JPH11505527A

JPH11505527A - 鏡像異性体リガンドの同定

Info

Publication number: JPH11505527A
Application number: JP8533492A
Authority: JP
Inventors: ニコラスマライアシューマッハー，アントニアス; エス．キム，ピーター
Original assignee: ホワイトヘッドインスティチュートフォーバイオメディカルリサーチ
Priority date: 1995-05-03
Filing date: 1996-05-02
Publication date: 1999-05-21
Also published as: WO1996034879A1; CA2218083A1; EP0825997A1

Abstract

(57)【要約】天然の左右像でなく（自然に生じたりまたは野生型の分子のキラリティーのものでない）、他のキラル高分子に対するリガンドである高分子（ペプチド、オリゴヌクレオチド、糖、及びＲＮＡ−蛋白複合体、蛋白質−脂質複合体等の高分子複合体）の同定方法。

Description

【発明の詳細な説明】鏡像異性体リガンドの同定関連出願本出願は、１９９６年３月２８日に提出された米国出願番号０８／６２７，４９７の一部継続出願であり、この出願は、１９９５年５月３日に提出された米国出願番号０８／４３３，５７２の一部継続出願である、１９９５年６月７日に提出された米国出願番号０８／４８２，３０９の一部継続出願である、１９９５年７月１１日に提出された米国暫定出願番号６０／００１，０６７の一部継続出願であり、これらの教示は参照により本明細書に取り込まれる。基金本明細書に記載された研究は、ハワード・ヒューズ医学研究所／生命科学調査基金により資金提供された。背景技術遺伝的にコードされた、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドのライブラリーは多くの高分子に対するリガンドの同定に好適である。しかしながら、生物学的にコードされたライブラリーの主な欠点は、得られたリガンドが天然に存在する酵素によるデグラデーションに付されることである。さらに、細胞性蛋白質分解酵素に対するそれらの感度のため、天然に存在するＬ−アミノ酸から構成されるペプチドは、ヘルパーＴ細胞（Ｔ_H細胞）への主要組織適合複合体クラスII制限提示過程を効果的に通過する。結果として、Ｌ−ペプチドは、かかる薬剤の活性を損なう活発な体液性免疫応答を誘導する天然の左右像の高分子の鏡像異性体は、天然の左右像の高分子より優れた薬剤を作製する。天然に存在するＬ−ペプチド配列およびＤ−核酸配列と対比して、これらの天然に存在する高分子の鏡像異性体（例えば、Ｄ−ペプチドおよびＬ− 核酸）は、天然に存在する蛋白質分解酵素およびヌクレアーゼの良好な基質ではない。さらに、天然の分子の鏡像異性体は、効果的な免疫応答を誘い出さない。薬剤として用いるためにＤ−ペプチドおよびＬ−核酸を入手することは望ましい。発明の要約本発明は、天然の左右像でない（天然に存在するような又は野生型分子のようなキラリティーでない）、他のキラル高分子に対するリガンドである鏡像異性体の高分子（蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、およびＲＮＡ− 蛋白質複合体、蛋白質−脂質複合体等の高分子複合体）の同定方法であり、標的又は所望の高分子に関する。標的又は所望の高分子は、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、およびホルモン、酵素、抗体、抗原等の蛋白質（例えば、ポリペプチドおよびペプチド）を含む。一の態様において、本発明は、標的又は所望のＬ−アミノ酸ペプチドを結合するＤ−アミノ酸ペプチドリガンドの同定方法である。第二の態様において、本発明は、オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）に対するリガンドであるＤ−アミノ酸残基からなるペプチドの同定方法である。さらなる態様において、本発明は、天然に発生するものとは反対のキラリティーのＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチドの同定方法である。ＤＮＡは、天然にはＤイソ型として発生する。一の態様において、本発明は、天然の左右像の標的高分子（例えは、ペプチト、オリゴヌクレオチド）に結合する非天然の左右像の高分子の製造方法に関しており、以下のように行なわれる：標的高分子の又は標的分子の特徴的なドメインの鏡像異性体を用意し、ライブラリー中の天然の左右像の高分子とその鏡像異性体との結合に適した条件下で、天然の左右像の高分子のライブラリーと接触させる；結果として、鏡像異性体は、ライブラリー中に存在する天然の左右像の高分子を結合する。標的高分子の鏡像異性体に結合した天然の左右像の高分子の鏡像異性体は製造される；天然の左右像の高分子の鏡像異性体は、天然の左右像の標的高分子に結合する非天然の左右像の高分子である。つまり、ライブラリー中に存在し、標的分子の鏡像異性体に結合する高分子の鏡像異性体は、製造される；結果物は、（天然の左右像の）標的分子を結合する非天然の左右像の高分子である。標的高分子が蛋白質（例えば、ペプチド）である態様において、標的Ｌペプチドに結合するＤアミノ酸ペプチドは製造される。方法は、以下のように行なう：標的Ｌ高分子の又はその特徴的なドメインのＤアミノ酸ペプチドおよびＬ−アミノ酸ペプチドのライブラリーを用意する。ライブラリー中のＬアミノ酸ペプチドのＤアミノ酸ペプチドとの結合に適した条件下で、ライブラリーおよび標的高分子のＤアミノ酸ペプチドを接触させる；結果として、Ｄアミノ酸ペプチドは、ライブラリー中に存在するＬアミノ酸ペプチドを結合する。Ｄアミノ酸ペプチドに結合したライブラリー中に存在するＬアミノ酸ペプチドは、同定され、配列決定される。ライブラリー中で同定されたＬアミノ酸ペプチドの又はそれの特徴的なドメインのＤアミノ酸ペプチドは製造される；得られたＤアミノ酸ペプチドは、天然の左右像の標的Ｌ高分子に結合する。つまり、ライブラリー中に存在し、標的Ｌ高分子のＤアミノ酸ペプチドに結合するＬアミノ酸ペプチドの鏡像異性体は、製造される；結果物は、Ｌ標的高分子を結合するＤアミノ酸ペプチドであり、本態様においてはＬ−アミノ酸ペプチドである。標的高分子が蛋白質（例えば、ペプチド）である態様において、標的Ｌ蛋白質に結合するＬオリゴヌクレオチドは製造される。方法は、以下のように行なわれる：標的Ｌ高分子の又はそれの特徴的なドメインのＤアミノ酸ペプチドおよびＤオリゴヌクレオチドのライブラリーを用意する。ライブラリー中のＤオリゴヌクレオチドとＤアミノ酸ペプチドとの結合に適した条件下で、ライブラリーをＤアミノ酸ペプチドと接触させ、それにより、ペプチドは、ライブラリー中に存在するＤオリゴヌクレオチドを結合する。Ｄアミノ酸ペプチドに結合したＤオリゴヌクレオチドは、同定され、配列決定される。ライブラリー中で同定されたＤオリゴヌクレオチドの又はそれの特徴的なドメインのＬオリゴヌクレオチドは製造される；Ｌオリゴヌクレオチドは、非天然の左右像の標的Ｌ高分子に結合する。つまり、ライブラリー中に存在し、標的Ｌ高分子のＤアミノ酸ペプチドに結合するＤオリゴヌクレオチドの鏡像異性体は、製造される；結果物は、Ｌ標的高分子を結合するＬオリゴヌクレオチドであり、本態様においてはＬアミノ酸ペプチドである。他の態様において、本発明は、天然の左右像の標的高分子に結合する非天然の左右像の高分子の製造方法に関しており、以下のように行なわれる：標的高分子の又は標的分子の特徴的なドメインの鏡像異性体を用意し、ライブラリー中の天然の左右像の高分子と鏡像異性体との結合に適した条件下で、天然の左右像の高分子のライブラリーと接触させる；結果として、鏡像異性体は、ライブラリー中に存在する天然の左右像の高分子を結合する。鏡像異性体に結合した天然の左右像の高分子は、同定され、配列決定される。天然の左右像の高分子の又はその特徴的なドメインの鏡像異性体に結合した、非天然の左右像の高分子の鏡像異性体は製造される；得られた天然の左右像の高分子の鏡像異性体は、天然の左右像の標的高分子に結合する非天然の左右像の高分子である。本発明のさらなる態様において、目的のＤアミノ酸ペプチドを結合するＬアミノ酸ペプチドは、以下のように同定される：ファージ表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドを含有するファージ提示ライブラリーを用意し、ファージ表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドと、目的のＤアミノ酸ペプチドの結合に適した条件下で、目的のＤアミノ酸ペプチドと接触させる。表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドに結合した、表面に目的のＤアミノ酸ペプチドを有するファージ（つまり、表面にＤアミノ酸ペプチド−提示Ｌアミノ酸ペプチド複合体を有する）は、同定される。複合体中の提示されたＬアミノ酸ペプチドは、目的のＤアミノ酸ペプチドを結合するＬアミノ酸ペプチドである。必要に応じ、ファージの表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドのアミノ酸配列は決定することができ、Ｌアミノ酸ペプチドのアミノ酸配列に対応するＤアミノ酸ペプチドは、合成することができ、ファージ表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドに対応するＤアミノ酸ペプチドの製造という結果になる。一の態様において、本明細書に記載のように、ファージ表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドは、あるクラスの蛋白質、具体的にはＳＲＣホモロジー３ドメイン（ＳＨ３ドメイン）のＤ−アミノ酸ペプチドを結合する。さらなる態様は、結合ペプチドが所望されるいかなる蛋白質（ポリペプチド、ペプチドを含む）であってもよい、標的Ｌアミノ酸蛋白質に対応するＤアミノ酸蛋白質の製造方法である。この態様において、ファージ表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドのＤアミノ酸蛋白質との結合に適した条件下で、ファージ表面に提示された蛋白質の混合物を含有するファージ提示ライブラリーを、標的Ｌアミノ酸蛋白質に対応する又は標的Ｌアミノ酸蛋白質の特徴的なドメインに対応するＤ −アミノ酸ペプチドと接触させる。混合物は、標的Ｌアミノ酸蛋白質又はそれの特徴的なＬアミノ酸ペプチドドメインを含有する。表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドに結合したＤアミノ酸ペプチドを表面に有するファージは、同定される。同定されたファージの表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドのアミノ酸配列は決定され、Ｌアミノ酸ペプチドのアミノ酸配列に対応するＤアミノ酸蛋白質は合成され、標的Ｌアミノ酸蛋白質に対応するＤアミノ酸ペプチドの製造という結果になる。また、本発明は、目的のＬアミノ酸ペプチドを結合するＬオリゴヌクレオチド核酸配列の取得方法に関する。この方法において、Ｄ核酸配列のコレクション（例えば、ＤＮＡライブラリー）は用意され、Ｄ核酸の目的のＤアミノ酸ペプチドとの結合に適した条件下で、目的のＤアミノ酸ペプチドと接触させる。Ｄアミノ酸ペプチドに結合するＤ核酸は単離され、Ｄ核酸のヌクレオチド配列は決定される。目的のＤアミノ酸ペプチドに結合するＤ核酸配列は、Ｌヌクレオチドを用いて調製され、Ｌアミノ酸ペプチドを結合するＬ核酸配列の製造という結果になる。本発明のさらなる態様は、Ｄ核酸配列のコレクションを用意し、Ｄ核酸配列をＬ核酸配列と接触させる工程からなるＤ核酸を結合するＬ核酸配列の取得方法に関する。Ｌ核酸配列、それにより、Ｄ核酸配列−Ｌ核酸配列複合体を製造する、に結合するＤ核酸配列が同定される。Ｌ核酸配列に結合するＤ核酸配列のヌクレオチド配列は決定される。Ｄ核酸配列は、Ｌヌクレオチドを用いて合成され、Ｄ核酸を結合するＬ核酸配列の製造という結果になる。また、本発明の主題は、本明細書に記載の方法により同定され、製造されたＤアミノ酸ペプチド等の合成Ｄアミノ酸ペプチドであるが、ＳＨ３ドメインに結合する合成アミノ酸ペプチド、ＳＨ３ドメインの全部又は一部に対応する合成Ｄアミノ酸ペプチド、およびより一般的には、細胞内情報伝達蛋白質のドメインを結合する合成Ｄアミノ酸ペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。さらに、本明細書に記載の方法により同定され、製造されたオリゴヌクレオチド等の非天然の左右像のオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡ）は、本発明の主題である。また、本発明は、天然の左右像の標的高分子を結合する非天然の左右像の高分子の誘導体の製造方法に関する。方法は、本明細書に記載の方法を用いて非天然の左右像の高分子を同定し、そして非天然の左右像の高分子を修飾し、または誘導して、それの誘導体を製造する工程からなる。本明細書に記載の本発明の方法により取得することのできる誘導体も、本発明の範疇である。本発明のＤアミノ酸ペプチドおよびＬ核酸配列は、薬剤として有用である。例えば、Ｄアミノ酸ペプチドは、天然に存在する蛋白質分解酵素に対する良好な基質ではなく（つまり、蛋白質分解デグラデーション耐性）、Ｌアミノ酸ペプチドにより誘い出されるものに匹敵する免疫応答を誘い出さない。図の簡単な説明図は、鏡像ファージ提示を通じた、Ｄペプチドリガンドの同定を図示したものである。発明の詳細な説明構造的バイオポリマーの合成鏡像異性体は、天然分子の鏡像コンホメーションにフォールデイングする；同様に、２分子複合体について、最初のパートナー分子の２つの鏡像異性体も、最初のものと鏡像対称を有する複合体を形成する。本発明は、キラルな生物学的標的分子の鏡像異性体を結合する天然の左右像の高分子（Ｌ−ペプチド、一本鎖Ｄ−オリゴヌクレオチド等）の同定が、標的の天然型を結合する非天然の左右像の高分子の同定方法を提供するという発見に基づく。かかる鏡像異性体の高分子は、標的の生物学的活性を妨害する能力を決定して評価される。こうして、本発明は、新規な長期間有効な治療用又は診断用分子の開発手段を提供する。