【発明の詳細な説明】
特定の標的構造に特異的に結合するフェライト及びオリゴヌクレオチドのコンジ
ュゲート
発明の概要
本発明は、請求の範囲の記載を特徴とする対象、即ちコーティング剤で覆われ
た金属酸化物を含むオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関する。これらのコン
ジュゲートは診断及び治療の分野で用いられる。
像形成診断はここ数10年で大きな発展をとげ、発達し続けている。大きな介入
なしに、生きている体の中の血管系、ほとんどの器官及び多くの組織を視覚化す
ることが現在可能である。多くの場合、病気は体内の解剖学的構造の形状、大き
さ及び位置の明らかな変化を導くので、診断される。体の内側からの上述の解剖
学的データは、Ｘ線技術、超音波診断及び磁気共鳴断層撮影法によって得ること
ができる。上述の技術の各々は、結果として生ずる像において、組織及び体液の
自然のコントラストを増強するための医薬剤の使用によりその効能を改良するこ
とができる。問題の医薬剤は、腔又は脈管をコントラストにおいて変化させる目
的で、体腔内に導入され、又は血管に注入される。更に、それらは生体内に血流
によって分散され、器官及び組織の視覚性を変化させることができる。例外的な
場合、このような物質は体内の特定の構造上に結合され、及び／又は活性状態で
輸送され、及び／又はそれから排出される。この場合において、その機能は、個
々の場合において視覚化することもでき、病気の診断に用いることもできる。
NMR診断のための造影剤は、体液のプロトンの緩和時間に影響を
与え、核共鳴像のように目で見ることはできない。粒子において原則として２ク
ラスの物質：常磁性及び超常磁性化合物が区別される。常磁性化合物の場合、そ
れらはほとんどの場合、金属キレート又は安定な遊離ラジカルであり、超常磁性
化合物は、安定化のためほとんどの場合、コーティング剤、例えばポリサッカリ
ド、タンパク質又はシランで覆われたフェライト粒子である（US 4,827,945（Gr
omanらを参照のこと）。それらの強い緩和効果に基づいて、超常磁性造影剤は、
例えばそれらが極めて低量で投与され得る利点を有する。
対照的に、核診断は、それら自体が目で見ることができる物質に基づく。この
場合、遠くまで及ぶ放射線を放射する放射性同位体が体内に導入される。生物内
のこれらの物質の分散は、適切なディテクターによって追跡することができる。
核医療方法の利点は、放射性医薬として示されるシグナル伝達性放射性物質の低
い投与量での高い有効性である。
α−又はβ−放射線又は組織中で有効な他の毒性デグラデーション産物を放出
する同位体が用いられるなら、治療目的、例えば腫瘍の破壊のために放射性医薬
剤も用いることができる。無害な同位体又は物質が体内に導入され、例えば中性
子又はＸ線放射線、超音波又は放射線波により、そこで治療に有効な形態に転化
されるという事実により、同じ目的を達成することもできる。
一般的な問題は、問題の器官及び組織の形状、構造及び循環の著しい変化がな
い時の病理的変化の診断及び局在化である。このような診断及び追跡調査は、例
えば転移についての調査を含む腫瘍の病気の場合、組織への酸素の少い供給の評
価の場合及び特定の感染及び代謝の病気の場合において、決定的に重要なもので
ある。
現在利用できる治療及び像形成診断法は、さもなければ検出でき
ない病理的変化の部位において濃縮された医薬調製物の有用性に本質的に依存す
る。
市販される造影剤はほとんど主にいわゆる非特異的調製物である。それらは、
例えば注入により、それらが導入される空間を広く通過する。
過去に、生きている生物内でのそれらの分散に関して特異性を約束する多数の
物質又は物質のクラスが同定されている。これに関する例は、抗体に加えて、レ
クチン、レセプター結合物質の全ての型、細胞、膜及び膜構成物、核酸、天然の
代謝物及びそれらの誘導体、並びに無数の医薬物質である。オリゴヌクレオチド
は、特別の注意をもって検査されており、また検査されている。
米国特許第 4,707,352号は、放射性同位体との複合分子を標識するための方法
に関するが、金属イオンの結合のために十分に適した複合剤は記載されていない
。
EP-A-0 285 057は、ヌクレオチド複合剤コンジュゲートを記載するが、それは
例えば生体内診断剤又は治療剤としての適用のために用いられるヌクレオチドの
生体内能力のため適切でなく、適合性及び薬物速度の他の要求のいずれにもほと
んど合致しない。
多数の米国特許、例えば米国特許第 4,707,440号は、検出可能な化学基を含む
修飾ポリマーに関する。そのポリマーは、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオ
チドであり得るが、それらは天然のヌクレアーゼによるデグラデーションに対し
て安定でなく、また標的構造に高結合アフィニティーで特異的に結合するように
特別の方法によって選択されない。これらの検出可能な分子の特定の実施形態が
米国特許第 4,843,122号及び第 4,943,523号に言及される。この方法において改
良された個々のヌクレオチドが米国特許第 4,952,685号でクレームされる、像形
成過程におけるこれらの剤の使用が米国
特許第 4,849,208号に開示される。
本発明の目的は、標的構造の検出のために利用できる特異的に結合する剤を作
ることであり、それによって例えば試験管内及び生体内での器官、組織及びそれ
らの病理的変化の視覚化が可能になる。
３′−位又は５′−位において１つのヒドロキシル基により、又は４′−位に
おいて１つのヒドロキシメチル基により還元された、天然のヌクレアーゼによる
デグラデーションを大きく制限する修飾を含む、標的構造に高アフィニティーで
特異的に結合するオリゴヌクレオチド、及びコーティング剤で覆われた、化学修
飾され、必要に応じて放射能標識されたフェラインからなるコンジュゲートがこ
の目的を達成することが現在見い出された。
本発明によるコンジュゲートは、一般式（Ｉ）：
Ｍ−（Ｂ−Ｌ−Ａ−PN）m （Ｉ）
〔式中、Ｎは末端の３′位又は末端の５′位において１つのOH基により還元さ
れた天然のヌクレアーゼによるデグラデーションを大きく制限する修飾を含む標
的構造に高アフィニティーで特異的に結合するオリゴヌクレオチドを意味し；
Ｂは、結合構成物Ｘ−Ｙ−Ｚ（式中、Ｘは直接の結合又は基−NHもしくは−NR
（ここで、ＲはＣ１〜Ｃ４アルキル鎖を意味する）を意味する）を意味し；
Ｙは、直接の結合又はスペーサーを意味し、そしてＺは直接の結合又は硫黄原
子を意味し；
Ｌは、リンカーを意味し；
Ａは、末端の３′−もしくは５′−位に結合した基：
又は４′−位に結合したカルボニル基を意味し；
Ｍは、ポリサッカリドでコートされた、化学的に修飾され、必要に応じて放射
能標識されたフェライトを意味し；そして
ｍは１〜100 の間の数を意味し、
但し基Ｘ，Ｙ及びＺの少くとも１つは直接の結合ではない〕
により示すことができる。
オリゴヌクレオチドＮは５〜200 ヌクレオチド、好ましくは15〜100 ヌクレオ
チドからなる。その構造は、
ａ）互いに独立した糖単位の２′−位が、次の基：
必要に応じて放射能標識されたヒドロキシル基、必要に応じて放射能標識され
た基OR2(式中、Ｒ2は必要に応じて２までのヒドロキシル基を含みそして必要に
応じて１〜５の酸素原子が割り込まれた１〜20炭素原子を有するアルキル基を意
味する)、
水素原子、
フッ素原子、
アミン基、
アミノ基
により占有され、そして３′−及び５′−位に存在するヒドロキシル基は必要に
応じて基Ｒ2でエーテル化され、
及び／又は
ｂ）ヌクレオチド間結合として用いられる互いに独立したホスホジエステルが
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート又はメチルホスホネートにより置換
され、
及び／又は
ｃ）３′−３′−又は５′−５′−位に結合するｂ）に記載されるヌクレオチ
ド間結合を含み
及び／又は
ｄ）３位に存在するＣ2〜Ｃ20ヒドロキシアルキル基によりエステル様に２つ
のチミジンに連結し、又は２′−，３′−又は５′−位において他の糖のヒドロ
キシル基と共にエステル様に、類似して置換されたチミジン基に連結するｂ）に
されるホスホジエステル結合を含み、
及び／又は
ｅ）３′−及び５′−位における末端基が必要に応じて、５までのチミジンに
連結するｂ）に記載される修飾されたヌクレオチド間結合を含む
ことを特徴とする。
オリゴヌクレオチドPNは、他の標的構造に高結合アフィニティーで特異的に結
合し、そしてそれは、ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物を標的構
造と一緒にし、ここで特定のオリゴヌクレオチドは前記オリゴヌクレオチドの混
合物に関して標的構造に高アフィニティーを示し、それを前記オリゴヌクレオチ
ド混合物の残りから分離し、次の標的構造に高アフィニティーを有するオリゴヌ
クレオチドを増幅して、標的構造に結合するオリゴヌクレオチドの増加部分を示
すオリゴヌクレオチドの混合物を得ることにおいて得ることができることを特徴
とする。
好ましくは、オリゴヌクレオチドPNは、他の標的構造に高結合アフィニティー
で特異的に結合し、そしてそれは、
ａ）最初に、このDNA鎖が、RNAポリメラーゼのためのプロモーターに相補的で
あり、同時にポリメラーゼ鎖反応(PCR)のプライマーに相補的である３′末端上
に規定された配列を示し、そしてこの DNA鎖が、ポリメラーゼ鎖反応のためのプ
ライマー配列に相補的である５′末端上に規定された DNA配列を示し、そしてそ
の配列が前記規定された配列間にランダム配列を含むように、化学合成により
DNA鎖が作られ、
ｂ）この DNA鎖は相補 RNA鎖において RNAポリメラーゼの助けにより転移され
、ここでリボース単位の２′−位において修飾されたヌクレオチドが前記ポリメ
ラーゼに供され、
ｃ）そのオリゴヌクレオチドが特異的に結合する標的構造で、この方法におい
て作られた RNAオリゴヌクレオチドが一緒にされ、
ｄ）前記標的構造に結合したこれらのオリゴヌクレオチドが、結合していない
オリゴヌクレオチドから標的構造と一緒に最初に分離され、次にその結合したオ
リゴヌクレオチドが標的構造から再び分離され、
ｅ）これらの標的構造特異的 RNAオリゴヌクレオチドが逆転写酵素により相補
的 DNA鎖に移され、
ｆ）これらの DNA鎖がポリメラーゼ鎖反応で規定されたプライマー配列を用い
ることにより増幅され、
ｇ）次にこの方法で増幅された DNAオリゴヌクレオチドが RNAポリメラーゼに
より、修飾されたヌクレオチドと共に RNAオリゴヌクレオチドに再び移され、
ｈ）上述の選択ステップｃ）〜ｇ）は、標的構造への高結合アフィニティーを
特徴とするオリゴヌクレオチドが十分に選択されるまで必要に応じてしばしばく
り返され、次にこれによって得られたオリゴヌクレオチドの配列が必要に応じて
決定され得ることによって得ることができることを特徴とする。前記標的構造は
、高分子、動物もしくはヒトのような高等生物の組織構造、動物もしくはヒトの
器官もしくは器官の一部、細胞、腫瘍細胞又は腫瘍の中から選択される。
本発明に従って用いることができるオリゴヌクレオチドは、生体内で発生する
ヌクレアーゼによるデグラデーションに対して安定で
ある。
未修飾のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ及
びエキソヌクレアーゼにより、生体内で開裂される。一連の RNAにおけるデグラ
デーション反応は、２′−ヒドロキシル基の活性化で始まる。他の異化酵素は、
例えば RNAのホスホジエステル結合を開裂するリボザイムである（Science 261
，709（1993）を参照のこと）。 RNA誘導体の生体内安定性は、２′−ヒドロキ
シル基の他の置換基への部分的又は完全な交換により増加され得る。このような
置換基は、例えばアルコキシ基、特にメトキシ基（例えば Chem.Pharm.Bull．13
，1273（1965），Biochemistry 10，2581，(1971)を参照のこと）、水素原子、
フッ素原子（例えばCan.J.Chem．46，1131（1965）を参照のこと）又はアミノ基
（例えばJ.Org.Chem．42，714(1977)を参照のこと）。これらの置換基のいくつ
か及び他のものは、1994年７月22日に出願された米国特許出願通し番号08／264,
029 号に記載される方法を用いて２′−位にも導入することができる。ヌクレオ
チド間結合を安定化させる他の可能性は、ホスホロチオエート(Trends Biochem.
Sci 14，97（1989）又はホスホロジチオエート(J.Chem.Soc.，Chem.Commun．591
(1983)及び Nucleic Acids Res．12，9095(1984))の形成を伴うホスホジエステ
ル架橋における１又は２の酸素原子の置換、並びにホスホジエステルのかわりの
アルキルホスホネートの使用（Ann.rep．N.Y．Acad.Sci．507 ，220(1988)）で
ある。
安定化は、互いに独立したリボース単位の２′−位におけるヒドロキシル基が
修飾されることで達成することができる。このような修飾は、このヒドロキシル
基の、OR2基、ハロゲン原子、特にフッ素原子、水素原子又はアミン基、特にア
ミノ基による置換によって達成することができる。アルコキシ基の基Ｒ2は、こ
の場合、必要
に応じて１〜２のヒドロキシ基を含み、そして必要に応じて１〜５の酸素原子が
割り込んだ１〜20のＣ原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基、例えばメ
チル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、tert−ブチル、ペンチルもし
くはヘキシル又は４〜20のＣ原子を有する環式未置換もしくは置換されたアルキ
ル基、例えばシクロペンチルもしくはシクロヘキシルを表す。安定化は、３′−
及び５′−位に存在するヒドロキシル基が基Ｒ2とエーテル化されることでも増
加される。
オリゴヌクレオチドの更なる安定化は、互いに独立してヌクレオチド間結合と
して用いられるホスホジエステルが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
ト又はアルキルホスホネートにより、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、特にメチル基で置換
されることでおこる。これらのヌクレオチド間結合は、３′−及び５′−位にお
いて末端基にも連結することができ、又は３′−３′−もしくは５′−５′−位
にも連結することができる。ホスホジエステル結合は、ヌクレオベースの窒素又
は炭素原子上に存在するヒドロキシアルキル基と可能な結合を更に作る。これに
より、例えば、２つのチミジンは、３−位に存在するヒドロキシアルキル鎖と、
又は２つのプリン塩基は８−位に存在する基と連結することができる。その結合
は、２′−，３′−又は５′−位においてヒドロキシル基においてもおこり得る
。
修飾されたヌクレオチド間結合は、必要に応じて、好ましくはポリヌクレオチ
ドの末端でおこり得、そして特に好ましくはそれらはチミジン上に結合される。
本発明によれば、用いられるオリゴヌクレオチド基Ｎは特定のオリゴヌクレオ
チド配列に限定されない。しかし、標的構造に高結合アフィニティーで特異的に
結合するこれらのオリゴヌクレオチドが
好ましい。
本発明によるコンジュゲートのための出発材料として要求される適切なオリゴ
ヌクレオチドを同定するための方法は、米国特許第 5,270,163号に記載される。
SELEXと呼ばれるこの方法は、いずれかの要求される標的分子に対する核酸リガ
ンドを作るのに用いることができる。
SELEX法は、本質的な結合アフィニティー及び選択性のいずれかの要求される
基準を達成するための、候補のオリゴヌクレオチドの混合物からの選択、並びに
同じ一般的選択スキームを用いる結合、分画及び増幅の段階的な繰り返しに関す
る。核酸の混合物、好ましくはランダム配列のセグメントを含む核酸の混合物か
ら開始して、 SELEX法は、結合に好ましい条件下で、標的と前記混合物を接触さ
せ、標的分子に特異的に結合したこれらの核酸から未結合の核酸を分画し、核酸
−標的複合体を解離させ、前記核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅してリ
ガンドの豊富な核酸の混合物を生成し、次に標的分子に対して高い特異性の高い
アフィニティーの核酸リガンドを生成するのに要求されるだけのサイクルで、前
記結合、分画、解離、及び増幅のステップを繰り返すことを含む。
いくつかの特定の目的を達成するために基本的な SELEX法を改良した。例えば
、1992年10月14日に出願された米国特許出願通し番号07／960,093 号は、曲がっ
た DNAのような特定の構造的特徴を有する核酸分子を選択するためのゲル電気泳
動と組み合わせた SELEXの使用を記載する。1993年９月17日に出願された米国特
許出願通し番号08／123,935 号は、標的分子と結合及び／又は光架橋し及び／又
はそれを光不活性化することができる光反応基を含む核酸リガンドを選択するた
めの SELEXベースの方法を記載する。1993年10月７日に出願された米国特許出願
通し番号08／134,028 号は、 Counter-S
ELEXと呼ばれる密接に関連した分子間を識別することができる高度に特異的な核
酸リガンドを同定するための方法を記載する。1993年10月25日に出願された米国
特許出願通し番号第08／143,564 号は、標的分子について高い及び低いアフィニ
ティーを有するオリゴヌクレオチド間を極めて有効に分画することができる SEL
EXベースの方法を記載する。1992年10月21日に出願された米国特許出願通し番号
07／964,624 号は、 SELEXが行われた後に改良された核酸リガンドを得るための
方法を記載する。1995年３月８日に出願された米国特許出願通し番号08／400,44
0 号は、その標的にリガンドを共有結合させるための方法を記載する。
SELEX法は、生体内安定性の改良又はデリバリー特性の改良のようなリガンド
に改良された特徴を供する修飾されたヌクレオチドを含む高アフィニティー核酸
リガンドの同定を含む。このような修飾の例は、リボース及び／又はホスフェー
ト及び／又は塩基置換基における化学置換基を含む。修飾されたヌクレオチドを
含む SELEXで同定された核酸リガンドは、1993年９月８日に出願された米国特許
出願通し番号08／117,991 号に記載され、それは、ピリミジンの５−及び２′位
で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する
。米国特許出願通し番号08／134,028 号（前掲）は、２′−アミノ(２′−NH2)
、２′−フルオロ（２′−Ｆ）、及び／又は２′−Ｏ−メチル(２′−OMe)で修
飾された１又は複数のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リガンドを記載す
る。1994年６月22日に出願された米国特許出願通し番号08／264,029 号は、種々
の２′修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する。
SELEX法は、各々1994年８月２日に出願された米国特許出願通し番号08／284,0
63 号及び1994年８月28日に出願された通し番号08／
234,997 号記載されるような、他の選択されたオリゴヌクレオチド及び非オリゴ
ヌクレオチド機能単位と、選択されたオリゴヌクレオチドを組み合わせることを
含む。これらの出願は、他の分子の要求される特性を伴うオリゴヌクレオチドの
、広範囲の形状及び他の特性の組合せ、並びに効力ある増幅及び複製特性を許容
する。
その最も基本的な形態において、 SELEX法は、次の一連のステップにより定義
され得る。
１）異なる配列の核酸の候補の混合物を調製する。その候補の混合物は、一般
に、固定された配列の領域（即ち、その候補混合物のメンバーの各々が同じ位置
に同じ配列を含む）及びランダムな配列の領域を含む。その固定された配列の領
域は、（ａ）以下に記載される増幅ステップを助け、（ｂ）標的に結合すること
が知られている配列に似ており、又は（ｃ）候補の混合物中の核酸の所定の構造
的配置の濃度を増加させることのいずれかで選択される。ランダムな配列は、全
体的にランダムである（即ちいずれかの位置において塩基を見い出す可能性が４
分の１である）か、又は部分的にのみランダムである（例えばいずれかの位置で
塩基を見つける可能性が、０〜 100％の間のいずれかのレベルで選択され得る）
。
２）候補の混合物を、標的と該候補混合物との間の結合に好ましい条件下で選
択された標的と接触させる。これらの環境下で、標的と候補混合物の核酸との間
の相互作用は、標的と、その標的に強いアフィニティーを有するこれらの核酸と
