JPH11504815A

JPH11504815A - 長いポストハーベスト寿命を示す遺伝子導入カーネーション

Info

Publication number: JPH11504815A
Application number: JP8533608A
Authority: JP
Inventors: ゼノンミシェル，ミシェル; ウェイングラハム，ミシェル; セシリーコーニッシュ，エドウィーナ; イーラガターソン，ニール; ティンスレイタッカー，ウイリアム
Original assignee: フロリジーンリミティド
Priority date: 1995-05-09
Filing date: 1996-05-09
Publication date: 1999-05-11
Also published as: EP0824591A4; EA199700369A1; AUPN286295A0; WO1996035792A1; EP0824591A1

Abstract

(57)【要約】本発明は一般に長いポストハーベスト（収穫後）寿命特性を示す遺伝子導入植物に関連する。より詳しくは、本発明はエチレン生合成経路に関連する１又は複数種の酵素の発現性を低減するように改良された遺伝子導入カーネーション植物に関連する。かかるカーネーション植物の花はエチレンを生成しないか、又はエチレンを低減した量で生成し、それ故遺伝子的に改良されていない天然のカーネーション植物の花よりも長いポストハーベストを保持可能である。

Description

【発明の詳細な説明】長いポストハーベスト寿命を示す遺伝子導入カーネーション本発明は一般に長いポストハーベスト（収穫後）寿命特性を示す遺伝子導入植物に関連する。より詳しくは、本発明はエチレン生合成経路に関連する１又は複数種の酵素の発現性を低減するように改良された遺伝子導入カーネーション植物に関連する。かかるカーネーション植物の花はエチレンを生成しないか、又はエチレンを低減した量で生成し、それ故遺伝子的に改良されていない天然のカーネーション植物の花よりも長いポストハーベストを保持可能である。本明細書の中で言及する公開物の文献目録は詳細な説明の最後にまとめた。ヌクレオチド及びアミノ酸配列の配列識別番号(SEQ ID NO)はこの文献目録の後に示す。本明細書及びそれに続く請求の範囲にわたり、文脈に何らかのことわりのない限り、「含んで成る」なる語は記載の構成要件又は構成要件群を含み、しかも任意のその他の構成要件又は構成要件群を排除しないことを表わすものと理解されるべきである。花産業は、病気及び病理耐性から改変された花序及び向上したポストハーベスト切花寿命等の向上した特性を有する新規且つ多種多様な顕花植物の開発に懸命となっている。伝統的な育種技術がある程度の成功を収めながら利用されてはいるが、一の特徴の改良は往々にして１又はそれより多くのその他の重要な特徴の犠牲を伴って達成されている。組換 DNA技術は、特定の１又は複数の特定の株の一の特徴を、任意のその他の商業的に有用な特色を変えることなく正確に改良せしめる手段を提供する。従って、植物の遺伝的性格を操作するため及び所望の特徴を示す又は所望されない性質が抑制された遺伝子導入植物を作製するための組換 DNA技術の開発についてかなりの研究がなされている。切花消費者により最も要求される特徴の一つは長い花びん内ポストハーベスト寿命である。例えばカーネーション等の主要な切花種のより長く生存する品種の開発は切花市場に米ドルで 250億を超える小売売上げの大いなる機会を与えるであろう。花の老化（senescence）は植物のエチレン生成に関係する。エチレンは植物の成長及び発育に直接関連し、そしてその生成は厳格に制御されている。Adams an d Yang（1979）により明示されている高等植物におけるエチレン生合成についての経路は、酵素 SAMシンセターゼによるＳ−アデノシル−メチオニン(SAM)を作り上げるための内生メチオニンプールの利用を包括する。エチレン生合成の開始段階は SAMが酵素 ACCシンセターゼ(ACS)により１−アミノシクロプロパン−１ −カルボン酸(ACC)へと変換されたときに起こる。この変換はエチレン生成にとって必須であり、そして往々にしてこの経路における律速段階となる。最終段階はその後のエチレン形成酵素(EFE)としても知られる酵素 ACCオキシダーゼ(ACO) による ACCからエチレンに至る変換である。エチレン生合成に関する更なる情報はKende(1993)による論文において見い出せうる。このような酵素をコードする遺伝子の制御はエチレン生合成の時期的及び場所的なパターンを決定する。この制御は複雑であり、そして異なる種及び異なる組織並びに様々な刺激に対する応答により変わる。従って、このようないづれかの酵素のレベル、しかしながら特に ACCシンターゼのレベル（なぜなら、この酵素がエチレンの生成をコントロールするからである）をコントロールする能力はエチレンレベルのコントロールを供し、それ故エチレンによりコントロールされる植物発育特性の制御を供する。これらには種子の発芽；器官脱離；ストレス及び創傷反応；果実成熟並びに葉及び花の老化が含まれる。トマト(Rottmanら；1991)及びアラビドプシス(Arabidopsis)において示されている通り、カーネーション ACCシンセターゼは多重遺伝子ファミリーによりコードされ（Parkら；1992）、そのことは様々な組織の中での様々な発育段階でのその様々なアイソザイムの様々な制御の説明に役立つ。カーネーション ACCシンセターゼ又は ACCオキシダーゼをコードする又はそれらをコードする配列に相補性である単離核酸分子の獲得は植物におけるこのような酵素のレベルをコントロールするのに有用な遺伝子構築体の如き組換材料の製造を可能にする。この遺伝子構築体はカーネーション植物に導入でき、それ故植物のエチレン生成の制御の可能性を供しうる。更に、前記酵素の特定のアイソザイムをコードする単離核酸分子の獲得はカーネーション植物に導入されうる遺伝子構築体の製造を可能にし、それ故長い花びん内ポストハーベスト寿命を示す花が製造できるようにするエチレン生成の制御の可能性を供する。従って、本発明の一の観点は、未遺伝子導入親株又は同種の未遺伝子導入植物に比して低められたクリメクトリックエチレン生成を示す遺伝子導入植物を製造するための方法を考慮し、この方法は ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼをコードする又はそれらをコードする配列に相補性である核酸分子又はこの核酸分子の誘導体を含んで成る遺伝子構築体を植物の１又は複数の細胞に導入し、そしてこの１又は複数の細胞から遺伝子導入植物を再生することを含んで成る。好ましくは、本方法により製造される遺伝子導入植物は１又は複数の下記の特性を示す：（ｉ） ACCシンターゼ特異的mRNAもしくは ACCオキシダーゼ特異的mRNAの生産性の低下；（ii） ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼ酵素の生産性の低下；及び／又は（iii）前記遺伝子植物から切り取った花もしくは花芽の老化の遅延。関連の態様において、遺伝子導入カーネーション植物を製造するための方法であって、 ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼをコードする又はそれらをコードする配列に相補性である単離された核酸分子を含む又はこの核酸分子の誘導体をこの植物に導入することを含んで成る方法を提供し、ここで前記遺伝子導入植物は１又は複数の下記の特性を示すことを特徴とする：（ｉ） ACCシンターゼ特異的mRNAもしくは ACCオキシダーゼ特異的mRNAの生産性の低下；（ii） ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼ酵素の生産性の低下；（iii）クリマクテリックエチレンの生産性の低下；及び／又は（iv）老化の遅延。更により詳しくは、本発明は長いポストハーベスト寿命特性を示す遺伝子導入カーネーション植物を製造するための方法を考慮しており、この方法は ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼをコードする核酸分子の非全長フラグメントを含んで成る遺伝子構築体をこのカーネーション植物に導入することを含んで成る。「クリマクテリック」エチレンとは、器官の成熟又は老化へとつながる一連の化学現象を誘導するエチレンの発育制御型生産を意味する。この語は本来成熟中の果実の代謝状態を述べるために利用されているが、カーネーション花の老化にも適用される。コントロールの植物によるクリマクテリックエチレンの生産のピークは図９に示している。好ましくは、この非全長フラグメントは長さ約 800〜1200塩基対である。好ましくは、この非全長フラグメントは ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼをコードする核酸分子の内部フラグメントである。好ましくは、この非全長フラグメントは、 ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ発現の低下が同時抑制によるものとなるようセンス方向で挿入される。本発明の遺伝子構築体は ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼをコードする又はこれらをコードする配列に相補性である単離された核酸分子又はこの核酸分子の誘導体を含んで成り、そして必要ならば、遺伝子導入植物におけるかかる分子の発現を制御するプロモーター及びターミネーター配列の如き追加の遺伝子配列を含んで成る。この遺伝子構築体が DNAのとき、それはcDNA又はゲノム DNA であってよい。 ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ配列は好ましくはカーネーション植物に由来する。本明細書において用いる「核酸分子」とは、 ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼにおけるアミノ酸配列を特定する任意の連続した一連のヌクレオチド塩基を意味する。この核酸は全長酵素又はその誘導体をコードしうる。更に、この核酸分子は全長 ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼはコードしなくてよいが、同時抑制又はアンチセンスにより内生 ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ遺伝子を下降調節するのに十分な長さである。