本発明は、天然に存在する又は野生型の左右像でない（つまり、キラリティー）、他のキラル分子（ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび高分子複合体）に対するリガンドである、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチド及び糖並びに高分子複合体（オリゴヌクレオチド−蛋白質複合体、蛋白質−脂質複合体）の鏡像異性体の高分子の同定方法に関するものである。本明細書に定義されているように、天然の左右像の高分子の鏡像異性体は、天然の左右像の高分子の均等物であるが、非天然の左右像である。本発明の方法において、天然に存在する標的高分子の鏡像異性体を調製し、天然に存在する高分子のコレクションから、鏡像異性体と相互作用する天然に存在するリガンドを単離するために用いられる。単離された天然に存在するリガンドの鏡像異性体型は、天然に存在する標的高分子と相互作用（例えば、結合）するであろう。天然の左右像の標的高分子は、１以上のキラル中心を有するいかなる高分子であってもよい。標的高分子（キラル標的）は、細胞内性又は細胞外性であってもよく、例えば、いずれもキラル中心を有する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、蛋白質又はその特徴的なドメイン（例えば、ペプチド）、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、糖、オリゴヌクレオチド−蛋白質複合体（ＲＮＡ− 蛋白質複合体）、蛋白質−脂質複合体、およびリン脂質があげられるがこれらに限定されるものではない。ドメイン、これらの高分子の領域断片は、高分子を標的とする。標的高分子は、哺乳類起源（例えば、ヒト）又は非哺乳類起源（例えば、細菌、菌類、ウイルス、原生動物）であってもよい。蛋白質（ポリペプチド、ペプチド）である標的高分子の例としては、細胞内情報伝達蛋白質およびそのドメイン（例えば、ＳＨ３ドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＰＨドメイン）（Ｃｏｈｅｎ，Ｇ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，８０：２３７−２４８（１９９５）参照）、ケモカイン（例えば、α−ケモカイン、β−ケモカイン）（Ｃｌｏｒｅ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔａｌ．，ＦＡＳＥＢＪ．，９：５７−６２（１９９５）参照）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１，ＴＮＦ、リンホトキシン−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＧＦα）、酵素（例えば、プロテインキナーゼＣ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ）（Ｄｉｖｅｃｈａ，Ｎ．ａｎｄＩｒｖｉｎｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｃｅｌｌ，８０：２６９−２７８（１９９５）参照）、チロシンキナーゼ（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃ．Ｊ．，Ｃｅ１１，８０：１７９−１８５（１９９５）参照）、ポリペプチド成長因子およびそのドメイン、成長因子受容体およびそのドメイン又は断片（例えば、ＰＤＧＦファミリー、ＥＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＩＧＦファミリー、ＨＦＧファミリー、ＶＥＧＦファミリー、ニューロトロフィンファミリー、Ｅｐｈファミリー、クラスＩサイトカインファミリー、ＧＨファミリー、ＩＬ−３ファミリー、ＩＬ−６ファミリー、ＩＬ−２ファミリー、クラスIIサイトカインファミリー、ＴＮＦファミリーの成長因子および成長因子受容体）、（Ｈｅｌｄｉｎ，Ｃ −Ｈ．，Ｃｅｌｌ，８０：２１３−２２３（１９９５）参照）、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、サイクリンおよびＣｄｃプロテイン（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．，Ｃｅｌｌ，８０：２２５−２３６（１９９５）参照）、転写因子およびそのドメイン（例えば、Ｅｔｓドメイン、ｂＺＩＰ，ｒｅｌ相同ドメイン、ＳＴＡＴ、ＮＦ−ＡＴ、ＴＣＦ、Ｆｏｓ、ＪＡＫ）（Ｈｉｌｌ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄＴｒｅｉｓｍａｎ，Ｒ．，Ｃｅｌｌ，８０：１９９−２１１（１９９５）参照）およびホルモンがあげられる。本発明において用いられる標的高分子の他の例としては、例えば、ヒトＣＤ２、ヒトＣＤ５８（ＬＦＡ−３）、ヒトエンドセリン、ヘレグリン−α、ヒトインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）、ヒトマクロファージ炎症性蛋白質１−β、プレーテット(platet)ファクター４、ヒトメラノーマ成長刺激活性、ＧＲＯ／メラノーマ成長刺激活性、ＭＨＣ分子、細菌ムラミダーゼ、クリングルドメイン（例えば、プラスミノーゲン、アポリポプロテイン）、ｒａｓ、ｒａｓ−ＧＡＰ、セレクション（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ）（Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン）、プレクストリン相同ドメイン、ストロメリシン、トロンビン、組織因子、カルモジュリン、ＣＤ４、コラーゲナーゼ、ジヒドロフォレート還元酵素、フィブロネクチン、フィブロネクチンタイプIIIモジュール、Ｇ−プロテインサブユニット、バソプレッシン、ファクターIX ＧＬＡドメイン、インターロイキン−８、（Ｃｌｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９；１６８９−１６９６（１９９０））、トロンボモジュリンＥＧＦ様ドメイン（Ｌｅｎｔｚ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍ．，２８８（２０）：１５３１２−１５３１７（１９９３））、ＧＰII_b−III_a細胞質ドメイン（Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：７７０１−７７０８（１９９４））、ファクターVIIa ＧＬＡドメイン、ファクターIX ＥＧＦ様ドメイン（Ｙａｎｇ，Ｙ．，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，３：１２６７ −１２７５（１９９４））、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）蛋白質（例えば、ＨＩＶプロテアーゼ、インテグラーゼ、マトリックス、プロテインチロシンホスファターゼ、逆転写酵素、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、エンベロープ、および他のＨＩＶ蛋白質、そのドメイン、フラグメント又はスカホールドミミック）、ＮＨ₂ 末端ＳＨ３ドメインＧＲＢ２、（Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１３５３１−１３５３９（１９９４））、ＣＯＯＨ末端ＳＨ３ドメインＧＲＢ２（Ｋｏｈｄａ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２：１０２９−１０４０（１９９４））、Ｐ１２０^GAPＳＨ３ドメイン（Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｓ．，ｅｔａｌ．，ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，１３（６）：１２７０−１２７９（１９８４））、および血管透過因子および血管内皮成長因子があげられる。オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である標的高分子の例としては、ＨＩＶＲＲＥ（ｒｅｖ応答エレメント）、ＨＩＶＴａｒ、およびＢＣＲ−ＡＢ１融合ＤＮＡ配列があげられる。リン脂質である標的高分子の例としては、ホスホイノシチド；ホスホイノシチダーゼＣ；ホスホイノシチド３−キナーゼ；ホスファチジルイノシトール；ホスファチジルイノシトール３−ホスフェート；ホスファチジルイノシトール（４，５）ビスホスフェート；ホスファチジルイノシトール（３，４，５）トリホスフェート；ホスファチジルコリン；ホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジン酸；イノシトール（１，４）ビスホスフェート；イノシトール（１，４，５）トリホスフェート；ジアシルグリセロール；スフィンゴシン；スフィンゴシンホスフェート；スフィンゴシンホスホコリン及びセラミド（Ｄｉｖｅｃｈａ，Ｎ．ａｎｄＩｒｖｉｎｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｃｅｌｌ，８０：２６９−２７８（１９９５）があげられる。本発明の方法において、天然由来の高分子の鏡像異性体（例えば、標的高分子の鏡像異性体またはライブラリーで同定された天然の左右像の高分子の鏡像異性体）を、型にはまった方法を用いて調製する。天然由来の高分子の鏡像異性体を天然に生じたもの由来の反対の左右像の構成成分の使用を通じて調製することができる（例えば、鏡像ペプチドの合成のためのＤアミノ酸の使用または鏡像オリゴヌクレオチドの合成のためのＬ−核酸の使用）。例えば、本発明に使用するＤ −ペプチドを、実施例１に記載のように、化学的に合成し、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製できる。天然由来の高分子の鏡像異性体の他の調製方法は、当該技術分野で公知である。標的高分子の鏡像異性体の型全体または標的高分子の三次元分子表面の一部を本発明の方法で使用できる。例えば、それ自身で、高分子全体中の本ドメインの鏡像異性体の型のそれと似ているコンフォメーションを得る標的高分子のサブドメインの鏡像異性体の型を、調製して、本発明の方法で用いることができる（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｔ，等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１，１８５４−１８５７（１９９６））。一方、標的高分子の鏡像異性体の型の連続あるいは不連続の断片を、標的高分子の鏡像異性体の型全体の分子表面の部分と似ている該断片の構成表面のペプチドまたは非ペプチド骨格上で調製することができる（Ｔｏｌｍａｎ，Ｒ，Ｌ等，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，４１，４５５（１９９３）；Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．ｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，３３，７７０１（１９９４）；ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．ＪおよびＨｏｅｓｓ，Ｒ．Ｈ，ＪＭＢ，２５０，４６０−４７０（１９９５）；Ｋｕ，Ｊら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２，６５５２（１９９５）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．等，ＥＭＢＯＪ．，５３０３−５３０９（１９９４）；Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉ，Ｓ．等，ＰｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＰｅｐｔｉｄｅｓＬｅｔｔ．，１，７０（１９９４）；Ｍｕｔｔｅｒ，Ｍ．，Ａｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２４，６３９（１９８５）；Ｃｏｃｈｒａｎ，Ａ．ＧおよびＫｉｍ，Ｐ．Ｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１，１１１３−１１１６（１９９６）；Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｅ．Ｋ．等，Ｃｅｌｌ，６８，６９９（１９９２）；Ｏａｓ，Ｔ．Ｇ．等，Ｎａｔｕｒｅ，３３６，４２（１９８８））。標的高分子と結合した非天然の左右像の高分子の同定および製造を、天然の左右像の高分子のいくつかのコレクションを用いて行うことができる。述べられた本方法は、生物学的にコードされたライブラリーをキラル標的（またはキラル「おとり」）と相互作用する構造を単離するために使用するすべての状態に応用できる（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｊ．Ｊ．等，Ｉｂｉｄ，２４９，４０４（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８７，６３７８（１９９０）；Ｃｕｌｌ，Ｍ．Ｇ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９，１８６５（１９９２）；Ｍａｔｔｈｅａｋ，Ｌ．Ｃ．，ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１，９０２２（１９９４））。実施例に述べられたように、ファージ提示ライブラリー（鏡像ファージ提示）などの、生物学的にコードされたライブラリーを本発明の方法で使用することができる。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドはさらにヌクレアーゼによって認識されるキラル中心を含むため、本アプローチは、ＲＮＡライブラリーおよびＤＮＡライブラリーの両方に同じく適用する（Ｂｏｃｋ，Ｌ．Ｃ．等，Ｎａｔｕｒｅ，３５５，５６４（１９９２））。したがって、本発明が有用なライブラリーの型は、ＲＮＡ（例えば、ＳＥＬＥＸ）、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡライブラリー）およびペプチドライブイラリー（例えば、インビトロ転写／翻訳に基づいたライブラリー、一価、多価ファージライブラリーおよび「ペプチドオンプラスミド」ライブラリー）を含む。