、の間の核酸−標的対を形成するとして考慮することができる。
３）標的について最も高いアフィニティーを有する核酸を、標的に対してより
少いアフィニティーを有する核酸から分画する。最も高いアフィニティー核酸に
相当する極めて少数の配列（あるいは１分子の核酸のみ）のみが候補混合物中に
存在するので、候補混合物
中の大量の核酸（約５〜50％）が分画の間、保持されるように分画基準をセット
することが一般に要求される。
４）標的に対して相対的により高いアフィニティーを有するものとして分画に
よって選択された核酸は、次に、標的について相対的により高いアフィニティー
を有する核酸が豊富である新しい候補混合物を作るように増幅される。
５）上述の分画及び増幅ステップをくり返すことにより、新しく形成された候
補混合物は次第に少い特有の配列を含むようになり、そして標的に対する核酸の
アフィニティーの平均的な程度はおおむね増加するだろう。極端な場合、 SELEX
法は、標的分子に対して最も高いアフィニティーを有するもとの候補混合物から
、これらの核酸を代表する特有の核酸の１つ又は少数を含む候補混合物を生成す
るだろう。
SELEXの特許及び出願は、極めて詳細にこの方法を記載し、詳しく述べている
。それには、その方法に用いることができる標的；候補混合物内の核酸を分画す
るための方法；及び豊富な候補混合物を生成するために分画された核酸を増幅す
るための方法が含まれる。 SELEXの特許及び出願は、タンパク質が核酸結合タン
パク質である場合及びそうでない場合の両方のタンパク質標的を含むいくつかの
標的種に対して得られたリガンドも記載する。それゆえ、 SELEX法は、標的分子
の高アフィニティーリガンドを供するのに用いることができる。
標的分子は好ましくはタンパク質であるが、他のものの中では、炭水化物、ペ
プチドグリカン及び種々の小分子も含む。慣用的なタンパク質の抗体と共に、生
物構造の一体化部分である分子との特異的相互作用を通して細胞表面又はウイル
スのような生物構造を標的づけするのに、核酸抗体（オリゴヌクレオチドリガン
ド）を用いる
ことができる。オリゴヌクレオチドリガンドは、慣用的な抗体にあるような自己
耐性により限定されない点で有利である。また、核酸抗体は、 SELEXが全体的に
試験管内方法であるため、合成又は生産のための動物又は細胞培養を必要としな
い。公知であるように、核酸は、相補的な核酸配列と結合することができる。こ
の核酸の特性は、核酸分子の検出、定量及び単離のために広範囲に利用されてい
る。これにより、本発明の方法は、核酸間のこれら公知の結合能力を含むことを
意図しない。詳しくは、核酸抗体の使用に関する本発明の方法は、核酸分子間の
周知の結合アフィニティーを含むことを意図しない。いくつかのタンパク質は、
核酸配列に結合することを通じて機能することが知られている。例えば核酸オペ
レーター配列に結合する調節タンパク質である。特定の核酸結合性タンパク質が
それらの天然の部位に結合する周知の能力は、例えば上述のタンパク質の検出、
定量、単離及び精製に用いられている。オリゴヌクレオチドリガンドの使用に関
する本発明の方法は、核酸結合性タンパク質とそれらが結合することが知られて
いる核酸配列との間の周知の結合アフィニティーを含むことを意図しない。しか
しながら、同じ核酸結合性タンパク質に結合する新規の非天然の配列は、 SELEX
を用いて開発することができる。特に、本発明のオリゴヌクレオチドリガンドは
、支配的にワトソン／クリック塩基対又は三本鎖ヘリックス結合に依存するメカ
ニズムを通して前記オリゴヌクレオチドリガンドに結合するポリヌクレオチド以
外の、三次元化学構造を含む上述の標的分子に結合し、ここで前記オリゴヌクレ
オチドリガンドは標的分子による結合の周知の生理的機能を有する核酸ではない
。
SELEXは、タンパク質に結合するであろう核酸配列の極めて迅速な決定を許容
し、これにより本明細書に記載されるような適用のた
めに用いることができる未知のオペレーター及び結合部位配列の構造を決定する
のに直ちに用いることができることに注目すべきである。これにより SELEXは、
核酸に結合することが知られていないタンパク質の検出、定量、単離及び精製の
ための核酸分子の使用のための一般的な方法である。更に、 SELEXにより単離で
きる特定の核酸抗体は、機能に影響を与えること、例えば特定の標的分子又は構
造の機能を阻害し、増強し、又は活性化するのにも用いることができる。特に核
酸抗体は、タンパク質の機能を阻害し、増強し、又は活性化するのに用いること
ができる。
本発明に従うコンジュゲートに用いられるオリゴヌクレオチドは、以下に記載
される方法に従って好ましい実施形態において得られる。これにより、適切なオ
リゴヌクレオチドは、ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物が、標的
構造、オリゴヌクレオチドの混合物に関して標的構造に対して増加されたアフィ
ニティーを示す特定のオリゴヌクレオチドと一緒にされ、そのオリゴヌクレオチ
ドはオリゴヌクレオチド混合物の残りから分離され、次に標的構造に対して増加
したアフィニティーを有するオリゴヌクレオチドが増幅され、標的構造に結合す
るオリゴヌクレオチドの増加した部分を示すオリゴヌクレオチドの混合物を得る
ことで得ることができる。
その方法において、 DNA鎖は、最初に化学合成により好ましい方法で作られる
。この DNA鎖は、その３′末端上に、 RNAポリメラーゼのためのプロモーターと
して用いられ、同時に、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)のためのプライマー配列に相
補的である周知の配列を有する。この場合の特に好ましい実施形態において、T7
RNAポリメラーゼのためのプロモーターが含まれる。このプロモーターの後に、
そのプロモーター上にランダム配列が合成される。ランダム配列は、４つの適切
な塩基が合成機において同じ比で入れられることで得
ることができる。これにより完全なランダム DNA配列が生じる。ランダム配列の
長さは好ましい実施形態において約15〜100 ヌクレオチドである。ランダム配列
を有するこの DNA断片上で、他の DNA配列が合成され、それはポリメラーゼ鎖反
応(PCR)のために用いることができる。
この DNA鎖の合成の後、それは相補 RNA鎖に対する RNAポリメラーゼによって
移される。この場合の好ましい実施形態において、T7 RNAポリメラーゼが用いら
れる。転写において、これらの修飾されたヌクレオチドは RNAポリメラーゼに供
給される。特に好ましい実施形態において、リボースは２′位において修飾され
る。この場合、アルキル基、好ましくはメトキシ基、アミノ基又はフッ素原子に
よる水素原子又はヒドロキシル基の置換が含まれ得る。次にこの方法において作
られた RNAオリゴヌクレオチドが選択過程に導入される。
選択過程において、標的構造を有する RNAオリゴヌクレオチドが導入される。
標的構造は、そのオリゴヌクレオチドが特異的に高アフィニティーで結合する構
造として定義される。
このような構造は、例えば高分子動物もしくはヒトのような高等生物の組織構
造、器官もしくは器官の一部、特に腫瘍細胞又は腫瘍である。
標的構造は、絶対的に純粋な形態で存在する必要はなく、天然の器官内又は細
胞表面上にも存在し得る。ポリアミノ（tRNA、ヘパリン）、血漿又は全体の血液
を SELEX反応に加えることにより、ストリンジェンシーを選択過程に適用するこ
とができる。
この場合において単離されたタンパク質が含まれるなら、それは固相、例えば
フィルターに結合させることができる。その選択において、 RNA混合物に関する
過剰な標的構造が用いられる。インキュ
ベーションにおいて、特定のオリゴヌクレオチド分子は標的構造に結合し、他方
結合していないオリゴヌクレオチドは例えば洗浄により、その混合物から分離さ
れる。
次に、オリゴヌクレオチド分子は、標的分子から分離され、又は適切な緩衝液
もしくは溶媒で洗浄することにより除去される。
次に逆転写酵素により、見い出された RNAオリゴヌクレオチドは相補的 DNA鎖
に移される。
これにより得られた DNA鎖は両端上にプライマー配列（又はプロモーター配列
）を示すので、見い出された DNA配列の増幅は、ポリメラーゼ鎖反応により同様
に行われ得る。
次に、この方法において増幅された DNAオリゴヌクレオチドが RNAポリメラー
ゼにより再び RNAオリゴヌクレオチドに移され、これにより得られた RNAオリゴ
ヌクレオチドは（上述のように）他の選択ステップに用いられ得る。
標的分子から、第２の選択ステップにおいて得られた結合する RNAオリゴヌク
レオチドを分離した後、それを再び逆転写酵素により DNA内に移され、これによ
り得られた相補的 DNAオリゴヌクレオチドはポリメラーゼ鎖反応により増幅され
、次に RNAポリメラーゼにより RNAオリゴヌクレオチドに転写され、それは更な
る選択ステップのために利用できる。
選択ステップが数回くり返されるなら、要求される高い特異性及び高い結合ア
フィニティーが得られうることが見い出されている。まれには、１又は２の選択
ステップの後に既に要求されるオリゴヌクレオチド配列が得られる。標的構造と
オリゴヌクレオチドとの間の要求される特異性及び結合アフィニティーが得られ
た後すぐに、オリゴヌクレオチドは配列決定され得、それにより、特異的に結合
するオリゴヌクレオチドの配列が決定され得る。
この方法における特別の利点は、適切なタンパク質だけでなく生体内にも用い
られ得ることである。しかし、上述の選択過程は精製された標的構造で行うこと
もできる。しかし、それは、生きている環境における標的構造のためにオリゴヌ
クレオチドの特異性が供される生体内診断のために特に本質的である。それゆえ
、選択過程は、細胞又は細胞培養物で、組織又は組織断片上で、灌流された器官
上で、及び生きている生物上でさえも行うことができる。
この場合、修飾されたオリゴヌクレオチドは、ほとんど偏在する RNAによるデ
グラデーションに耐えることができることが有利である。結果として、適切な天
然のオリゴヌクレオチドが RNAにより異化されるので、要求されるオリゴヌクレ
オチド配列は、生きている生物での選択過程においてそれ自体、濃縮される。
フェライトＭは、安定化のためにポリサッカリド、好ましくはデキストリンで
覆われたシグナル伝達性酸化金属の核からなる（例えばEP 0 186 616(Griesら)
を参照のこと）。本発明によるコンジュゲートの形成のため、ポリサッカリドは
例えばグリコール−スプリッティングにより化学的に修飾される。
フェライトとして、原則的に、 NMR診断のために提唱されるコーティング剤に
より安定化された全ての微結晶性酸化金属が適している。特に超常磁性材料、例
えば Endorem(R)と命名される磁鉄鉱AMI-25(Guerbet Company，Paris)，AMI-227
と命名される磁鉄鉱（Advanced Magnetics Company，Cambridge，Mass.）、米国
特許第 4,101,435（M.Hasegawaら）に従って作られたデキストラン−磁鉄鉱、 U
SPIOもしくはMIONと命名される単一結晶性酸化鉄微少粒子(R.Weisslederら.，Ra
diology（1992）；182 ：381〜385)又は MSMと命名される超常磁性粒子(A.K.Fa
hlvikら、Invest.Radiol.(1990)，25：113〜120)である。好ましいのは、アルカ
リ処理されたポリサッ
カリドで覆われた粒子である〔EP 0 186 616(Griesら)；EP 0 525199（Kitoら）
； WO 92／22586(Hasegawaら)を参照のこと〕。コーティング剤としてグリコサ
ミノグリカンで安定化されたフェライト粒子（例えばEP 0 516 252（M.Kresseら
を参照のこと）も適している。デキストラン−磁鉄鉱が特に好ましい。
本発明によるフェライト又はフェライトコンジュゲートは、金属酸化物核が30
nm未満、好ましくは15nm未満の直径を示す微小粒子の値を有する。
フェライトは、必要に応じて放射性でもあり得る。これにより、例えば、多数
の希土酸化物と混合された鉄の酸化物が周知であり（V.K.Sankaranayananら、 J
.Mater.Sci．1994，29（3）：762〜767）、それは、放射線診断及び／又は放射
線療法のために適した同位体、例えばYb-169又はY-90の組込みにより放射能標識
され得る。この場合、R.Weisslederら(Radiology 1994，191 ：225)により記載
される同時沈殿法が有利に用いられる。
適切な同位体として、例えば放射線診断のためにFe-57，Ga-67，Tc-99m，In-1
11，I-123，Ti-201及びYb-169が、そして放射線療法のためにY-90が言及され得
る。
化学的に修飾されたフェライトＭへのオリゴヌクレオチドＮの結合は、結合要
素Ｂ−Ｌ−Ａ
〔式中、Ｂは結合構成物Ｘ−Ｙ−Ｚ（式中、Ｘは直接の結合又は基−NHもしく
はNR（式中、ＲはＣ１〜Ｃ４アルキル鎖を意味する）であり、Ｙは直接の結合又
はスペーサーであり、そしてＺは直接の結合又は硫黄原子である）であり；
Ｌはリンカーを意味し；そして
Ａは末端の３′−又は５′−位：
上に結合したカルボニル基又は末端の４′−位上に結合したカルボニル基を示す
〕
によりおこる。
基ＡのオリゴヌクレオチドＮとの結合は、ヒドロキシル基により末端の３′−
端又は５′−端上で還元されたオリゴヌクレオチド基上で、又はヒドロキシメチ
ル基により４′−位において還元されたオリゴヌクレオチド基上でおこり、基Ｘ
のフェライトＭとの結合は、官能基を有するフェライト誘導体上でおこる。官能
基として、ホルミル基、カルボニル基、グリシジル基及びアミノ基を例として挙
げることができる。
Ｙがスペーサーを意味する場合、それは、必要に応じて１〜10イミノ、好まし
くは１〜５イミノ、１〜３フェニレン、１〜３フェニレノキシ、１〜10アミド、
１〜２ヒドラジド、１〜10カルボニル、１のスクシニミド、１の６−エチルピリ
ジン−２−イル基を含み、そして必要に応じて、１〜60酸素原子及び／又は１〜
５硫黄原子が割り込まれ、そして必要に応じてカルボキシ、シアノ、ニトロ、ス
ルホニル及び／又はアセチル基により置換された、１〜５ヒドロキシ、１〜10オ
キソ、１〜３カルボキシ、１〜５カルボキシ−Ｃ１〜Ｃ４アルキル、１〜３ヒド
ロキシ−Ｃ１〜Ｃ４アルキル、１〜３Ｃ１〜Ｃ７アルコキシ及び／又は１〜２フ
ェニル基により必要に応じて置換された、直鎖又は分枝鎖の、飽和又は不飽和Ｃ
１〜Ｃ200 、好ましくはＣ１〜Ｃ50アルキレン鎖を表す。
スペーサーＹとしては、次の構造：
を挙げることができる。
リンカーＬは、必要に応じて１〜３イミノ、１〜３オキソ、フェニレン又はフ
ェニレノキシ基を含み、そして必要に応じて１〜６酸素原子及び／又は１〜３硫
黄原子が割り込まれた直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和Ｃ１〜Ｃ20アルキレン鎖
を表す。
次の構造：
が例として挙げられる。
更に、本発明は、本発明によるコンジュゲートの生産のための方法に関する。
本発明による一般式Ｉ：
Ｍ−（Ｂ−Ｌ−Ａ−PN）m （Ｉ）
（式中、PNは、末端の３′−位又は５′−位において１つのヒドロキシル基に
より、又は末端の４′−位において１つのヒドロキシメチル基により還元された
天然のヌクレアーゼによるデグラデーションを大きく制限する修飾を含む標的構
造に対して高アフィニティーで特異的に結合するオリゴヌクレオチドを意味し；
Ｂは結合構成物Ｘ−Ｙ−Ｚ（式中、Ｘは直接の結合又は基−NHも
しくはNR（式中、ＲはＣ１〜Ｃ４アルキレン鎖を意味する）を意味する）を意味
し；
Ｙは直接の結合又はスペーサーを意味し、Ｚは直接の結合又は硫黄原子を意味
し；
Ｌはリンカーを意味し；
Ａは末端の３′−又は５′−位に結合する基：
又は末端の４′−位に結合したカルボニル基を意味し；
Ｍはポリサッカリドでコートされ、化学的に修飾された必要に応じて放射能標
識されたフェライトを意味し；そして
ｍは１〜100の数字を意味し、
但し基Ｘ，Ｙ及びＺの少くとも１つは直接の結合ではない〕
の化合物の生産は、当該技術で周知である方法において、
ａ）一般式II：
Ｍ−（Ｘ−Ｙ′−Ｅ）m （II）
（式中、Ｘ及びｍは上述の意味を有し；そして
Ｅは反応性基を表し；
Ｅ1はＦ，Br，Cl，OTs 又はOMesのような脱離基を表し；そして
Ｙ′はＹと同じ意味を有し；又は
Ｅ2は、
のようなアクセプター基を意味し；そして
Ｙ′はＥ2−Ｈにより還元されたスペーサーＹを意味し；そして
Ｒ1は、水素、Ｃ１〜Ｃ10アルキル又は必要に応じて−OCH3，−CN，−SO2R，
−COCH，−NO2，−Cl，−CO2H，−OCH3，−CF3で置換された、フェニルを表す〕
の化合物を、一般式III：
Ｈ，Ｓ−Ｌ−Ａ−PN （III）
（式中、Ｌ，Ａ及びPNは上述の意味を有する）
の化合物のｍ等量と反応させ、又は
ｂ）上述の一般式（II）
（式中、Ｘ及びＹは各々直接の結合を表し；
Ｅは官能基を表し；
Ｅ3は、ホルミル、カルボキシ、カルボキシアルキル又はグリシジル基を意味
する）
の化合物を、一般式Ｘ：
HX−Ｌ−Ａ−PN （ＸＩ）
（式中、Ｘは−NH又は−NR（式中、Ｒは上述の意味を有する）を表し、そして
、Ｌ，Ａ及びPNは上述の意味を有する）
の化合物のｍ等量と反応させることで行われ、アルデヒド基とのホルミル基の反
応の場合、還元ステップが必要である。
ａ）下に言及される反応は、保護性の気体上で、好ましくはアルゴン下で、室
温で、アルカリpHで、好ましくはpH８〜９で、水性媒体中で行われる。
一般式IIの化合物の生産のために、例えば以下の官能基：
ａ）グリコール−スプリッティングにより得られるホルミル基(G.Jaymeら、B.77
，383(1944)及びB.85，1840(1952))、
ｂ）アルカリ処理により得られるカルボキシル基（米国特許 4,101,435号を参
照のこと）、
ｃ）OH基のカルボキシアルキル化により得られるカルボキシアル
キル基：−Ｏ−(CH2)n−COOH(式中、ｎは１〜１０を意味する)(EP 0 525 199を
参照のこと)、
ｄ）普通の方法に従ってハロヒドリンとのOH基の反応により得られるグリシジ
ル基、又は
ｅ）EP 0 125 995の22ページに示される方法に従って誘導されるアミノ基
を含むポリサッカリドでコートされた化学的に修飾された、必要に応じて放射能
標識されたフェライトから出発材料が作られる。
一般式II（式中、Ｙはスペーサーを表す）の化合物への反応は、例えば以下の
方法：
α）一般式IV：
Ｘ−Ｙ−Ｅ （IV）
（式中、Ｘは−NHを表し、そしてＥは上述の意味を有する）
のｍアミノ化合物での還元剤としてナトリウムシアノボロヒドリドを含む室温で
の水性媒体中でのホルミル基の還元的アミノ化により、
β）例えば好ましくはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドの添加を伴う、中
性条件下での室温での水性媒体中での、一般式IV
（式中、Ｘは−NH又は−NR（式中、Ｒは上述の意味を有する）であり、そして
Ｙ及びＥは上述の意味を有する）
のアミノ化合物との活性化カルボキシル基のカルボジイミドとの反応により、
γ）中性条件下での室温での水性媒体中でのβ）下に言及される意味を有する
一般式IVのアミノ化合物でグリシジル基のエポキシド環を開環することにより、
行うことができる。
一般式IVの化合物は、保護基Ｇを、一般式Ｖ：
Ｇ−Ｘ−Ｙ−Ｅ （Ｖ）
〔式中、Ｘ，Ｙ及びＥは上述の意味を有し；
Ｇは当業者に周知の保護基、例えばtert−ブチル−オキシカルボニル、Fmoc又
はトリフルオロアセチル基を表す（T.W.Greeneら(John Wiley & Sons，New York
1991：Protective Group in Organic Synthesis)を参照のこと）〕
において開裂させることによって得られる。
一般式Ｖの化合物は、一般式VI：
Ｇ−Ｘ−Y1−NRH （VI）
（式中、Ｇ及びＸは上述の意味を有する）
の化合物の、
ａ）一般式VIIａ：
HOOC−CH(R1)−E1 （VIIａ）
（式中、Ｅ1及びＲ1は上述の意味を有し、Ｙ1−NR−CO−CHR1はＹを表す）
の酸と、又は
ｂ）一般式VIIｂ：
HOOC−Y2−E2 （VIIｂ）
（式中、Ｅ2は上述の意味を有し、Ｙ1−NR−CO−Ｙ2はＹを表す）
の酸と
の反応によって得られる。
その反応は、有機溶媒、例えばジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、テト
ラヒドロフラン、ジオキサン又はジクロロメタン中で、−５℃〜50℃の間の温度
で、好ましくは室温で行われる。この場合、その酸基は、当業者に周知である方
法において、例えば酸塩化物としてのチオニルクロライドとの煮沸により活性化
され；また、
混合された無水物も適している〔 Krejcarek及びTucker，Biochem.Biophys.Res.