「誘導」とは、天然酵素に対する任意の単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を意味する。これに関し、核酸は ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼをコードする天然ヌクレオチド配列を含むか、又は前記天然配列に対する単一もしくは複数のヌクレオチド置換、欠失及び／もしくは付加を含みうる。「類似体」及び「誘導体」なる語は ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼの任意の化学均等物にも及び、この核酸分子の唯一の要件は本発明に従って遺伝子導入植物を製造するとき、前記遺伝子導入植物が１又は複数の下記の特性を示すことにある：（ｉ） ACCシンターゼ特異的mRNAもしくは ACCオキシダーゼ特異的mRNAの生産性の低下；（ii） ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼ酵素の生産性の低下；（iii）クリマクテリックエチレンの生産性の低下；及び／又は（iv）老化の遅延。当該核酸分子の誘導体は SEQ ID NO：３に記載のヌクレオチド配列に30℃での低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能な遺伝子分子を包括するものとも考慮される。低ストリンジェンシー条件とは、30℃において50％のホルムアミドを伴って DNAをハイブリダイズさせることを含む。他の条件、例えば培地及び高ストリンジェンシー条件もこの誘導体に依存して使用し得る。より詳しくは、この遺伝子導入カーネーション植物は花又は花芽であって、このカーネーション植物から切り取ったとき、長いポストハーベスト寿命特性並びに１又は複数の下記の特性を有するものを担持している：（ｉ）未遺伝子導入内生レベルを下廻る低減したレベルの ACCシンターゼ特異的mRNAもしくは ACCオキシダーゼ；（ii）未遺伝子導入内生レベルを下廻る低減したレベルの ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼ；及び／又は（iii）未遺伝子導入内生レベルを下廻る低減したレベルのクリマクテリックエチレン生産性。本発明の好適な態様において、遺伝子導入カーネーション植物を製造するための方法であって、 ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼの非全長部分をコードする又はそれらをコードする配列に相補性である単離された核酸分子を含む遺伝子構築体をこの植物に導入することを含んで成る方法を提供し、ここでこの遺伝子導入植物は１又は複数の下記の特性を示すことを特徴とする：（ｉ） ACCシンターゼ特異的mRNAもしくは ACCオキシダーゼ特異的mRNAの生産性の低下；（ii） ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼ酵素の生産性の低下；（iii）クリマクテリックエチレンの生産性の低下；及び／又は（iv）老化の遅延。本発明は更に１又は複数の上記の特性を有するかかる遺伝子導入植物及びかかる植物由来の花芽を含む前記植物由来の切花又は切器官に及ぶ。より詳しくは、前記遺伝子導入植物の花は１又は複数の下記の特性を示す：（ｉ）未遺伝子導入内生レベルを下廻る低減したレベルの ACCシンターゼ特異的mRNAもしくは ACCオキシダーゼ特異的mRNA；（ii）未遺伝子導入内生レベルを下廻る低減したレベルの ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼ；（iii）未遺伝子導入内生レベルを下廻る低減したレベルのクリマクテリックエチレン生産性；及び／又は（iv）老化の遅延。 ACCシンターゼ酵素のレベルについての本明細書における言及は酵素の正常な内生又は存在レベルを下廻る30％以上の低下、又はより好ましくは30〜50％の低下、又は更に好ましくは50〜75％の低下、又は更により好ましくは75％以上の低下を意味する。かかる低下は ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ酵素活性の「改変」と呼ぶ。この改変は ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ遺伝子配列の転写、後翻訳安定性、又は翻訳のレベルにあることが可能である。本明細書において用いる核酸分子は単独で存在するか、又はベクター、そして好ましくは発現ベクターと組合さって存在しうる。かかるベクター分子は原核及び／又は真核細胞の中で複製及び／又は発現する。好ましくは、このベクター分子又はその一部は植物ゲノムの中に組込まれることが可能である。核酸分子は更に前記組込みを促進するうえで有用な配列及び／又は植物細胞の中での核酸分子の発現を誘導できるプロモーター配列を更に含みうる。この核酸分子及びプロモーターはエレクトロポレーション、マイクロ−プロジェクチルボンバードメント又はアグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介型移入の如き任意の数多くの手段を介して細胞の中に導入することができうる。従って、本発明の別の観点はカーネーション ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼ、又はかかる ACCシンターゼもしくはオキシダーゼの突然変異体、誘導体、一部、フラグメント、同族体もしくは類似体をコードする、又はそれらをコードする配列に相補性であるヌクレオチト配列を含んで成る単離された核酸分子を提供する。一の態様において、かかる突然変異体は機能的であってよく、即ちそれらは少なくともある程度 ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ活性を示すものであってよい。全てのケースにおいて、この核酸分子は、それがそれらの又は別のプロモーターに対して一方又は別の方向にあることにより、即ち、センス抑制又はアンチセンス抑制により媒介されて、 ACO又は ACS遺伝子発現を抑制することができる。「 ACCシンターゼ」及び「 ACCオキシダーゼ」なる表現は ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ活性を有するポリペプチド及びタンパク質、並びに ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ活性を有する任意の突然変異体、誘導体、一部、フラグメント、同族体又は類似体を含むことを意味する。 ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ活性を有する分子は ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ活性を有するポリペプチド又はタンパク質と外生のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との融合ポリペプチド又はタンパク質でもありうる。本明細書において用いる語「単離された核酸分子」は非天然条件下にある遺伝子配列を含むことを意味する。一般に、これはその天然状態から取り出されていること、又はその天然環境において必ずしも遭遇しない過程により形成されたことを意味する。より詳しくは、それにはin vitroで形成又はin vitroに維持された核酸分子、例えばゲノム DNAフラグメント、組換又は合成分子、及び外来核酸と組合さった核酸、例えば本発明の遺伝子配列に融合又は作用可能式に連結された外来核酸が含まれる。「単離された核酸分子」なる語はゲノム DNAもしくはcD NA、又は ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼを構成するその一部、又は A CCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼの突然変異体、誘導体、一部、フラグメント、同族体もしくは類似体に及び、それらの又はその他のプロモーターに対してセンスであろうと逆方向であろうとよい。それは更に他の核酸配列の少なくとも部分的な精製を経た天然配列に及ぶ。本明細書において用いる語「単離された核酸分子」は「核酸単離体」と同一の意味をもつものと理解される。詳しい態様において、 ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼの突然変異体及びその他の類似の変異体は少なくともある程度の ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ活性を保持し、それ故機能性であると考えられる。表現「遺伝子配列」は本明細書においてはその最も一般的な意味で用いられ、そして ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ活性を有するポリペプチド又はタンパク質を含む ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ分子を含んで成るアミノ酸配列を直接特定するか、又は相補性の一連の塩基を介して特定する任意の連続する一連のヌクレオチド塩基を包括する。かかるアミノ酸配列は全長 A CCシンターゼ、例えば SEQ ID NO：３に記載の如き、又はそのトランケーション形態、又はその突然変異体、誘導体、一部、フラグメント、同族体もしくは類似体を構成し得る。他方、このアミノ酸配列は例えばこれらの配列の一部、又は S EQ ID NO：３に記載の配列全体又は SEQ ID NO：４に示されているが如き、その一部を含んで成りうる。このアミノ酸配列は他に SEQ ID NO：７に記載の ACCオキシダーゼを構成しうる。本発明は上記のアミノ酸配列をコードする核酸分子並びに SEQ ID NO：３又は SEQ ID NO：７のいづれかに記載のアミノ酸配列に対して約60％以上、より好ましくは約70％以上、更により好ましくは約80％以上、そして更により好ましくは約90％以上の類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。