本発明の方法のＤＮＡライブラリーの使用は、実施例５に述べられる。これらのライブラリーに示された大量の構造の空間の調査は、生物学的および医学的に重要なタンパク質に対する新しいリガンドをもたらすことができる。実施例に述べられたように、天然由来の（野生型）高分子のＤ−鏡像異性体およびＬ−鏡像異性体と特異的に相互作用するファージを単離した。標的高分子の鏡像異性体に結合したライブラリーの天然の左右像の高分子の選択工程は、アキラルな溶媒（例えば、水）またはキラル溶媒中で行うことができる。さらに、天然由来の高分子および鏡像異性体の間の相互作用は、いくつかの付加的なキラルコファクターを要求することはしそうにない。使用できる選択工程の例示は、実施例に述べられる。選択工程の改変は、当該技術分野に公知の方法を用いて行うことができる。特別の態様において、天然由来のＬアミノ酸ペプチドに対するリガンドであるＤアミノ酸ペプチドは、クレームした方法によって同定できる。その様なＤアミノ酸ペプチドは、Ｌアミノ酸ペプチドに寸分違わず一致して製造することができ（組成アミノ酸がＤでありＬ鏡像異性体でないことを除く）、または同定されたＤアミノ酸ペプチドの誘導体を製造するために１以上の組成アミノ酸の置換、欠失もしくは修飾または１以上のＤアミノ酸の付加等によって、改変することができる。別の態様において、Ｄ核酸配列またはＬアミノ酸ペプチドに結合するＬ核酸配列は、クレームした方法で同定される。Ｌ核酸配列は、Ｄ核酸に一致して製造され（組成ヌクレオチドが、Ｌヌクレオチドであることを除く）、もしくは同定されたＬ核酸配列の誘導体を製造するために１以上の組成Ｌヌクレオチドの置換、欠失もしくは修飾または１以上のＬ核酸の付加等によって、改変することができる。ここで述べられた方法を用い、その誘導体を生産するために、非天然左右像の高分子を改変する天然の左右像の標的高分子に結合する非天然左右像の高分子の誘導体の製造方法も、本発明に包含することができる。ここで用いたように、「誘導体」という語は、例えば、ここで述べられた方法によって同定された、標的高分子と結合し、１以上の成分の付加、欠失、置換または修飾による非天然の左右像の高分子と異なるような方法で改変された非天然の左右像の高分子を含む。１つの態様として、該誘導体は、改変されたＤ−ペプチドである。本発明のＤ −ペプチドの誘導体は、例えば、改変または変更（例えば、増えた、減少した）した親和性、特異性、膜透過性、疎水性、親油性、経口の生物学的利用能および／または生物学的半減期を有するＤ−ペプチドを含む。Ｄ−ペプチドの誘導体の製造のストラテジーは、例えば、Ｎ−メチレーションによりペプチド骨格を改変すること（Ｏｓｔｒｅｓｈ，Ｊ．Ｍ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１，１１１３８−１１１４２（１９９４）；ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．，Ｃ．Ｒ．Ｃｌａｒｋ．ｅｄｓ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９９０））および／または疑似ペプチドを製造すること（Ｃｈｏ，Ｃ．Ｙ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，１３０３（１９９３）；ＭｏｒａｎＥ．Ｊ．等，ｋＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，３７，２１３−２１９（１９９５））を含む。一方、Ｄ−ペプチドの側鎖は非天然のアミノ酸およびアミノ酸アナログを誘導することにより改変できる（Ｃｏｍｂｓ，Ａ．Ｐ．等，Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，２８７−２８８（１９９６）；Ｒｉｖｉｅｒ，Ｊ．Ｅ．ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９３，２０３１（１９９５）；Ｍｕｎｒｏｅ，Ｊ．Ｅ．等，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，５，２８９７−２９０２（１９９５））。特に好ましい態様において、Ｄ−ペプチドは非天然由来の側鎖を含む。改変した側鎖を有するＤ−アミノ酸ペプチドの誘導体の例は、下記式：ＮＨ₂−ＣＨＲ−ＣＯＯＨ式中、Ｒは、ここでは、直鎖状または分岐状であることができ、および１以上の２重または３重結合を含むことができる約１〜約５０の炭素原子のアルキル基として定義される低級アルキル基（例えば、メチル、エチル）である。該低級アキル（ａｋｙｌ）は、−ＮＨ₂、−ＯＨ、アリール（例えば、フェニル）、ヘテロアリール（例えば、イミダゾール、インドール）、−ＣＯＯＨ（例えば、アルギニン）基等の置換低級アキルであることができる。さらに、低級アキルは、アリール（例えば、フェニル、ナフチル）、置換アリール（例えば、−ＯＨ、ハロゲン）、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリール基であることができる。さらに、本発明のＤ−ペプチドは、環式、多環式誘導体を生じることにより修飾することができ、ここで、例えば、ジスルフィド結合はＤ−ペプチドのコンフォメーションを至適化し、限定するために置換される（Ｋａｔｚ，Ｂ．Ａ．等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，８５４１（１９９５）；ＬａｄｎｅｒＲ．Ｃ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１３，４２６−４３０（１９９５））。例えば、ここで述べられたように同定されたＤ−アミノ酸ペプチドは、ペプチド結合を介して、シクロスポリンの場合のような環をつくる。さらに、本発明のＤ−ペプチドの誘導体は、例えば、リポソームおよび／または脂質誘導体（Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ，Ｔ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８（３），１９８２−１９８６，１９８２（１９９３））、および／またはペプチド性および非ペプチド性ポリマー（ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃ．Ｒ．Ｃｌａｒｋ，ｅｄｓ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９９０）；Ｓｈｅｌｄｏｎ，Ｋ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２，２０５６（１９９５））を用いて、膜透過性および／または生物学的利用能を向上するために、支持体に共役または取り込むことができる。さらに、ここで述べられた方法により同定された該Ｄ−アミノ酸ペプチドは、特に標的が細胞内標的の場合、Ｄ−アミノ酸ペプチドの疎水性を増加することによって、派生させることができる（例えば、アルキル化、例えばＤ−アミノ酸ペプチド骨格のメチル化）。ベンゼン環は、疎水性を増加させるために、側鎖に付加することができる。一方、Ｄ−アミノ酸ペプチドは、該ペプチドの疎水性を増加させるためにリポソーム等の薬剤運搬系に取り込むことができる。さらに、Ｄ−ペプチドのＣまたはＮ末端は、保護基によって修飾することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｈ．およびＷｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９１）を参照）。例えば、親油性ポリマーをＮ末端またはＣ末端に結合することができる（例えば、Ｃ末端のポリエチレングリコールエステル）。一方、１以上の側鎖を、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）等の親油性ポリマーに結合もしくはエーテルまたはエステル結合に結合させることができる（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖カルボキシル基とのエステルを形成）。例えば、Ｄ−ペプチドは、ポリマー−Ｄ−ペプチドコンジュゲートを生産することにより改変することができ、ここで該ポリマーは、例えば、モノメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／またはポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）である（ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍａｒｓｈａｋ，Ｄ．ａｎｄＬｉｕ，Ｄ．ｅｄｓ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９））。他の態様において、誘導体はＬ−核酸である。ここで述べられたＤ−ペプチドを改変するためのストラテジーは、それらの薬理学的性質を至適化するために、ここで述べられたように同定された、非天然の左右像の修飾ＲＮＡおよびＤＮＡを用いることもできる（例えば、Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｓ．等，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２，６８３（１９９５）；Ｌａｔｈａｍ，Ｊ．Ａ．等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２２，２８１７（１９９４）；Ｇｏｌｄ，Ｌ．等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．等，６４，７６３（１９９５））。合成および生物学的にコードされたライブラリーは、多様な高分子に対するリガンドおよび核酸配列の同定に極めて有益であることを証明した。得られたペプチドがタンパク質分解による切断に非感受性であり効果的な免疫応答を誘導しないため、（Ｄ）−アミノ酸を構成した合成ペプチドライブラリーは、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｊ．Ｊ．等，Ｉｂｉｄ，２４９，４０４（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８７，６３７８（１９９０）；‘ｐｅｐｔｉｄｅｏｎｐｌａｓｍｉｄ ’，Ｃｕｌｌ，Ｍ．Ｇ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９，１８６５（１９９２）のファージ提示およびＭａｔｔｈｅａｋ，Ｌ．Ｃ，等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１，９０２２（１９９４）のインビトロ翻訳に基づいたシステム等の遺伝子に基づいた技術が好ましい。さらに、（Ｄ）−アミノ酸で構成されたペプチドは、胃腸で吸収され得る（Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１，１９４２（１９９４））。主にＮ−メチル化されたものおよび（Ｄ）−アミノ酸から構成された１１残基環状ペプチドであるシクロスポリンＡは、免疫抑制誘導剤であり、一般的に経口的に投与される（Ｐｔａｃｈｃｉｎｓ，Ｒ．Ｊ．等，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，１１，１０７（１９８６））。（Ｄ）−アミノ酸ライブラリーのスクリーニングは、近年、鎮痛活性を有するペプチドの同定を導くが（Ｄｏｏｌｅｙ，Ｃ．Ｔ．，ｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，２０１９（１９９４））、合成ライブラリー中でサンプルを取ることができる配列空間の割合は、一般的に、生物学的にコードされた系の使用を通して得ることができるものの画分のみである。この低い縮重のため、およびさらに重要なことには、中間体増幅過程の欠損のため、リガンドの同定において、合成ライブラリーの使用は、必ずしも、ファージ提示ライブラリーと同様に成功するとは限らない。（Ｄ）−アミノ酸で構成されたタンパク質は、天然由来の（Ｌ）−アミノ酸タンパク質のそれと正確に反対である基質および阻害剤に対するキラル特異性を有する（ＤｅｌＭｉｌｔｏｎ，Ｒ．Ｃ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，１４４５（１９９２）；Ｐｅｔｓｋｏ，Ｇ．Ａ．Ｉｂｉｄ，２５６，１４０３（１９９２）；Ｚａｗａｄｚｋｅ，Ｌ．Ｅ．ａｎｄＢｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，４００２（１９９２））。一定の例において、（Ｄ） −アミノ酸リガンドは、天然のリガンドの（Ｄ）−鏡像異性体をつくることによって（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｊ．等，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６５１（１９９４））、あるいは「逆」（Ｄ）−鏡像異性体をつくることによって（Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｂ．Ａ．等，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７４４（１９９４）；Ｇｕｐｔａｓａｒｍａ，ＴＩＢＴＥＣＨ，１４，４２−４３（１９９６））のいずれかによって得ることができるが、その様な方法は、一般的な応用性はない（Ｂｒａｄｙ，Ｌ．ａｎｄＤｏｄｓｏｎ，Ｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６９２（１９９４）；Ｃｈｏｖｅｖ，Ｍ．ａｎｄＧｏｏｄｍａｎ，Ｍ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１４，４３− ４４（１９９６）；Ｇｕｉｃｈａｒｄ，Ｇ．等，ＴＩＢＴＥＣＨ，１４，４４− ４５（１９９６））。（Ｄ）−アミノ酸リガンドを得るための、より一般的な方法は、目的のタンパク質の（Ｄ）−鏡像異性体を用いて、生物学的にコードされたライブラリーからのペプチドの選択であるにちがいない。