Commun．77，581(1997)〕。Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、アシルイミ
ダゾールの使用も文献において周知である〔Houben-Weyl，Methoden der organi
schen Chemie〔Methods of Organic Chemistry〕，Georg Thieme Verlag，Stutt
gart，Volune E，５：633(1985)；Org.React.12：157(1962)〕。酸結合剤として
、有機アミン、例えばトリエチルアミン、ピリジン、Ｎ−エチルモルホリンが用
いられる。
一般式VIIａの酸は市販されるか、又は一般式VIII：
HO2C−CH2R1 （VIII）
（式中、Ｒ1は上述の意味を有する）の市販される化合物からも容易に得ること
ができる。これにより、式VIIａのα−ハロゲン酸は、C.Hell，Vol.14：891(188
1)，J.Volhard，A．242 ：141(1887)又はN.Zelinsky，Vol.20：2026，(1887)の
方法に従って臭素元素と前記酸を反応させることによって得られる。その反応の
適切な能力〔C.K.Ingold，Soc.119 ：316(1921)〕により、酸から活性化ハロゲ
ン酸への反応ステップを通り越すことさえ可能である。ω−ハロゲン酸は、ハロ
ゲン化水素で対応するラクトンを開環することによって得ることができる。
一般式VIIｂの酸の生産は、当業者に周知である方法に従って、例えば一般式I
X：
HOOC−Y2−NH2 （IX）
のアミンとの無水マレイン酸の反応により、又は無水マレイン酸での一般式VIII
のアミノカルボン酸の処理により、行われる。
一般VIの部分的に保護されたアミンは、一般式Ｘ：
HX−Y1−XH （Ｘ）
（式中、Ｘ及びＹ1は上述の意味を有する）
の市販の化合物から、例えばジ−ｔ−ブチルピロカルボネートとの反応により〔
Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem.，357 ，1651（1976）〕、得ることができる。
一般式IIIの化合物は、適切なリンカー前駆体との反応により、遊離３′−又
は５′−位を有する部分的に保護されたポリヌクレオチドから、ヌクレオチド化
学の普通の方法(Oligonucleotides and Analogues，A Practical Approach，Ed.
F.Eckstein，Oxford University Press，Oxford，New York，Tokyo，1991)に従
って得られる。これにより、例えばオリゴヌクレオチドの５′−（６−メルカプ
トヘキシルリン酸エステル）は、β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルア
ミノ−Ｓ−トリチル−６−メルカプト−ホスホルアミジトとの縮合、次の形成さ
れた亜リン酸塩のヨウ素でのホスホトリエステルへの酸化、及び次のアンモニア
溶液での標的化合物のＳ−トリチル誘導体への加水分解によって得られる。
更に、２−メルカプトピリジル基及びメルカプトメチル基は、還元的に開裂さ
れ得る硫黄保護基として適切である（T.W.Greene、前掲）。
一般式IIIの化合物は、Pharmacia Companyの自動合成機により、容易に作るこ
とができる（F.Eckstein、前掲を参照のこと）。
Ｙ及びＺが直接の結合である一般式Ｉの化合物は、上述のα〜γ下に記載され
る反応と同様の、一般式ＸＩ：
HX−Ｌ−Ａ−PN （ＸＩ）
〔式中、Ｘは−NH又は−NR（式中、Ｒは上述の意味を有する）であり、そして
Ｌ，Ａ及びＮは上述の意味を有する〕
のアミンとの、ａ）〜ｄ）下に記載される化学的に修飾されたフェライトの反応
によって得られ、そしてこれらのアミンは、ヌクレオチド化学の普通の方法（F.
Ecksteinら、前掲）に従って、例えばシ
アノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−（３，６，９−トリオキサ−11−
フタルイミド−１−ウンデシル）−ホスホルアミジトとの反応によって得ること
ができる(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,86：6230〜6234(1988))。４′−カルボキ
シアミドは、普通の方法によっても得られる。
Ｙ及びＺが直接の結合を意味する一般式Ｉの化合物は、アミノ基の還元的アミ
ノ化によって得られ、例えばJ.Haralambidisら(Bioorg.Med.Chem.Letters，４：
1005〜1010(1994))に従って作られた一般式ＸII：
OHC−Ｌ′−Ａ−PN （ＸII）
（式中、Ａ及びPNは上述の意味を有し、そしてＬ′はメチレン基により還元さ
れた基Ｌを意味する）
の化合物のホルミル基で、Ｍにおける方法に従って導入される。その反応は、好
ましくは、中性pHの水性媒体中で、室温で、そして保護性気体下で行われる。
本発明による医薬剤の生産は、当該技術において周知である方法で、本発明に
従うオリゴヌクレオチド−コンジュゲートにより、必要に応じて通常生薬中の添
加物を加えることにより、水性媒体に懸濁又は溶解し、次にその懸濁液又は溶液
を必要に応じて滅菌し又はろ過により滅菌されて行われる。適切な添加物は、例
えば生理的に無害の緩衝液（例えばクエン酸ナトリウム）、電解質、例えば塩化
ナトリウム、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸もしくはマンニトール（又は他
の浸透活性を有する物質）又は安定剤、例えば乳酸ナトリウムである。
本発明による医薬剤は、好ましくは 0.1μmol ／ｌ〜 0.lmmol／ｌの本発明に
よるオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含み、一般に、0.01nmol／kg〜60μmo
l ／kg、好ましくは５〜20μmol の金属
／kgの量で投与される。
微小粒子の調製物においては、ナノメーター範囲の安定化された粒子を含む金
属酸化物の低粘性コロイド水溶液又は懸濁液が含まれる。微小粒子の溶液は、粒
径に関する非経口物の国際薬局方の要求があるので、いずれの実質的な凝集物も
含まない。
その溶液又は懸濁液は、黒がかった茶の色であり、それは鉄を含む結晶の濃い
色に寄与する。その強調される固有の色は、例えば外科的薬剤中のマーカー物質
として、視覚的な検出のために用いることができる。MR技術での検出のために、
微少粒子は超常磁性であり、又は超常磁性の部分を含む。その粒子は、低い場の
強度の場合でさえ行われ、外部磁石をオフにした後にもはや残った磁化を示さず
、残留磁気を示さない極めて高度に飽和した磁化を物理的に示す。
その微少粒子は溶液として製剤化され（懸濁液）、更に調製を行うことなく、
投与することができる。微少粒子の溶液は通常の医療用溶媒、例えば生理的塩化
ナトリウム溶液、電解質溶液又は糖溶液に適合するので、例えば特別の適用のた
めに、その粒子は意のままに希釈することができ、また注入することができる。
本発明は、更に、標的構造を検出するための方法に関する。この場合、１又は
複数の上述の化合物が、生体内又は試験管内で検査されるべきサンプルと一緒に
される。この場合において、そのオリゴヌクレオチドは、検出されるべき標的構
造に特異的かつ高結合アフィニティーで結合する。
サンプル中に標的構造が存在するなら、それは、シグナルに基づいてそこで検
出され得る。本方法は、特に病気の非侵入的診断に適している。この場合、好ま
しくは放射性同位体で標識された上述の化合物の１又は複数が生体内に投与され
る。シグナルに基づいて、オリゴヌクレオチドが特異的かつ高アフィニティーで
結合する標的
構造が検査されるべき生物中に存在するか否かを検出することができる。
本発明によるコンジュゲート及び剤は、診断剤に課せられる種々の要求に合致
する。それらは、特に問題の標的構造に関する高い特異性又はアフィニティーに
より区別される。周知のオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、本発明に
よるコンジュゲートは、特に高い生体内安定性を示す。これは、２′−ヒドロキ
シ基の置換によって達成された。驚くことに、オリゴヌクレオチドの特異性は、
この修飾によってもフェライトとのカップリングによっても大きく損なわれない
。他の利点は、適合性に関して有利である制御可能な薬物速度及び低投与量であ
る。
オリゴヌクレオチド構成物の特性により、静脈内又は局所的間隙投与後のMRリ
ンパ管造影、腫瘍の視覚化、機能又は障害のある機能の視覚化、プラーク視覚化
（アテローム性硬化症の像形成）、クロット及び脈管閉塞の視覚化、MR血管造影
、灌流テスト、梗塞形成の視覚化、内皮損傷の視覚化、レセプター像形成、血液
脳関門の一体性の視覚化等のような特別の適用のため、び区別的診断、特に腫瘍
／転移及び過形成組織のため、多くの使用の分野が生ずる。
以下の実施例は、本発明の対象をより詳細に説明するために用いられる。
更に詳説することなく、当業者は、先の記載を用いて、その最も十分な程度ま
で、本発明を利用することが確信される。それゆえ、以下の好ましい特定の実施
形態は、単に詳説するためである開示の範囲を限定しないと解釈されるべきであ
る。
上述の及び以下の実施例において、全ての温度はセ氏温度で示され、他に示さ
なければ、全ての部及び割合（％）は重量による。
先の及び後の全ての出願、特許及び出版物の全体の開示は、ある
としても引用による本明細書に組み込まれる。
実施例
実施例Ａ
１−アミノ−３，６，９−トリオキサ−11−（２−ブロモ−２−フェニル−ア
セチルアミノ）−ウンデカン
ａ）１−アミノ−３，６，９−トリオキサ−11−（ｔ−ブチロキシカルボニル
アミノ）−ウンデカン
撹拌しながら、43.65ｇ(200mmol)のジ−ｔ−ブチロキシピロカーボネートを、
乾燥テトラヒドロフラン 200ml中の１，11−ジアミノ−３，６，９−トリオキサ
−ウンデカン 38.45ｇ(200mmol)の溶液に滴下する。それを一晩、撹拌して、次
に真空下で乾燥するまでエバポレートし、シリカゲルでのクロマトグラフィーに
より精製する。溶離液として、酢酸エチルとエタノールとの混合液を用いる。タ
イトル化合物を油として得る。
収率： 40.17ｇ（理論値の68.7％）
元素分析：
計算値：Ｃ 53.41 Ｈ 9.65 Ｎ 9.58
測定値：Ｃ 53.49 Ｈ 9.71 Ｎ 9.51
ｂ）１−（２−ブロモ−２−フェニル−アセチルアミノ）−３，６，９−トリ
オキサ−11−（ｔ−ブチロキシカルボニルアミノ）−ウンデカン
１ａ）下で作られたアミン 29.24ｇ(100mmol)を 300mlのジクロロメタンに溶
かす。それを 10.12ｇ(100mmol)トリエチルアミンと混合し、次に30mlのジクロ
ロメタン中に溶かれされた 23.35ｇ(100mmol)の２−ブロモ−２−フェニル−ア
セチルクロライドを撹拌し、氷水で冷やしながらその中に滴下する。一晩撹拌し
た後、それ
を氷水に注ぎ、その有機溶液を分離してそれを迅速に冷やした２Ｎ塩酸で洗浄し
、次に飽和重炭酸溶液で洗浄し、それを硫酸ナトリウムで乾燥させて、真空下で
乾燥するまでエバポレートする。油としてタイトル化合物を得る。
収率： 41.38ｇ（理論値の87.4％）
元素分析：
計算値：Ｃ 53.28 Ｈ 7.03 Br 16.88 Ｎ 5.92
測定値：Ｃ 53.38 Ｈ 7.15 Br 16.94 Ｎ 5.86
ｃ）１−アミノ−３，６，９−トリオキサ−11−（２−ブロモ−２−フェニル
−アセチルアミノ）−ウンデカン
１ｂ）下で作られたアミノ化合物 28.40ｇ（60mmol）を、撹拌して氷水で冷や
しながら、 100mlのトリフルオロ酢酸及び 10.81ｇ(100mmol)のアニソールに溶
かす。それを更に１時間、室温で撹拌し、その反応の過程を薄層クロマトグラフ
ィーにより検査する。出発材料がもはや存在しないことが示される。それを真空
下でのエバポレーションにより大きく濃縮し、乾燥ヘキサンを加えて撹拌し、そ
のヘキサン相を分離する。その残留物を油ポンプ真空下で乾燥させる。粘性油と
してタイトル化合物のトリフルオロアセテートを得る。
収率： 49.68ｇ（理論値の98.7％）
元素分析：
計算値：Ｃ 42.96 Ｈ 5.21 Br 15.88 Ｆ 11.32 Ｎ 5.57
測定値：Ｃ 43.07 Ｈ 5.27 Br 15.94 Ｆ 11.41 Ｎ 5.50
実施例Ｂ
１−アミノ−11−オキソ−12−アザ−15，18，21−トリオキサ−23−（２−ブ
ロモ−２−フェニル−アセチルアミノ）−トリコサン
ａ）１−アミノ−３，６，９−トリオキサ−12−アザ−13−オキ
ソ−23−（ｔ−ブチロキシカルボニルアミノ）−トリコサミン
30.14ｇ(100mmol)の11−ｔ−ブチロキシカルボニルアミノウンデカン酸を 250
mlの乾燥テトラヒドロフランに溶かす。それを０℃に冷やし、次に撹拌しながら
16.22ｇ(100mmol)のカルボニルジイミダゾールを加え、０℃で更に１時間、撹
拌する。次に、この溶液を 150mlの乾燥テトラヒドロフラン中 28.84ｇ(150mmol
)の１，11−ジアミノ−３，６，９−トリオキサ−ウンデカンの溶液に滴下し、
激しく撹拌する。それを一晩、撹拌し、次に真空下でのエバポレーションにより
濃縮し、その生成物をシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製する。溶
離液として、酢酸エチル及びエタノールの混合液を用いる。シロップとしてタイ
トル化合物を得る。
収率： 37.20（理論値の78.2％）
元素分析：
計算値：Ｃ 60.60 Ｈ 10.38 Ｎ 8.83
測定値：Ｃ 60.69 Ｈ 10.45 Ｎ 8.89
ｂ）１−（２−ブロモ−２−フェニル−アセチルアミノ）−３，６，９−トリ
オキサ−12−アザ−13−オキソ−23−（ｔ−ブチロキシカルボニルアミノ）−ト
リコサン
ａ）下で作られたアミノ化合物 47.57ｇを 400mlのジクロロメタンに溶かす。
それを 10.12ｇ(100mmol)のトリエチルアミンと混合し、０℃に冷やし、次に30m
lのジクロロメタンに溶かした 23.35ｇ(100mmol)の２−ブロモ−２−フェニル−
アセチルクロライドを撹拌及び冷却しながらそれに滴下する。一晩、撹拌した後
、それを氷水に注ぎ、その有機溶液を分離し、それを２Ｎ塩酸で、次に飽和重炭
酸溶液で迅速に洗浄し、それを硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下でのエバポレ
ーションにより濃縮する。粘性油としてタイトル化合物を得る。
収率： 58.46ｇ（理論値の86.9％）
元素分析：
計算値：Ｃ 57.14 Ｈ 8.09 Br 11.88 Ｎ 6.25
測定値：Ｃ 57.01 Ｈ 8.17 Br 11.96 Ｎ 6.37
ｃ）１−アミノ−11−オキソ−12−アザ−15，18，21−トリオキサ−23−（２
−ブロモ−２−フェニル−アセチルアミノ−トリコサン
5.41ｇ（50mmol）のアニソールを 100mlのトリフルオロ酢酸に加える。冷やし
ながら、 14.27mg（30mmol）のｂ）下で作られた化合物を撹拌しながら入れる。
それを室温で更に１時間、撹拌し、次にその反応の過程を薄層クロマトグラフィ
ーによって検査する。反応が完了したことが示される。それを真空下でのエバポ
レーションにより濃縮し、乾燥ヘキサンと混合し、そして水蒸気を排除しながら
撹拌する。そのヘキサン溶液を分離し、その残留物を油ポンプ真空下で乾燥させ
る。トリフルオロアセテートとしてタイトル化合物を得る。
収率：5.91ｇ（理論値の86.1％）
元素分析：
計算値：Ｃ 50.73 Ｈ 6.90 Br 11.64 Ｆ 8.30 Ｎ 6.12
測定値：Ｃ 50.62 Ｈ 6.99 Br 11.72 Ｆ 8.40 Ｎ 6.19
実施例Ｃ
35merオリゴヌクレオチド：
の５′−（６−メルカプト−１−ヘキシル−リン酸エステル）(セリンプロテア
ーゼのための修飾リガンド)
糖単位において、及び５′−結合配列により修飾された、 SELEX法に従って同
定された 35merオリゴヌクレオチド：
5′-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′（米国特許第 5,270,163
号からの配列番号：13）を、通常の方法で、オリゴヌクレオチドが固相支持体の
カラム上にも存在する Pharmacia Companyの自動合成機において生産する(Oligo
nucleotides and Analogues，A Practical Approach，Ed.F.Eckstein，Oxford U
niversity Press，Oxford，New York，Tokyo，1991)。ジクロロメタン中のトリ
クロロ酢酸との反応により、５′−ヒドロキシル基を開裂する。カラムの充填は
、約10mgの 35merオリゴヌクレオチドである。リンカーに結合するために、その
カラムを、テトラゾールの存在下でアセトニトリル中の50μmolのβ−シアノエ
チル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｓ−トリチル−６−メルカプト）−ホス
ホルアミジトの溶液と反応させる。その形成された亜リン酸塩の完全に保護され
たホスホトリエステルへの酸化は、テトロヒドロフラン中のヨウ素でおこる。次
にそのカラムを連続的にメタノール及び水で洗浄する。固体支持体から修飾オリ
ゴヌクレオチドを除去するために、そのカラムの成分をマルチバイアルに移し、
５mlの30％アンモニア溶液と混合し、その容器を密閉して55℃で一晩、振とうす
る。次に０℃まで冷やして、遠心し、その支持体を５mlの水で洗い、その組み合
わせた水性相を凍結乾燥させる。精製のためにその固体材料を２mlの水にとり、
２mlの 0.5Ｍ酢酸アンモニウム溶液と、次に10mlのエタノールと混合する。それ
を−20℃で一晩、放置し、遠心し、その残留物を１mlのエタノール（−20℃）で
洗い、最後に室温で真空下で乾燥させる。９mgのＳ−トリチル化されたタイトル
化合物を得る。そのトリチル保護基を開裂するために、その生成物を 0.5mlの水
に溶かし、 0.1mlの１Ｍ窒化銀溶液と混合して、室温で１時間撹拌する。次に、
それを１Ｍジチオトレイトール溶液 0.1mlと混合する。15分後、それを遠心し、
その上清溶液を酢酸エチルで数回、抽出
する。凍結乾燥した後、その水溶液から８mgの要求されるタイトル化合物を得る
。
注意：＊：ヌクレオチド間結合はメチルホスホネート基である。
実施例Ｄ
35merオリゴヌクレオチド：
の５′−（６−アミノ−ヘキシル−リン酸エステル）
上流配列T*T*T*T*T-３′の修飾及び修飾された糖単位を有する SELEX法に従っ
て同定された5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′を、通常の方法で、 Pha
rmacia Companyの自動合成機において生産し(Oligonucleotides and Analogues
，A Practical Approach，Ed.F.Eckstein，Oxford University Press，Oxford，
New York，Tokyo，1991を参照のこと)、ここでそのオリゴヌクレオチドは固体支
持体のカラム上にも存在する。ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液との反応
により、５′−ヒドロキシル基を開裂させる。カラムの充填量は、 35merオリゴ
ヌクレオチド約10mgである。リンカーに結合するために、そのカラムを、テトラ
ゾールの存在下で（Nucl.Acids.Res．16，2659〜2669（1988）に従って作られた
）β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−６−（トリフルオロアセ
タミド）−１−ヘキシル−ホスホルアミジト50μmol のアセトニトリル溶液と反
応させる。形成された亜リン酸塩の、完全に保護されたホスホトリエステルへの
酸化はテトラヒドロフラン中のヨウ素でおこる。次に、カラムを、メタノール及
び水で連続的に洗う。固体支持体から修飾オリゴヌクレオチドを除去するために
、カラムの成分をマルチバイアルに移し、５mlの30％アンモニア溶液と混合し、
その容器を密封し、55℃で一晩、振とうする。次に０℃に冷やし、遠心して、そ
の支持体を５mlの水で洗い、その組み合わせた水性相を
凍結乾燥させる。精製のため、その固体材料を２mlの水にとり、２mlの 0.5Ｍ酢
酸アンモニウム溶液と混合し、10mlのエタノールと混合し、それを−20℃で一晩
、放置し、遠心して、その残留物を１mlのエタノール（−20℃）で洗い、最後に
室温で真空下で乾燥させる。無色粉体として８mgのタイトル化合物を得る。
実施例１
オリゴヌクレオチド及びカルボキシデキストラン−フェライトからのコンジュ
ゲートの生産（流体力学径≦20nm；充填率（loading factor）ｍ＝26）
Hasegawaら（WO 94／03501 の実施例11）に従うフェライト溶液(108mgの鉄；
108mgのカルボキシデキストラン)2.0mlをメンブランフィルター(カットオフ30
kPa)を有する Amicon Diaflo撹拌セルに加え、限外ろ過する。その保持物を再び
二重蒸留水で満たし、限外ろ過を続ける。その保持物を得て、二重蒸留水で20.0
mlに希釈する。ICP-AES(誘導結合形高周波プラズマ原子発光分光法)での鉄の測
定は、 5.4mg／mlの鉄成分を示し、カルボキシデキストラン成分は 1.6mg／mlと
して測定される(アントロンでの吸光光度分析、Dische Z，Whistler and Wolfro
m，Methods in Carbohydrate Chemistry I，Academic Press，New York，London
，490〜491，1962)。フェライト溶液の活性化のため、10.0ml（54mgの鉄；16mg
のデキストラン）を氷浴中で冷やし、次に 7.6mgのナトリウムペルオキシデート
（Merck，Germany）と混合する。反応を終えた後、ヨウ化物がもはやろ液から測
定され得なくなるまで Amicon Diaflo撹拌セル内で再び限外ろ過する（窒化銀水
溶液での検出、Jander，G.及びBlasius，E
Chemie〔Textbook of Analytical and Preparative Inorganic Chemistry〕，S.