本発明に従うと、 ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼをコードする又はそれらをコードする配列に相補性である核酸分子を、遺伝子導入すべきカーネーションに導入して発現させる。これにより前記植物の花によるクリマクテリックエチレンの生産性は天然レベルを下廻るにまで低下しうる。これは花の老化の開始を阻止するか、又は遅らせ、そして花は収穫後長い花びん内寿命を示す。アンチセンス及びセンス抑制技術についての背景情報は米国特許第 5,107,065号並びに米国特許第 5,034,323、 5,231,020及び 5,283,184号のそれぞれにおいて見い出せうる。従って、本発明は遺伝子導入顕花植物であって、その花が非遺伝子導入レベルを下廻る低減したエチレン生産レベルを示す植物を製造するための方法を提供し、この方法はカーネーション植物の細胞の中に、 ACC シンターゼもしくは ACCオキシダーゼをコードする又はそれらをコードする配列に相補性である核酸分子を、前記植物ゲノムへの前記核酸分子の組込みが可能となる条件下で導入し、この細胞から遺伝子導入植物を再生し、そしてこの遺伝子導入植物をこの核酸分子の ACCシンターゼ特異的mRNA又は ACCオキシダーゼ特異的mRNAへの転写、そして必要ならば、 ACCシンターゼmRNA又は ACCオキシダーゼ特異的mRNAの酵素 ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼに至る翻訳が可能となるのに十分な時間及び条件下で成長させる。好ましくは、導入した遺伝子構築体は ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼをコードする核酸分子の非全長セグメントを含んで成る。本発明のこの観点は前記遺伝子導入植物から切り取った又は何らかの方法で切断した花、例えば花の一部及び花又は花芽を担持する遺伝子導入植物の一部に及ぶ。本発明は更に前記特徴を示す遺伝子導入カーネーション植物及びそれに由来する花の製造を達成するための機能的に均等な方法に及ぶ。本発明は、導入された ACCシンターゼ及び／又は ACCオキシダーゼ遺伝子配列を含む品種レッド・コルソ(Red Corso)；アンバー・ローズ（Ember Rose）；クローリー・シム(Crowley Sim)；ホワイト・シム(White Sim)；スカニア（Scania ）の遺伝子導入カーネーション植物の作製により例示される。これらの株の利用は本明細書に記載の本発明の用途を何ら限定するものでもなく、そしてこのような遺伝子導入株より獲得した結果は一般にその他のカーネーション品種に適用される。好適な態様において、この遺伝子導入カーネーション植物は低減したレベルのクリマクテリックエチレン生産性を有する老化の遅延した特性を示す花を咲かす。その結果、本発明は ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼを表現する核酸分子全体もしくは一部及び／又はその任意の同族体もしくは近縁体を含む遺伝子導入カーネーション植物、そして特に低減した ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼ特異的mRNA及び／もしくは低減した ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼレベル及び／もしくは低減したエチレン生産性及び／もしくは遅延した老化特性を示す花を咲かす遺伝子導入植物に及ぶ。従って、この遺伝子導入植物は ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を含んで成る安定的に導入された核酸分子を含む。本発明はかかる遺伝子導入植物から切り取った花及びそれに由来する種子に及ぶ。本発明の別の観点は、染色体外的にプラスミド形態で ACCシンターゼ又は ACC オキシダーゼをコードする遺伝子配列を担持する原核又は真核生物に関する。一の態様において、このプラスミドはアグロバクテリウム・トゥメファシエンス(A grobacterium tumefaciens)中のpWTT2160である。更なる態様において、このプラスミドはエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）中の pCGP407である。プラスミド pCGP407及びpWTT2160のそれぞれを含む微生物エッシェリヒア・コリ株XL１−ブルー及びアグロバクテリウム・トゥメファシエンス株EHA101は豪州国政府 Analytical Laboratories，1 Suakin Street ，Pymble，New South Wales，2037に、受託番号 N95／26121 及び N95／26122 でそれぞれ1995年５月１日に寄託した。本発明を以下の非限定的な図及び実施例を参照しながら更に説明する。図において：図１は様々な種由来の ACCシンターゼをコードするcDNAについてのヌクレオチド配列の整合である。ホワイト・シム及びスカニア株由来のカーネーション配列をペチュニア（EMBL受託番号Z18952）；トマト（van der Straeten ら1990）；らん(Genbank受託番号L07882)；アラビドプシス・サリアナ(Arabidop sis thaliana)(Liangら、1992)及びせいようかぼちゃ（Satoら、1991）に由来する配列と対比させた。整合は Higginsら1991の Clustal Vプログラムを用い、配列のコード領域について行った。翻訳開始及び終止コドンに下線を付した。星印は保存ヌクレオチドを示す。図２はバイナリー発現ベクターpWTT2160の模式図であり、その構築方法は実施例４に記載してある。Tc耐性＝テトラサイクリン耐性遺伝子；LB＝左境界；RB＝右境界；SurB＝アセトラクテートシンターゼ遺伝子についてのコード領域及びターミネーター配列；35Ｓ＝カリフラワーモザイクウィルス35Ｓ遺伝子由来のプロモーター領域； car ACS＝カーネーション ACCシンターゼをコードする核酸分子；nos ３′＝アグロバクテリウム・トゥメファシエンス・ノパリン・シンターゼ遺伝子由来のターミネーター領域。選定の制限酵素部位を表示した。図３は様々な植物種由来の ACCオキシダーゼをコードするcDNAについてのヌクレオチド配列の整合である。スカニア及びホワイト・シム株由来のカーネーション配列をアラビドプシス・サリアナ、トマト（Holdsworthら、1987；EMBL受託番号X04792）；らん（Nadeauら、1993； Genbank受託番号L079l2）；りんご（Dong ら、1992）；ペチュニア（Wang and Woodson，1992）；ひまわり（Liu and Reid 、未公開； Genbank受託番号L29405）及びてんじくあおい（Wangら、1994）由来の配列を対比させた。整合は Higginsら、1991のClustral Vプログラムを用い、配列のコード領域について行った。翻訳開始及び終止コドンに下線を付した。星印は保存ヌクレオチドを示す。図４はバイナリー発現ベクター pCGP407の模式図である。その構築方法は実施例８に記載してある。Gm＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；RB＝右境界；LB＝左境界； car ACO＝カーネーション ACCオキシダーゼをコードする核酸分子； MAC＝カリフラワーモザイクウィルス35Ｓ遺伝子配列により強められたマンノピンシターゼプロモーター；mas ３′＝アグロバクテリウム・トゥメファシエンス・マンノピン・シンターゼ遺伝子由来のターミネーター領域；35Ｓ＝カリフラワーモザイクウィルス35Ｓ遺伝子由来のプロモーター領域； NPTII＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII；tml ３′＝ pTiA₆由来の tmlターミネーター領域DNA 1120 7-10069(Barkerら、1983)。選定した制限酵素部位を表示した。図５は選択マーカーとしてのアセトラクテートシンターゼ遺伝子(ALS)及び AC Cシンターゼをコードする核酸分子の内部フラグメントを含む遺伝子構築体（pWT T2160）で形質転換された多種多様なカーネーション株由来の葉組織から単離した DNAのサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー図である。カーネーションゲノム DNAをEcoRＩで消化し、そしてサザンブロットを ALSコード領域に由来する³²Ｐ−ラベル化− 760塩基対フラグメントによりプロービングした。フィルターを 0.2×の SSC／１％ｗ／ｖの SDSの中で65℃で洗浄した。数値１〜４は品種ホワイト・シム；クローリー・シム；アンバー・ローズ及びスカニアのそれぞれを示す。ネガティブコントロール（Ｎ）は未形質転換ホワイト・シムである。レーン１〜４の多重バンドはpWTT2160由来の DNAのコピーが植物のゲノムの中に組込まれたことを示す。未形質転換ネガティブコントロールではバンドは検出されなかった。図６は、選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPTII)遺伝子及び ACCオキシダーゼを規定する核酸分子をプロモーターに対して反対方向で含む遺伝子構築体(pCGP407)により形質転換されたカーネーション品種ホワイト・シム及びスカニア由来の葉組織から単離した DNAのサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー図である。カーネーションゲノム DNAは制限酵素HindIIIで消化した。サザンブロットは NPTII遺伝子のコード配列に由来の³²Ｐ−ラベル化EcoRＩ DNAフラグメントでプロービングした。フィルターを 0.1×の SSC、 0.1％ｗ／ｖの SDSで65℃で洗浄した。バンドは pCG P407由来の単一又は複数のコピーが植物のゲノムの中に組込まれたことを示す。レーン２において、スカニア植物♯705は６コピーの NPTII遺伝子を、そしてホワイト・シム植物♯2373Bを示し、レーン５においては単一コピーの NPTIIがあった。未形質転換ネガティブコントロールにおいてはバンドは検出されなかった。検出されたフラグメントのサイズは図の左手にキロベースで表示した。