（Ｄ）−および（Ｌ）−タンパク質は、正確に反対の基質および阻害剤に対するキラル特異性をもつため、（Ｄ）−タンパク質と相互作用するファージに提示されたペプチドの（Ｄ）−鏡像異性体の型は、天然の左右像のタンパク質と相互作用するであろう。本アプローチの有効性は、ＳＲＣホモロジー３ドメイン（ＳＨ３ドメイン）のＤ−鏡像異性体と特異的に相互作用するファージの単離により示された。実施例１に述べられたように、ファージライブラリーから（Ｄ）−アミノ酸リガンドの同定にたいする（Ｌ）−および（Ｄ）−タンパク質間の鏡像関係に使用することが可能であることを試すために、ｃ−ＳｒｃチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインの（Ｄ）−アミノ酸バージョンを合成した。ＳＨ３ドメインは、細胞内エフェクター分子の多様性に見られる５５−７０アミノ酸タンパク質ドメインである（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，４，２５（１９９４）に概説される）。ｃ−ＳＲＣ活性が砕骨細胞を仲介した骨再吸収に必須であるため、ＳＲＣ機能の妨害は骨粗しょう症の処置において価値があるかも知れない（Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐｅｔａｌ，Ｃｅｌｌ，６４，６９３（１９９２）；Ｌｏｗｅ，Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０，４４８５（１９９３）；Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｊ．Ｆ．，ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，２，４８（１９９５））。ＳＨ３ドメインは、８〜１０残基のII型ポリプロリンヘリックスを形成するそれらの細胞内標的中の配列因子と相互作用する（Ｒｉｃｋｌｅｓ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１３，５５９８（１９９４）；Ｓｐａｒｋｓ，Ａ．Ｂ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２３８５３（１９９４）：Ｃｈｅａｄｌｅ，Ｃ．ｅｔａｌ，Ｉｂｉｄ，２６９，２４０３４（１９９４）；Ｙｕ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７６，９３３（１９９４）；Ｆｅｎｇ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６，１２４１（１９９４）；Ｌｉｍ，Ｗ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７２，３７５（１９９４））。細胞内細胞シグナル伝達タンパク質中の仲介するタンパク質相互作用、およびＳＨ３ドメインを含むタンパク質のシグナル伝達の妨害が望まれるであろう。ＳＨ３ドメインの多様性に対するリガンドおよび基質は、ファージ提示ライブラリーから単離したが（Ｒｉｃｋｌｅｓ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１３，５５９８（１９９４）；Ｓｐａｒｋｓ，Ａ．Ｂ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２３８５３（１９９４）；Ｃｈｅａｄｌｅ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｉｂｉｄ，３９，２４０３４（１９９４））、合成の（Ｌ）−アミノ酸ペプチドライブラリー由来のそのような配列の同定は、好ましいリガンドの先行公知の配列にのみ可能である（Ｙｕ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７６，９３３（１９９４））。このように、合成ライブラリー由来のＳＨ３ドメインに対する（Ｄ）−アミノ酸リガンドの同定は、可能なリガンドの先の配列または構造情報がなしでは、成功しないであろう。ニワトリｃ−ＳＲＣドメインのＬ−およびＤ−鏡像異性体は、それぞれ、微生物学的な発現および化学合成によって調製された。ビオチン化合成６０アミノ酸Ｄ−ＳＨ３ドメインを、リフォールドし、ＳＨ３ドメインに対する公知のペプチドリガンドＤ−アミノ酸バージョンを有するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した（Ｙｕ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，７６，９３３（１９９４））。予想されたように、細菌で発現したＬ−ＳＨ３は、このペプチドのＬ−鏡像異性体を有するアフィニティーカラムに残ったが、Ｄ−鏡像異性体を有するものには残らなかった。このことは、ＳＨ３ドメインとその基質との相互作用が立体特異的であることを示す。ファージライブラリーは、ランダムに、１０−残基ペプチド配列が、バクテリオファージｆｄのｐＩＩＩタンパク質のＮＨ₂−末端で発現されるように構築された（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６（１９９０））。免疫抑制剤シクロスポリンおよびガンプロモーターミクロシスチン等の多くの天然の生物活性ペプチドは環状であるため、ライブラリーは、ジスルフィド結合形成のための性質を持つ多くの配列を含むようにデザインした（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄＳｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，２１７，２２８（１９９３））。Ｌ−ＳＨ３ドメインを、相互作用するペプチド配列のためのファージ提示ライブラリーをスクリーニングするために使用したとき、他によって同定されたジスルフィドフリーのポリプロリン型配列を単離した（Ｙｕ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７６，９３３（１９９４）；Ｒｉｃｋｌｅｓ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１３，５５９８（１９９４）；Ｓｐａｒｋｓ，Ａ．Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２３８５３（１９９４）；Ｃｈｅａｄｌｅ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，ｉｂｉｄ，ｐ．２４０３４））。同じファージ提示をＤ−ＳＨ３ドメインでスクリーニングしたとき、Ｌ−ＳＨ３結合配列に相似した明らかな配列を示さなかった一連のペプチド配列を単離し、３つのクラスにグループ化した（表１）。これらのペプチドすべて、それらが（Ｄ）−ＹＧＧＲＥＬＰＰＬＰＲＦペプチド（配列番号：２）で溶出したので、ＳＨ３ドメインの基質結合部位と相互作用した。Ｄ−ＳＨ３ドメインに結合するこれらのファージに提示されたペプチドは、保存されたロイシンおよびグリシン残基ならびに保存されたアルギニンまたはリジン残基の組み合わせによって特徴付けられる。Ｌ−ＳＨ３ドメインに対するＬ−ペプチドリガンドに対照的に（Ｙｕ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７６，９３３（１９９４）；Ｒｉｃｋｌｅｓ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１３，５５９８（１９９４）；Ｓｐａｒｋｓ，Ａ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２３８５３（１９９４）；Ｃｈｅａｄｌｅ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，ｉｂｉｄ，ｐ．２４０３４））、Ｄ−ＳＨ３ドメインに対するリガンド中の正電荷を帯びた残基は保存残基の範囲の中央に位置し、このことは、リガンド結合の形式が２つの形態において異なることを示唆する。さらに、Ｄ−ＳＨ３ドメインに対する全てのリガンドは、システイン残基のペアを含み、Ｌ−ＳＨ３ドメインと相互作用するＬ−ペプチドに観察されない性質を含む（Ｙｕ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７６，９３３（１９９４）；Ｒｉｃｋｌｅｓ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１３，５５９８（１９９４）；Ｓｐａｒｋｓ，Ａ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２３８５３（１９９４），Ｃｈｅａｄｌｅ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，ｉｂｉｄ．，ｐ．２４０３４））。ジスルフィド結合は、Ｄ−ＳＨ３ドメインに対するこれらのペプチドの親和性は、可能な適合の数を減らすことによって増加するかもしれない。これらのファージ粒子によって発現したペプチドのＤ−アミノ酸鏡像異性体が全てのＬアミノ酸ＳＨ３ドメインと相互作用するコンフォメーションは、標準結合および検出方法を用いて行われる。実施例２に述べられるように、Ｄ−ＳＨ３ドメインに結合するファージに提示されたペプチドの一方の鏡像であるＰｅｐ− Ｄ１と記されたＤ−ペプチドを合成し、その細菌で発現したＬ−ＳＨ３ドメインとの相互作用を調べた。（Ｄ）−ＳＨ３ドメインが（Ｌ）−ＳＨ３ドメインの基質結合部位と結合することを証明するために、非直接的な結合アッセイを使用した。実施例３で述べられているように、ＳＨ３ドメイン中の本Ｄ−ペプチドの結合部位を決定するために、Ｐｅｐ−Ｄ１の非存在および存在下で¹⁵Ｎ−ラベルしたＳＨ３ドメインを供しヘテロ核磁気共鳴（ＮＭＲ）実験を行った。Ｐｅｐ−Ｄ１と相互作用するＳＨ３ドメイン中の残基を、Ｄ−ペプチドリガンドの付加からのアミド¹Ｈまたは¹⁵Ｎケミカルシフト中の変化を通して同定した。本方法を通して単離されたリガンドは、全ての場合において、それらの生物学的対象物の活性を損なう機能が顕著になくなるか、または影響されない。例えば、ここで述べられた方法で単離されたリガンドは、ヌクレオチドに基づいたリガンドのＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ活性（Ａｓｈｌｅｙ，Ｇ．Ｗ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，９７３１（１９９２）；Ｕｒａｔａ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１３，８１７４（１９９１））ならびにペプチドに基づいたリガンドのプロテアーゼ分解および免疫応答の活性化（Ｇｉｌｌ，Ｔ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９７，７４６（１９６３）；Ｍａｕｅｒ，Ｐ．Ｈ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２１，３３９（１９６５）；Ｂｏｒｅｋ，Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｊ．，９６，５７７（１９６５）；Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．ａｎｄＳｅｌａ，Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３，２９（１９６７）；Ｄｉｔｚｉｓ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１６，３０６（１９９３））が顕著になくなるか、または影響されない。天然の左右像でないリガンドを単離するここに述べられたアプローチは、このように使用された全てのアプローチが自然の左右像のリガンドの単離だけに導入されることはないので、オリゴヌクレオチドに基づいたリガンドの単離に唯一のものである。結果として、このような「慣用的な」リガンドは、天然由来の酵素による分解に影響される。これに対して、Ｄ−アミノ酸で構成された合成ペプチドライブラリーの合成およびスクリーニングは、技術的に可能である。しかしながら、生物学的にコードされたライブラリー系においてスクリーニングできる多数の化合物（合成ペプチドライブラリーを達成できることより数桁高い程度）ならびに使われた中間増幅工程の有利な効果の両方のため、ここで述べられた技術と組み合わせたとき、かかるシステムが優れた結果を生じる。特に、合成ペプチドに基づいたストラテジーは、ペプチド溶解度の限界および使われたアッセイ（合成組み合わせのライブラリーおよび他の溶液に基づいたペプチドライブラリーのため）、または体積を考慮することによって固体相に基づいたライブラリーのいずれかの検出限界によって決められた縮重の上限をもつ。第２に、生物学的にコードされたライブラリー系に使用された中間増幅過程は、バックグラウンドの結合が高い状況において（もし、それが１回目のスクリーニング後に回収された分子の全プールの簡単に検出できる一部分を構成するならば、増幅過程を行われない系で、特異的なリガンドが同定されるだけである）、リガンドの同定を可能にする。第３に、ファージ提示および他の生物学的にコードされたライブラリー系は、エラーしやすい（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ等の工程を通して、コードするＤＮＡの変異による親和性の成熟を可能にする。最後に、ファージライブラリーは、合成ペプチドに基づいたライブラリーに比べて、著しい長さのインサートに適応する。これは、異なる大きさ別のクラスのリガンドの可能な単離を可能にするが、これらのインサート内に含まれる短いリガンドの複雑さ（スライディングウィンドウ（ｓｌｉｄｉｎｇｗｉｎｄｏｗｓ）として）を著しく増加させる。実施例４で述べられたように、ここで述べられた特異的な標的と相互作用するＤ−アミノ酸ペプチドリガンドの同定を、偏った（Ｄ）−アミノ酸ペプチドおよびペプチドに基づいたライブラリーのデザインのガイドラインを提供するために使用した。該ライブラリーは、次に新しいリガンドを単離するために使われた。本発明はさらに下記の実施例で示され、それは、いかなる方法にも限定することを意味するものではない。実施例１Ｄ−アミノ酸ペプチドと特異的に相互作用するファージの同定Ｌ−ＳＨ３ドメインの調製残基の番号が付与された系は、ニワトリのｃ−ＳＲＣ蛋白の全長である。