Hirzel.Verlag Stuttgart，161，1979）。生じたアル
デヒドをヒドロキシルアミン（Makromol.Chemic（Macromol.Chemistry）；182；
1641〜1689；1981）で 0.036mmolと測定した。
活性化フェライトを実施例Ａ（69.2mg）に従って（アルデヒド基に関して）５
倍過剰のスペーサーと混合し、30分、撹拌する。未結合のスペーサーの精製を、
30kDaカットオフメンブランでの Amicon Diaflo撹拌セルによって行う。その保
持物を水で真ん中を通して完全に満たし、そのろ液の伝導度が10μＳ／cm未満で
ある限りその精製を続ける。そのろ液を組み合わせ、臭素成分の測定（元素分析
）により未結合のスペーサーを測定する。結合したスペーサーの部分を用いた量
の差によって作り、13.8mgと測定する。
フェライト溶液を 0.1ＮのNaOHでpH 8.5に調節し、保護性気体アルゴン下で、
実施例Ｃに従うオリゴヌクレオチド(711mg)の（スペーサー成分に対して）２倍
過剰量と混合する。その反応溶液を３日間、撹拌し、次に未結合のオリゴヌクレ
オチドを 30kDaカットオフフィルターを有する Amicon Diaflo撹拌セルでのろ過
により分離して回収する。ろ液中の吸光(260nm；標準二重蒸留水)がもはや測定
され得ない場合(OD＜0.002AU)に精製を終える。結合したオリゴヌクレオチドの
測定を、リン酸エステルの無機ホスフェートへの転化（リン酸中での加熱）の後
に破壊的に行い、全部で 355.6mgのオリゴヌクレオチドの結合部分を生成する。
次にオリゴヌクレオチド−フェライト溶液を0.22μｍ孔の膜フィルターによりろ
過し、凍結乾燥させる。
収率：特徴的でない分解点を有する茶色がかった黒色の粉体 460mg
その凍結乾燥物の分析により以下の特徴的な値を供する。
実施例２
オリゴヌクレオチド及びカルボキシデキストラン−フェライトから作られたコ
ンジュゲートの生産（流体力学径＞20nm；充填率ｍ＝45）
Hasegawaら(WO 94／03501の比較例１)（104mgの鉄； 120mgのカルボキシデキ
ストラン）によるフェライト溶液 2.0mlを、実施例のように未結合のカルボキシ
デキストランにより精製する。ICP-AES(誘導結合形高周波プラズマ原子発光分光
法)での鉄測定は 5.2mg／mlの鉄成分を示し、カルボキシデキストラン成分は 1.
7mg／mlとし
て測定された（アントロンでの吸光光度定量）。フェライト溶液の活性化のため
に、10.0ml（50.5mgの鉄；17mgのカルボキシデキストラン）を氷浴内で冷却し、
次に3.03mgの過ヨウ素酸ナトリウム（Merck，Germany）。実施例１のような反応
及び精製の後、 0.014mmolの CHO成分を作る。活性化フェライトは実施例Ｂに従
うスペーサーの（アルデヒド基に関して）５倍過剰量と混合し、実施例１のよう
に処理する。結合したスペーサーの部分は、用いた量の差によって生じ、 8.1と
測定された。そのフェライト溶液を 0.1ＮのNaOHでpH 8.5に調節し、保護性気体
としてのアルゴン下で（スペーサー成分に関して）２倍過剰量の実施例Ｃ）に従
うオリゴヌクレオチド(283mg)と混合し、実施例１と同様のオリゴヌクレオチド
と反応させる。オリゴヌクレオチドの結合した部分は 141.7mgと測定された。次
に、オリゴヌクレオチド−フェライト溶液を、0.22μｍの孔の膜フィルターによ
ってろ過し、凍結乾燥させる。
収率：特徴のない分解点を有する茶色がかった黒色粉体 237mg
その凍結乾燥物の分析は、以下の特徴的な値を供する。
実施例３
クロマトグラフィー予備精製で、オリゴヌクレオチド及びカルボキシデキスト
ラン−フェライトから作られたコンジュゲートの生産（流体力学径＜20nm；充填
率ｍ＝20）
Hasegawaら(WO 94／03501 の実施例１)によるフェライト溶液2.0ml（118mgの
鉄； 150mgのカルボキシデキストラン）を、 Sephadex G-25が充愼され、二重蒸
留水で平衡化されたPD10カラムに適用する。サンプルをゲル内に浸潤させた後、
１mlステップで二重蒸留水で溶出を行う。各々１mlの最初の４画分を収集してプ
ールする。ICP-AES(誘導結合形高周波プラズマ原子発光分光法)での鉄測定は、2
7mg／mlの鉄成分を供し、カルボキシデキストラン成分は23.1mg／mlと測定され
た（アントロンでの吸光光度分析）。
フェライト溶液の活性化のために、3.0ml(81mgの鉄；69.4mgのカルボキシデキ
ストラン)を氷浴中で冷やし、次に 3.3mgの過ヨウ素酸ナトリウム（Merck，Germ
any）と混合する。実施例１の通りの反応及び精製の後、アルデヒド成分 0.015m
molを作る。
活性化フェライトを実施例Ａによるスペーサー（30mg）の（アルデヒド基に関
して）５倍過剰量と混合し、実施例１の通り処理する。結合したスペーサーの部
分を用いた量の差によって作り、６mgと測定した。
フェライト溶液を 0.1ＮのNaOHでpH 8.5に調節し、保護性気体としてのアルゴ
ン下で、実施例Ｃによるオリゴヌクレオチドの（スペーサー成分に関して）２倍
過剰量(308.5mg)と混合し、実施例１と同様のオリゴヌクレオチドと反応させる
。オリゴヌクレオチドの結合部分を 154mgと測定した。
次にそのオリゴヌクレオチドフェライト溶液を0.22μｍの孔のサイズの膜フィ
ルターによってろ過し、凍結乾燥させる。
収率：特徴のない分解点を有する茶色がかった黒色粉体331mg
凍結乾燥物の分析は、以下の特徴的な値を供する。
実施例４
オリゴヌクレオチド及びデキストラン−フェライトから作られたコンジュゲー
トの生産（流体力学径≦20nm；充填率ｍ＝55）
Shen，T.ら（MRM 29； 599〜604；1993）に従うフェライト溶液25.0mlを実施
例１の通り Amicon Diaflo撹拌セルにおいて精製する。ICP-AES(誘導結合形高周
波プラズマ原子発光分光法)でのその保持物中の鉄測定は、3.24mg／mlの鉄成分
を供し、そのデキストラン成分は0.88mg／mlと測定された（アントロンでの吸光
光度分析）。
フェライト溶液の活性化のために、10.0ml（3.24mgの鉄； 8.8mgのデキストラ
ン）を氷浴中で冷却し、次に3.14mgの過ヨウ素酸ナトリウム（Merck，Germany）
と混合する。実施例１の通りの反応及び精製の後、 0.015mmolのアルデヒド成分
を生ずる。
活性化フェライトを実施例Ａに従うスペーサーの（アルデヒド基に関して）５
倍過剰量（28.5mg）と混合し、実施例１の通り処理する。結合したスペーサーの
部分が用いた量の差から生じ、 5.7mgと測定された。
フェライト溶液を 0.1ＮのNaOHでpH 8.5に調節し、保護性気体としてのアルゴ
ン下で実施例Ｃに従うオリゴヌクレオチドの（スペーサー成分に関して）２倍過
剰量(293.3mg)と混合し、実施例１と同様のオリゴヌクレオチドと反応させる。
オリゴヌクレオチドの結合部分を 146.7mgと測定した。
次にオリゴヌクレオチド−フェライト溶液を0.22μｍの孔サイズを有する膜フ
ィルターでろ過し、凍結乾燥させる。
収率：特徴のない分解点を有する茶色がかった黒色粉体208mg
凍結乾燥物の分析は、以下の特徴的な値を供する。
実施例５
オリゴヌクレオチド及びデキストラン−フェライトから作られたコンジュゲー
トの生産（流体力学径＞20nm；充填率ｍ＝56）
10.0mlのフェライト溶液 Endorem(R)（Guerbet GmbH，Germany）(112mgの鉄；
132mgのデキストラン)を実施例１の通り、 Amicon Diaflo撹拌セル内で精製す
る。ICP-AES(誘導結合形高周波プラズマ原子発光分光法)でのその保持物中の鉄
測定は、5.15mg/mlの鉄成分を供し、デキストラン成分は 1.8mg／mlと測定され
た（アントロンでの吸光光度測定）。
フェライト溶液の活性化のため、10.0ml（5.51mgの鉄；18mgのカルボキシデキ
ストラン）を氷浴中で冷やし、次に 0.5mgの過ヨウ素酸ナトリウム（Merck，Ger
many）と混合する。実施例１の通りの反応及び精製の後、 0.002mmolのアルデヒ
ド成分から作られる。
活性化フェライトを実施例Ｂに従うスペーサーの（アルデヒド基に関して）５
倍過剰量(6.7mg)と混合し、実施例１の通り処理する。結合したスペーサーの部
分は用いた量の差により生じ、1.34mgと測定された。
そのフェライト溶液を 0.1ＮのNaOHでpH 8.5に調節し、保護性気体としてのア
ルゴン下で、実施例Ｃによるオリゴヌクレオチドの（スペーサー成分に関して）
２倍過剰量（46.8mg）と混合し、実施例１と同様に、オリゴヌクレオチドと反応
させる。そのオリゴヌクレオチドの結合部分を23.4mgと決定した。
次に、オリゴヌクレオチド−フェライト溶液を0.22μｍ孔サイズの膜フィルタ
ーによってろ過し、凍結乾燥される。
収率：特徴のない分解点を有する茶色がかった黒色の粉体 112mg
凍結乾燥物の分析は、以下の特徴的な値を供する。
実施例６
オリゴヌクレオチド及びデキストラン−フェライトから作られたコンジュゲー
トの生産（流体力学径＞20nm；充填率ｍ＝32）
フェライトAMI-227(Advanced Magnetics Inc.；USA)の凍結乾燥物200mg(44mg
の鉄； 137mgのデキストラン)を２重蒸留水25mlに溶かし、次に実施例１の通り
Amicon Diaflo撹拌セル中で精製する。ICP-AES(誘導結合形高周波プラズマ原子
発光分光法)でのその保持物の鉄測定は 4.3mg／mlの鉄成分を供し、デキストラ
ン成分を 1.9mg／mlと決定した（アントロンでの吸光光度分析）。
フェライト溶液の活性化のため、5.0ml(21.6mgの鉄； 9.5mgのデキストラン）
を氷浴中に冷やし、次に1.13mgの過ヨウ素酸ナトリウム（Merck，Germany）と混
合する。実施例１の通りの反応及び精製の後、 0.005mmolのアルデヒド成分が生
成される。
活性化フェライトを実施例Ａによるスペーサーの（アルデヒド基に関して）５
倍過剰量（10.3mg）と混合し、実施例１の通りに処理する。結合したスペーサー
の部分は用いた量の差により生じ、 2.0mgと決定された。
そのフェライト溶液を 0.1ＮのNaOHでpH 8.5に調節し、保護性気体としてのア
ルゴン下で、実施例Ｃに従うオリゴヌクレオチドの（
スペーサー成分に関して）２倍過剰量(105.5mg)と混合し、実施例１と同様にオ
リゴヌクレオチドと反応させる。そのオリゴヌクレオチドの結合部分は53mgと測
定された。
次にオリゴヌクレオチド−フェライト溶液を0.22μｍ孔サイズの膜フィルター
でろ過し、凍結乾燥させる。
収率：特徴のない分解点を有する茶色がかった黒色粉体94mg
その凍結乾燥物の分析は、以下の特徴的値を供する。
実施例７
オリゴヌクレオチド及びコンドロイチン−４−スルフェート−フ
ェライトから作られたコンジュゲートの生産（流体力学径＞20nm；充填率ｍ＝86
）
EP 0,516,252の実施例１に従うコンドロイチン−４−スルフェート−フェライ
ト 1.0mlを二重蒸留水で１：10に希釈し、 0.1Ｎの HClでpH4.75に調節する。そ
のフェライト溶液を10mlの水中の 9.2mgの EDC〔１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド HCl〕の新しく調製された溶液 1.0mlと混合
し、そのpHを２時間、4.75の一定値に維持する(滴定システムTPC 2000；Schott
，Germany)。 EDCの反応は pH-STAT滴定における酸消費量により追跡することが
でき、活性化酸 2.4μmol として計算される。低分子反応物の分離を 30kDaのカ
ットオフの Amicon Diaflo限外ろ過によって行う。ICP-AES(誘導結合形高周波プ
ラズマ原子発光分光法)でのその保持物での鉄測定は、５mg／mlの鉄成分を供し
、コンドロイチン成分は 2.1mg／mlと測定された（Morgan-Elson，Morgan，W.T.