図７はpWTT2160で形質転換したカーネーション由来の側苗条組織から単離した RNAのノーザンブロットのオートラジオグラフィー図である。コントロールは未形質転換のホワイト・シムである。８種の個々の遺伝子導入系を示す。フィルターをアセトラクテートシンターゼ遺伝子コード領域由来の³²Ｐ−ラベル化HindII I DNAフラグメントでプローブし、そして２×の SSC、１％ｗ／ｖの SDSで65℃ にて洗い、続いて 0.2×の SSC、１％ｗ／ｖの SDSで65℃で30分２回洗った。図８は花弁から単離した ACCオキシダーゼmRNA及び ACCオキシダーゼアンチセンス RNAのノーザンブロットのオートラジオグラフィー図である。全RNA(10μｇ／レーン)をコントロール、未遺伝子導入ホワイト・シム（レーン）、遺伝子導入スカニア（レーン３）及び遺伝子導入ホワイト・シム（レーン５）花の０日目の花弁より；並びにコントロール、未遺伝子導入ホワイト・シム（レーン２）、遺伝子導入スカニア（レーン４）及び遺伝子導入ホワイト・シム（レーン）花の５日目の花弁より分析した。更に分析したのは18時間前からエチレン（150ppm）に曝露しておいた遺伝子導入スカニア（レーン７）、遺伝子導入ホワイト・シム（レーン８）の５日目の花である。フィルターを鎖依存性アンチセンス RNAプローブと ACCオキシダーゼmR NAを検出するため、又は鎖依存性 ACCオキシダーゼ RNAプローブとアンチセンス ACCオキシダーゼ RNAを検出するためにハイブリダイズし、そして２×の SSC／１％ｗ／ｖの SDSで65℃で１時間洗い、続いて 0.2×の SSC／１％ｗ／ｖの SDS で65℃で１時間洗い、そしてアンチセンス ACOの場合、最後に 0.1×の SSC／ 0 .1％ｗ／ｖの SDSで65℃で１時間洗った。図９はカーネーション花におけるエチレン生産のグラフを示す。カーネーション品種スカニア及びホワイト・シムの花を収穫してから毎日３時間にわたり気密チャンバーの中に入れておいた。このチャンバーから採取したガスサンプルのエチレン含有量を実施例19に記載のガスクロマトグラフィーを利用して測定した。エチレン測定値は１時間当り１ｇの花組織（幹を含まず）につき生産されたエチレンのナノリットル数として表わした。コントロールの未遺伝子導入花についての値は９種の個別の花由来のエチレン測定値の平均である。遺伝子導入スカニア及びホワイト・シム値は３個づつの花から平均する。図10（Ａ）−10（Ｆ）は以下を示すカラー写真板の白黒再生図である：（Ａ）ポストハーベスト０日目の未遺伝子導入コントロールスカニア花；（Ｂ）ポストハーベスト４日目の未遺伝子導入コントロールスカニア花；（Ｃ）ポストハーベスト７日目の未遺伝子導入コントロールスカニア花；（Ｄ）ポストハーベスト０日目の遺伝子導入 ACCシンターゼセンス抑制型スカニア花；（Ｅ）ポストハーベスト４日目の遺伝子導入 ACCシンターゼセンス抑制型スカニア花；及び（Ｆ）ポストハーベスト11日目の遺伝子導入 ACCシンターゼセンス抑制型スカニア花。遺伝子導入花はポストハーベスト11日目において新鮮であり続け、一方未遺伝子導入コントロールは４日目に内巻きし、そしてポストハーベスト７日目に完全に老化した。オリジナルのカラー写真板は出願人により調査のために入手できる。図11（Ａ）−11（Ｆ）は以下を示すカラー写真板の白黒再生図である：（Ａ）ポストハーベスト０日目の未遺伝子導入コントロールレッド・コルソ花；（Ｂ）ポストハーベスト７日目の未遺伝子導入コントロールレッド・コルソ花；（Ｃ）ポストハーベスト９日目の未遺伝子導入コントロールレッド・コルソ花；（Ｄ）ポストハーベスト０日目の遺伝子導入 ACCシンターゼセンス抑制型レッド・コルソ花；（Ｅ）ポストハーベスト７日目の遺伝子導入 ACCシンターゼセンス抑制型レッド・コルソ花；及び（Ｆ）ポストハーベスト９日目の遺伝子導入 ACCシンターゼセンス抑制型レッド・コルソ花。遺伝子導入花はポストハーベスト９日目において新鮮であり続け、一方未遺伝子導入コントロールはポストハーベスト７日目に内巻きし、そして完全に老化した。オリジナルのカラー板は出願人より調査のために入手できる。図12（Ａ）−12（Ｆ）は以下を示すカラー写真板の白黒再生図である：（Ａ）ポストハーベスト０日目の未遺伝子導入コントロールアンバー・ローズ花；（Ｂ）ポストハーベスト４日目の未遺伝子導入コントロールアンバー・ローズ花；（Ｃ）ポストハーベスト７日目の未遺伝子導入コントロールアンバー・ローズ花；（Ｄ）ポストハーベスト０日目の遺伝子導入 ACCシンターゼセンス抑制型アンバー・ローズ花；（Ｅ）ポストハーベスト４日目の遺伝子導入 ACCシンターゼセンス抑制型アンバー・ローズ花；及び（Ｆ）ポストハーベスト７日目の遺伝子導入 ACCシンターゼセンス抑制型アンバー・ローズ花。オリジナルカラー板は出願人より調査のために入手できる。図13（Ａ）−13（Ｄ）は以下を示すカラー写真板の白黒再生図である：（Ａ）ポストハーベスト０日目の未遺伝子導入コントロールクローリー・シム花；（Ｂ）ポストハーベスト４日目の未遺伝子導入コントロールクローリー・シム花；（Ｃ）ポストハーベスト０日目の遺伝子導入 ACCシンターゼセンス抑制型クローリー・シム花；及び（Ｄ）ポストハーベスト４日目の遺伝子導入 ACCシンターゼセンス抑制型クローリー・シム花。オリジナルのカラー板は出願人より調査のために入手できる。図14（Ａ）−14（Ｃ）は以下を示すカラー写真板の白黒再生図である：（Ａ）ポストハーベスト０日目の１個の未遺伝子導入コントロールホワイト・シム花（写真の左側）及び３個の ACCシンターゼセンス抑制型ホワイト・シム花；（Ｂ）ポストハーベスト11日目の１個の未遺伝子導入コントロールホワイト・シム花（写真の左側）及び３個の ACCシンターゼセンス抑制型ホワイト・シム花；及び（Ｃ）ポストハーベスト20日目の１個の未遺伝子導入コントロールホワイト・シム花（写真の左側）及び３個の ACCシンターゼセンス抑制型ホワイト・シム花。収穫後、花は全て蒸留水の中で、且つ管理した光及び温度条件下で保存した。未遺伝子導入コントロール花はポストハーベスト１回目に内巻きし、そして老化が進み、そしてポストハーベスト20日目には完全に老化し、一方コントロール花はポストハーベスト20日目でも新鮮であり続けた。オリジナルのカラー板は出願人より調査のために入手できる。図15はポストハーベスト６日目に撮影した１個の未遺伝子導入コントロールスカニア花（写真の左側）及び１個のアンチセンス ACCオキシダーゼ遺伝子導入スカニア花を示すカラー写真板の白黒再生図である。花びん内寿命測定は蒸留水の中で、且つ管理した光及び温度条件下で実施した。オリジナルのカラー板は出願人より調査のために入手できる。図16はポストハーベスト８日目に撮影した１個の未遺伝子導入コントロールホワイト・シム（写真の右側）及び１個のアンチセンス ACCオキシダーゼ遺伝子導入ホワイト・シム花を示すカラー写真板の白黒再生図である。花は蒸留水の中で、且つ管理した光及び温度条件下で保存した。オリジナルのカラー板は出願人より調査のために入手できる。実施例１生物学試薬制限酵素及びその他の試薬は全て商業的ソースから入手し、そして一般に製造者の推奨に従って使用した。クローニングベクター pBluescriptII(KS+)はStratageneから入手した。実施例２細菌株使用した細菌は下記の通りである：エッシェリヒア・コリ： XL1-Blue sup E44， hsd R17(r_k-，m_k+)，rec A1，end A1，gy r A96(Nal^r)， thi -1，rel A1，lac -，[F′pro AB ，lacI ^q，lac Z ΔM15，Tn10(tet^r)](Bullockら1987 )． DH5α supE44 Δ（lac ZYA-Arg F）U169 φ80d lac Z ΔM15 hsdR17(r_k-，m_k+)，recA1 ，endA1 ，gyrA96(Nal^r)， thi-1 ，relA1 ，deoR(Hanahan，1983 and BRL，1986)． JM83 F^- ara Δ(lac-proAB)rps L(Str^r)[φ80d Δ（lac Z）M15](Vieira and Messing，1982) JM109 F′traD36 lacI^q Δ(lacZ)M15，proA ⁺ B ⁺/e14^-（M crA^-）Δ（lac - proAB ）thi gyrA96(Nal^r)， en dA1 hsdR17(r_k-，m_k+)relA1 supE44 recA1 （ Yanisch-Perronら1985）アグロバクテリア・トゥメファシエンス： AGLO Lazoら（1991） EHA101 Hoodら（1984）実施例３成長条件何らかのことわりのない限り、植物は特製成長室内で、14日間にわたり、最低 10,000luxの光強度及び22〜26℃の温度において成長させた。実施例４ホワイト・シム株由来のカーネーション ACCシンターゼ(ACS)の単離ａ．ポリメラーゼ連鎖反応プライマーホワイト・シム株由来のカーネーション ACCシンターゼ(ACS)cDNAクローンを逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を利用して調製した。 PCRプライマーは約1500塩基対（bp）コード配列内で認められる高度保存領域に基づいて合成した。約 1,100bpのフラグメントが増幅後に得られた。使用したプライマーは下記の通りである：ｂ．カーネーション花からの ACSクローンの単離 RNAをカーネーション株ホワイト・シムの花弁から完全開花期において単離し、そしてクリマクテリックエチレン合成を誘導するために１ppm のエチレンに一夜曝露した。 RNA単離のために標準のフェノール溶解法を利用した(Jonesら、19 85)。ポリ A⁺RNA は標準のオリゴ（dT）セルロースクロマトグラフィー（Aviv and Leder，1972）を利用して全 RNA調製品から調製した。逆転写酵素反応及びその後の PCR増幅は Ausub elら、1992に従って実施した。約 1,100bpの推定サイズのフラグメントがエチレン処理カーネーション花由来のポリ A⁺RNA の逆転写酵素 PCRを経て得られた。実施例５カーネーション株ホワイト・シムACS cDNAクローンの配列分析約 1,100bpのカーネーションACS cDNAフラグメントをベクター pBluescriptII (KS+)の中にクローニングし、そして末端ヌクレオチドを配列決定用プライマーとして SEQ ID NO：１及び SEQ ID NO：２オリゴヌクレオチドを利用して配列決定した。 