ニワトリのｃ−ＳＲＣの８１〜１４０残基を、プラスミドｐＭＭＨｂ（Ｓｔａｌｅｙ，Ｊ．Ｐ．及びＫｉｍ，Ｐ．Ｓ．，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，３：１８２２（１９９４））の他のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩサイトにクローニングした。このプラスミドにおいては、メチオニン残基がロイシンに置換され、システイン残基がアラニンに置換され（Ｓｔａｌｅｙ，Ｊ．Ｐ．及びＫｉｍ，Ｐ．Ｓ．，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，３：１８２２（１９９４））、そしてリーダー配列のカルボキシル末端に９個のヒスチジン残基が付加された、ＴｒｐＬＥリーダー配列が修飾された形の融合蛋白として蛋白が発現される。６００ｎｍの吸光度が０．６の時点で、０．４ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（リサーチオーガニクス）を大腸菌ＢＬ２１−（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（ストラタジーン）に添加し、プラスミドｐＭＭＨｂ−ＳＲＣＳＨ３にコードされた融合蛋白の発現を誘導した。２時間の誘導処理に次いで、細胞を遠心分離に付して封入体を単離した。組換え蛋白は、封入体を、６Ｍグアニジン−塩酸、０．２Ｍトリス、ｐＨ８．７（緩衝液Ａ）に再懸濁させ、Ｎｉ²⁺カラム（Ｎｉ²⁺−ＮＴＡ−アガロース；キュイアゲン）でクロマトグラフィーに付すことにより精製した。溶出を行った後、水に対して透析し、凍結乾燥し、融合蛋白を７０％蟻酸中に溶解させ、ＣＮＢｒで切断した（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｐ．及びＫｉｍＰ．Ｓ．，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，３：１８２２（１９９４））。透析、凍結乾燥されたものを、次いで、緩衝液Ａ中に溶解させ、Ｎｉ²⁺カラムでクロマトグラフィーに付すことにより精製した（切断後においては、単離されたＳＨ３ドメインはこのカラムを素通りするのに対して、切断されなかった融合蛋白や切断されたＴｒｐＬＥリーダー配列は保持される）。（低イオン強度のＰＢＳ緩衝液に対して、そして最後に水に対して）透析を行った後、凍結乾燥し、ｐＨが中性での高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析と、レーザー脱着マススペクトロメトリー（理論値は６６８６ダルトン；実測値は６６８３ダルトン）とでSＨ３ドメインの純度と同一性を確認した。全Ｄ−ＳｒｃＳＨ３ドメインの合成全Ｄアミノ酸ＳＨ３ドメイン、配列Ｓ−ＣＯＯＨ−末端（配列番号：１）、ニワトリのｃ−ＳＲＣ蛋白の残基８１〜１４０、は、ＡＢＩ４３１Ａペプチド合成装置とＡＢＩファストモックサイクル（Ｆｍｏｃの性質はＨＢＴＵで活性化され、無水酢酸でキャップされたもの）を用いてＨＭＰ樹脂（ＡＢＩ／パーキンエルマー）上で合成された。保護されたＤ−アミノ酸は、バッケムカリフォルニア、バッケムバイオサイエンス、アドバンスドケムテック及びノババイオケムより入手した。Ｄ−ＩｌｅとＤ−Ｔｈｒについては、その側鎖が鏡像体のものを使用し、側鎖のキラリティーも天然のＬ− ＴｈｒとＬ−Ｉｌｅとは逆である。合成が終了した後、そのペプチドのアミノ末端をＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンＩＩ（ピアース）で修飾した。切断後、そのペプチドを凍結乾燥し、ｐＨ６．０の６Ｍグアニジン塩酸中に溶解させ、カットオフ分子量が３５００ダルトン（Ｄ）（スペクトラ／ポア）の透析チューブを用いて、ｐＨ６．０の１００ｍＭのＮａＨＰＯ₄、１００ｍＭのＮａＣｌに対して透析した。透析後、このものを短時間遠心分離処理に付して不溶性の残渣を除去し、その後上清を５％酢酸に対して透析し、凍結乾燥した。このペプチドを、１ｍＭビオチンを含む、トリスで緩衝能が付与された塩溶液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ）に溶解させ、３．３ｍｇ／ｍＬの濃度とした。全てがビオチン処理された、長さが６０アミノ酸の（Ｄ）−ＳＨ３ドメイン産物は再び折り畳まれ、ＳｒｃＳＨ３ドメインに対する公知の基質の全てが（Ｄ）体である、（Ｄ）−ＹＧＧＲＥＬＰＰＬＰＲＦ（配列番号：２）、これはピオチン化されて、そしてストレプトアビジン−アガロースカラム（ピアース）に固定化されている、のアフィニティークロマトグラフィーにより精製を行った（Ｙｕ，Ｈ．ら，Ｃｅｌｌ，７６：９３３（１９９４））。このペプチドは、全てが（Ｌ） −ＳＨ３ドメインに対して結合性を示す、全てが（Ｌ）−ペプチドの誘導体であり（Ｙｕ，Ｈ．ら，Ｃｅｌｌ，７６：９３３〜９４５（１９９４））、アミノ末端にＹＧＧが付加されて濃度の決定が容易化されている（Ｈ．Ｅｄｅｌｈｏｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６：１９４８（１９６７））。同じく、アミノ末端にＹＧＧが付加されたＬ−ペプチドは、実験のコントロールリガンドとして有用であった。予想されるように、細菌により発現される（Ｌ）−ＳＨ３（ニワトリのｃ−ＳＲＣの残基８１〜１４０が発現された）は（Ｌ）−鏡像体上で保持され得るものであるが、このペプチドの（Ｄ）−鏡像体上ではそうではなく、このことはＳＨ３のドメインとその基質との相互作用が立体特異的であることを示すものである。クロマトグラフィーのフラクションを、ボイジャーマススペクトロメーター（パーセプティブバイオシステムズ）によりレーザー脱着マススペクトロメトリー分析に付した。予想される質量のもの（理論値は７０２７ダルトン；実測値は７０２７〜７０３５ダルトン）を含むフラクションを集め、そして水に対して７２時間透析を行い、凍結乾燥し、そして水に溶解させて１０７μｇ／ｍＬの濃度とした。ファージライブラリーの生産ファージライブラリーは、アミノ末端と繊維状ファージｐＩＩＩ蛋白との融合物としてのペプチドをランダムに発現するように設計された。典型的には、ファージ粒子あたり３〜５コピーが存在し、弱い／中間のアフィニティーリガンドの単離を可能とするものであった。（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．及びＳｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ，，２１７：２２８（１９９３））に記載のビオチン化プライマーを用いて、セリン又はシステインで挟まれた、ランダムに１０残基が挿入されたものをコードするＤＮＡ（Ｓ／Ｃ−Ｘ₁₀−Ｓ／Ｃ）（配列番号：２０）を、８５残基のオリゴヌクレオチドのＰＣＲによって調製した（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．，“ＣｌｏｎｉｎｇｉｎＦｕｓｅｖｅｃｔｏｒｓ”，ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｉｓｓｏｕｒｉ（１９９２年２月１０日版））。挿入物のデザインは：ＮＨ₂−Ａ−Ｄ−Ｇ−Ａ−Ｓ／Ｃ−Ｘ₁₀−Ｓ／Ｃ−Ｇ− Ａ−Ｇ−Ａ−ＰＩＩＩ（配列番号：３）であった。８５残基のオリゴヌクレオチド：ここで、ＳはＣ／ＧＮはＡ／Ｔ／Ｃ／Ｇ（等モル混合物）ＰＣＲ産物の精製、そしてＢｇｌＩでの切断後、ストレプトアビジンで被覆したアガロースビーズ（ピアース）を用いてその末端部分を除去した。次いで、ＰＣＲ産物をエタノールで沈殿させ、そしてポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分析に付した。ランダムＰＣＲ産物の、ＳｆｉＩ−カットＦｕｓｅ５ベクターへのライゲーションにより、このライブラリーを作製した。ライゲーションの後、反応混合物をフェノール及びクロロフォルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、そして１０ｍＭトリス／１ｍｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に溶解させた。次いで、バイオーラッド大腸菌パルサーと０．１ｃｍのキュベットを用いて、ＭＣ１０６１細胞（バイオラッド）のエレクトロコンピテントセルにライゲーション産物を移した。非制限的に１時間培養した後、テトラサイクリンを含有するプレート上に形質転換された細胞の一部を載せて形質転換の効率性を調べ、３．６×１０⁸個の形質転換体の初期ライブラリーを得た。次いで、形質転換混合物を希釈し、２０ μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含む４００ｍＬのＬＢで培養し、さらに１４時間培養した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により、上記の培養上清を連続して２回沈殿させてファージのストックを調製した。最終的に、このファージのストックを、トリスで緩衝能を付与した塩溶液／ＮａＮ₃に再懸濁させ、Ｋ９１ −ｋａｎ細胞（Ａ２１）の感染により力価を測定し、総計２．８×１０¹¹の形質転換単位を得た。個々のクローンの配列を調べることにより、挿入の不規則性を確認した。次いで、４×１０¹⁰の形質転換単位を用いてＫ９１−ｋａｎ細胞に感染させ、ライブラリーを増幅した。１８時間後、ＰＥＧによる沈殿を３回繰り返してファージを精製し、ＴＢＳ／ＮａＮ₃中に１０ｍＬの増幅されたファージライブラリーを得た（１．２−１０¹²形質転換単位／ｍＬ）。１）レクチンであるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ，Ｋ．Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５３９３（１９９２）；Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ら，同上，５３９８；２）マウスＭＨＣクラスＩのＨ鎖に対する二種のマウスモノクローナル抗体；及び３）ＳｒｃＳＨ３ドメインの細菌による発現物、と相互作用する挿入物を発現するファージを選択することによって、ライブラリーの品質を確認した。全てのスクリーニングは、予想された結果を示した。ＣｏｎＡでのスクリーニング３回目の後ファージライブラリーのスクリーニングＤ−ＳＨ３ドメインと一連のペプチド配列、これらの配列はＬ−ＳＨ３−結合性配列とは明確な類似性を示さない、を用いて、ファージ提示物のスクリーニングを行い、単離した（表１参照）。底が平らな９６ウェル高結合性Ｅ．Ｉ．Ａ．／Ｒ．Ｉ．Ａ．プレート（コスター）のシングルウェルを、１００μＬの１００ｍＭＮａＨＣＯ₃中に１０μｇのストレプトアビジン（ピアース）によって、４℃で一晩被覆した。水で一回洗浄した後、ウェルを１００μＬ（１０．７μｇ）のビオチン化（Ｄ）−ＳＨ３と共に、２０℃で１時間インキュベーションを行い、３０ｍｇ／ｍＬの透析処理済みウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の１００ｍＭＮａＨＣＯ₃溶液で２時間ブロッキング処理を行い、そして再び１００μＬ（１０．７μｇ）のビオチン化（Ｄ）−ＳＨ３と共に１時間インキュベーションを行った。５ｍＭのビオチンの、トリスで緩衝能を付与した塩溶液（ＴＢＳ）を８μＬ添加して３０分間、リガンドが結合していないストレプトアビジンのブロッキングを行った。次いで、リン酸で緩衝能を付与した塩溶液（ＰＢＳ）と０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０でウェルを５回洗浄し、５０μＬのＴＢＳ／ＮａＮ₃中のファージストックと、５０μＬのＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ₃ とで一晩インキュベーションを行った。次いで、選択の手順が後の回になるとインキュベーションの時間が長くなるという状況下で、２００μＬのＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡを６回添加してウェルを洗浄した。次いで、１００μＬのＤ−ＳＨ３リガンドペプチド、配列はＤ−ＹＧＧＲＥＬＰＰＬＰＲＦ−アミド（配列番号：２）、（７１５μＭ）を添加し、４℃で１５分間、ペプチドの終濃度が７００〜１０００μＭとすることによってファージ粒子と結合した（Ｄ）−ＳＨ３を溶出した。このスクリーニングでのファージの酸による溶出により、Ｄ−ＳＨ３で被覆されたウェルに対する選択的な結合性は、４回目の選択後では検出できない。次いで、この溶出物をＫ９１−ｋａｎ細胞への感染に使用した。１００μＬの溶出物を、（上記で調製された）１００μＬのＫ９１テリフィックブロス細胞と軽く混合し、室温で２０分間インキュベーションを行った。次いで、この混合物を、２０ｍＬのＬＢ／０．２μｇ／ｍＬテトラサイクリンが入った三角フラスコに移した。３７℃で１時間、振とうしつつインキュベーションを行い、テトラサイクリンを終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように添加し、適当に希釈したものをテトラサイクリン含有プレート（２０μｇ／ｍＬ）上に広げて溶出物の力価を調べ、そして培養物を３７℃で１２〜１６時間インキュベーションを行った。２回のＰＥＧによる沈殿により、上清からファージを単離し、そして得られるファージストックを、力価から収量を求めるために、及び続く選択の回のために使用した。第４回目の選択において、ファージをＤ −ＳＨ３ドメインで被覆されたウェル内又は被覆されていないウェル内でインキュベーションを行い、捕捉の特異性を求めた。洗浄条件及び異なる選択回での収量は、次のようであった：これらのデータから、１）洗浄条件が明らかに厳しくなるにも関わらず、収量が増加することから、後の回ほど、より強固に結合するファージが選択される、そして２）このドメインに対する基質とインキュベーションを行うことで溶出されることから、そしてさらに重要な理由としては、４回目でのファージ粒子の回収が、Ｄ−ＳＨ３ドメインの存在下では非存在下に比べて２０倍以上高いこと（回収はＤ−ＳＨ３ドメインで被覆されたプレートからより高いものである）から、この結合はＤ−ＳＨ３ドメインに対して特異的である、ということが明らかとなった。極めて多くのファージ粒子が、Ｄ−ＳＨ３ドメイン非存在下よりも存在下で保持された。