，及びElson，L.A.，J.Biochem．51，1824，1933に従うヘキソサミン法での吸光
光度分析）。
活性化フェライトを、実施例Ｂに従うスペーサーの（活性化酸基に関して）５
倍過剰量と混合し、実施例１の通り処理する。結合したスペーサーの部分は用い
た量の差によって生じ、 2.7mgと決定された。
そのフェライト溶液を 0.1ＮのNaOHでpH 8.5に調節し、保護性気体としてのア
ルゴン下で、実施例Ｃに従うオリゴヌクレオチドの（スペーサー成分に関して）
２倍過剰量（96mg）と混合し、実施例１と同様にオリゴヌクレオチドと反応させ
る。オリゴヌクレオチドの結合部分は46mgと測定された。
次にオリゴヌクレオチド−フェライト溶液を0.22μｍ孔サイズの膜フィルター
によりろ過し、凍結乾燥させる。
収率：特徴のない分解点を有する茶色がかった黒色の粉体148mg
その凍結乾燥物の分析は以下の特徴的な値を供する。
実施例８
オリゴヌクレオチド及びコンドロイチン−４−スルフェート−フェライトから
作られたコンジュゲートの生産（流体力学径＜20nm；充填率ｍ＝22）
EP 0,516,252の実施例13に従うコンドロイチン−４−スルフェート−フェライ
ト1.0ml(22.4mgの鉄、19.6mgのコンドロイチン−４−スルフェート)を二重蒸留
水で１：200 に希釈し、RS2000タンク及
び100kDaカットオフの中空繊維膜を備えたAmicon限外ろ過ユニット内で二重蒸留
水からろ過して遊離コーティングポリマーを分離する。次に、その溶液を約８ml
まで濃縮し、次に二重蒸留水で10.0mlまで満たす。活性化のため、フェライト溶
液を 0.1Ｎの HClでpH4.75に調節する。次にそのフェライト溶液を10mlの水中 4
.2mgの EDC〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
HCl〕の新しく調製された溶液 1.0mlと混合し、そのpHを２時間、4.75の一定値
に維持する(滴定システムTPC 2000；Schott，Germany)。 EDCの反応は、 pH-STA
T滴定における酸の消費量によって追跡することができ、活性酸の 2.2μmolと計
算される。低分子反応物の分離は、 30kDaのカットオフの Amicon Diaflo限外ろ
過によっておこる。ICP-AES(誘導結合形高周波プラズマ原子発光分光法)でのそ
の保持物の鉄測定は、 1.8mg／mlの鉄成分を供し、コンドロイチン成分は 0.8mg
／mlと決定される（Morgan-Elsonに従うヘキソサミン法の吸光光度分析）。
活性化フェライトを、実施例Ａに従うスペーサーの（アルデヒド基に関する）
５倍過剰量(4.3mg)と混合し、実施例１の通り処理する。結合したスペーサーの
部分は、用いた量の差によって生じ、0.86mgと決定された。
そのフェライト溶液を 0.1ＮのNaOHでpH 8.5に調節し、保護性気体としてのア
ルゴン下で、実施例Ｃに従うオリゴヌクレオチドの（スペーサー成分に関して）
２倍過剰量（44mg）と混合し、実施例１と同様にオリゴヌクレオチドと反応させ
る。オリゴヌクレオチドの結合部分は22mgと測定された。
次にオリゴヌクレオチド−フェライト溶液を0.22μｍ孔サイズの膜フィルター
によってろ過し、凍結乾燥させる。
収率：特徴のない分解点を有する茶色がかった黒色の粉体61.5mg
凍結乾燥物の分析は、以下の特徴的値を供する。
実施例９
オリゴヌクレオチド及びポリカルボキシヘキシルデキストラン−フェライトか
ら作られたコンジュゲートの生産（流体力学径＜20nm；充填率ｍ＝39）
ml当り56mgの鉄の濃度の（WO 94／03501 の実施例11（Hasegawaら）による）
フェライト溶液5.0ml(カルボキシデキストラン60mg／ml)を20mlの２ＮのNaOHで
満たし、還流条件下で80℃に加熱する（マグネチックスターラー）。撹拌しなが
ら、１ｇの６−ブロモヘキサ
ン酸（Aldrich，Germany）をゆっくりと加える。３時間の反応後、それを室温ま
で冷やし、次に約６Ｎ HClでフード下で中和する。精製のために、その酸置換し
たフェライトをエタノール２容量と混合し、その沈殿を遠心して落とす（10分、
1000ｇ）。次に、その沈殿を５mlの二重蒸留水に再び懸濁し、0.22μｍセルロー
スアセテートフィルターを通し、次に 5.0mlの二重蒸留水で満たす。カルボキシ
ルデキストリンの、ヘキサン酸での置換の程度を決定するため、純粋な安定化ポ
リマー（カルボキシデキストラン）上で同じ条件下で反応を行い、その酸基の成
分をポテンシオメトリック滴定により19.9±1.2 ％と決定した。 1.0mlのフェラ
イト溶液（54mgの鉄、48mgのカルボキシデキストラン）を二重蒸留水で５mlに希
釈し、実施例Ａに従うスペーサー 103.8mgと混合し、そして次にその混合物を 0
.1Ｎの HClでpH4.75に調節する。その溶液を10.2mgの EDC-HCl／１mlの二重蒸留
水（新しく調製されたもの）と混合し、そのpHを、自動滴定システム(TPC 2000
，Schott，Germany)により、２時間、pH4.75の一定値に維持する。低分子反応物
及び未結合又は吸着したカルボキシデキストラン安定剤の精製を透析によって行
う(Visking dialyzer tube，Serva，Germany)。結合したスペーサーの部分は、
用いられる量の差によって作られ、20.5mgと決定された。
そのフェライト溶液を 0.1ＮのNaOHでpH 8.5に調節し、保護性気体としてのア
ルゴン下で、実施例Ｃに従うオリゴヌクレオチドの（スペーサー成分に関して）
２倍過剰量（1067mg）と混合し、実施例１と同様に、オリゴヌクレオチドと反応
させる。そのオリゴヌクレオチドの結合部分は533mgと決定された。
次にオリゴヌクレオチド−フェライト溶液を0.22μｍ孔サイズの膜フィルター
によりろ過して、凍結乾燥させる。
収率：特徴のない分解点を有する茶色がかった黒色粉体674mg
凍結乾燥物の分析は、以下の特徴的値を供する。
実施例10
オリゴヌクレオチド及びポリカルボキシメチルデキストラン−フェライトから
作られたコンジュゲートの生産（流体力学径＜20nm；充填率ｍ＝56）
ml当り56mgの鉄の濃度の(WO 94／03501 の実施例11（Hasegawaら）に従う)フ
ェライト溶液5.0ml(カルボキシデキストラン約60mg／ml)を20mlの２ＮのNaOHで
満たす。別個の容器において、 600mgのモノクロロ酢酸を５mlの水に溶かし、 3
40mgの無水炭酸ナトリウム
とゆっくりと混合する。次にその２つの別個の溶液を混合し、65℃で１時間、加
熱する。次に、その溶液をエタノールの２倍容量に注ぐことにより精製を行う。
その沈殿を再び水に溶かし、エタノールで再び沈殿させる。次に、その沈殿を５
mlの水に再分散させ、0.22μｍセルロースアセテートフィルターを通して、次に
二重蒸留水で5.0mlまで満たす。
モノクロロ酢酸のカルボキシメチル基での置換の程度を決定するために、純粋
な安定化ポリマー（カルボキシデキストラン）上で同じ条件下でその反応を行い
、その酸基の成分を、ポテンショメトリック滴定により決定した。平均でグルコ
ース単位当り１のカルボキシメチル基が作られる。
1.0mlのフェライト溶液（53mgの鉄、49mgのカルボキシデキストラン）を二重
蒸留水で５mlに希釈し、実施例Ａによるスペーサー 105.9mgと混合させ、そして
その混合物を 0.1Ｎ のHClでpH4.75に調節する。その溶液を10.2mgの EDC-HCl／
１mlの二重蒸留水（新しく調製されたもの）と混合し、そのpHを自動滴定システ
ム(TPC 2000，Schott，Germany)により、２時間、pH4.75の一定値に維持する。
低分子反応物及び遊離した、密接に結合又は吸着していないカルボキシデキスト
ラン安定剤の精製を透析により行う(Visking dialyzer tube，Serva，Germany)
。結合したスペーサーの部分は、用いた量の差によって作られ、21.2mgと測定さ
れた。
そのフェライト溶液を 0.1ＮのNaOHでpH 8.5に調節し、保護性気体としてのア
ルゴン下で、実施例Ｃに従うオリゴヌクレオチドの（スペーサー成分に関して）
２倍過剰量（1088.9mg）と混合し、実施例１と同様のオリゴヌクレオチドと反応
させる。そのオリゴヌクレオチドの結合部分は 544mgと測定された。
次に、オリゴヌクレオチド−フェライト溶液を0.22μｍ孔サイズ
のメンブランフィルターによってろ過し、凍結乾燥させる。
収率：特徴のない分解点を有する茶色がかった黒色の粉体 687mg
その凍結乾燥物の分析は、以下の特徴的値を供する。
実施例11
オリゴヌクレオチド及びデキストラン−フェライトから作られたコンジュゲー
トの生産（流体力学径＞20nm；充填率ｍ＝65）
フェライトAMI-227(Advanced Magnetics Inc.；USA)の凍結乾燥物200mg(44mg
の鉄； 137mgのデキストラン)を25mlの二重蒸留水に溶かし、次に実施例１の通
りAmicon Diaflo撹拌セル内で精製する
。ICPS（誘導結合形高周波プラズマ原子発光分光法）でのその保持物中の鉄測定
は 4.3mg／mlの一定量の鉄を供し、そのデキストラン成分は 1.9mg／mlと決定さ
れた（アントロンでの吸光光度分析）。フェライト溶液の活性化のために、5.0m
l(21.6mgの鉄； 9.5mgのデキストラン)を氷浴中で冷やし、次に2.26mgの過ヨウ
素酸ナトリウム（Merck，Germany）と混合する。実施例１の通りの反応及び精製
の後、 0.011mmolの CHO成分が作られる。その活性化フェライトを、実施例Ａに
よるスペーサーの（アルデヒド基に関して）５倍過剰量（20.5mg）と混合し、実
施例１の通り処理する。結合したスペーサーの部分は用いた量の差によって作ら
れ、 4.1mgと測定された。
そのフェライト溶液を0.1ＮのNaOHでpH 8.5に調節し、保護性気体としてのア
ルゴン下で、実施例Ｄに従うオリゴヌクレオチドの（スペーサー成分に関して）
２倍過剰量(211.1mg)と混合し、実施例１と同様のオリゴヌクレオチドと反応さ
せる。そのオリゴヌクレオチドの結合部分を 105.6mgと決定した。次にそのオリ
ゴヌクレオチド−フェライト溶液を0.22μｍ孔サイズのメンブランフィルターに
よってろ過し、凍結乾燥する。
その収率は、特徴のない分解点を有する茶色がかった黒色粉体94mgである。
その凍結乾燥物の分析は、以下の特徴的値を供する。
実施例12
オリゴヌクレオチド−磁鉄鉱コンジュゲートの放射能標識溶液の生産
R.Weisslederら(Radiology 1994；191 ：225〜230)に従って作られたインジウ
ム−111 で標識された MION 46−磁鉄鉱の凍結乾燥物 200mgを二重蒸留水で10ml
に溶かす。その溶液を撹拌し、かつ氷浴中で冷やしながら 4.1mgの過ヨウ素酸ナ
トリウムと混合する。20分後、５mlのエチレングリコール：水（１：１（ｖ／ｖ
）を加え、限外ろ過によってYM-300メンブラン（Amicon）により精製する。その
溶液を、室温で撹拌しながら実施例Ａに従って得られたスペーサー 1.8mgと反応
させる。30分後、それを62mgのシアノボロヒドリドと混合し、その溶液を限外ろ
過によって更に30分、精製する。次に 0.1Ｎの水酸化ナトリウム溶液を加えるこ
とによりpH 8.5に調節し、実施例Ｃに従って得られた 35merオリゴヌクレオチド
3.5mgと共に、アルゴン保護性気体下で室温で２時間、反応させる。更なる限外
ろ過の後、その溶液を20mmol／ｌの鉄の濃度に調節する。
凍結乾燥物の分析は、以下の特徴的値を供する。
先の実施例は、一般的に又は特定して記載された反応物を置換し及び／又は先
の実施例に用いられるものについて本発明の条件を操作することによって、同様
の成功がくり返され得る。
先の記載から、当業者は、要旨及びその範囲から離れることなく、本発明の本
質的な特徴を容易に確認することができ、それを種々の利用及び条件に適合させ
るために本発明の種々の変換及び改良を行うことができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Conjugates of ferrites and oligonucleotides that specifically bind to specific target structures. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is directed to objects characterized by the claims, i.e., metal coated with a coating agent. The present invention relates to an oligonucleotide conjugate containing an oxide. These conjugates are used in the fields of diagnosis and therapy. Imaging diagnostics has made great progress in recent decades and has continued to evolve. Without major intervention, it is now possible to visualize the vasculature, most organs and many tissues in the living body. In many cases, the disease is diagnosed because it leads to obvious changes in the shape, size and location of the anatomy in the body. The above anatomical data from inside the body can be obtained by X-ray techniques, ultrasound diagnosis and magnetic resonance tomography. Each of the above techniques can improve its efficacy by using pharmaceutical agents to enhance the natural contrast of tissues and body fluids in the resulting image. The pharmaceutical agent in question is introduced into a body cavity or injected into a blood vessel for the purpose of altering the cavity or vessel in contrast. In addition, they can be dispersed in the body by the bloodstream, altering the visibility of organs and tissues. In exceptional cases, such substances are bound on certain structures in the body and / or are transported in an active state and / or are excreted therefrom. In this case, the function can also be visualized in individual cases and used for diagnosing a disease. Contrast agents for NMR diagnosis affect the relaxation time of protons in body fluids and are not visible like nuclear resonance images. In the particles, two classes of substances are distinguished in principle: paramagnetic and superparamagnetic compounds. In the case of paramagnetic compounds, they are most often metal chelates or stable free radicals, and superparamagnetic compounds are mostly ferrites coated with coatings, such as polysaccharides, proteins or silanes, for stabilization. (US Pat. No. 4,827,945 (see Groman et al.). Based on their strong moderating effect, superparamagnetic contrast agents have the advantage, for example, that they can be administered in very low doses. In contrast, the nucleus Diagnosis is based on substances that are themselves visible, in which case radioactive isotopes that emit far-reaching radiation are introduced into the body, and the dispersion of these substances in the organism is determined by appropriate detectors. The advantage of nuclear medicine methods is the high efficacy of low doses of signaling radioactive substances shown as radiopharmaceuticals If isotopes that release α- or β-radiation or other toxic degradation products effective in tissue are used, radiopharmaceuticals can also be used for therapeutic purposes, eg, for tumor destruction. The same purpose can also be achieved by the fact that harmless isotopes or substances are introduced into the body and are converted there into a therapeutically effective form, for example by neutrons or X-ray radiation, ultrasound or radiation waves. A typical problem is the diagnosis and localization of pathological changes in the absence of significant changes in the shape, structure and circulation of the organs and tissues in question. It is of crucial importance in the case of tumor diseases, including the evaluation of low supply of oxygen to tissues and in the case of certain infectious and metabolic diseases. Diagnostic plasticity essentially depends on the usefulness of a pharmaceutical preparation concentrated at the site of an otherwise undetectable pathological change.The commercially available contrast agents are almost exclusively so-called non-specific preparations. They pass widely through the space into which they are introduced, for example by injection.In the past, a number of substances or classes of substances have been identified that promise specificity with respect to their dispersion in living organisms. Examples in this connection are, in addition to antibodies, lectins, all forms of receptor-binding substances, cells, membranes and membrane components, nucleic acids, natural metabolites and their derivatives, and countless pharmaceutical substances. U.S. Pat. No. 4,707,352 relates to a method for labeling complex molecules with radioisotopes, Complexing agents well-suited for coupling on is not described. EP-A-0 285 057 describes nucleotide conjugation agent conjugates, which are not suitable, for example, due to the in vivo capacity of the nucleotides used for in vivo diagnostic or therapeutic applications, and are not compatible and Few meet any of the other requirements of drug rate. Numerous U.S. Patents, such as U.S. Pat. No. 4,707,440, relate to modified polymers containing detectable chemical groups. The polymers can be polynucleotides and oligonucleotides, but they are not stable to degradation by natural nucleases and are not selected by special methods to specifically bind to the target structure with high binding affinity . Particular embodiments of these detectable molecules are mentioned in U.S. Patent Nos. 4,843,122 and 4,943,523. The use of these agents in the imaging process is disclosed in U.S. Pat. No. 4,849,208, wherein the individual nucleotides modified in this manner are claimed in U.S. Pat. No. 4,952,685. It is an object of the present invention to create a specifically binding agent that can be used for the detection of a target structure so that, for example, visualization of organs, tissues and their pathological changes in vitro and in vivo. Will be possible. Highly targeted structures, including modifications that are greatly reduced by native nucleases, reduced by one hydroxyl group at the 3'- or 5'-position or by one hydroxymethyl group at the 4'-position. It has now been found that a conjugate consisting of an oligonucleotide that specifically binds with affinity and a chemically modified and optionally radiolabeled ferline covered with a coating agent, achieves this purpose. The conjugate according to the invention has the general formula (I): M- (BLA-PN) m (I) wherein N is high affinity and specific for the target structure containing a modification that greatly limits degradation by natural nucleases reduced by one OH group at the terminal 3 'or 5' position B means a binding construct XYZ (where X is a direct bond or a group -NH or -NR, wherein R means a C1-C4 alkyl chain Y means a direct bond or a spacer, and Z means a direct bond or a sulfur atom; L means a linker; A is a terminal 3'- Or a group bonded to the 5'-position: Or a carbonyl group attached at the 4'-position; M represents a chemically modified, optionally radiolabeled ferrite coated with a polysaccharide; and m represents 1 to 100. Wherein at least one of the radicals X, Y and Z is not a direct bond]. Oligonucleotide N consists of 5 to 200 nucleotides, preferably 15 to 100 nucleotides. Its structure is as follows: a) The 2′-position of the sugar units independent of each other is replaced by the following groups: optionally radioactively labeled hydroxyl groups, optionally radioactively labeled groups OR Two (Where R Two Means an alkyl group having 1-20 carbon atoms optionally containing up to 2 hydroxyl groups and optionally interrupted by 1-5 oxygen atoms), a hydrogen atom, a fluorine atom, an amine group, The hydroxyl group occupied by the amino group and present at the 3'- and 5'-positions Two And / or b) the independent phosphodiesters used as internucleotide linkages are replaced by phosphorothioates, phosphorodithioates or methylphosphonates, and / or c) 3'-3'- or 5'- Contains an internucleotide linkage as described in b) attached to the 5'-position and / or d) a C present in the 3-position Two ~ C 20 Linked to two thymidines in an ester-like manner by a hydroxyalkyl group or to an analogously substituted thymidine group in the 2'-, 3'- or 5'-position, like the ester, together with the hydroxyl group of another sugar. and / or e) a modified nucleotide according to b) wherein the terminal groups at the 3'- and 5'-positions are optionally linked to up to 5 thymidine. It is characterized by including inter-coupling. Oligonucleotide PN specifically binds to other target structures with high binding affinity, and it combines a mixture of oligonucleotides containing random sequences with the target structure, where a particular oligonucleotide is a mixture of said oligonucleotides Oligos that show high affinity for the target structure with respect to and separate it from the rest of the oligonucleotide mixture and amplify the oligonucleotides with high affinity for the next target structure, indicating an increased portion of oligonucleotides that bind to the target structure It is characterized in that it can be obtained in obtaining a mixture of nucleotides. Preferably, the oligonucleotide PN specifically binds to other target structures with high binding affinity, and it comprises: a) first, this DNA strand is complementary to a promoter for RNA polymerase, Shows the defined sequence on the 3 'end that is complementary to the primer for the strand reaction (PCR), and the DNA strand is defined on the 5' end that is complementary to the primer sequence for the polymerase chain reaction. A DNA strand is formed by chemical synthesis such that the DNA strand contains a random sequence between the defined sequences, and b) the DNA strand is transferred with the aid of RNA polymerase in a complementary RNA strand. Wherein the nucleotide modified at the 2'-position of the ribose unit is subjected to the polymerase, and c) a label to which the oligonucleotide specifically binds. In structure, the RNA oligonucleotides made in this way are combined, d) those oligonucleotides bound to the target structure are first separated from unbound oligonucleotides together with the target structure, The bound oligonucleotides are again separated from the target structure, e) these target structure-specific RNA oligonucleotides are transferred to complementary DNA strands by reverse transcriptase, and f) these DNA strands are defined in a polymerase chain reaction. G) then the DNA oligonucleotide amplified in this way is retransferred to the RNA oligonucleotide together with the modified nucleotide by RNA polymerase; h) the selection steps c) to above) g) Oligonucleotides characterized by high binding affinity to the target structure Is necessary to be selected sufficiently often repeated returned, then the sequence of the oligonucleotide obtained by this, characterized in that the can be obtained by can be determined as required. The target structure is selected from macromolecules, tissue structures of higher organisms such as animals or humans, organs or parts of organs of animals or humans, cells, tumor cells or tumors. Oligonucleotides that can be used according to the invention are stable against degradation by nucleases that occur in vivo. Unmodified oligonucleotides or polynucleotides are cleaved in vivo by endonucleases and exonucleases. The degradation reaction in a series of RNAs begins with activation of the 2'-hydroxyl group. Other catabolic enzymes are, for example, ribozymes that cleave the phosphodiester bond of RNA (Science 261 , 709 (1993)). The in vivo stability of an RNA derivative can be increased by partial or complete replacement of the 2'-hydroxyl group with another substituent. Such substituents include, for example, alkoxy groups, especially methoxy groups (see, for example, Chem. Pharm. Bull. 13 , 1273 (1965), Biochemistry Ten , 2581, (1971)), a hydrogen atom, a fluorine atom (for example, see Can. J. Chem. 46 , 1131 (1965)) or an amino group (see, for example, J. Org. Chem. 42 , 714 (1977)). Some and other of these substituents may also be introduced at the 2'-position using the method described in U.S. Patent Application Serial No. 08 / 264,029, filed July 22, 1994. Can be. Other possibilities for stabilizing internucleotide linkages include phosphorothioates (Trends Biochem. 14 , 97 (1989) or phosphorodithioate (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 591 (1983) and Nucleic Acids Res. 12 , 9095 (1984)), the replacement of one or two oxygen atoms in a phosphodiester bridge, and the use of alkyl phosphonates instead of phosphodiesters (Ann. Rep. NY. Acad. Sci. 507 , 220 (1988)). Stabilization can be achieved by modifying the hydroxyl group at the 2'-position of the ribose unit, which is independent of each other. Such a modification would result in an OR of this hydroxyl group. Two It can be achieved by substitution with a group, a halogen atom, especially a fluorine atom, a hydrogen atom or an amine group, especially an amino group. Group R of an alkoxy group Two Represents, in this case, a straight-chain or branched alkyl group having 1-20 C atoms, optionally containing 1-2 hydroxy groups, and optionally interrupted by 1-5 oxygen atoms, For example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, tert-butyl, pentyl or hexyl or a cyclic unsubstituted or substituted alkyl group having 4 to 20 C atoms, for example cyclopentyl or cyclohexyl. The stabilization is effected by the hydroxyl groups present at the 3'- and 5'-positions Two It is also increased by etherification. Further stabilization of the oligonucleotides occurs when the phosphodiesters used independently of one another as internucleotide linkages are replaced by phosphorothioates, phosphorodithioates or alkylphosphonates with C1-C6 alkyl, in particular methyl groups. These internucleotide linkages can also be linked to terminal groups at the 3'- and 5'-positions, or to the 3'-3'- or 5'-5'-positions. Phosphodiester linkages further make possible linkages with hydroxyalkyl groups present on the nucleobase nitrogen or carbon atom. Thus, for example, two thymidines can be linked to a hydroxyalkyl chain located at the 3-position, or two purine bases can be linked to a group located at the 8-position. The coupling can also take place at the hydroxyl group at the 2'-, 3'- or 5'-position. The modified internucleotide linkages can optionally occur preferably at the termini of the polynucleotide, and particularly preferably they are attached on thymidine. According to the invention, the oligonucleotide group N used is not limited to a particular oligonucleotide sequence. However, those oligonucleotides that specifically bind to the target structure with high binding affinity are preferred. Methods for identifying suitable oligonucleotides required as starting materials for conjugates according to the invention are described in US Pat. No. 5,270,163. This method, called SELEX, can be used to generate nucleic acid ligands for any required target molecules. The SELEX method involves selecting from a mixture of candidate oligonucleotides and binding, fractionating and amplifying using the same general selection scheme to achieve the required criteria of either intrinsic binding affinity or selectivity. Concerning the stepwise repetition of Starting from a mixture of nucleic acids, preferably a mixture of nucleic acids comprising segments of random sequence, the SELEX method involves contacting said mixture with a target under conditions favorable for binding and binding those nucleic acids specifically bound to the target molecule. From the unbound nucleic acid, dissociate the nucleic acid-target complex, amplify the nucleic acid dissociated from said nucleic acid-target complex to produce a mixture of ligand-rich nucleic acids, Repeating the steps of binding, fractionating, dissociating, and amplifying in as many cycles as required to produce a high specificity, high affinity nucleic acid ligand. The basic SELEX method was modified to achieve some specific objectives. For example, U.S. patent application Ser. No. 07 / 960,093, filed Oct. 14, 1992, discloses SELEX in combination with gel electrophoresis to select nucleic acid molecules having particular structural characteristics, such as bent DNA. Describe use. US patent application Ser. No. 08 / 123,935, filed Sep. 17, 1993, discloses a nucleic acid ligand containing a photoreactive group capable of binding and / or photocrosslinking and / or photoinactivating it with a target molecule. Describes a SELEX-based method for selecting US patent application Ser. No. 08 / 134,028, filed Oct. 7, 1993, discloses a highly specific nucleic acid ligand capable of distinguishing between closely related molecules called Counter-S ELEX. Describe the method. US patent application Ser. No. 08 / 143,564, filed Oct. 25, 1993, describes a SEL EX-based method that can very effectively fractionate between oligonucleotides having high and low affinity for a target molecule. I do. US Patent Application Serial No. 07 / 964,624, filed October 21, 1992, describes a method for obtaining improved nucleic acid ligands after SELEX has been performed. U.S. Patent Application Serial No. 08 / 400,440, filed March 8, 1995, describes a method for covalently attaching a ligand to its target. The SELEX method involves the identification of high affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides that provide improved characteristics to the ligand, such as improved in vivo stability or improved delivery properties. Examples of such modifications include chemical substituents on ribose and / or phosphate and / or base substituents. SELEX-identified nucleic acid ligands containing modified nucleotides are described in U.S. patent application Ser. No. 08 / 117,991, filed Sep. 8, 1993, which includes chemicals at the 5- and 2'-positions of pyrimidine. An oligonucleotide comprising a modified nucleotide derivative is described. U.S. Patent Application Serial No. 08 / 134,028 (supra) discloses 2'-amino (2'-NH Two 2.) Highly specific nucleic acid ligands comprising one or more nucleotides modified with 2, 2'-fluoro (2'-F), and / or 2'-O-methyl (2'-OMe). U.S. Patent Application Serial No. 08 / 264,029, filed June 22, 1994, describes oligonucleotides containing various 2 'modified pyrimidines. The SELEX method is described in U.S. patent application Ser. No. 08 / 284,063, filed on Aug. 2, 1994, and in Ser. No. 08 / 234,997, filed on Aug. 28, 1994, respectively. And combining the selected oligonucleotides and non-oligonucleotide functional units with the selected oligonucleotides. These applications allow a wide range of shapes and combinations of other properties of oligonucleotides with the required properties of other molecules, as well as potent amplification and replication properties. In its most basic form, the SELEX method can be defined by the following sequence of steps. 