γ RIIBを導入することを含んでなる方法。４７．請求項30に記載の方法であって、該キナーゼはSykキナーゼである方法。４８． IgEレセプターFc_εRIのγサブユニットの信号伝達を阻害する方法であって、該レセプターを担時する細胞中に、該細胞中に存在するSykをコードする配列をターゲットするアンチセンス構築物を、信号伝達が阻害されるような条件下で導入することを含んでなる方法。４９．請求項48に記載の方法であって、該細胞は喘息患者の肺に存在する方法。５０．請求項49に記載の方法であって、該導入は、該構築物を該患者の肺にエアゾールまたは全身的投与によって投与することによって実行される方法。５１．請求項47に記載の方法であって、該阻害剤は、Sykキナーゼの第二ＳＨドメイン及び触媒（キナーゼ）ドメインの間の中間領域をターゲットする方法。５２． Sykキナーゼの中間領域によって媒介される信号伝達を選択的に阻害する能力についてのテスト化合物をスクリーニング（篩い分ける）する方法であって、該化合物を、Syk中間配列からなるポリペプチド及びZAP70中間配列からなるポリペプチドと接触させることと、該化合物が該Syk中間配列またはZap70中間領域と結合するかどうかを決定することを具備し、ここで、該Zap70中間領域配列ではなく該Syk中間領域と結合する化合物が選択的阻害能力を有するものである方法。５３． Syk産生細胞からのメデイエータの分泌を阻害する方法であって、該細胞に、該細胞中に存在するSykをコードする配列をターゲットするアンチセンス構築物またはリボザイム、もしくはSyk中間領域配列によって媒介される信号伝達を選択的に阻害する薬剤を、該阻害が実行されるような条件下で導入することを特徴とする方法。５４．請求項第53項に記載の方法であって、該細胞は喘息患者の肺に存在する方法。５５．図５または図６に記載した配列を担持する核酸。５６． i）プロモーターと、 ii）２本鎖DNAのセグメントであって、その転写された一本鎖が、機能可能に該プロモータに結合されたSykキナーゼmRNAと相補的な配列とを、５´末端から３´末端への転写方向に含んでなるアンチセンス構築物。５７．請求項56に記載の構築物であって、SykキナーゼmRNAと相補的である該配列は、転写開始コドンを囲むかまたは包むSykキナーゼｍＲＮＡの領域と相補的である構築物。５８．請求項56に記載の構築物であって、SykキナーゼmRNAと相補的である該配列は、最小の二次構造を持つSykキナーゼｍＲＮＡの領域と相補的である構築物。５９． Sykキナーゼ中間領域または少なくとも６アミノ酸からなるその一部もしくは擬似物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物。