（Ｄ）−ＳＨ３ドメインがこのライブラリーのスクリーニングに用いられた場合、一連のペプチドが単離され、３つのクラスに分けられた。（Ｄ）−ＹＧＧＲＥＬＰＰＬＰＲＦペプチド（配列番号：２）で溶出されることから、これらのペプチドは全てＳＨ３ドメインの基質結合部位と相互作用する。驚くことには、全てのペプチドは一対のシステイン残基と、（Ｌ）−ＳＨ３ドメインと相互作用するポリプロリンペプチドでは認められない特性とを有していた。このジスルフィド結合は、可能なコンフォマーの総数を減少させることにより、これらのペプチドの（Ｄ）−ＳＨ３ドメインへのアフィニティを高めるらしい。Ｉ群及びＩＩＩ群のペプチドは、ＳＨ３ドメインのアスパラギン酸９９との塩橋を形成し得るアルギニンを少なくとも１残基有し、そしてＳｒｃ−結合性ポリプロリンペプチドのアルギニ残基と相互作用する（Ｆｅｎｇ，Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：１２４１（１９９４））。Ｉ群とＩＩＩ群の異なるメンバー間の保存残基を太字で示し、半保存残基を下線で示す。Ｉ群とＩＩＩ群のすべてのメンバーに対して、システイン残基に対する保存残基の位置が保存されていることに注目せよ。（Ｄ）−ＳｒｃＳＨ３ドメインへの結合について４〜５回めの選択後、すべての３群の挿入物を提示する個々のファージクローンを分析した。すべてのクローンは、対照ウエルに比べて少なくとも１５０倍以上、０．５μｇのストレプトアビジンと１．３μｇのＳｒｃＳＨ３ドメインで被覆したウエルに結合する。低ストリンジェンシー及び高ストリンジェンシーの両方のスクリーニングで、４回めの選択後、個々のコロニーを分析した。高ストリンジェンシー及び低ストリンジェンシーの両方のスクリーニングは、同一の初回の選択に基づいていた。高ストリンジェンシー及び低ストリンジェンシーの両方のスクリーニング間の相違は、ウエルに被覆するために使用した（Ｄ）−ＳｒｃＳＨ３の濃度が２倍低いこと、プレート上でのファージのインキュベーション時間が短いこと（１６時間から１時間へ）及びプレートの６回の洗浄のインキュベーション時間が長いこと（低ストリンジェンシースクリーニング：２、３及び４回め、各３分、５分及び１０分；高ストリンジェンシー：２〜４回め、すべて１０分のインキュベーション）を含むものである。Ｌ−ＳＨ３ドメインを用いるファージの提示も評価した。（Ｌ）−ＳＨ３ドメインを用いて、配列の相互作用に対してファージライブラリー（Ａ１２）をスクリーニングするとき、他者により発見されたポリプロリン配列が単離される（結果は以下のとおりであり、提示が働くことが示された：おとり４回めの後ＧＣＮ４ロイシンジッパー：短い（３３残基）が、低い蓋然性ｃ−ＳｒｃＳＨ−３ドメイン：６０残基、ペプチドと結合（タイプＩＩポリＰｒｏ）ＧＣＮ４ロイシンジッパー：前向きに合成、５回めの後予想されるＣＤ＋／−ジッパーの回収に相違なし５９個の独立クローンを試験、＋／−ジッパーに相違なしＳｒｃＳＨ３ドメイン：Ｓｒｃ（Ｌ−）ＳＨ３は立体特異的様式で基質に結合するＳｒｃ（Ｌ−）ＳＨ３はライブラリーからポリＰｒｏ配列を選択するＬ−ＳＨ３ドメインを用いる４回めの選択後、少数の単離物の配列分析により、以下の２つのペプチド配列が明らかになった：ＣＬＡＲＳＲＬＰＡＩＰＳ（配列番号：１０）（９個の単離物）及びＳＲＭＳＰＬＶＰＬＲＮＳ（配列番号：２１）（１個の単離物）。これらのペプチドの配列は、ＳＨ３ドメインのクラスＩ及びクラスＩＩリガンドに対して記載されているものと一致した特徴を有する（単ファージクローンの分析より精密にこの相互作用の特異性を分析するために、４回の選択後に得られた６個のクローンをＬＢ／２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン中で生育した。ファージ粒子をＰＥＧ沈殿により１．３ｍｌの上清から単離し、５００５μｌＴＢＳ中に再懸濁し、推定濃度６．５×１０¹⁰形質転換単位／ｍｌを得た。０．２μ １部分（約１．３×１０⁷ＴＵ）を前述したようにコートされているが、１０μ ｌではなく０．５のストレプタヴィジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を有し、１．３μｇＤ−ＳＨ３を有するまたは有しないウェルにおいて５０μｌのＴＢＳ／０．１％ツイーン２０／１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ中でインキュベートした。ファージと共にインキュベーションした後、非結合ファージを６（３分）で取り除き、１５０μｌのＴＢＳ／０．１％ツイーン２０／１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを用いて洗浄した。結合ファージ粒子を、次に４０μｌグリシネシンＨＣｌｐＨ２．２／１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを用いて４℃、１０分間で溶出した。溶出物を、次に中性ＰＨに持っていき、前述したようにＫ９１カン（ｋａｎ）細胞に滴定した。４および５回の選択の後、個々のクローンを分析した。次の回に、洗浄間のインキュベーション時間を増加した（１から５回の間に、それぞれ０、３、５、１０および１０分の時間）。４回の選択の後、２９個のクローンをシークエンスし、その中で、７個だけが表１のグループＩＩＩにあたるものである。選択されたファージがストレプトアビジンに結合していない、またはストレプトアビジン− Ｄ−ＳＨ３複合体により形成されたストレプトアビジンにより形成される複合表面に結合していないことを確認するために、５回目の選択をマトリクスとしてニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いて行った。この５回目の選択の後のクローンの配列分析は、ｆｄＳＲＣ−２−タイプの配列のみを示した。予備試験は、対応するペプチド、Ｐｅｐ−Ｄ２、の親和性がＰｅｐ−Ｄ１のものと似ていることを示唆する。Ｐｅｐ−Ｄ１は、ｆｄＳＲＣ−１挿入ＣＬＳＧＬＲＬＧＬＶＰＣ（配列番号：１６）（表１）に類似し、すべてのフランキング配列に存在しているＣＯＯＨ末端アラニンを有している（実施例２参照）。４回の選択後に得られた他のファージ単離物は、以下の２つの配列の１つを発現した：ＣＫＲＦＶＷＲＧＱＡＬＣ（配列番号：１３）（１０個の単離物）およびＣＷＹＬＧＹＷＰＧＱＥＣ（配列番号：１５）（１２個の単離物）。これら配列の始まりは、様々のビオチン化結紮を用いて単離されるバックグランドの配列に似ており（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．およびＳｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，２１７：２２８（１９９３））、以前にミオヘメリシリン（ｍｙｏｈｅｍｅｒｙｔｈｒｉｎ）に対するモノクローナル抗体を用いて単離された配列にも類似しているが、それはこの抗体に対する認識モチーフと同様ではない（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．およびＳｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６（１９９０））。従って、この配列は、ＳＨ３ドメイン以外の系においていくつかの成分と結合する見込みがある。実際、この配列のＤ−アミノ酸版は、ＥＬＩＳＡおよびＮＭＲ実験により判断すると、Ｌ−ＳＨ３ドメインに結合できない。４回の選択の後採取した他の配列は、始まりの配列との限定された類似性を示し、それ以上調べられていない。実施例２全Ｄアミノ酸ＳｒｃＳＨ３ドメインは、ＬＳｒｃＳＨ３ドメインに結合するＤ−ＳｒｃＳＨ３ドメインに結合するファージ提示ペプチドの一つの鏡像である、Ｐｅｐ−Ｄ１を示す（Ｄ）−アミノ酸ペプチド、（Ｄ）−ＲＣＬＳＧＬＲＬＧＬＶＰＣＡ（配列番号：１１、グループＩＩＩ配列の代表的な配列）を合成し、その細菌的に発現された（Ｌ）−ＳＨ３ドメインとの相互作用を試験した。Ｐｅｐ−Ｄ１は、ｆｄＳＲＣ−１挿入ＣＬＳＧＬＲＬＧＬＶＰＣ（配列番号：１６）（表１）に類似し、すべてのフランキング配列に存在しているＣＯＯＨ末端アラニンを有している。最初のシステイン残基の直前にあるアルギニンをｆｄＳＲＣ−３配列に観察した（表１）。分泌性および膜通過性内外の蛋白質のＮＨ₂ 末端に近接したアルギニン残基およびリジン残基の存在は、蛋白質の移動に消極的に影響を与える（Ｂｏｙｄ，Ｄ．およびＢｅｃｋｗｉｔｈ，Ｊ．，Ｃｅｌｌ，６２：１０３１（１９９０））。さらに、ファージｐＩＩＩ融合体のＮＨ₂末端部分にあるアルギニン残基に対する選択が観察された（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１３：２５０８（１９９４））。従って、このクローンにおいてアラニンからアルギニンへの変異は、Ｄ−ＳＨ３ドメインについて挿入配列の親和性を増加し、ペプチドの溶解度を改良することができた；従って、それは合成ペプチドに含まれた。親和性測定に関して、ＮＨ₂末端Ｄ−チロシンを濃度測定法についてペプチドに添加した（Ｅｄｅｌｈｏｃｈ，Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６：１９４８（１９６７）。ＮＨ₂末端チロシンを有するおよび有しないペプチドを１００ｍＭトリス、ｐＨ８．５、１ｍｇ／ｍｌの濃度で４８時間空気酸化した。酸化されたペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより、Ｃ₁₈カラムおよび０．１％トリフルオロ酢酸中で水−アセトニトリル勾配を用いて精製した。生成物の同定は、レーザー脱着質量分析により確認した。還元型のＰｅｐ−Ｄ１はこのアッセイにおいて検出可能な結合活性を示さず（Ｋ_d＞＞８００μＭ）、このことはジスルフィドの形成が効果的な結合に要求されることを示している。Ｌ−ＳＨ３ドメインに対するＰｅｐ−Ｄ１の親和性を競争的な酵素結合免疫溶媒アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定した。９６ウェルプレートの一つのウェルを５μｇのＬ−ＳＨ３ドメインでコートした（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６（１９９０）；Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．およびＳｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，２１７：２２８（１９９３））。ウェルはＢＳＡでブロックされ、Ｌ−ＳＨ３−結合挿入ＣＬＡＲＳＲＬＰＡＩＰＳ（配列番号：１０）を発現するファージを、増加量の競争者ペプチドの存在下で１０ｍＭＮａＨＰＯ₄、ｐＨ７．２、１５ｍＭＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ₃、および０．１％ツイーン２０中で結合するのが可能であった。ファージ結合はウサギＭ１３抗体（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））およびウサギに対するアルカリホスファターゼ標識化ヤギ抗体（ピアス）を用い、基質としてｐ−ニトロフェノールホスフェートの新しい溶液を用いて定量した。４１０ｎｍの吸収はダイナテックマイクロタイタープレートリーダーを用いて決定した。Ｌ−ペプチドリガンドＹＧＧＲＥＬＰＰＬＰＲＦアミド（配列番号：２）およびＤ−ペプチドリガンドＰｅｐ−Ｄ１ＹＲＣＬＳＧＬＲＬＧＬＶＰＣＡ（配列番号：２２）について２５ｍＭジチオスレイトールの存在下および非存在下で滴定曲線（３点法）を得た。Ｋ_dについての相対値を前述したように得た（Ｍｉｎｏｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｊｒ．およびＫｉｍ，Ｐ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６７：６６０（１９９４））。Ｌ−ペプチドＹＧＧＲＥＬＰＰＬＰＲＦ−アミド（配列番号：２）のＫ_dを６．０μＭになるように直接トリプトファン蛍光分光法により決定した。ペプチド溶液を１５ｍＭＮａＣｌおよび１０ｍＭＮａＨＰＯ₄、ｐＨ７．２中の１μＭＳＨ３溶液内に滴定した。トリプトファン蛍光を２９５ｎｍ（５ｎｍスリット幅）で励起することにより誘導し、日立Ｆ−４５００蛍光分光計を用いて発光を３３９ｎｍ（１０ｎｍスリット幅）で測定した。解離定数をスキャッチャード分析により決定した。ルブレドキシン（４５アミノ酸）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロテアーゼ（９９アミノ酸）の両方の（Ｄ）−鏡像異性体型の合成はＤｅｌＭｉｌｔｏｎ，Ｒ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１４４５（１９９２）；Ｐｅｔｓｋｏ，Ｇ．Ａ．，Ｉｂｉｄ，２５６：１４０３（１９９２）；Ｚａｗａｄｚｋｅ，Ｌ．Ｅ．およびＢｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：４００２（１９９２）；Ｚａｗａｄｚｋｅ，Ｌ．Ｅ．およびＢｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１６：３０１（１９９３））に述べられており、成功する化学合成の見込みに対するサイズ限定のため、ほとんどの蛋白質について完全（Ｄ）−鏡像異性体型の合成が可能ではない。しかしながら、細胞内および細胞外蛋白質の両方は、しばしば１００アミノ酸以下の自律的なドを参照）。このサイズ範囲は、流動固体相ペプチド合成技術、および化学における最近の進歩の範囲内にあり、保護されていない蛋白質フラグメントに対するライゲーション戦略は、より大きな蛋白質ドメインでさえ合成することが約束されている。従って、興味深い蛋白質（例えば、マルチドメイン蛋白質）に対するリガンドの単離を、ＳＨ３ドメインについて本明細書で述べたように、その構成ドメインの一つの合成およびスクリーニングを通じて達成してもよい。実施例３ＳＨ３ドメインにおけるＤ−ペプチドの結合部位の決定ヘテロ核磁気共鳴（ＮＭＲ）実験を、ＳＨ３ドメインにおけるこのＤ−ペプチドの結合部位を決定するために、Ｐｅｐ−Ｄ１の存在下および非存在下で¹⁵Ｎ− 標識されたＳＨ３ドメインについて行った。Ｐｅｐ−Ｄ１と相互作用するＳＨ３ドメインにおける残基を、Ｄ−ペプチドリガンドの添加した際のアミドの¹Ｈまたは¹⁵Ｎ化学シフトの変化を通して同定した。