1) Prepare a mixture of candidate nucleic acids of different sequences. The candidate mixture generally comprises regions of fixed sequence (ie, each of the members of the candidate mixture contains the same sequence at the same position) and regions of random sequence. The region of the immobilized sequence may (a) assist in the amplification step described below, (b) resemble a sequence known to bind to a target, or (c) in a mixture of candidate The choice is made either by increasing the concentration of a given structural arrangement of nucleic acids. A random sequence can be entirely random (ie, one-fourth the likelihood of finding a base at any position), or it can be only partially random (eg, The likelihood of finding can be selected at any level between 0 and 100%). 2) contacting the mixture of candidates with the selected target under conditions favorable for binding between the target and the candidate mixture. Under these circumstances, the interaction between the target and the nucleic acids of the candidate mixture may be considered as forming a nucleic acid-target pair between the target and those nucleic acids that have a strong affinity for that target. it can. 3) Fractionate the nucleic acids with the highest affinity for the target from those with less affinity for the target. Since only a very small number of sequences (or only one molecule of nucleic acid) corresponding to the highest affinity nucleic acid are present in the candidate mixture, a large amount of nucleic acid (about 5-50%) in the candidate mixture is retained during fractionation. It is generally required to set the fractionation criteria as described. 4) The nucleic acids selected by fractionation as having a relatively higher affinity for the target are then amplified to create a new candidate mixture that is rich in nucleic acids having a relatively higher affinity for the target. You. 5) By repeating the fractionation and amplification steps described above, the newly formed candidate mixture will increasingly contain fewer unique sequences and the average degree of nucleic acid affinity for the target will generally increase. Would. In the extreme case, the SELEX method will generate a candidate mixture containing one or a few of the unique nucleic acids that represent these nucleic acids from the original candidate mixture that has the highest affinity for the target molecule. SELEX patents and applications describe and elaborate this method in great detail. It includes a target that can be used in the method; a method for fractionating the nucleic acids in the candidate mixture; and a method for amplifying the fractionated nucleic acids to generate a rich candidate mixture. SELEX patents and applications also describe the resulting ligands for several target species, including both protein targets when the protein is a nucleic acid binding protein and not. Therefore, the SELEX method can be used to provide a high affinity ligand for the target molecule. The target molecule is preferably a protein, but also includes carbohydrates, peptidoglycans and various small molecules, among others. Use of nucleic acid antibodies (oligonucleotide ligands) to target biological structures such as cell surfaces or viruses through specific interactions with molecules that are an integral part of the biological structure, along with conventional protein antibodies Can be. Oligonucleotide ligands are advantageous in that they are not limited by self-resistance as in conventional antibodies. Also, nucleic acid antibodies do not require animal or cell culture for synthesis or production, as SELEX is entirely an in vitro method. As is known, nucleic acids can bind to complementary nucleic acid sequences. This property of nucleic acids is widely used for the detection, quantification and isolation of nucleic acid molecules. Thus, the methods of the invention are not intended to include these known binding capabilities between nucleic acids. In particular, the methods of the invention relating to the use of nucleic acid antibodies are not intended to involve the well-known binding affinity between nucleic acid molecules. Some proteins are known to function through binding to nucleic acid sequences. For example, a regulatory protein that binds to a nucleic acid operator sequence. The well-known ability of specific nucleic acid binding proteins to bind to their natural sites has been used, for example, in the detection, quantification, isolation and purification of the proteins described above. The methods of the present invention relating to the use of oligonucleotide ligands are not intended to include the well-known binding affinity between nucleic acid binding proteins and nucleic acid sequences to which they are known to bind. However, new unnatural sequences that bind to the same nucleic acid binding protein can be developed using SELEX. In particular, the oligonucleotide ligands of the present invention may comprise a target as defined above comprising a three-dimensional chemical structure other than a polynucleotide that binds to said oligonucleotide ligand through a mechanism that relies predominantly on Watson / Crick base pairing or triple-helix binding. Binds to a molecule, wherein said oligonucleotide ligand is not a nucleic acid having the well-known physiological function of binding by a target molecule. SELEX allows for a very rapid determination of the nucleic acid sequence that will bind to a protein, thereby reducing the structure of unknown operator and binding site sequences that can be used for applications as described herein. It should be noted that it can be used immediately to make a decision. SELEX is thus a common method for the use of nucleic acid molecules for the detection, quantification, isolation and purification of proteins that are not known to bind to nucleic acids. In addition, certain nucleic acid antibodies that can be isolated by SELEX can also be used to affect function, eg, inhibit, enhance, or activate the function of a particular target molecule or structure. In particular, nucleic acid antibodies can be used to inhibit, enhance, or activate the function of a protein. The oligonucleotides used in the conjugate according to the invention are obtained in a preferred embodiment according to the method described below. Thus, a suitable oligonucleotide is a mixture of oligonucleotides comprising a random sequence, combined with a specific oligonucleotide that exhibits increased affinity for the target structure with respect to the target structure, mixture of oligonucleotides, and the oligonucleotide Is obtained by separating the oligonucleotides with the increased affinity for the target structure from the remainder of the mixture of oligonucleotides and then amplifying the oligonucleotides to show an increased portion of the oligonucleotides that bind to the target structure be able to. In that method, the DNA strand is first made in a preferred manner by chemical synthesis. This DNA strand has on its 3 'end a well-known sequence that is used as a promoter for RNA polymerase and is complementary to a primer sequence for the polymerase chain reaction (PCR). In a particularly preferred embodiment in this case, a promoter for T7 RNA polymerase is included. After this promoter, a random sequence is synthesized on the promoter. A random sequence can be obtained by placing the four appropriate bases in the same ratio in the synthesizer. This results in a completely random DNA sequence. The length of the random sequence is in a preferred embodiment about 15-100 nucleotides. On this DNA fragment with a random sequence, another DNA sequence is synthesized, which can be used for the polymerase chain reaction (PCR). After synthesis of this DNA strand, it is transferred by RNA polymerase to the complementary RNA strand. In a preferred embodiment in this case, T7 RNA polymerase is used. Upon transcription, these modified nucleotides are supplied to an RNA polymerase. In a particularly preferred embodiment, the ribose is modified at the 2 'position. In this case, replacement of a hydrogen atom or a hydroxyl group by an alkyl group, preferably a methoxy group, an amino group or a fluorine atom, may be included. The RNA oligonucleotide made in this way is then introduced into the selection process. In the selection process, an RNA oligonucleotide having the target structure is introduced. A target structure is defined as a structure to which the oligonucleotide specifically binds with high affinity. Such structures are, for example, tissue structures, organs or parts of organs of higher organisms such as macromolecular animals or humans, in particular tumor cells or tumors. The target structure need not be present in absolutely pure form, but may also be present in a natural organ or on the cell surface. Stringency can be applied to the selection process by adding polyamino (tRNA, heparin), plasma or whole blood to the SELEX reaction. In this case, if an isolated protein is included, it can be attached to a solid phase, such as a filter. In that selection, the excess target structure for the RNA mixture is used. During the incubation, specific oligonucleotide molecules bind to the target structure, while unbound oligonucleotides are separated from the mixture, for example, by washing. The oligonucleotide molecules are then separated from the target molecule or removed by washing with a suitable buffer or solvent. The found RNA oligonucleotide is then transferred to the complementary DNA strand by reverse transcriptase. Since the DNA strand thus obtained shows a primer sequence (or promoter sequence) on both ends, amplification of the DNA sequence found can likewise be carried out by the polymerase chain reaction. The DNA oligonucleotide amplified in this way is then transferred back to the RNA oligonucleotide by RNA polymerase, and the resulting RNA oligonucleotide can be used for another selection step (as described above). After separating the binding RNA oligonucleotide obtained in the second selection step from the target molecule, it is again transferred into the DNA by reverse transcriptase, whereby the complementary DNA oligonucleotide obtained is subjected to the polymerase chain reaction. And then transcribed by RNA polymerase into an RNA oligonucleotide, which is available for further selection steps. It has been found that if the selection step is repeated several times, the required high specificity and high binding affinity can be obtained. In rare cases, the required oligonucleotide sequence is obtained after one or two selection steps. As soon as the required specificity and binding affinity between the target structure and the oligonucleotide is obtained, the oligonucleotide can be sequenced, and thereby the sequence of the specifically binding oligonucleotide can be determined. A particular advantage of this method is that it can be used in vivo as well as the appropriate protein. However, the above selection process can also be performed on a purified target structure. However, it is particularly essential for in vivo diagnostics where the specificity of the oligonucleotide is provided for the target structure in the living environment. Therefore, the selection process can be performed on cells or cell cultures, on tissues or tissue fragments, on perfused organs, and even on living organisms. In this case, it is advantageous that the modified oligonucleotide can withstand degradation due to almost ubiquitous RNA. As a result, the required oligonucleotide sequence is itself enriched during the selection process in living organisms, as the appropriate natural oligonucleotide is catabolized by RNA. Ferrite M consists of a signaling metal oxide core coated with a polysaccharide, preferably dextrin, for stabilization (see, for example, EP 0 186 616 (Gries et al.)). To form a conjugate according to the invention, the polysaccharide is chemically modified, for example, by glycol-splitting. Suitable ferrites are in principle all microcrystalline metal oxides which have been stabilized by the coating agents proposed for NMR diagnosis. Especially superparamagnetic materials such as Endorem (R) Magnetite named AMI-25 (Guerbet Company, Paris), magnetite named AMI-227 (Advanced Magnetics Company, Cambridge, Mass.), Dextran made according to US Pat. No. 4,101,435 (M. Hasegawa et al.) Monocrystalline iron oxide microparticles named magnetite, U SPIO or MION (R. Weissleder et al., Radiology (1992); 182 : 381-385) or superparamagnetic particles designated as MSM (AKFahlvik et al., Invest. Radiol. (1990), twenty five : 113 to 120). Preferred are particles coated with an alkali-treated polysaccharide [see EP 0 186 616 (Gries et al.); EP 0 525199 (Kito et al.); WO 92/22586 (Hasegawa et al.)]. Also suitable as coating agents are ferrite particles stabilized with glycosaminoglycans (see for example EP 0 516 252 (see M. Kresse et al.) Dextran-magnetite is particularly preferred.Ferrite or ferrite conjugate according to the invention Has the value of microparticles in which the metal oxide nuclei exhibit a diameter of less than 30 nm, preferably less than 15 nm.Ferrites can also be radioactive, if desired. Mixed iron oxides are well known (VKSankaranayanan et al., J. Mater. Sci. 1994, 29 (3): 762-767), which can be radiolabeled by incorporation of isotopes suitable for radiodiagnosis and / or radiotherapy, such as Yb-169 or Y-90. In this case, R. Weissleder et al. (Radiology 1994, 191 : 225) is advantageously used. Suitable isotopes include, for example, Fe-57, Ga-67, Tc-99m, In-11, I-123, Ti-201 and Yb-169 for radiodiagnosis, and Y-169 for radiotherapy. 90 may be mentioned. The binding of the oligonucleotide N to the chemically modified ferrite M is determined by the binding element BLA [where B is the binding constituent XYZ (where X is a direct bond or a group- L is NH or NR (where R means a C1-C4 alkyl chain), Y is a direct bond or a spacer, and Z is a direct bond or a sulfur atom); And A is terminal 3'- or 5'-position: A carbonyl group bonded on the top or a carbonyl group bonded on the terminal 4'-position]. The linkage of group A to oligonucleotide N can be on the oligonucleotide group reduced on the terminal 3'- or 5'-end by a hydroxyl group or on the oligonucleotide reduced in the 4'-position by a hydroxymethyl group. Occurs on the nucleotide group and the bond of the group X to the ferrite M occurs on the ferrite derivative having a functional group. Examples of the functional group include a formyl group, a carbonyl group, a glycidyl group and an amino group. When Y means a spacer, it is optionally 1-10 imino, preferably 1-5 imino, 1-3 phenylene, 1-3 phenylenoxy, 1-10 amide, 1-2 hydrazide, 1-10 carbonyl One succinimide, one 6-ethylpyridin-2-yl group and is optionally interrupted by 1 to 60 oxygen atoms and / or 1 to 5 sulfur atoms and optionally contains carboxy, cyano 1-5 hydroxy, 1-10 oxo, 1-3 carboxy, 1-5 carboxy-C1-C4 alkyl, 1-3 hydroxy-C1-C4 alkyl, substituted by nitro, sulfonyl and / or acetyl groups, 1 Straight or branched, saturated or unsaturated C 1 -C 200, optionally substituted with ３3 C 1 -C 7 alkoxy and / or 1-2 phenyl groups, preferably 1~C50 represents an alkylene chain. The following structure is used as the spacer Y: Can be mentioned. The linker L optionally contains 1 to 3 imino, 1 to 3 oxo, phenylene or phenylenoxy groups and optionally 1 to 6 oxygen atoms and / or a straight chain or 1 to 3 sulfur atoms interrupted. Represents a branched, saturated or unsaturated C1-C20 alkylene chain. The following structure: Is given as an example. Furthermore, the invention relates to a method for the production of a conjugate according to the invention. General formula I according to the invention: M- (BLA-PN) m (I) wherein PN is a natural nuclease reduced by one hydroxyl group at the terminal 3'- or 5'-position or by one hydroxymethyl group at the terminal 4'-position. B refers to an oligonucleotide that specifically binds with high affinity to a target structure containing modifications that greatly limit the gradation; B is a binding construct XYZ, wherein X is a direct bond or a group -NH Or NR (wherein R represents a C1-C4 alkylene chain); Y represents a direct bond or a spacer; Z represents a direct bond or a sulfur atom; A means a linker; A is a group bonded to the terminal 3'- or 5'-position: Or a carbonyl group attached to the terminal 4'-position; M represents a polysaccharide coated, chemically modified, optionally radiolabeled ferrite; and m represents 1 to 100 Wherein at least one of the radicals X, Y and Z is not a direct bond.] The production of compounds of the general formula II: M- (X -Y'-E) m (II) wherein X and m have the meanings given above; and E represents a reactive group; 1 Represents a leaving group such as F, Br, Cl, OTs or OMes; and Y 'has the same meaning as Y; Two Is Means an acceptor group such as Two A spacer Y reduced by -H; and R 1 Is hydrogen, C1-C10 alkyl or optionally -OCH Three , −CN, −SO Two R, -COCH, -NO Two , -Cl, -CO Two H, -OCH Three , −CF Three Represented by phenyl substituted with a compound represented by the general formula III: H, S-LA-PN (III) wherein L, A and PN have the above-mentioned meanings. Or b) the general formula (II) described above, wherein X and Y each represent a direct bond; E represents a functional group; Three Is a formyl, carboxy, carboxyalkyl or glycidyl group) of the general formula X: HX-LA-PN (XI), wherein X is -NH or -NR (where R is And L, A and PN have the meanings given above, and in the case of the reaction of a formyl group with an aldehyde group, a reduction step is necessary. a) The reactions mentioned below are carried out in an aqueous medium on a protective gas, preferably under argon, at room temperature, at alkaline pH, preferably at pH 8-9. For the production of compounds of the general formula II, for example, the following functional groups: a) formyl groups obtained by glycol-splitting (G. Jayme et al. 77 383 (1944) and B. 85 B) carboxyl group obtained by alkali treatment (see U.S. Pat. No. 4,101,435); c) carboxyalkyl group obtained by carboxyalkylation of OH group: -O- (CH Two ) n -COOH, wherein n represents 1 to 10 (see EP 0 525 199), d) a glycidyl group obtained by reaction of the OH group with halohydrin according to the usual methods, or e) EP 0 The starting material is made from chemically modified, optionally radiolabeled ferrite coated with a polysaccharide containing amino groups derived according to the method set forth on page 22 of 125 995. The reaction of a compound of general formula II (where Y represents a spacer) can be carried out, for example, by the following method: α) General formula IV: X—Y—E (IV) (where X represents —NH, And E has the meaning given above) by reductive amination of the formyl group in an aqueous medium at room temperature containing sodium cyanoborohydride as a reducing agent with the m-amino compound of the formula (3), for example preferably sulfo-N- General formula IV in an aqueous medium at room temperature under neutral conditions with the addition of hydroxysuccinimide, wherein X is -NH or -NR, where R has the meaning given above And Y and E have the meaning given above) by reacting the activated carboxyl group with the carbodiimide with an amino compound of the formula: γ) under neutral conditions at room temperature at room temperature under β) Glycidi is an amino compound of general formula IV having the meaning mentioned. By opening the epoxide ring of groups, it can be performed. The compounds of the general formula IV can be prepared by converting the protecting group G to a general formula V: G—X—Y—E (V) wherein X, Y and E have the meanings given above; Represents a protecting group such as tert-butyl-oxycarbonyl, Fmoc or a trifluoroacetyl group (see TWGreene et al. (See John Wiley & Sons, New York 1991: Protective Group in Organic Synthesis)). Can be Compounds of general formula V are represented by general formula VI: GXY 1 -NRH (VI) wherein G and X have the meanings given above, a) of the general formula VIIa: HOOC-CH (R 1 ) -E1 (VIIa) (wherein E 1 And R 1 Has the meaning described above, and Y 1 -NR-CO-CHR 1 Represents Y) or b) HOOC-Y of the general formula VIIb: Two -E2 (VIIb) (wherein E Two Has the meaning described above, and Y 1 -NR-CO-Y Two Represents Y). The reaction is carried out in an organic solvent such as dichloromethane, dimethylformamide, tetrahydrofuran, dioxane or dichloromethane at a temperature between -5C and 50C, preferably at room temperature. In this case, the acid groups are activated in a manner well known to the person skilled in the art, for example by boiling with thionyl chloride as acid chloride; mixed anhydrides are also suitable [Krejcarek and Tucker, Biochem. .Biophys. Res. Commun. 