DNA配列決定は Sequenase酵素(USB、バージョン 2.1)を利用し、Sange rらの方法（1977）により本質的に実施し、そしてこの約 1,100bpフラグメントはParkら（1992）由来の配列に対するヌクレオチド配列類似体に基づき、カーネーションのクリマクテリック ACS遺伝子の一部であることが示された。全長カーネーション ACSヌクレオチド配列を SEQ ID NO：３として示し、そして約 1,100 bp内部フラグメントを SEQ ID NO：４として示す。実施例６スカニア株由来のカーネーション ACCシンターゼ(ACS)クローンの単離別のACS cDNAクローンを今度はスカニア株から単離するために別の手法を利用した。ａ．ポリメラーゼ連鎖反応プライマーオールド・グローリー・ブルー株由来のペチュニア ACCシンターゼcDNAフラグメントを PCRを利用して調製した。プライマーをvander Straetenら（1990）のトマトACS cDNA，pcVV4A由来の公知のコード配列に基づいて合成した。使用したプライマー配列は下記の通りである：ｂ．ペチュニア花からの ACSクローンの単離 RNAを、１時間当り、１ｇの新鮮重量につき５ml以上のエチレンを生産するペチュニア株オールドグローリーブルー老化中花弁から単離した。標準のCsClクッション法（Sambrookら、1989）を RNA単離のために利用した。逆転写酵素反応及びその後の PCR増幅は Ausubelら（1992）に従って実施した。 1,380bpのフラグメントが35増幅サイクルを経て得られた。 PCR生成物のヌクレオチド配列の決定は、それがトマト pcVV4A cDNA由来の対応の領域の推定翻訳生成物に類似のポリペプチドをコードすることを確証せしめた。ｃ．カーネーション株スカニアcDNAライブラリーの構築 cDNAライブラリーをスカニア株の老化中のカーネーション花弁由来のmRNA及びラムダZAP cDNAクローニングベクター（Stratagene）を利用して構築した。cDNA を、マロニーのネズミ白血病ウィルス逆転写酵素(MMLV)(BRL)を利用するポリＡ⁺ 富化 RNAのオリゴ（dT）プライミングにより作製した。cDNAの第二鎖を DNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）により作り、ブラント化し、そしてリンカーを付加してEcoRＩ適合性末端を作った。次いでこの DNAをS200カラム(Pharmac ia)でサイズ選別し、そしてラムダバクテリオファージアームにライゲーションして60,000個の組換ファージを有するライブラリーを作り上げた。このライブラリーを増幅させてワーキングストックを供した（Sambrookら、1989）。ｄ．カーネーションcDNAライブラリーの異種スクリーニング 1,380bpのペチュニア ACCシンターゼをコードする PCRフラグメントを³²Ｐラベルし、そして低ストリンジェンシーの条件下でカーネーション株スカニア花弁cDNAライブラリーの60,000のプラーク（前記実施例６ｃ）をスクリーニングするために用いた。フィルターを50％のホルムアミドの中で30℃でハイブリダイズし、そして５×の SSC、１％ｗ／ｖの SDSの中で室温で30分洗い、次いで５×の SSC、１％ｗ／ｖの SDSの中で42℃で２回洗った。異種スクリーニングのため、10個のcDNAクローンを単離した。これらのクローンのうちの５つの分析はそれらが全て同一遺伝子を占めることを示した。最長のクローンは約 1,820bpのインサートを含んだ。実施例７カーネーション株スカニアACS cDNAクローンの配列分析約 1,820bpの最長クローンを両鎖に基づいて配列決定した。それはParkら（19 92）により単離されたカーネーション株ホワイト・シム由来の ACCシンターゼをコードするcDNAのヌクレオチド配列と99.6％類似することが見い出された（前記実施例５参照）。スカニア配列は 133bp短く、そして３個のアミノ酸変化に結びつく複製のヌクレオチド相違を含んだ。即ち、 131位でのセリンからグリシン； 381位でのアルギニンからグリシン； 500位でのイソロイシンからセリン。それは 130位において追加のスレオニンも含む。 Genbank，SWISS-PROT及びEMBLデーターベースに対する相同性探索を FASTA及びLFASTAプログラム（Pearson and Lipman，1988）を利用して行った。カーネーション株ホワイト・シム及びスカニアの ACCシンターゼ配列とペチュニア、トマト、らん、アラビドプシス、せいようかぼちゃである他の５種の配列との整合及び対比は図１に示した。整合は Clustal Vプログラム(Higgins and Sharp，1989 ；Higginsら、1991)を利用して実施した。パーセンテージ類似性はカーネーション株間での99.6％からカーネーションとせいようかぼちゃとの間での65.1％に至るまで範囲した。実施例８ pWTT2160の構築 1,100bpのカーネーション株ホワイト・シムACS cDNAフラグメント（実施例５参照）をカリフラワーモザイクウィルス35Ｓプロモーター／クロロフィルab結合性タンパク質(Cab)5′領域及びノポリンシンセターゼ３′領域の間に挿入した（ Harpsterら、1988）。キメラ部分カーネーション ACS遺伝子配列を含んで成る得られるフラグメントをクロルスルフロン耐性形質転換体の選択を可能にするSurB 遺伝子（タバコアセトラクテートシンターゼ）と一緒に35Ｓプロモーターを含んで成るものの如き適当な選択マーカー遺伝子を含む T-DNAベクターに挿入した。一のかかる得られるベクターにpWTT2160の表示を与え、そして図２に示す。実施例９ pWTT2160によるＥ．コリ及びＡ．トゥメファシエンスの形質転換日常的な操作のために利用されているエッシェリヒア・コリJM83（Vieira and Messing，1982）及びJM109(Yanisch-Perronら、1985)を標準の手順（Sambrook ら、1989）に従って形質転換した。Ｅ．コリからアグロバクテリア・トゥメファシエンス株EHA101へとバイナリーベクターpWTT2160を移すため、三親株交配(triparental mating)(Dittaら、1980 )を利用した。可動性プラスミドpRK2013（Guttersonら、1986）を含むＥ．コリ株NE47をヘルパー株とした。EHA101株はリファンピシン耐性であり（Hoodら、19 84）、10μｇ／mlのゲンタマイシン及び100μｇ／mlのリファンピシンを含むLB アガープレート(Ausubelら、1992)上で28℃においてトランス接合個体が選択できるようにする。実施例10 部分 ACCシンターゼ配列によるジアンサス・カリオフィルス(Dianthus caryop hyllus)の形質転換ａ．植物材料ジアンサス・カリオフィルス（クローリー・シム、スカニア、ダーク・ピエロット（Dark Pierrot）、アンバー・ローズ、ラグナ（Laguna）、マンゴ(Mango) 、モンテ・リサ（Monte Lisa）、レッド・コルソ、タンゲリン(Tangerine)、バレンシア（Valencia）及びアシュレイ（Ashley）品種）切株をVan Wyk and Son Flower Supply，Victoria，Australiaより入手した。外葉を除去し、そして切株を70％ｖ／ｖのエタノールで簡単に滅菌し、次いで次亜塩素ナトリウム（Tween 20含有）で60分滅菌し、そして滅菌水で３回すすいだ。目に見える葉及び葉腋芽を同時培養前に解剖顕微鏡のもとで除去した。ホワイト・シム品種については、温室内で成長させた幹を収穫し、75％ｖ／ｖのエタノールで２分、次いで20％ｖ／ｖの市販の漂白剤＋ 0.1％ｖ／ｖのTween- 20で20〜30分表面滅菌し、そして滅菌水で３回すすいだ。菌条の頂部分裂組織を単離し、長さ約１cmの節を幹から切り取り、そして両方を10〜12個／標準ペトリ皿の密度において、ビタミンＢ５を補充したMurashigen and Skoog（1962）の培地（MS）、 590mg／ｌの２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホネート(MES)；１m g／ｌのベンジルアミノプリン(BAP)；0.02mg／ｌのα−ナフタレン酢酸(NAA)；3 0ｇ／ｌのスクロース；0.25％ｗ／ｖのGelrite Gellan Gum(Schweizerhall)、pH 5.8より成る苗条増殖培地上で培養した。植物ホルモンの全てをオートクレーブ処理後に加えた。培養物を増殖チャンバーの中で16時間の光時間で（≒30μＥ／ｍ²／ｓ）で24±１℃でインキュベートした。光源は常に培養物の上方とし、なぜなら下からの光による熱は凝縮を引き起こし、そして劣った再生及び増殖をもたらすからである。各分裂組織は２週間以内にいくつかのガラス化苗条(vitrified shoot)を生み出した。これらを切除し、そして新鮮な苗条増殖培地上で毎月継代培養した。３〜４回の継代培養後、高い割合で増殖した苗条株、即ち、一月以内に全部で20〜25枚の葉を有する苗条塊を生み出す３〜４枚の葉をもつ苗条がそれぞれ樹立できた。これらを形質転換のために葉外植体の起源として日常的に利用した。ｂ．アグロバクテリア及びジアンサス組織の同時培養バイナリーベクターpWTT2160を含むアグロバクテリア・トゥメファシエンス株 AGLO（Lazoら、1991）を50mg／ｌのテトラサイクリンを含むLBアガー上で４℃にて維持した。翌日それを、接種の前に、液体MS培地で５×10⁸個の細胞／mlに希釈した。アセトシリンゴンをアグロバクテリア懸濁物に20μＭの最終濃度となるまで加えた。ジアンサスの幹組織を３％ｗ／ｖのスクロース、 0.5mg／ｌの BAP 、 0.5mg／ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、 100μＭのアセトシリンゴン及び0.25％ｗ／ｖのGelrite(pH 5.7)の補充したMS培地上で５日間アグロバクテリアと同時培養した。ジアンサス品種ホワイト・シムとの同時培養のため、バイナリーベクターpWTT 2160を含むアグロバクテリア・トゥメファシエンス株EHA101（Hoodら、1984）をグリセロール中の凍結サンプルから採取し、暗所で選別にとって適当な抗生物質を含む固体Ｌ−培地(Ausubelら1992)の上で28℃で２日間培養し、次いで接種のための液体MinA(Ausubelら、1992)の中に一夜懸濁した。