その天然のＬ−アミノ酸リガンドに対するＳＨ３ドメインのリガンド−結合部位は、共に分子の１側面に相対的に浅い溝を形成する３つのポケットからなる（）。ポケットＡは、アスパラギン酸⁹⁹およびトリプトファン¹¹⁸の側鎖により形成されており、転換されたアルギニン残基を提供し、ポケットＢおよびポケットＣがＳＨ３リガンドにおいて脂肪族残基およびプロリン残基に適応する疎水性の表面を形成する。（）。均一な（≧³９５％）¹⁵Ｎ−標識されたＳＨ３ドメインを、（¹⁵ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ を補足したＭ９培地液中でプラスミドｐＭＭＨｂ−ＳＲＣＳＨ３を持つ大腸菌を生育することにより得た（９９．７％ ¹⁵Ｎ；Ｉｓｏｔｅｃ，Ｍｉａｍｉｓｂｕｒｇ，Ｏｈｉｏ）。６００ｎｍで０．６の吸光度に達するまで、細胞を０．４ｍＭＩＰＴＧで４時間誘導した。蛋白質を非標識化材料について記載したように精製した。スペクトルをＢｒｕｋｅｒＡＭＸ５００ＭＨｚＮＭＲ分光計で集めた。共鳴割当量を標準的な方法により行い（当量で構成した（Ｙｕ，Ｈ．ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬＥＴＴ．，３２４：８７（１９９３））。ペプチドＰｅｐ−Ｄ１を、１０ｍＭホスフェート、ｐＨ６．０中に¹⁵Ｎ−標識されたＳＨ３ドメインを含む溶液に１．５：１（ペプチド：蛋白質）の割合で２９８Ｋで添加した；ヘテロ核酸単量子結合力（ＨＳＱＣ）スペクトル（Ｂｏｄｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇ．およびＲｕｂｉｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，６９：１８５（１９８０）の非複合型および複合型を比較した。¹Ｈディメンジョンにおいて０．０４ｐ．ｐ．ｍ．より大きい、または¹⁵Ｎディメンジョンにおいて０．１７ｐ．ｐ．ｍ．より大きい化学シフトの違いをもつ共鳴はなかった。しかしながら、多くの共鳴は強度において減少し、または複合体のＨＳＱＣスペクトルにおいて完全に存在しなかった。リガンド−フリースペクトルと比較し、有意にＰｅｐ−Ｄ１結合を減少した、それらのＨＳＱＣ共鳴の強度を有する残基は、以下の方法で同定した：個々のピークについて、ペプチドの非存在下および存在下でピーク強度の割合を決定し、対数の尺度に置き換えた。メジアンの周囲に得られる分布は、左に向かって顕著に歪む。メジアンより高い割合を持つ残基のうち９０％より多くを含む窓は、メジアンより低い化学シフトをもつ残基に適用された。メジアンより低い割合の残基およびこの窓の内に含まれないものだけが、有意に摂動を経ると考えられた（これらの基準に従って、メジアンのものの０．６５以下に減少する割合をもつ残基のみが有意な摂動を経ると考えられた）。これらの残基は残基９４、９７、１１２、１１５、１１７、１１９、１２０、１３１、１３２および１３５、トリプトファン¹¹⁹のインドール共鳴およびアスパラギン¹¹³、およびアスパラギン¹³⁵の側鎖アミドを含む。９５、９６、９８、９９、１００、１１８および１３４の共鳴およびトリプトファン¹¹⁸のインドール共鳴は、リガンドの存在下では存在しなかった。Ｌ −ペプチドＹＧＧＲＥＬＰＰＬＰＲＦアミド（配列番号：２）を用いた対照実験は、¹Ｈディメンジョンにおいて³０．１ｐ．ｐ．ｍ．ｉ以上、または¹⁵Ｎディメンジョンにおいて³０．５ｐ．ｐ．ｍ．以上までシフトされた１７個の共鳴を得た（残基８７、８９、９０、９２、９６、９８、９９、１００、１０９、１１１、１１４、１１６、１１９、１２１、１３１、１３２および１３５、トリプトファン¹¹⁹のインドール共鳴およびアスパラギン¹¹³、およびアスパラギン¹³⁵の側鎖アミド）。５個の共鳴（９５、９７、１１７、１１８および１３４）は複合体のＨＳＱＣスペクトルに存在しなかった。Ｐｅｐ−Ｄ１と相互作用する残基を同定するために選ばれるアプローチを確認するために、このアプローチがＬ −ペプチドＹＧＧＲＥＬＰＰＬＰＲＦアミド（配列番号：２）を用いて得られるスペクトルに適用した。このアプローチを用いたところ、このペプチドと相互作用するような新しい残基は同定されなかった。プロリン¹³³の化学シフト上で結合するペプチドの効果、それはポケットＢ部分を形成する、を、この型の実験では観察することはできなかった。Ｐｅｐ−Ｄ１の結合は、近接した残基の断片と同様にポケットＡを形成する残基の化学シフトの摂動を生じる（図２Ｃ）。また、ほとんどのこれら残基は、Ｌ −ペプチドの結合に関してこれらの化学シフトに変化を生じる（図２Ｂ）。ポケットＡは、Ｄ−ペプチドにおいて、Ｌ−アミノ酸リガンドにおけるアルギニン残基の認識に対する類似体である方法で、転換されたアルギニン残基またはリジン残基と相互作用する可能性がある。Ｌ−およびＤ−アミノ酸リガンド両方とこの部位の相互作用は、これら２つのリガンドの結合について観察された競争を説明する。Ｐｅｐ−Ｄ１は、ＳＨ３ドメインについてポリプロリン型リガンドにより接触される結合部位の部分のみを占めていることが明らかである（図３）。ポケットＢおよびポケットＣ部分を形成する残基（チロシン⁹⁰およびチロシン⁹²）、またはこのポケットに近接した残基（バリン⁸⁷およびロイシン⁸⁹）はＰｅｐ−Ｄ１の結合に摂動を生じる（図２および３）。変異分析は、Ｌ−アミノ酸リガンドについて、これらの部位での相互作用が高親和性結合に必要であることを示唆する（Ｆｅｎｇ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１２４１（１９９４）。従って、高親和性のＤ−ペプチド阻害剤を、さらに溝に沿ってＳＨ３ドメインのポケットＣ内に拡大するＰｅｐ−Ｄ１またはＰｅｐ−Ｄ２（表１）の類似体の設計または選択により、潜在的に得ることができた。実施例４高度に濃縮したライブラリーを設計するためのＤ−アミノ酸ペプチドリガンドの使用ランダムな合成ライブラリーは、与えられた標的に対して高親和性リガンドの単離を常に可能にするための十分な構造空間をカバーしていない。より可能性がある戦略は、興味深い標的と相互作用することが知られている構造成分の傾向があるライブラリーを使用することである。特に、本明細書で述べられた戦略を用いて単離される与えられた標的と相互作用するＤ−アミノ酸ペプチド配列は、傾向のある（Ｄ）−アミノ酸ペプチドおよびペプチド基礎ライブラリーの設計についてのガイドラインとして使用される。これらの傾向のあるライブラリーは次に、新規なリガンドの単離に利用される。例えば、ＳＨ３ドメインについて３つのクラスの（Ｄ）−アミノ酸ペプチドリガンド（実施例２）は、ＳＨ３結合ペプチドまたはペプチド類似物を高度に濃縮するよう（Ｄ）−アミノ酸ペプチド−基礎ライブラリーを設計するのに有用である。かかるライブラリーはＳＨ３ドメインに結合するペプチドを同定するのに有用であり、それらがＳＨ３ドメインに結合することが知られているペプチドの（ある高められた割合を持つ）傾向があるので特に有用である。（Ｌ）−アミノ酸ペプチドと相互作用するすべてのＳＨ３ドメインは、相似した構造成分をもつリガンドに結合するか調べた。また、ＳＨ３ドメインに対する（Ｄ）−アミノ酸リガンドの構造に基づく合成ライブラリーは、他のＳＨ３ドメインに対するリガンドに富む。ＳＨ３ドメインに対する（Ｄ） −アミノ酸リガンドの構造に基づく傾向のあるライブラリーは、様々なＳＨ３ドメインに対するリガンドの単離に有用である。例えば、以下のように、（Ｄ）−ＳＨ３ドメインに結合することを示すような実施例２で述べられる３クラスのペプチドのアミノ酸配列に基づいて、傾向のあるライブラリーを構成する。ライブラリーの約８０％のＤ−アミノ酸ペプチドが転換されたアミノ酸残基を有し、ライブラリーの約２０％のＤ−アミノ酸ペプチドが転換されたアミノ酸残基を有しないように、Ｄ−アミノ酸の化学ペプチドライブラリーを調製する。従って、（Ｄ）−ＳＨ３ドメインに結合することが知られる一般的な構造のペプチドを有するペプチドについてかなり傾向がある（例えば、８０％）ライブラリーは、転換された構造を有し、他のＳＨ３ドメイン（例えば、ヒト）と結合する他のＤ−アミノ酸ペプチドを単離するのに用いることができる。さらに、転換アミノ酸残基が変えられ（例えば、Ｄ−アミノ酸ペプチドの２０％から）、同量のまたはより大きい親和性をもつＳＨ３ドメインに結合するような、Ｄ−アミノ酸ペプチドを単離することができる。実施例５鏡像異性体ＤＮＡ性バソプレッシン阻害剤の鏡像選択従来の固相ペプチド合成法を用いて、バソプレッシンを調製した。ペプチドホルモンＬ−バソプレッシンのアンタゴニストを生じる最初の段階で、合成Ｄ−バソプレッシン（ＤＶＰ）に結合する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡｓ）を単離するために、インビトロ選択を用いた。１０¹⁶個の異なる９６マー（９６ −ｍｅｒｓ）の開始プールをＤＮＡ合成機で合成した。各プールの分子は、６０のランダム配列部位をもつ中心領域を含み、それは２つの１８−ｎｔ定義領域と接していた。ＤＶＰと結合するこの開始プール内の分子を、アフィニティクロマトグラフィーにより濃縮した。ストレプトアビジンアガロースにビオチン化したＤＶＰをカップリングすることにより、アフィニティ樹脂を調製した。ｓｓＤＮＡプールを放射線標識し、変性し、生理的緩衝液中で復元し、この樹脂に通した。カラムを広範囲に洗浄した後、ＤＶＰに結合する分子を１モーラー過剰なＤＶＰを用いてカラムから溶出した。負鎖「プライマー−ターミネーター」、即ち、正鎖がさらに延びるのをブロックする非ヌクレオチド性物質の中心のセグメントに有するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより、溶出プールを増幅した（）。かかるＰＣＲにより、２つの生成鎖間の実質的なサイズの違いを生じさせ、正鎖ｓｓＤＮＡプールのゲル精製を容易にする。このアフィニティクロマトグラフィーとＰＣＲの組み合わせは、選択増幅の一つのサイクルを構成した。選択増幅サイクルを１３回繰り返した後、プールをクローン化した。５６のクローンの分析は、９６．２および９６．４の２つの異なる配列のみを示した。正ｓｓＤＮＡの各配列はＤＶＰに結合し、両方は非常によく似た二次構造を形成する可能性をもつ。一連の欠失変異のアフィニティクロマトグラフィー研究は、親の配列よりむしろＤＶＰに結合するのが明らかな一つ、６９．１、を同定した。このアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）は、Ｌ−バソプレッシンによりＤＶＰ樹脂から溶出されない。９６．２９６．４６９．１Ｄ−バソプレッシンアプタマー。２つの原型のアプタマーに分割される配列ブロックは、大文字で示されている。ランダム配列領域に接する定義された配列セグメントを太字で示している。最終プールの２つの配列により分割されているランダム配列部位由来のセグメントは、輪郭で示されている。６９．１アプタマーは、９６．４の欠損誘導体である。選択反射手法を完成させるために必要な情報は、前述されている。鏡像異性− デオキシリボースホスホロアミダイトを用いる６９．１配列の合成により、天然のバソプレッシンに結合するが、ヌクレアーゼ分解を受けにくいアプタマーを得る。しかしながら、かかるアプタマーを合成する前に、６９．１配列に基づく縮重配列セットを用いて開始する第２の選択実験を行なうことが可能である。このことにより、高親和性でＤＶＰと結合する配列変異体を単離することが可能である。この第２の選択からのデータは、さらなる欠失実験を導く信頼性のある二次構造モデルをも提供し、サイズがより小さく活性がより高い最終ＤＶＰアプタマーを得る。このヌクレアーゼ耐性アプタマーを、ｉｎｖｉｔｒｏでリガンドとして試験し、ｉｎｖｉｖｏでバソプレッシンのアンタゴニストとして試験する。均等物当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。かかる均等物は下記クレームの範疇に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号６０／００１，０６７ (32)優先日 1995年７月11日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／６２７，４９７ (32)優先日 1996年３月28日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者キム，ピーターエス. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02173 レキシントン，ミドルバイロード４

Claims