77 , 581 (1997)]. The use of N-hydroxysuccinimide esters, acylimidazoles is also well known in the literature [Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie [Methods of Organic Chemistry], Georg Thieme Verlag, Stutt gart, Volune E, 5 : 633 (1985); Org. React. 12 : 157 (1962)]. Organic amines such as triethylamine, pyridine, N-ethylmorpholine are used as acid binders. The acids of general formula VIIa are commercially available or of general formula VIII: HO Two C-CH Two R 1 (VIII) (wherein, R 1 Has the meaning described above). Thus, the α-halogen acids of the formula VIIa can be obtained from C. Hell, Vol. 14 : 891 (188 1); J. Volhard, A .; 242 : 141 (1887) or N. Zelinsky, Vol. 20 : 2026, (1887) by reacting elemental bromine with the acid. The appropriate ability of the reaction [CK Ingold, Soc. 119 : 316 (1921)], it is even possible to go through the reaction step from acid to activated halogen acid. ω-Halogen acids can be obtained by opening the corresponding lactone with hydrogen halide. The production of the acid of general formula VIIb can be carried out according to methods well known to those skilled in the art, for example, general formula IX: HOOC-Y Two −NH Two By reacting maleic anhydride with an amine of (IX) or by treating an aminocarboxylic acid of general formula VIII with maleic anhydride. The partially protected amine of general VI has the general formula X: HX-Y 1 -XH (X) (wherein X and Y 1 Have the meanings mentioned above) from commercially available compounds, for example by reaction with di-tert-butylpyrocarbonate [Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 357 , 1651 (1976)]. Compounds of general formula III can be prepared from partially protected polynucleotides having a free 3'- or 5'-position by reaction with a suitable linker precursor by the usual methods of nucleotide chemistry (Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991). Thus, for example, the 5 '-(6-mercaptohexyl phosphate) of the oligonucleotide was condensed with β-cyanoethyl-N, N-diisopropylamino-S-trityl-6-mercapto-phosphoramidite, followed by formation. Obtained by oxidation of phosphite to phosphotriester with iodine and subsequent hydrolysis of the target compound to an S-trityl derivative in ammonia solution. In addition, 2-mercaptopyridyl and mercaptomethyl groups are suitable as reductively cleavable sulfur protecting groups (TWGreene, supra). Compounds of general formula III can easily be made by an automated synthesizer from the Pharmacia Company (see F. Eckstein, supra). Compounds of the general formula I in which Y and Z are direct bonds can be prepared by reacting a compound of the general formula XI: HX-LA-PN (XI) Is -NH or -NR, wherein R has the meaning given above, and L, A and N have the meaning given above. These amines are obtained by reaction of chemically modified ferrites, and these amines can be prepared according to conventional methods of nucleotide chemistry (F. Eckstein et al., Supra), for example, cyanoethyl-N, N-diisopropylamino- (3,6,9 -Trioxa-11-phthalimido-1-undecyl) -phosphoramidite (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86 : 6230-6234 (1988)). 4'-Carboxamide can also be obtained by a common method. Compounds of the general formula I in which Y and Z represent a direct bond can be obtained by reductive amination of the amino group and are described, for example, in J. Haralambidis et al. (Bioorg. Med. Chem. Letters, 4 : 100-5-1010 (1994)) General formula XII: OHC-L'-A-PN (XII) wherein A and PN have the meanings described above and L 'is reduced by a methylene group The formyl group of the compound of formula (I) is introduced according to the method for M. The reaction is preferably carried out in an aqueous medium at neutral pH, at room temperature and under a protective gas. The production of a pharmaceutical agent according to the invention is carried out in a manner which is well known in the art, by suspending or dissolving it in an aqueous medium by means of the oligonucleotide-conjugate according to the invention, if necessary by adding additives, usually in crude drugs. The suspension or solution is then sterilized as necessary or sterilized by filtration. Suitable additives are, for example, physiologically harmless buffers (eg sodium citrate), electrolytes such as sodium chloride, antioxidants such as ascorbic acid or mannitol (or other substances having osmotic activity) or stabilizers, For example, sodium lactate. The pharmaceutical agent according to the invention preferably comprises from 0.1 μmol / l to 0.1 mmol / l of the oligonucleotide conjugate according to the invention and generally comprises from 0.01 nmol / kg to 60 μmol / kg, preferably from 5 to 20 μmol of metal / It is administered in kg quantities. Microparticle preparations include low viscosity colloidal aqueous solutions or suspensions of metal oxides containing stabilized particles in the nanometer range. The solution of microparticles does not contain any substantial agglomerates due to the requirements of the International Pharmacopoeia of parenterals for particle size. The solution or suspension is dark brown in color, which contributes to the dark color of the iron-containing crystals. The highlighted unique color can be used for visual detection, for example, as a marker substance in a surgical agent. For detection with MR techniques, the microparticles are superparamagnetic or contain a superparamagnetic portion. The particles are performed even at low field strengths and no longer show any remaining magnetization after turning off the external magnet, physically exhibiting a very highly saturated magnetization showing no remanence. The microparticles are formulated as a solution (suspension) and can be administered without further preparation. Since the solution of microparticles is compatible with common medical solvents, such as physiological sodium chloride solution, electrolyte solution or sugar solution, the particles can be diluted at will, e.g. for special applications, and Can be injected. The invention further relates to a method for detecting a target structure. In this case, one or more of the above-mentioned compounds is combined with the sample to be tested in vivo or in a test tube. In this case, the oligonucleotide binds specifically and with high binding affinity to the target structure to be detected. If a target structure is present in the sample, it can be detected there based on the signal. The method is particularly suitable for non-invasive diagnosis of disease. In this case, one or more of the aforementioned compounds, preferably labeled with a radioisotope, are administered in vivo. Based on the signal, it can be detected whether a target structure to which the oligonucleotide binds specifically and with high affinity is present in the organism to be examined. The conjugates and agents according to the invention meet the various requirements imposed on diagnostic agents. They are distinguished by high specificity or affinity, especially for the target structure in question. With respect to the known oligonucleotide conjugates, the conjugates according to the invention show a particularly high in vivo stability. This was achieved by substitution of the 2'-hydroxy group. Surprisingly, the specificity of the oligonucleotide is not significantly impaired by this modification or by coupling with ferrite. Other advantages are controllable drug rates and low dosages that are advantageous with respect to compatibility. Depending on the properties of the oligonucleotide construct, MR lymphangiography after intravenous or local interstitial administration, tumor visualization, visualization of function or impaired function, plaque visualization (imaging of atherosclerosis), For special applications such as visualization of clots and vessel occlusions, MR angiography, perfusion tests, visualization of infarct formation, visualization of endothelial damage, receptor imaging, visualization of blood-brain barrier integrity, etc. Many fields of use arise because of differential diagnosis, especially for tumor / metastasis and hyperplastic tissue. The following examples are used to explain the subject of the present invention in more detail. Without further elaboration, it is believed that one skilled in the art can, using the preceding description, utilize the present invention to its fullest extent. Therefore, the following preferred specific embodiments should not be construed as limiting the scope of the disclosure, which is merely illustrative. In the above and following examples, all temperatures are given in degrees Celsius and, unless otherwise indicated, all parts and percentages (%) are by weight. The entire disclosures of all earlier and later applications, patents and publications are incorporated herein by reference, if any. Examples Example A 1-Amino-3,6,9-trioxa-11- (2-bromo-2-phenyl-acetylamino) -undecane a) 1-amino-3,6,9-trioxa-11- ( t-Butyloxycarbonylamino) -undecane 43.65 g (200 mmol) of di-tert-butyloxypyrocarbonate are stirred with 1,11-diamino-3,6,9-trioxa-undecane in 200 ml of dry tetrahydrofuran 38.45 g (200 mmol) is added dropwise to the solution. It is stirred overnight, then evaporated to dryness under vacuum and purified by chromatography on silica gel. A mixed solution of ethyl acetate and ethanol is used as an eluent. Obtain the title compound as an oil. Yield: 40.17 g (68.7% of theory) Elemental analysis: Calculated: C 53.41 H 9.65 N 9.58 Found: C 53.49 H 9.71 N 9.51 b) 1- (2-Bromo-2-phenyl-acetylamino)- 3,6,9-Trioxa-11- (t-butyloxycarbonylamino) -undecane 29.24 g (100 mmol) of the amine prepared under 1a) are dissolved in 300 ml of dichloromethane. It is mixed with 10.12 g (100 mmol) of triethylamine and then stirred with 23.35 g (100 mmol) of 2-bromo-2-phenyl-acetyl chloride dissolved in 30 ml of dichloromethane, while cooling with ice water. Drip. After stirring overnight, it was poured into ice water, the organic solution was separated and it was quickly washed with cold 2N hydrochloric acid, then with saturated bicarbonate solution, which was dried over sodium sulfate, Evaporate to dryness under vacuum. Obtain the title compound as an oil. Yield: 41.38 g (87.4% of theory) Elemental analysis: Calculated: C 53.28 H 7.03 Br 16.88 N 5.92 Found: C 53.38 H 7.15 Br 16.94 N 5.86 c) 1-Amino-3,6,9-trioxa -11- (2-Bromo-2-phenyl-acetylamino) -undecane 1b) 28.40 g (60 mmol) of the amino compound prepared under 1b) are stirred and cooled with ice-water with 100 ml of trifluoroacetic acid and 10.81 g ( (100 mmol) of anisole. It is stirred for a further hour at room temperature and the course of the reaction is checked by thin-layer chromatography. It shows that the starting material is no longer present. It is concentrated largely by evaporation under vacuum, dry hexane is added and stirred, and the hexane phase is separated. The residue is dried under oil pump vacuum. The title compound trifluoroacetate is obtained as a viscous oil. Yield: 49.68 g (98.7% of theory) Elemental analysis: Calculated: C 42.96 H 5.21 Br 15.88 F 11.32 N 5.57 Found: C 43.07 H 5.27 Br 15.94 F 11.41 N 5.50 Example B 1-amino-11- Oxo-12-aza-15,18,21-trioxa-23- (2-bromo-2-phenyl-acetylamino) -tricosan a) 1-amino-3,6,9-trioxa-12-aza-13- Oxo-23- (t-butyroxycarbonylamino) -tricosamine 30.14 g (100 mmol) of 11-t-butyroxycarbonylaminoundecanoic acid are dissolved in 250 ml of dry tetrahydrofuran. It is cooled to 0 ° C., then 16.22 g (100 mmol) of carbonyldiimidazole are added with stirring and stirred at 0 ° C. for a further hour. This solution is then added dropwise to a solution of 28.84 g (150 mmol) of 1,11-diamino-3,6,9-trioxa-undecane in 150 ml of dry tetrahydrofuran and stirred vigorously. It is stirred overnight, then concentrated by evaporation under vacuum and the product is purified by chromatography on silica gel. A mixture of ethyl acetate and ethanol is used as an eluent. Obtain the title compound as a syrup. Yield: 37.20 (78.2% of theory) Elemental analysis: Calculated: C 60.60 H 10.38 N 8.83 Found: C 60.69 H 10.45 N 8.89 b) 1- (2-Bromo-2-phenyl-acetylamino) -3 , 6,9-Trioxa-12-aza-13-oxo-23- (t-butyloxycarbonylamino) -trichosane a. 47.57 g of the amino compound prepared under a) are dissolved in 400 ml of dichloromethane. It was mixed with 10.12 g (100 mmol) of triethylamine, cooled to 0 ° C., and then 23.35 g (100 mmol) of 2-bromo-2-phenyl-acetyl chloride dissolved in 30 ml of dichloromethane were added thereto with stirring and cooling. Drip. After stirring overnight, it was poured into ice-water, the organic solution was separated, it was washed quickly with 2N hydrochloric acid and then with saturated bicarbonate solution, it was dried over sodium sulfate and dried under vacuum. Concentrate by evaporation. Obtain the title compound as a viscous oil. Yield: 58.46 g (86.9% of theory) Elemental analysis: Calculated: C 57.14 H 8.09 Br 11.88 N 6.25 Found: C 57.01 H 8.17 Br 11.96 N 6.37 c) 1-Amino-11-oxo-12-aza -15,18,21-Trioxa-23- (2-bromo-2-phenyl-acetylamino-tricosan 5.41 g (50 mmol) of anisole are added to 100 ml of trifluoroacetic acid, while cooling 14.27 mg (30 mmol) of b ) Add the compound made below with stirring. It is stirred at room temperature for a further hour and then the course of the reaction is checked by thin-layer chromatography. It indicates that the reaction is complete. It is concentrated by evaporation under vacuum, mixed with dry hexane and stirred while excluding water vapor. The hexane solution is separated and the residue is dried under oil pump vacuum. The title compound is obtained as trifluoroacetate. Yield: 5.91 g (86.1% of theory) Elemental analysis: Calculated: C 50.73 H 6.90 Br 11.64 F 8.30 N 6.12 Found: C 50.62 H 6.99 Br 11.72 F 8.40 N 6.19 Example C 35mer oligonucleotide: 5 '-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphate) (a modified ligand for serine proteases) 35mer oligonucleotides identified according to the SELEX method, modified in the saccharide unit and by the 5'-linking sequence : 5′-T * T * T * T * TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3 ′ (SEQ ID NO: 13 from US Pat. No. 5,270,163) is produced in a conventional manner on an automated synthesizer of the Pharmacia Company, where the oligonucleotides are also present on columns of solid support (Oligo nucleotides). and Analogues, A Practical Approach, Ed.F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991). Reaction with trichloroacetic acid in dichloromethane cleaves the 5'-hydroxyl group. The column packing is about 10 mg of the 35-mer oligonucleotide. To attach the linker, the column is reacted with a solution of 50 μmol of β-cyanoethyl-N, N-diisopropylamino-S-trityl-6-mercapto) -phosphoramidite in acetonitrile in the presence of tetrazole. The oxidation of the phosphite formed to the fully protected phosphotriester occurs with iodine in tetrahydrofuran. The column is then washed successively with methanol and water. To remove the modified oligonucleotide from the solid support, transfer the components of the column to a multivial, mix with 5 ml of a 30% ammonia solution, seal the vessel and shake overnight at 55 ° C. It is then cooled to 0 ° C., centrifuged, the support is washed with 5 ml of water and the combined aqueous phases are lyophilized. For purification, the solid material is taken up in 2 ml of water, mixed with 2 ml of a 0.5 M ammonium acetate solution and then with 10 ml of ethanol. It is left at −20 ° C. overnight, centrifuged, the residue is washed with 1 ml of ethanol (−20 ° C.) and finally dried under vacuum at room temperature. 9 mg of S-tritylated title compound are obtained. To cleave the trityl protecting group, the product is dissolved in 0.5 ml of water, mixed with 0.1 ml of a 1M silver nitride solution and stirred at room temperature for 1 hour. Then it is mixed with 0.1 ml of a 1 M dithiothreitol solution. After 15 minutes, it is centrifuged and the supernatant solution is extracted several times with ethyl acetate. After lyophilisation, 8 mg of the required title compound are obtained from the aqueous solution. Note: *: Internucleotide linkage is a methylphosphonate group. Example D 35mer oligonucleotide: 5 '-(6-amino-hexyl-phosphate ester) 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA- identified by the SELEX method having a modification of the upstream sequence T * T * T * T * T-3' and a modified sugar unit 3 'is produced in the usual manner on an automated synthesizer of the Pharmamacia Company (see Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991). ), Wherein the oligonucleotide is also present on a column of a solid support. The 5'-hydroxyl group is cleaved by reaction with a solution of trichloroacetic acid in dichloromethane. The column loading is about 10 mg of the 35-mer oligonucleotide. In order to attach the linker, the column was loaded in the presence of tetrazole with β-cyanoethyl-N, N-diisopropylamino-6- (made according to Nucl. Acids. Res. 16, 2659-2669 (1988)). (Trifluoroacetamide) -1-hexyl-phosphoramidite 50 μmol of acetonitrile solution. Oxidation of the phosphite formed to the fully protected phosphotriester occurs with iodine in tetrahydrofuran. Next, the column is washed successively with methanol and water. To remove the modified oligonucleotide from the solid support, transfer the components of the column to a multivial, mix with 5 ml of 30% ammonia solution, seal the vessel and shake at 55 ° C. overnight. It is then cooled to 0 ° C., centrifuged, the support is washed with 5 ml of water and the combined aqueous phases are lyophilized. For purification, take the solid material in 2 ml of water, mix with 2 ml of 0.5 M ammonium acetate solution, mix with 10 ml of ethanol, leave it at −20 ° C. overnight, centrifuge and remove the residue. Wash with 1 ml ethanol (−20 ° C.) and finally dry under vacuum at room temperature. 8 mg of the title compound are obtained as a colorless powder. Example 1 Production of conjugate from oligonucleotide and carboxydextran-ferrite (hydrodynamic diameter ≦ 20 nm; loading factor m = 26) Ferrite solution (108 mg) according to Hasegawa et al. (Example 11 of WO 94/03501) 2.0 ml of 108 mg of carboxydextran) is added to an Amicon Diaflo stirred cell with a membrane filter (cut off 30 kPa) and ultrafiltered. The retentate is refilled with double distilled water and ultrafiltration is continued. The retentate is obtained and diluted to 20.0 ml with double distilled water. The measurement of iron by ICP-AES (inductively coupled high frequency plasma atomic emission spectroscopy) shows that the iron component is 5.4 mg / ml, and the carboxydextran component is 1.6 mg / ml (spectrophotometric analysis with anthrone) Dische Z, Whistler and Wolfrom, Methods in Carbohydrate Chemistry I, Academic Press, New York, London, 490-491, 1962). For activation of the ferrite solution, 10.0 ml (54 mg of iron; 16 mg of dextran) are cooled in an ice bath and then mixed with 7.6 mg of sodium peroxidate (Merck, Germany). After the reaction has been completed, ultrafiltration is again performed in an Amicon Diaflo stirred cell until iodide can no longer be measured from the filtrate (detection in aqueous silver nitride, Jander, G. and Blasius, E Chemie [Textbook of Analytical and Preparative Inorganic Chemistry], S. Hirzel. Verlag Stuttgart, 161, 1979). The resulting aldehyde was measured as 0.036 mmol with hydroxylamine (Makromol. Chemic (Macromol. Chemistry); 182; 1641 to 1689; 1981). The activated ferrite is mixed according to Example A (69.2 mg) with a 5-fold excess (for aldehyde groups) of the spacer and stirred for 30 minutes. Purification of the unbound spacer is performed by an Amicon Diaflo stirred cell with a 30 kDa cut-off membrane. The retentate is completely filled with water through the middle and the purification is continued as long as the conductivity of the filtrate is less than 10 μS / cm. The filtrates are combined, and unbound spacers are measured by bromine component measurement (elemental analysis). It is made by the difference in the amount using the bound spacer part and measures 13.8 mg. The ferrite solution is adjusted to pH 8.5 with 0.1 N NaOH and mixed with a 2-fold excess (relative to the spacer component) of the oligonucleotide according to Example C (711 mg) under protective gaseous argon. The reaction solution is stirred for 3 days, then unbound oligonucleotide is separated and recovered by filtration through an Amicon Diaflo stirred cell with a 30 kDa cut-off filter. If the absorbance in the filtrate (260 nm; standard double distilled water) can no longer be measured (OD <0.002 AU), the purification is terminated. The measurement of the bound oligonucleotide is made destructively after the conversion of the phosphate ester to inorganic phosphate (heating in phosphoric acid), producing a total of 355.6 mg of the binding moiety of the oligonucleotide. The oligonucleotide-ferrite solution is then filtered through a 0.22 μm pore membrane filter and lyophilized. Yield: 460 mg of a brownish black powder with an uncharacteristic decomposition point. Analysis of the lyophilizate gives the following characteristic values: Example 2 Production of conjugates made from oligonucleotides and carboxydextran-ferrite (hydrodynamic diameter> 20 nm; packing m = 45) Hasegawa et al. (Comparative Example 1 of WO 94/03501) (104 mg iron; 2.0 ml of ferrite solution with carboxydextran) is purified with unbound carboxydextran as in the examples. Iron measurement by ICP-AES (Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy) showed an iron content of 5.2 mg / ml and a carboxydextran content of 1.7 mg / ml (absorption spectrophotometric determination with anthrone). . For activation of the ferrite solution, 10.0 ml (50.5 mg of iron; 17 mg of carboxydextran) are cooled in an ice bath, then 3.03 mg of sodium periodate (Merck, Germany). After reaction and purification as in Example 1, 0.014 mmol of the CHO component is made. The activated ferrite is mixed with a 5-fold excess (with respect to the aldehyde groups) of the spacer according to Example B and treated as in Example 1. The portion of the bound spacer caused by the difference in the amounts used and measured 8.1. The ferrite solution was adjusted to pH 8.5 with 0.1 N NaOH and mixed with a 2-fold excess (with respect to the spacer component) of an oligonucleotide according to Example C) (283 mg) under argon as protective gas, as in Example 1. With the same oligonucleotide. The bound portion of the oligonucleotide was determined to be 141.7 mg. The oligonucleotide-ferrite solution is then filtered through a 0.22 μm pore membrane filter and lyophilized. Yield: 237 mg of a brownish black powder with an uncharacterized decomposition point. Analysis of the lyophilizate gives the following characteristic values: Example 3 Production of a conjugate made from oligonucleotides and carboxydextran-ferrite in a chromatographic prepurification (hydrodynamic diameter <20 nm; packing m = 20) according to Hasegawa et al. (Example 1 of WO 94/03501). 