植物組織の接種のための細菌濃度は 0.5〜1.0 ×10⁹細胞／mlとした。アセトシリンゴンをアグロバクテリア懸濁物に20μＭの最終濃度で加えた。ホワイト・シム品種の葉を苗条株から引っ張ることにより単離した。クロルスルフロンによる選別のために、それは１mmより大きい葉腋分裂組織を除くだけでよいという好都合なものであった。葉を数分間細菌と混合し、次いでその混合物を取り出し、そして同時培養培地上のろ紙の上に５日間置いた。この同時培養培地は苗条増殖培地と同じだが、１mg／ｌの BAP；0.02mg／ｌの NAA 及び 100μＭのアセトシリンゴンの代わりに 0.5mg／ｌの BAP及び 0.5mg／ｌの２，４−Ｄを含んだ。プレートをパラフィルムでシールした。ｃ．遺伝子導入ジアンサス植物の回収形質転換幹組織の選別のため、各同時培養幹の頂部６〜８mmを３〜４mmの切片に切り、それらを 0.5mg／ｌの BAP、 0.5mg／ｌの２，４−Ｄ、１μｇ／ｌのクロルスルフロン、 500mg／ｌのチカルシリン及び0.25％ｗ／ｖの Gelriteの添加したMS培地に移した。２週間後、外植体を0.16mg／ｌのチジアズロン(TDE)、 0. 5mg／ｌのインドール酪酸(IBA)、２μｇ／ｌのクロルスルフロン、 500mg／ｌのチカルシリン及び0.25％ｗ／ｖの Gelriteを含む新鮮なMS培地に移し、そして幹外植体から葉腋苗条を除去するためにこの段階で注意を払った。３週間後、健康な不定苗条を３％ｗ／ｖのスクロース、３μｇ／ｌのクロルスルフロン、 500mg ／ｌのチカルシリン、0.25％ｗ／ｖの Gelriteを含むホルモン非含有MS培地に移した。３μｇ／ｌのクロルスルフロンで生存した苗条を３％ｗ／ｖのスクロース、 500mg／ｌのチカルシリン、５mg／ｌのクロルスルフロン及び0.25％ｗ／ｖの Gelriteの添加されたMS培地に苗条伸長のために移した。２〜３週間後、選別で残った苗条から葉を引っ張り取り、そして0.22mg／ｌの TDZ、 0.5mg／ｌの IBA、３μｇ／ｌのクロルスルフロン、 500mg／ｌのチカルシリン及び0.25％ｗ／ｖの Gelriteの添加したMS培地より成る再生培地上に載せ、選択下で苗条再生させた。再生した苗条を５μｇ／ｌのクロルスルフロン、 500mg／ｌのチカルシリン及び0.25％ｗ／ｖの Gelriteを含むホルモン非含有MS培地に２〜４週間移し、次いで標準化のために 200mg／ｌのチカルシリン及び 0.4％ｗ／ｖの Gelriteを含むガラスジャー内のホルモン非含有MS培地に移した。ガラスジャーの頂部にSuncap s（Sigma）を載せ、苗条の標準化を早めた。全ての培養物を16時間の光時間(120 μＥ／ｍ²／ｓのクールホワイト蛍光)のもとで23±２℃にて維持した。高さ約 1 .5〜２cmの標準化苗条を３ｇ／kg IBAの発根粉末上で発根させ、そしてミスト下で馴化させた。75％のパーライト(perlite)／25％のピート（peat）を含む土壌混合物を馴化のために用い、それは14時間の光時間(200μＥ／ｍ²／ｓ水銀ハライド光)のもとで23℃で実施し、そして一般に３〜４週間続けた。植物を１ｇ／ｌの CaNO₃及び0.75ｇ／ｌの微量元素と 4.7：3.5 ：29.2の比のＮ：Ｐ：Ｋとの混合物で肥沃化した。形質転換した葉組織の選別のため、葉をビタミンＢ５； 590mg／ｌの MES； 0 .5mg／ｌの BAP； 0.5mg／ｌの２，４−Ｄ；30g／ｌのスクロース；0.25％ｗ／ｖの Gelrite； 500mg／ｌのカルベニシリン及び２μｇ／ｌのクロルスルフロンの添加されたMS培地より成る新鮮培地pH 5.8に２週間移しておいた。葉外植体を次にビタミンＢ５； 590mg／ｌの MES； 0.5mg／ｌの IBA；0.22mg／ｌの TDZ； 30ｇ／ｌのスクロース；0.25％ｗ／ｖの Gelrite； 500mg／ｌのカルベニシリン及び３μｇ／ｌのクロルスルフロンより成る再生培地pH 5.8に移した。２〜３週間後に小さな苗条塊が形成されたら、それらを２〜４個の切片に分けた。更に３週間後、再生した苗条を収穫した；再生苗条の葉を引っ張ってバラバラにし、そして新鮮な再生培地上にまいて二次再生させた。形質転換したガラス化苗条が３週間以内に葉から再生した。標準化のため、それらを１％の TCCアガー及び３μｇ／ｌのクロルスルフロンを含むホルモン非含有MS培地に移し、そしてプレート内で３週間培養し、そしてMagenta(商標)GA-7キューブ内で更に３週間培養した。２〜３週間以内に正常な苗条が形成され、そして 0.2％ｗ／ｖの Gelriteを含むホルモン非含有MS培地の中で発根させた。発根した植物を土壌に移し、徐々にハードニングさせ、次いで温室条件に移した。実施例II スカニア品種からのカーネーション ACCオキシダーゼ(ACO)クローンの単離ａ．³²Ｐ−ラベル化プローブの調製 20μｇの全 RNAを 100℃で２分インキュベートし、次いで更に２分氷上で冷却した。この RNAを20μｇ／mlのオリゴ−dT、50mMのトリス−HCl pH 8.0、75mMの KCl、30mMの MgCl₂、10mMの DTT、 0.5mg／mlのアクチノマイシンＤ、 200μＭのdATP、 200μＭのdGTP、 200μＭのdTTP、 2.5μＭのdCTP、 100μCiの〔α−³² Ｐ〕−dCTP（Bresatec、3000Ci／mmol）、40ユニットのリボヌクレアーゼインヒビター(Promega)及び60ユニットのMMLV逆転写酵素(BRL)を含む反応混合物に加え、そして37℃で１時間インキュベートした。EDTA及びNaOHをそれぞれ50mM及び 0.2Ｍの最終濃度になるまで加え、そしてこの混合物を70℃で20分インキュベートした。次いでこの混合物を 0.2Ｍの濃度に至る HClの添加により中和した。組込まれなかった〔α−³²Ｐ〕−dCTPをSephadex G-50(Fine)カラムでのクロマトグラフィーにより除去した。ｂ．DNAフラグメントの³²Ｐ−ラベル化 DNAフラグメント(50〜100ng)をオリゴラベル化用キット（Bresatec）を用い、 50μCiの〔α−³²Ｐ〕−dCTPで放射性ラベル化した。組込まれなかった〔α−³² Ｐ〕−dCTPはSephadex G-50(Fine)カラムでのクロマトグラフィーにより除去した。ｃ．カーネーション品種スカニアcDNAライブラリーの示差的スクリーニング cDNAライブラリーを前記実施例６ｃに記載の通りにして、スカニア品種の老化中のカーネーション花弁由来のmRNA及びラムダZAP cDNAクローニングベクター（ Stratagene）を用いて構築した。示差スクリーニング手法を、老化中のカーネーション花弁においては発現するが、収穫時においては花の中で少ないような遺伝子であるcDNAクローンを単離するために用いた。３万個のコロニーを15cmのプレート当り 1,500コロニーでスクリーニングした。プラークリフトをデュプリケートで（ｉ）０日目の花弁又は（ii）内巻き花弁cDNAのいづれかに由来するcDNAプローブとハイブリダイズさせ、そして高ストリンジェンシー条件下、即ち、50％ｖ／ｖのホルムアミド、６×の SSC、１％ｗ／ｖの SDS中で16ｈにわたるニトロセルロース上でのハイブリダイゼーション及び 0.2×の SSC、１％ｗ／ｖの SDS 中での65℃で30分３回の洗浄、で洗浄した。次いでフィルターを Kodak XARフィルムに増強スクリーンを伴って−70℃で16時間曝露させた。内巻き花弁cDNAとハイブリダイズするが、０日目のcDNAとはハイブリダイズしないクローンを更なる調査のために選別した。実施例12 カーネーション品種スカニアACO cDNAクローンの配列分析いくつかの老化関連cDNAクローンを同定した。１のクローンの DNA配列、即ち pCGP363と命名する 1,156bpの配列はエチレンの生成及び果実の熟成に関連するトマトのcDNAクローンpTOM13の DNA配列に対して68％の相同性を示した。その後、pTOM13は ACCオキシダーゼをコードすることが同定された（Hamiltonら1991； Holdworthら1987； Spanuら1991）。 321個のアミノ酸の推定アミノ酸配列はトマトのアミノ酸配列(Holdworthら、1987)と68％の同一性を、リンゴのACO(Dong ら、1992)と74.6％の同一性を、そして別のカーネーション品種ホワイト・シム（Wang and Woodson，1991）由来の ACO配列と99％以上の同一性を共有した。スカニアの配列はホワイト・シムのそれとはアミノ酸残基 147でのみ相違した。ホワイト・シムの配列におけるアラニンはスカニアの配列においてグリシンに置き代っている。このクローン及びその他のクローンの DNA配列決定は Sequenase酵素(USB、バージョン 2.1)を用い、Sangerら（1977）の方法により本質的に実施した。 1,15 6bpのカーネーション品種スカニアの ACC配列を SEQ ID NO：７として示す。 Genbank，SWISS-PROT及びEMBLデーターベースに対する相同性探索を FASTA及びLFASTAプログラム（Pearson and Lipman，1988）を利用して再び実施した。カーネーション品種スカニア ACCオキシダーゼ配列とその他の８種の配列、即ち、カーネーション品種ホワイト・シム；アラビドプシス・サリアナ；トマト；らん；りんご；ペチュニア；ひまわり及びてんじくあおいのそれとの整合及び対比を図３に示す。整合は Clustal Vプログラム(Higginsら、1991)を利用して実施した。パーセンテージ類似性はカーネーション品種間での95％から、カーネーションとてんじくあおいとの72％に至る範囲であった。実施例13 pCGP407の構築ベクター pCGP407をSambrookら（1989）に記載の標準技術を利用して構築した。pCGP363(実施例12参照)内に含まれているカーネーションACO cDNAフラグメントをバイナリーベクターpCGP293（Brugliera、1994）の中に、 MACプロモーター (Comaiら、1990)とmas ３ ′ターミネーター領域（アグロバクテリア・マンノピンシンターゼ遺伝子由来）との間において挿入した。 