【特許請求の範囲】１．下記工程を含む、天然の左右像の標的高分子に結合する非天然の左右像の高分子の製造方法：ａ）標的高分子又はそのドメイン特性を有するものの鏡像異性体を提供する工程；ｂ）天然の左右像の高分子ライブラリーを提供する工程；ｃ）該ライブラリー中の天然の左右像の高分子と工程ａ）の鏡像異性体との結合に適した条件下で、工程ｂ）のライブラリーを工程ａ）の鏡像異性体と接触させる工程、それにより工程ａ）の鏡像異性体が、該ライブラリー中に存在する天然の左右像の高分子と結合する工程；及びｄ）工程ａ）の鏡像異性体に結合する天然の左右像の高分子の鏡像異性体を製造する工程、ここで、工程ｄ）の鏡像異性体は、天然の左右像の標的高分子に結合する非天然の左右像の高分子である。２．下記工程を含む、天然の左右像の標的高分子に結合する非天然の左右像の高分子の製造方法：ａ）標的高分子又はそのドメイン特性を有するものの鏡像異性体を提供する工程；ｂ）天然の左右像の高分子ライブラリーを提供する工程；ｃ）該ライブラリー中の天然の左右像の高分子と工程ａ）の鏡像異性体との結合に適した条件下で、工程ｂ）のライブラリーを工程ａ）の鏡像異性体と接触させる工程；それにより工程ａ）の鏡像異性体が、該ライブラリー中に存在する天然の左右像の高分子と結合する工程；ｄ）工程ａ）の鏡像異性体に結合する高分子を同定する工程；ｅ）工程ｄ）で同定した天然の左右像の高分子の配列を決定する工程；及びｅ）工程ｄ）で同定した高分子又はそのドメイン特性を有するものの鏡像異性体である非天然の左右像の高分子を製造する工程、ここで、工程ｅ）の鏡像異性体は、天然の左右像の標的高分子に結合する非天然の左右像の高分子である。３．該標的高分子が蛋白質である請求項２記載の方法。４．該蛋白質が、バソプレッシン、インターロイキン−８、トロンボモデュリンＥＧＦ様ドメイン、ＧＰＩＩ_b−ＩＩＩ_a細胞質ドメイン、ファクターＶＩＩａＧＬＡドメイン、ファクターＩＸＥＧＦ様ドメイン、ＨＩＶプロテアーゼ、ＮＨ₂末端ＳＨ３ドメインＧＲＢ２、ＣＯＯＨ末端ＳＨ３ドメインＧＲＢ２、Ｐ１２０^GAPＳＨ３ドメイン、血管透過性因子及び血管内皮成長因子からなる群より選ばれたものである請求項３記載の方法。５．該標的高分子が、オリゴヌクレオチドである請求項２記載の方法。６．該オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶＲＲＥ、ＨＩＶＴａｒ及びＢＣＲ−ＡＢ１融合ＤＮＡ配列からなる群より選ばれたものである請求項５記載の方法。７．下記工程を含む、標的Ｌ高分子に結合するＤアミノ酸ペプチドの製造方法：ａ）標的Ｌ高分子又はそのドメイン特性を有するもののＤアミノ酸ペプチドを提供する工程；ｂ）Ｌアミノ酸ペプチドのライブラリーを提供する工程；ｃ）該ライブラリー中のＬアミノ酸ペプチドと工程ａ）のＤアミノ酸ペプチドとの結合に適した条件下で、工程ｂ）のライブラリーを工程ａ）のＤアミノ酸ペプチドと接触させ、それにより工程ａ）のペプチドが、該ライブラリー中に存在するＬアミノ酸ペプチドと結合する工程；ｄ）工程ａ）のＤアミノ酸ペプチドに結合するＬアミノ酸ペプチドを同定する工程；ｅ）工程ｄ）で同定したＬアミノ酸ペプチドの配列を決定する工程；及びｅ）工程ｄ）で同定したＬアミノ酸ペプチド又はそのドメイン特性を有するもののＤアミノ酸ペプチドを製造する工程、ここで、工程ｅ）のＤアミノ酸ペプチドは、標的Ｌ高分子に結合する。８．該ペプチドが、バソプレッシン、インターロイキン−８、トロンボモデュリンＥＧＦ様ドメイン、ＧＰＩＩ_b−ＩＩＩ_a細胞質ドメイン、ファクターＶＩＩａＧＬＡドメイン、ファクターＩＸＥＧＦ様ドメイン、ＨＩＶプロテアーゼ、ＮＨ₂末端ＳＨ３ドメインＧＲＢ２、ＣＯＯＨ末端ＳＨ３ドメインＧＲＢ２、Ｐ１２０^GAPＳＨ３ドメイン、血管透過性因子及び血管内皮成長因子からなる群より選ばれたものである請求項７記載の方法。９．下記工程を含む、標的Ｌ高分子に結合するＬオリゴヌクレオチドの製造方法：ａ）標的Ｌ高分子又はそのドメイン特性を有するもののＤアミノ酸ペプチドを提供する工程；ｂ）Ｄオリゴヌクレオチドのライブラリーを提供する工程；ｃ）該ライブラリー中のＤオリゴヌクレオチドと工程ａ）のＤアミノ酸ペプチドとの結合に適した条件下で、工程ｂ）のライブラリーを工程ａ）のＤアミノ酸ペプチドと接触させ、それにより工程ａ）のペプチドが、該ライブラリー中に存在するＤオリゴヌクレオチドと結合する工程；ｄ）工程ａ）のＤアミノ酸ペプチドに結合するＤオリゴヌクレオチドを同定する工程；ｅ）工程ｄ）で同定したＤオリゴヌクレオチドの配列を決定する工程；及びｅ）工程ｄ）で同定したＤオリゴヌクレオチド又はそのドメイン特性を有するもののＬオリゴヌクレオチドを製造する工程、ここで、工程ｅ）のＬオリゴヌクレオチドは、標的Ｌ高分子に結合する。１０．該高分子が、バソプレッシン、インターロイキン−８、トロンボモデュリンＥＧＦ様ドメイン、ＧＰＩＩ_b−ＩＩＩ_a細胞質ドメイン、ファクターＶＩＩａＧＬＡドメイン、ファクターＩＸＥＧＦ様ドメイン、ＨＩＶプロテアーゼ、ＮＨ₂末端ＳＨ３ドメインＧＲＢ２、ＣＯＯＨ末端ＳＨ３ドメインＧＲＢ２、Ｐ１２０^GAPＳＨ３ドメイン、血管透過性因子及び血管内皮成長因子からなる群より選ばれたものである請求項９記載の方法。１１．下記工程を含む、目的のＤアミノ酸ペプチドと結合するＬアミノ酸ペプチドの同定方法：ａ）ファージの表面に提示されるＬアミノ酸ペプチドを含むファージ提示ライブラリーを提供する工程；ｂ）ファージの表面に提示されるＬアミノ酸ペプチドと目的のＤアミノ酸ペプチドとの結合に適した条件下で、工程ａ）のファージ提示ライブラリーを目的のＤアミノ酸ペプチドと接触させる工程、；及びｃ）目的のＤアミノ酸ペプチドが、該表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドに結合する表面上でファージを同定する工程、それによりＤアミノ酸ペプチド−提示Ｌアミノ酸ペプチド複合体を製造する工程、ここで、提示されたＬアミノ酸ペプチドは、目的のＤアミノ酸ペプチドと結合するＬアミノ酸ペプチドである。１２．同定された該Ｌアミノ酸に対応するＤアミノ酸ペプチドを作製する工程をさらに含み、かつ、下記工程をさらに含む請求項１１記載の方法：ｄ）ファージの表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドのアミノ酸配列を決定する工程；及びｅ）工程ｄ）で決定したＬアミノ酸ペプチドのアミノ酸配列に対応するＤアミノ酸ペプチドを合成する工程、それにより、該表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドに対応するＤアミノ酸ペプチドを製造する工程。１３．ファージの表面に提示されたＬアミノ酸ペプチドが、ｓｒｃＳＨ３ドメインのＤアミノ酸ペプチドと結合する請求項１１記載の方法。１４．ｓｒｃＳＨ３ドメインと結合する合成アミノ酸ペプチド。１５．ｓｒｃＳＨ３ドメインの全体又は一部に対応する合成Ｄアミノ酸ペプチド。１６．細胞内シグナル蛋白質のドメインと結合する合成Ｄアミノ酸ペプチド。１７．下記工程を含む、目的のＬアミノ酸ペプチドと結合するＬ核酸配列を得る方法：ａ）Ｄ核酸配列のコレクションを提供する工程；ｂ）Ｄ核酸配列と目的のＤアミノ酸ペプチドとの結合に適した条件下で、工程ａ）のＤ核酸配列と目的のＤアミノ酸ペプチドと接触させる工程；ｃ）Ｄアミノ酸ペプチドに結合するＤ核酸配列を単離する工程；ｄ）工程ｃ）のＤ核酸配列のヌクレオチド配列を決定する工程；及びｅ）Ｌヌクレオチドを用いて、工程ｄ）のヌクレオチド配列を有する核酸配列を調製する工程、ここで、工程ｅ）の核酸配列は、Ｌアミノ酸ペプチドと結合するＬ核酸配列である。１８．請求項７記載の方法により同定されたＤアミノ酸ペプチド。１９．請求項９記載の方法により同定されたＬオリゴヌクレオチド。２０．天然の左右像の標的高分子に結合し、該標的高分子が、蛋白質、オリゴヌクレオチド及びリン脂質からなる群より選ばれた請求項１記載の方法により製造された非天然の左右像の高分子。２１．標的高分子に結合し、該標的高分子が、細胞内シグナル蛋白質及びそのドメイン；ケモカイン；サイトカイン；酵素；成長因子；成長因子受容体及びそのドメイン；転写因子及びそのドメイン並びにホルモンからなる群より選ばれた蛋白質である請求項２０記載の非天然の左右像の高分子。２２．該標的高分子が、ＳＨ３ドメイン；ＳＨ２ドメイン；ＰＨドメイン；α− ケモカイン；β−ケモカイン；ＩＬ−１；ＴＮＦ；リンホトキシン−α；ＩＬ− １β；ＩＬ−６；Ｍ−ＣＳＦ；ＴＧＦ；プロテインキナーゼＣ；ホスホリパーゼＣ；ホスホリパーゼＤ；ＰＤＧＦファミリー、ＥＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＩＧＦファミリー、ＨＧＦファミリー、ＶＥＧＦファミリー、ニューロトロフィンファミリー、Ｅｐｈファミリー、クラスＩサイトカインファミリー、ＧＨファミリー、ＩＬ−３ファミリー、ＩＬ−６ファミリー、ＩＬ−２ファミリー、クラスＩＩサイトカインファミリー若しくはＴＮＦファミリーにおける成長因子及び成長因子受容体；プロテインキナーゼ；プロテインホスファターゼ；サイクリン；Ｃｄｃ蛋白質；Ｅｔｓドメイン；ｂＺＩＰ；ｒｅｌホモロジードメイン；ＳＴＡＴｓ；ＮＦ−ＡＴｓ；ＴＣＦ；Ｆｏｓ；ＪＡＫｓ；ヒトＣＤ２；ヒトＣＤ５８；ヒトエンドセリン；ヘレグリン(heregulin)−α；ヒトインターロイキン−１β変換酵素；ヒトマクロファージ炎症性蛋白質１−β；プレーテット(pla tet)ファクター４；ヒトメラノーマ成長刺激活性，ＧＲＯ／メラノーマ成長刺激活性；ＭＨＣ分子；細菌のムラミダーゼ；クリングルドメイン；ｒａｓ；ｒａｓ −ＧＡＰ；セレクション(selection)；プレクストリン（Pleckstrin）ホモロジードメイン；ストロメリシン(stromelysin)；トロンビン；組織因子；カルモジュリン；ＣＤ４；コラーゲナーゼ；ジヒドロフォレート還元酵素；フィブロネクチン；フィブロネクチンタイプＩＩＩモジュール；Ｇ蛋白質サブユニット；バソプレッシン；ファクターＩＸＧＬＡドメイン；因子；インターロイキン−８；トロンボモジュリンＥＧＦ様ドメイン；ＧＰＩＩ_b−ＩＩＩ_a細胞質ドメイン；ファクターＶＩＩａＧＬＡドメイン；ファクターＩＸＥＧＦ様ドメイン；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）蛋白質；ＮＨ₂末端ＳＨ３ドメインＧＲＢ２；ＣＯＯＨ末端ＳＨ３ドメインＧＲＢ２；Ｐ１２０^GAPＳＨ３ドメイン；血管透過性因子及び血管内皮成長因子からなる群より選ばれたものである、請求項２１記載の非天然の左右像の高分子。２３．標的高分子に結合し、該標的高分子がＨＩＶＲＲＥ；ＨＩＶＴａｒ；及びＢＣＲ−ＡＢ１融合ＤＮＡ配列からなる群より選ばれたオリゴヌクレオチドである請求項２０記載の非天然の左右像の高分子。２４．標的高分子に結合し、該標的高分子がホスホイノシチド；ホスホイノシチダーゼＣ；ホスホイノシチド３−キナーゼ；ホスファチジルイノシトール；ホスファチジルイノシトール３−ホスフェート；ホスファチジルイノシトール（４，５）ビスホスフェート；ホスファチジルイノシトール（３，４，５）トリホスフェート；ホスファチジルコリン；ホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジン酸；イノシトール（１，４）ビスホスフェート；イノシトール（１，４，５）トリホスフェート；ジアシルグリセロール；スフィンゴシン；スフィンゴシンホスフェート；スフィンゴシンホスホコリン及びセラミドからなる群より選ばれたリン脂質である、請求項２０記載の非天然の左右像の高分子。２５．天然の左右像の標的高分子に結合し、該標的高分子が蛋白質、オリゴヌクレオチド及びリン脂質からなる群より選ばれたものである、請求項７記載の方法により製造された非天然の左右像の高分子。２６．標的高分子に結合し、該標的高分子が細胞内シグナル蛋白質及びそのドメイン；ケモカイン；サイトカイン；酵素；成長因子；成長因子受容体及びそのドメイン；転写因子及びそのドメイン；並びにホルモンからなる群より選ばれた蛋白質である、請求項２５記載の非天然の左右像の高分子。２７．該標的高分子が、ＳＨ３ドメイン；ＳＨ２ドメイン；ＰＨドメイン；α− ケモカイン；β−ケモカイン；ＩＬ−１；ＴＮＦ；リンホトキシン−α；ＩＬ− １β；ＩＬ−６；Ｍ−ＣＳＦ；ＴＧＦ；プロテインキナーゼＣ；ホスホリパーゼＣ；ホスホリパーゼＤ；ＰＤＧＦファミリー、ＥＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＩＧＦファミリー、ＨＧＦファミリー、ＶＥＧＦファミリー、ニューロトロフィンファミリー、Ｅｐｈファミリー、クラスＩサイトカインファミリー、ＧＨファミリー、ＩＬ−３ファミリー、ＩＬ−６ファミリー、ＩＬ−２ファミリー、クラスＩＩサイトカインファミリー若しくはＴＮＦファミリーにおける成長因子及び成長因子受容体；プロテインキナーゼ；プロテインホスファターゼ；サイクリン；Ｃｄｃ蛋白質；Ｅｔｓドメイン；ｂＺＩＰ；ｒｅｌホモロジードメイン；ＳＴＡＴｓ；ＮＦ−ＡＴｓ；ＴＣＦ；Ｆｏｓ；ＪＡＫｓ；ヒトＣＤ２；ヒトＣＤ５８；ヒトエンドセリン；ヘレグリン(heregulin)−α；ヒトインターロイキン−１β変換酵素；ヒトマクロファージ炎症性蛋白質１−β；プレーテット(pla tet)ファクター４；ヒトメラノーマ成長刺激活性；ＧＲＯ／メラノーマ成長刺激活性；ＭＨＣ分子；細菌のムラミダーゼ；クリングルドメイン；ｒａｓ；ｒａｓ −ＧＡＰ；セレクション(selection)；プレクストリン(Pleckstrin )ホモロジードメイン；ストロメリシン(stromelysin)；トロンビン；組織因子；カルモジュリン；ＣＤ４；コラーゲナーゼ；ジヒドロフォレート還元酵素；フィブロネクチン；フィブロネクチンタイプＩＩＩモジュール；Ｇ蛋白質サブユニット；バソプレッシン；ファクターＩＸＧＬＡドメイン；因子；インターロイキン−８；トロンボモジュリンＥＧＦ様ドメイン；ＧＰＩＩ_b−ＩＩＩ_a細胞質ドメイン；ファクターＶＩＩａＧＬＡドメイン；ファクターＩＸＥＧＦ様ドメイン；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）蛋白質；ＮＨ₂末端ＳＨ３ドメインＧＲＢ２；ＣＯＯＨ末端ＳＨ３ドメインＧＲＢ２；Ｐ１２０^GAPＳＨ３ドメイン；血管透過性因子及び血管内皮成長因子からなる群より選ばれたものである、請求項２６記載の非天然の左右像の高分子。２８．標的高分子に結合し、該標的高分子が、ＨＩＶＲＲＥ；ＨＩＶＴａｒ；及びＢＣＲ−ＡＢ１融合ＤＮＡ配列からなる群より選ばれたオリゴヌクレオチドである、請求項２５記載の非天然の左右像の高分子。２９．標的高分子に結合し、該標的高分子がホスホイノシチド；ホスホイノシチダーゼＣ；ホスホイノシチド３−キナーゼ；ホスファチジルイノシトール；ホスファチジルイノシトール３−ホスフェート；ホスファチジルイノシトール（４，５）ビスホスフェート；ホスファチジルイノシトール（３，４，５）トリホスフェート；ホスファチジルコリン；ホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジン酸；イノシトール（１，４）ビスホスフェート；イノシトール（１，４，５）トリホスフェート；ジアシルグリセロール；スフィンゴシン；スフィンゴシンホスフェート；スフィンゴシンホスホコリン及びセラミドからなる群より選ばれたリン脂質である、請求項２５記載の非天然の左右像の高分子。３０．該標的高分子が、バソプレッシンである請求項９記載の方法。３１．該標的高分子に結合するＬオリゴヌクレオチドが、配列番号：２３、配列番号：２３４及び配列番号：２５からなる群より選ばれたものである、請求項３０記載の方法。３２．下記工程を含む、天然の左右像の標的高分子に結合する非天然の左右像の高分子誘導体の製造方法：ａ）天然の左右像の標的高分子に結合する非天然の左右像の高分子を製造する工程；ｂ）標的高分子又はそのドメイン特性を有するものの鏡像異性体を提供する工程；ｃ）天然の左右像の高分子のライブラリーを提供する工程；ｄ）該ライブラリー中の天然の左右像の高分子と工程ｂ）の鏡像異性体との結合に適した条件下で、工程ｃ）のライブラリーと工程ｂ）の鏡像異性体とを接触させ、それにより、工程ｂ）の鏡像異性体が、該ライブラリー中に存在する天然の左右像の高分子と結合する工程；ｅ）工程ｂ）の鏡像異性体に結合する天然の左右像の高分子の鏡像異性体を製造する工程、ここで、工程ｅ）の鏡像異性体は、天然の左右像の標的高分子に結合する非天然の左右像の高分子である；及びｆ）工程ｅ）の非天然の左右像の高分子誘導体を製造する工程。３３．請求項２０記載の方法により得られうる誘導体。