2.0 ml of ferrite solution (118 mg iron; 150 mg carboxydextran) is applied to a PD10 column filled with Sephadex G-25 and equilibrated with double distilled water. After the sample has been infiltrated into the gel, elution is performed with double distilled water in 1 ml steps. The first four fractions of 1 ml each are collected and pooled. Iron measurement by ICP-AES (inductively coupled high frequency plasma atomic emission spectroscopy) provided an iron component of 27 mg / ml, and the carboxydextran component was determined to be 23.1 mg / ml (absorptiometric analysis in anthrone). . For activation of the ferrite solution, 3.0 ml (81 mg of iron; 69.4 mg of carboxydextran) are cooled in an ice bath and then mixed with 3.3 mg of sodium periodate (Merck, Germany). After the reaction and purification as in Example 1, 0.015 mmol of the aldehyde component is made. The activated ferrite is mixed with a 5-fold excess (with respect to aldehyde groups) of the spacer according to Example A (30 mg) and treated as in Example 1. It was made by the difference in the amount used with the part of the bound spacer and measured as 6 mg. The ferrite solution was adjusted to pH 8.5 with 0.1 N NaOH and mixed with a 2-fold excess (with respect to the spacer component) of the oligonucleotide according to Example C (308.5 mg) under argon as protective gas, Example 1 With the same oligonucleotide. The binding portion of the oligonucleotide was measured at 154 mg. The oligonucleotide ferrite solution is then filtered through a 0.22 μm pore size membrane filter and lyophilized. Yield: 331 mg of brownish black powder with an uncharacterized decomposition point Analysis of the lyophilizate gives the following characteristic values: Example 4 Production of conjugates made from oligonucleotides and dextran-ferrite (hydrodynamic diameter ≦ 20 nm; packing m = 55) 25.0 ml of ferrite solution according to Shen, T. et al. (MRM 29; 599-604; 1993) Is purified in an Amicon Diaflo stirred cell as in Example 1. Iron determination in the retentate by ICP-AES (inductively coupled high frequency plasma atomic emission spectroscopy) provided an iron component of 3.24 mg / ml and its dextran component was determined to be 0.88 mg / ml (at anthrone). Spectrophotometric analysis). For activation of the ferrite solution, 10.0 ml (3.24 mg iron; 8.8 mg dextran) are cooled in an ice bath and then mixed with 3.14 mg sodium periodate (Merck, Germany). After reaction and purification as in Example 1, 0.015 mmol of the aldehyde component is obtained. The activated ferrite is mixed with a 5-fold excess (with respect to aldehyde groups) of the spacer according to Example A (28.5 mg) and treated as in Example 1. The portion of the bound spacer that resulted from the difference in the amounts used measured 5.7 mg. The ferrite solution was adjusted to pH 8.5 with 0.1 N NaOH and mixed with a two-fold excess (293.3 mg) (with respect to the spacer component) of the oligonucleotide according to Example C under argon as protective gas and mixed with Example 1. React with similar oligonucleotides. The binding portion of the oligonucleotide was measured at 146.7 mg. The oligonucleotide-ferrite solution is then filtered through a membrane filter having a pore size of 0.22 μm and lyophilized. Yield: 208 mg of a brownish black powder with an uncharacterized decomposition point Analysis of the lyophilizate gives the following characteristic values: Example 5 Production of conjugates made from oligonucleotides and dextran-ferrite (hydrodynamic diameter> 20 nm; filling m = 56) 10.0 ml ferrite solution Endorem (R) (Guerbet GmbH, Germany) (112 mg iron; 132 mg dextran) is purified as in Example 1 in an Amicon Diaflo stirred cell. Iron determination in the retentate by ICP-AES (Inductively Coupled Radio Frequency Plasma Atomic Emission Spectroscopy) provided an iron content of 5.15 mg / ml and a dextran content of 1.8 mg / ml (anthrone in anthrone). Absorbance photometry). For activation of the ferrite solution, 10.0 ml (5.51 mg iron; 18 mg carboxydextran) are cooled in an ice bath and then mixed with 0.5 mg sodium periodate (Merck, Ger many). After reaction and purification as in Example 1, it is made from 0.002 mmol of the aldehyde component. The activated ferrite is mixed with a 5-fold excess (6.7 mg) (with respect to aldehyde groups) of the spacer according to Example B and treated as in Example 1. The portion of the bound spacer that resulted from the difference in the amounts used measured 1.34 mg. The ferrite solution was adjusted to pH 8.5 with 0.1N NaOH and mixed with a 2-fold excess (46.8 mg) (with respect to the spacer component) of the oligonucleotide according to Example C under argon as protective gas, Reaction with oligonucleotides as in 1. The binding portion of the oligonucleotide was determined to be 23.4 mg. The oligonucleotide-ferrite solution is then filtered through a 0.22 μm pore size membrane filter and lyophilized. Yield: Brownish black powder with an uncharacterized decomposition point 112 mg Analysis of the lyophilizate gives the following characteristic values: Example 6 Production of conjugates made from oligonucleotides and dextran-ferrite (hydrodynamic diameter> 20 nm; packing m = 32) 200 mg (44 mg lyophilizate) of ferrite AMI-227 (Advanced Magnetics Inc .; USA) 137 mg of iron (dextran) is dissolved in 25 ml of double distilled water and then purified in an Amicon Diaflo stirred cell as in Example 1. Iron measurement of the retentate by ICP-AES (inductively coupled high frequency plasma atomic emission spectroscopy) provided an iron component of 4.3 mg / ml and determined the dextran component to be 1.9 mg / ml (spectrophotometric analysis with anthrone) ). For activation of the ferrite solution, 5.0 ml (21.6 mg iron; 9.5 mg dextran) are cooled in an ice bath and then mixed with 1.13 mg sodium periodate (Merck, Germany). After reaction and purification as in Example 1, 0.005 mmol of aldehyde component is produced. The activated ferrite is mixed with a 5-fold excess (10.3 mg) (with respect to aldehyde groups) of the spacer according to Example A and treated as in Example 1. The portion of the attached spacer resulted from the difference in the amounts used and was determined to be 2.0 mg. The ferrite solution was adjusted to pH 8.5 with 0.1N NaOH and mixed with a 2-fold excess (with respect to the spacer component) (105.5 mg) of the oligonucleotide according to Example C under argon as protective gas. Reaction with oligonucleotides as in 1. The binding portion of the oligonucleotide was measured at 53 mg. The oligonucleotide-ferrite solution is then filtered through a 0.22 μm pore size membrane filter and lyophilized. Yield: 94 mg of a brownish black powder with an uncharacterized decomposition point. Analysis of the lyophilizate gives the following characteristic values: Example 7 Production of a conjugate made from oligonucleotides and chondroitin-4-sulphate-ferrite (hydrodynamic diameter> 20 nm; packing m = 86) 1.0 ml of chondroitin-4-sulphate-ferrite according to example 1 of EP 0,516,252 Is diluted 1:10 with double distilled water and adjusted to pH 4.75 with 0.1N HCl. The ferrite solution is mixed with 1.0 ml of a freshly prepared solution of 9.2 mg of EDC [1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl] in 10 ml of water and the pH is kept at 4.75 for 2 hours. Maintain at the value (titration system TPC 2000; Schott, Germany). The EDC reaction can be monitored by acid consumption in the pH-STAT titration and is calculated as 2.4 μmol of activated acid. Separation of small molecule reactants is performed by Amicon Diaflo ultrafiltration with a 30 kDa cut-off. Iron measurement on the retentate by ICP-AES (Inductively Coupled Radio Frequency Plasma Atomic Emission Spectroscopy) provided an iron component of 5 mg / ml and a chondroitin component of 2.1 mg / ml (Morgan-Elson, Morgan, WT, and spectrophotometric analysis by the hexosamine method according to Elson, LA, J. Biochem. 51, 1824, 1933). The activated ferrite is mixed with a 5-fold excess (with respect to the activated acid groups) of the spacer according to Example B and treated as in Example 1. The portion of the spacer attached was caused by the difference in the amounts used and was determined to be 2.7 mg. The ferrite solution was adjusted to pH 8.5 with 0.1 N NaOH and mixed with a 2-fold excess (with respect to the spacer component) (96 mg) of the oligonucleotide according to Example C (96 mg) under argon as protective gas. In the same manner as described above. The binding portion of the oligonucleotide was measured at 46 mg. The oligonucleotide-ferrite solution is then filtered through a 0.22 μm pore size membrane filter and lyophilized. Yield: 148 mg of a brownish black powder with an uncharacterized decomposition point. Analysis of the lyophilizate gives the following characteristic values: Example 8 Production of a conjugate made from oligonucleotides and chondroitin-4-sulfate-ferrite (hydrodynamic diameter <20 nm; packing m = 22) 1.0 ml chondroitin-4-sulfate-ferrite according to Example 13 of EP 0,516,252 (22.4 mg iron, 19.6 mg chondroitin-4-sulfate) was diluted 1: 200 with double distilled water and duplicated in an Amicon ultrafiltration unit equipped with an RS2000 tank and a 100 kDa cut-off hollow fiber membrane. The free coating polymer is separated by filtration from distilled water. The solution is then concentrated to about 8 ml and then filled to 10.0 ml with double distilled water. For activation, the ferrite solution is adjusted to pH 4.75 with 0.1N HCl. The ferrite solution is then mixed with 1.0 ml of a freshly prepared solution of 4.2 mg of EDC [1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl] in 10 ml of water and the pH is increased to 4.75 for 2 hours. (Titration system TPC 2000; Schott, Germany). The EDC reaction can be followed by the acid consumption in the pH-STAT titration, calculated as 2.2 μmol of active acid. Separation of small molecule reactants occurs by Amicon Diaflo ultrafiltration with a 30 kDa cut-off. Iron measurement of the retentate by ICP-AES (Inductively Coupled Radio Frequency Plasma Atomic Emission Spectroscopy) provides an iron component of 1.8 mg / ml and a chondroitin component of 0.8 mg / ml (according to Morgan-Elson) Spectrophotometric analysis of hexosamine method). The activated ferrite is mixed with a 5-fold excess (4.3 mg) (with respect to aldehyde groups) of the spacer according to Example A and treated as in Example 1. The portion of the spacer attached was caused by the difference in the amounts used and was determined to be 0.86 mg. The ferrite solution was adjusted to pH 8.5 with 0.1 N NaOH and mixed with a two-fold excess (44 mg) (with respect to the spacer component) of the oligonucleotide according to Example C under argon as protective gas, Example 1 In the same manner as described above. The binding portion of the oligonucleotide was measured at 22 mg. The oligonucleotide-ferrite solution is then filtered through a 0.22 μm pore size membrane filter and lyophilized. Yield: 61.5 mg of a brownish black powder with an uncharacterized decomposition point. Analysis of the lyophilizate gives the following characteristic values: Example 9 Production of conjugates made from oligonucleotides and polycarboxyhexyldextran-ferrite (hydrodynamic diameter <20 nm; packing m = 39) Example 11 of WO 94/03501 at a concentration of 56 mg iron per ml (WO 94/03501) (According to Hasegawa et al.) 5.0 ml of a ferrite solution (carboxydextran 60 mg / ml) is filled with 20 ml of 2N NaOH and heated to 80 ° C. under reflux conditions (magnetic stirrer). While stirring, 1 g of 6-bromohexanoic acid (Aldrich, Germany) is slowly added. After 3 hours of reaction, it is cooled to room temperature and then neutralized under hood with about 6N HCl. For purification, the acid-substituted ferrite is mixed with 2 volumes of ethanol and the precipitate is centrifuged off (10 min, 1000 g). Next, the precipitate is resuspended in 5 ml of double distilled water, passed through a 0.22 μm cellulose acetate filter, and then filled with 5.0 ml of double distilled water. To determine the degree of substitution of carboxyl dextrin with hexanoic acid, the reaction was carried out under the same conditions on a pure stabilized polymer (carboxydextran), and the content of the acid group was determined by potentiometric titration at 19.9 ± 1.2%. It was decided. 1.0 ml of ferrite solution (54 mg of iron, 48 mg of carboxydextran) is diluted to 5 ml with double distilled water, mixed with 103.8 mg of the spacer according to Example A, and then the mixture is diluted with 0.1N HCl to pH 4 Adjust to .75. The solution was mixed with 10.2 mg of EDC-HCl / 1 ml of double distilled water (freshly prepared) and the pH was adjusted to pH 4.75 with an automatic titration system (TPC 2000, Schott, Germany) for 2 hours. Is maintained at a constant value. Purification of small molecule reactants and unbound or adsorbed carboxydextran stabilizer is performed by dialysis (Visking dialyzer tube, Serva, Germany). The portion of the bound spacer made by the difference in the amounts used and was determined to be 20.5 mg. The ferrite solution was adjusted to pH 8.5 with 0.1 N NaOH and mixed with a 2-fold excess (with respect to the spacer component) (1067 mg) of the oligonucleotide according to Example C under argon as protective gas, according to Example 1. In the same manner as described above. The binding portion of the oligonucleotide was determined to be 533 mg. The oligonucleotide-ferrite solution is then filtered through a 0.22 μm pore size membrane filter and lyophilized. Yield: 674 mg brownish black powder with an uncharacterized decomposition point Analysis of the lyophilizate gives the following characteristic values: Example 10 Production of conjugates made from oligonucleotides and polycarboxymethyldextran-ferrite (hydrodynamic diameter <20 nm; filling m = 56) Example 11 of WO 94/03501 with a concentration of 56 mg iron per ml (WO 94/03501) Fill 5.0 ml of ferrite solution (according to Hasegawa et al.) (About 60 mg / ml carboxydextran) with 20 ml of 2N NaOH. In a separate container, dissolve 600 mg of monochloroacetic acid in 5 ml of water and mix slowly with 340 mg of anhydrous sodium carbonate. The two separate solutions are then mixed and heated at 65 ° C. for 1 hour. Next, purification is performed by pouring the solution into twice the volume of ethanol. The precipitate is redissolved in water and precipitated again with ethanol. The precipitate is then redispersed in 5 ml of water, passed through a 0.22 μm cellulose acetate filter, and then filled to 5.0 ml with double distilled water. To determine the degree of substitution of monochloroacetic acid with carboxymethyl groups, the reaction was performed under the same conditions on a pure stabilized polymer (carboxydextran) and the content of the acid groups was determined by potentiometric titration. . On average one carboxymethyl group is made per glucose unit. 1.0 ml of ferrite solution (53 mg of iron, 49 mg of carboxydextran) is diluted to 5 ml with double distilled water, mixed with 105.9 mg of the spacer according to Example A, and the mixture is brought to pH 4.75 with 0.1 N HCl. Adjust. The solution was mixed with 10.2 mg of EDC-HCl / 1 ml of double distilled water (freshly prepared) and the pH was adjusted with an automatic titration system (TPC 2000, Schott, Germany) for 2 hours at pH 4.75. Maintain a constant value. Purification of the small molecule reactants and the free, not tightly bound or adsorbed carboxydextran stabilizer is performed by dialysis (Visking dialyzer tube, Serva, Germany). The portion of the spacer attached was made by the difference in the amounts used and measured 21.2 mg. The ferrite solution was adjusted to pH 8.5 with 0.1 N NaOH and mixed with a two-fold excess (with respect to the spacer component) (1088.9 mg) of the oligonucleotide according to Example C under argon as protective gas. Reaction with the same oligonucleotide as in 1. The binding portion of the oligonucleotide measured 544 mg. The oligonucleotide-ferrite solution is then filtered through a 0.22 μm pore size membrane filter and lyophilized. Yield: 687 mg of brownish black powder with an uncharacterized decomposition point Analysis of the lyophilizate gives the following characteristic values: Example 11 Production of a conjugate made from oligonucleotides and dextran-ferrite (hydrodynamic diameter> 20 nm; packing m = 65) Lyophilized 200 mg (44 mg of ferrite) AMI-227 (Advanced Magnetics Inc .; USA) Iron (137 mg of dextran) is dissolved in 25 ml of double distilled water and then purified in an Amicon Diaflo stirred cell as in Example 1. Iron determination in the retentate by ICPS (inductively coupled radio frequency plasma atomic emission spectroscopy) provided a fixed amount of 4.3 mg / ml iron and its dextran content was determined to be 1.9 mg / ml (anthrone Spectrophotometric analysis). For activation of the ferrite solution, 5.0 ml (21.6 mg of iron; 9.5 mg of dextran) are cooled in an ice bath and then mixed with 2.26 mg of sodium periodate (Merck, Germany). After the reaction and purification as in Example 1, 0.011 mmol of the CHO component is made. The activated ferrite is mixed with a 5-fold excess (20.5 mg) (with respect to aldehyde groups) of the spacer according to Example A and treated as in Example 1. The portion of the attached spacer was made by the difference in the amounts used and measured 4.1 mg. The ferrite solution was adjusted to pH 8.5 with 0.1 N NaOH and mixed with a two-fold excess (211.1 mg) (with respect to the spacer component) of the oligonucleotide according to Example D under argon as protective gas. Reaction with the same oligonucleotide as in 1. The binding portion of the oligonucleotide was determined to be 105.6 mg. The oligonucleotide-ferrite solution is then filtered through a 0.22 μm pore size membrane filter and lyophilized. The yield is 94 mg of a brownish black powder with an uncharacterized decomposition point. Analysis of the lyophilizate provides the following characteristic values. Example 12 Production of a radiolabeled solution of an oligonucleotide-magnetite conjugate R. Weissleder et al. (Radiology 1994; 191 Dissolve 200 mg of lyophilized MION 46-magnetite labeled with indium-111 prepared according to 225-230) in 10 ml with double distilled water. The solution is stirred and mixed with 4.1 mg of sodium periodate while cooling in an ice bath. After 20 minutes, 5 ml of ethylene glycol: water (1: 1 (v / v) are added and purified by ultrafiltration on a YM-300 membrane (Amicon). The solution is stirred according to Example A at room temperature according to Example A. React with 1.8 mg of the obtained spacer, after 30 minutes, mix it with 62 mg of cyanoborohydride and purify the solution by ultrafiltration for another 30 minutes, then add 0.1 N sodium hydroxide solution The pH is adjusted to pH 8.5 and reacted with 3.5 mg of the 35-mer oligonucleotide obtained according to Example C for 2 hours at room temperature under a protective atmosphere of argon After further ultrafiltration, the solution is brought to 20 mmol / l. Adjust the concentration of iron in the lyophilizate to give the following characteristic values: The previous examples can be repeated with similar success by substituting the reactants generally or specifically described and / or manipulating the conditions of the present invention for those used in the previous examples. obtain. From the foregoing description, those skilled in the art can easily ascertain the essential characteristics of the present invention without departing from the spirit and scope thereof, and make various modifications of the present invention to adapt it to various uses and conditions. Can be converted and improved.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｆ 19/00 Ａ６１Ｋ 43/00
49/02 Ａ
(72)発明者 クレセ，マイク
ドイツ連邦共和国，デー−10711 ベルリ
ン，ヨーアヒム−フリードリヒ−シュトラ
ーセ １
(72)発明者 プラツェク，ヨハネス
ドイツ連邦共和国，デー−12621 ベルリ
ン，グロットカウエル シュトラーセ 55
(72)発明者 ニードバラ，ウルリッヒ
ドイツ連邦共和国，デー−14195 ベルリ
ン，ゴスレシュトラーセ 28ア
(72)発明者 グリース，ハインツ
ドイツ連邦共和国，デー−10717 ベルリ
ン，ヘルムシュテットテル シュトラーセ
19
(72)発明者 ラディシェル，ベルント
ドイツ連邦共和国，デー−13465 ベルリ
ン，ゴランクツシュトラーセ 132
(72)発明者 ゴールド，ラリー
アメリカ合衆国，コロラド 80302，ボル
ダー，フィフス 1033────────────────────────────────────────────────── (5) Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI C07F 19/00 A61K 43/00 49/02 A (72) Inventor Cresse, Mike Germany, Day 10711 Berlin, Joachim Friedrich-Strasse 1 (72) Inventor Platsek, Johannes Germany, Day 12621 Berlin, Grotto Couerstraße 55 (72) Inventor Nidvara, Ulrich Germany, Day 14195 Berlin, Gothlestrasse 28 A (72) Inventor Gries, Heinz Germany-Day 10717 Berlin, Helmstedttel Straße 19 (72) Inventor Radishell, Bernd Germany-Day 13465 Berlin, Gorandsch Rase 132 (72) inventor Gold, Larry USA, Colorado 80302, Bol loaders, Fifth 1033