Comaiら（1990）によれば、 MACは強力な構成プロモーターである。バイナリーベクター pCGP407はアンチセンス ACO核酸分子の他にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPTII)遺伝子を含み、カナマイシン上での増殖により遺伝子導入苗条の選択が可能となる（図４）。実施例14 pCGP407によるＥ．コリ及びＡ．トゥメファシエンスの形質転換ベクター pCGP407によるエッシェリヒア・コリ株XL１−ブルーの形質転換を標準の手順（Sambrookら、1989）又はInoueら（1990）に従って実施した。プラスミド pCGP407は、５μｇのプラスミド DNAを、50mlのMG／Ｌ（Garfinke l and Nester，1980）培養物に接種して28℃で16時間振盪させることにより調製した 100μｌのコンピテントアグロバクテリア・トゥメファシエンス細胞に加えることによりアグロバクテリア・トゥメファシエンス株AGLOに導入した。これらの細胞をペレット化し、そして 0.5mlの85％ｖ／ｖの 100mMの CaCl₂／15％ｖ／ｖのグリセロールの中に再懸濁した。 DNA−アグロバクテリア混合物を液体Ｎ₂ の中で２分間インキュベートすることにより凍結し、次いで37℃で５分間のインキュベーションにより融解させた。 DNA／細菌混合物を更に10分間氷上に載せた。この細胞を１mlのMG／Ｌ培地と混合し、そして28℃で16ｈ振盪しながらインキュベーションした。 pCGP407を担持するＡ．トゥメファシエンスの細胞を 100μ ｇ／ｌのゲンタマイシンを含むMG／Ｌアガープレート上で選別した。プラスミドの存在はゲンタマイシン耐性形質転換体から単離した DNAのサザン分析により確認した。実施例15 ACCオキシダーゼによるジアンサス・カリオフィルスの形質転換ａ．植物材料ジアンサス・カリオフィルス（品種ホワイト・シム及びスカニア）切株を Van Wyk and Son Flower Supply，Victoria Australiaより入手した。外葉を除去し、そしてその切株を70％ｖ／ｖのエタノールで簡単に滅菌し、次いで1.25％ｗ／ｖの次亜塩素酸ナトリウム（Tween 20を含む）で６分間滅菌し、そして滅菌水で３回すすいだ。目に見える葉及び葉腋芽は全て同時培養の前に解剖顕微鏡のもとで除去した。ｂ．アグロバクテリア及びジアンサス組織の同時培養バイナリーベクター pCGP407を含むアグロバクテリア・トゥメファシエンス株 AGLO（Lazoら、1991）を50mg／ｌのテトラサイクリンを含むLBアガープレート上で４℃で維持した。単一のコロニーを50mg／ｌのテトラサイクリンを含む液体LB 培地中で一夜増殖させた。翌日、接種の前に、それを液体MS培地で５×10⁸個の細胞／mlに希釈した。ジアンサス幹組織をアグロバクテリアと５日間、３％ｗ／ｖのスクロース、 0.5mg／ｌの BAP、 0.5mg／ｌの２，４−Ｄ、 100μＭのアセトシリンゴン及び0.25％ｗ／ｖのGelrite(pH 5.7)の添加したMS培地上で同時培養した。ｃ．遺伝子導入ジアンサス植物の回収形質転換幹組織の選別のため、各同時培養幹の頂部６〜８mmを３〜４mmの切片に切り、それを１mg／ｌの BAP、 0.1mg／ｌの NAA、 150mg／ｌのカナマイシン、 500mg／ｌのチカルシリン及び 0.8％のDifco Bacto Agar（選択培地）の添加したMS培地に移した。３週間後、外植体を新鮮な選択培地に移し、そしてこの段階で幹外植体から葉腋苗条が除去されるよう注意を払った。選択培地上で６〜８週間後、健全な不定苗条を３％ｗ／ｖのスクロース、 150mg／ｌのカナマイシン、 500mg／ｌのチカルシリン、 0.8％のDifco Bacto Agarを含むホルモン非含有MS培地に移した。この段階で、 NPTIIドット−ブロットアッセイ(M cDonnellら、1987)を遺伝子導入苗条を同定するために用いた。遺伝子導入苗条を３％ｗ／ｖのスクロース、 500mg／ｌのチカルシリン及び 0.4％ｗ／ｖの Gel riteの添加したMS培地に苗条伸長のために移した。全ての培養物を16時間の光時間(120μＥ／ｍ²／ｓのクールホワイト蛍光)のもとで23±２℃にて維持した。植物が発根し、そして高さ４〜６cmに達したら、それらをミスト下で馴化させた。ハイドロポニック混合物（Kandreck and Black，1984）の中に浸漬した高い割合のパーライト（75％以上）を含む混合物を馴化のために用い、それは一般に４〜５週間続けた）。植物を23℃にて14時間の光時間(200μＥ／ｍ²／ｓの水銀ハライド灯)のもとで馴化させた。実施例16 サザン分析ａ．ジアンサスからのゲノム DNAの単離 DNAを本質的にDellaportaら（1983）に記載の通りにして組織から単離した。この DNA調製品をCsCl浮遊密度遠心分離により更に精製した（Sambrookら、1989 ）。ｂ．サザンブロットゲノムDNA(10μｇ)をEcoRＩ（センス ACSのため）又はHindIII（アンチセンス ACOのため）により消化し、TAE(40mMのトリス−酢酸、50mMのEDTA)のランニングバッファーでそれぞれ 0.7％ｗ／ｖ又は 0.8％ｗ／ｖのアガロースゲルに電気泳動させた。次いでこの DNAを変性溶液(1.5ＭのNaCl／ 0.5ＭのNaOH)の中で１〜 1.5時間変性させ、 0.5Ｍのトリス−HCl(pH 7.5)／ 1.5ＭのNaClの中で２〜３時間中和させ、次いでその DNAを20×の SSCの中での毛細転写（ Sambrookら、1989）によりHybondA（Amersham）に転写した。クロルスルホン又はカナマイシンのいづれかに基づく選別を経て得られた推定遺伝子導入ジアンサス植物のサザン分析は、図５及び６に示すように、適当なキメラ遺伝子のゲノムへの組込みを確証せしめた。実施例17 ノーザン分析液体Ｎ₂の中で凍結し、そして乳鉢を用いて微細粉末へと粉砕した組織から全 DNAを単離した。４Ｍのグアニジニウムイソチオシアネート、50mMのトリス−HCl (pH 8.0)、20mMのEDTA、 0.1％ｖ／ｖサルコシルの抽出バッファーを組織に加え、そしてその混合物をポリトロンを利用し１分間最大速度でホモジナイズした。この懸濁物をMiracloth(Calbiochem)で濾過し、そしてJA20ローターで 10,000rp mで10分遠心分離した。その上清液を集め、そして 0.2ｇ／mlのCsClｗ／ｖにした。次にサンプルを38.5mlのQuick-seal遠沈管(Beckman)内の 5.7ＭのCsCl、50m MのEDTA（pH 7.0）の10mlのクッションの上に載せ、そして Ti-70ローターで 42 ,000rpmにて12〜16時間、23℃で遠心分離した。ペレットをTE／SDS(10mMのトリス−HCl(pH 7.5)、１mMのEDTA、0.1％ｗ／ｖのSDS)に再懸濁し、そして10mMのED TAで飽和にしたフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25：24：１) (pH 7.5)で抽出した。 RNAをエタノール沈殿物として維持し、そして適当なアリコートを使用前にペレット化した。 RNAサンプルを40mMのモルホリノ−プロパンスルホン酸（pH 7.0）、５mMの酢酸ナトリウム、 0.1mMのEDTA（pH 8.0）を含むランニングバッファーを利用して 2.2Ｍのホルムアルデヒド／ 1.2％ｗ／ｖのアガロースゲルに電気泳動した。この RNAを製造者により述べられている通りにしてHybond-Nフィルター（Amersham）に転写し、そして³²Ｐ− ラベル化cDNAフラグメント（10⁸cpm／μｇ、２×10⁶cpm／ml）でプロービングした。プレハイブリダイゼーション（42℃で１ｈ）及びハイブリダイゼーション（ 42℃で16ｈ）は50％ｖ／ｖのホルムアルデヒド、１ＭのNaCl、１％ｗ／ｖの SDS 、10％ｗ／ｖのデキストランスルフェート、 100μｇ／mlのサケ精子 DNAの中で行った。フィターを２×の SSC／１％ｗ／ｖの SDSの中で65℃で１時間、次いで 0.2× の SSC／１％ｗ／ｖの SDSの中で65℃で１時間洗った。しかしながら、アンチセンス ACOの場合、フィルターを 0.1×の SSC／ 0.1％ｗ／ｖの SDSで65℃で１時間でも洗った。フィルターは全て増強スクリーンを伴って Kodak XARフィルムに −70℃で48時間曝露させた。センス ACS植物のノーザン分析は、 ALS導入遺伝子が検定した８種の系列のうち６系列の葉において発現されたことを示した（図７参照）。アンチセンス ACO植物のノーザン分析は、遺伝子導入スカニア及びホワイト・シム由来の花弁が４〜６日目においてごくわずかなレベルの ACO及びACS mRNAを生成することを示した。その際、正常なコントロール花では内巻きが生じた（図８参照）。実施例18 DNAプローブの³²Ｐ−ラベル化 DNAフラグメント(50〜100ng)をオリゴラベル化キット（Bresatec）を用い、50 μCiの〔α−³²Ｐ〕−dCTPで放射性ラベルした。組込まれなかった〔α−³²Ｐ〕 −dCTPはSephadex G-50(Fine)カラムでのクロマトグラフィーにより除去した。実施例19 ジアンサス品種の形質転換プラスミドpWTT2160及び pCGP407内に含まれた遺伝子構築体を前記実施例10及び15に記載の通りにして、アグロバクテリア媒介遺伝子導入を利用して様々なカーネーション品種に導入した。植物ゲノムへの適当な DNAの組込みは、実施例16 に記載の通りにして、カナマイシン又はクロルスルホン選択を経て得られた植物のサザン分析により確認した。本発明に従って遺伝子導入型に効果的にされた植物は非遺伝子導入コントロールに比べ、有意に低まったレベルのクリマクテリックエチレン生産を有する。例えば、Porapak(登録商標)N カラム（80Ｃ）、火炎電離化検出器及び Varian 440 0インテグレーターの備ったVarianモデル3300ガスクロマトグラフィーを利用するエチレン生産の測定は、導入されたアンチセンス ACO遺伝子構築体を担持するカーネーション品種スカニア及びホワイト・シムの花が著しく弱められたエチレン生産能力を有することを示した。図９のグラフは収穫日以降の遺伝子導入花及びコントロール（非遺伝子導入）花によるエチレンの進展を示す。コントロール植物は正常な量のエチレンを合成する花を生産し、内巻きの開始においてのエチレン生産の予測のクリマクテリック上昇を示す。カーネーション品種スカニア及びホワイト・シムの遺伝子導入花はコントロール花により生産されるエチレンレベルの10％未満を生産した。実施例20 長期化したポストハーベスト生存植物ゲノムへの ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼ DNA配列のいづれかの１又は複数の追加のコピーの導入は切花のポストハーベスト寿命に著しい効果を及ぼすことができる。内生遺伝子の発現は、米国特許第 5,034,323； 5,231,020及び 5,238,184号に開示のセンス転写体及び同時抑制技術、又は米国特許第 5,107,065号に開示のアンチセンス転写体及びアンチセンス技術のいづれかを利用することにより抑制することが可能であり、これにより有意に低まったレベルのクリマクテリックエチレンを生産する形質転換カーネーション花が作製される。これらの花は、その未形質転換同等物の正常な花びん内寿命の往々にして２倍を超えるポストハーベスト寿命を示し、そして環境に毒性であるチオ硫酸銀の如き化学品による通常の処置が必要でない。センス ACS手法を利用する「長寿」表現型の例を図10（Ａ）−10（Ｆ），11（Ａ）−11（Ｆ），12（Ａ）−12（Ｆ）及び13（Ａ）−13（Ｄ）に示す。花を全て収穫後、水の中で、且つコントロールした条件下(10001ux、22℃、相対湿度65％)で12ｈの昼／夜サイクルに保った。図10（Ａ）−10（Ｆ）はポストハーベストの０，４及び11日目のスカニア品種遺伝子導入カーネーション花を示す。コントロールの未遺伝子導入花はポストハーベストの０，４及び７日目にて示す。遺伝子導入花は11日目ではまだ新鮮に見え、一方未遺伝子導入同等物はポストハーベストの４日目において老化中のカーネーション花に典型的な既に花弁の内巻きを示し、そしてポストハーベストの７日目に完全に老化した。図11（Ａ）−11（Ｆ），12（Ａ）−12（Ｆ）及び13（Ａ）−13（Ｄ）のそれぞれに示す通り、同等の結果が品種レッド・コルソ；アンバー・ローズ及びクローリー・シムについて得られた。各ケースにおいて、遺伝子導入カーネーション花は、未遺伝子導入コントロールに比べ、長い間新鮮に見えた。カーネーション品種ホワイト・シムの遺伝子導入「長寿」花を、図14（Ａ）− 14（Ｃ）に示している通り、本発明に従い、センス ACS手法を利用しても製造した。未遺伝子導入コントロールホワイト・シム（各写真の左側）はポストハーベストの11日目に内巻き及び老化し始め、そしてポストハーベストの20日目に完全に老化した。一方、３種の ACSセンス抑制型遺伝子導入花はポストハーベストの11日目において新品のように新鮮であり、そしてポストハーベストの20日目でも内巻きしなかった。更に、アンチセンス ACOを利用して遺伝子導入型にした植物由来の花もカーネーション品種ホワイト・シム及びスカニアについて製造した。ACO mRNAのレベルは抑制され、それ故クリマクテリックエチレン生産はほとんど消え、そしてカーネーション花びん内寿命は対応して伸びた。これらの花の正常な花びん内寿命は、収穫の日から内巻きを開始するまで約５日である。遺伝子導入スカニア及びホワイト・シム由来の花は８〜９日の花びん内寿命を有し、その後花弁はゆっくり色を失い、そしてカーネーション花の老化に典型的な内巻き挙動を示さずに枯れはじめた。コントロール植物は全て正常な老化表現型の花を開花した。ポストハーベストの６日目のスカニアの遺伝子導入「長寿」花を、未遺伝子導入コントロール花と比較しながら、図15に示す。図16は、未遺伝子導入ホワイト・シムコントロール植物由来の花の隣りに遺伝子導入「長寿」ホワイト・シム花の写真を示し、共にポストハーベスト８日目である。遺伝子導入花は新鮮に見え続け、一方、コントロールの未遺伝子導入花は完全に老化した。当業者は本明細書に記載の本発明が特述したもの以外に変更及び改良できることを理解するであろう。本発明はこのような変更及び改良の全てを包括する。本発明は本明細書に記載の又は示唆した工程、特徴、組成物及び化合物の全てを個別的に、又は集約的に包括し、そして任意の二以上の前記工程又は特徴の組合せの全を包括する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コーニッシュ，エドウィーナセシリーオーストラリア国，ビクトリア 3808，アッパービーコンスフィールド，リードベターロードロット 33 (72)発明者ガターソン，ニールイーラアメリカ合衆国，カリフォルニア 94618, オークランド，ゴールデンゲイトアベニュ 5169 (72)発明者タッカー，ウイリアムティンスレイアメリカ合衆国，カリフォルニア 94602, オークランド，カメリアドライブ 24

Claims

【特許請求の範囲】１．未遺伝子導入親株又は同種の未遺伝子導入植物に比べて低められたクリメクトリックエチレン生成を示す遺伝子導入植物を製造するための方法であって、 ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼをコードする又はそれらをコードする配列に相補性である核酸分子又はこの核酸分子の誘導体を含んで成る遺伝子構築体を植物の１又は複数の細胞に導入し、そしてこの１又は複数の細胞から遺伝子導入植物を再生することを含んで成る方法。２．前記遺伝子導入植物が１又は複数の下記の特性を示す、請求項１記載の方法：（ｉ） ACCシンターゼ特異的mRNA又は ACCオキシダーゼ特異的mRNAの生産性の低下；（ii） ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼ酵素の生産性の低下；及び／又は（iii）前記遺伝子導入植物から切り取った花もしくは花芽の老化の遅延。３．前記遺伝子構築体が ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼをコードする核酸分子の非全長フラグメントを含んで成る、請求項１又は２記載の方法。４．前記非全長フラグメントが長さ約 800〜1200塩基対である、請求項３記載の方法。５．前記非全長フラグメントが ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼをコードする核酸分子の内部フラグメントである、請求項３記載の方法。６． ACCシンターゼ特異的mRNAもしくは ACCオキシダーゼ特異的mRNAの生産性の低下又は ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼの生産性の低下が同時抑制により達成される、請求項３，４又は５記載の方法。７．カーネーション植物から切り取ったときに未遺伝子導入親株又は同種の未遺伝子導入植物に比べて長いポストハーベスト寿命特性を示す花又は花芽を有する遺伝子導入カーネーション植物を製造するための方法であって、 ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼをコードする又はそれらをコードする配列に相補性である核酸分子の非全長フラグメントを含んで成る遺伝子構築体を植物の１又は複数の細胞に導入し、そしてこの１又は複数の細胞から植物を再生することを含んで成り、ここで前記遺伝子導入植物は１又は複数の下記の特性を示すものである、方法：（ｉ）未遺伝子導入内生レベルを下廻る、低減したレベルの ACCシンターゼ特異的mRNAもしくは ACCオキシダーゼ特異的mRNA；（ii）未遺伝子導入内生レベルを下廻る、低減したレベルの ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼ；及び／又は（iii）未遺伝子導入内生レベルを下廻る、低減したレベルのクリマクテリックエチレン生産性。８．前記核酸分子の非全長フラグメントが長さ約 800〜1200bpであり、そして ACCシンターゼ特異的mRNAもしくは ACCオキシダーゼ特異的mRNAの低下、又は A CCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼの低下、又はクリマクテリックエチレン生産性の低下が同時抑制によるものである、請求項７記載の方法。９．前記核酸分子が SEQ ID NO：３に実質的に記載のヌクレオチドの配列を含んで成るものであるか、又はその誘導体であるか、又は低ストリンジェンシー条件下で30℃にて SEQ ID NO：３に記載のヌクレオチドの配列とハイブリダイズできる核酸分子であるか、又は SEQ ID NO：３に記載のヌクレオチドの配列に対して約60％以上の類似性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子である、請求項１又は８記載の方法。 10．前記核酸分子が SEQ ID NO：４に実質的に記載のヌクレオチド配列を含んで成るものであるか、又はその誘導体であるか、又は低ストリンジェンシー条件下で30℃にて SEQ ID NO：４に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズできる核酸分子であるか、又は SEQ ID NO：４に記載のヌクレオチド配列に対して約60 ％以上の類似性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子である、請求項１又は８記載の方法。 11．前記核酸分子が SEQ ID NO：７に実質的に記載のヌクレオチド配列を含んで成るものであるか、又はその誘導体であるか、又は低ストリンジェンシー条件下で30℃にて SEQ ID NO：７に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズできる核酸分子であるか、又は SEQ ID NO：７に記載のヌクレオチド配列に対して約60 ％以上の類似性を有するヌクレオチト配列を有する核酸分子である、請求項１又は８記載の方法。 12．前記核酸分子が SEQ ID NO：３に実質的に記載のアミノ酸配列をコードするものであるか、又はそれに対して約40％以上の類似性を有するものである、請求項１又は８記載の方法。 13．前記核酸分子が SEQ ID NO：４に実質的に記載のアミノ酸配列をコードするものであるか、又はそれに対して約40％以上の類似性を有するものである、請求項１又は８記載の方法。 14．前記核酸分子が SEQ ID NO：７に実質的に記載のアミノ酸配列をコードするものであるか、又はそれに対して約40％以上の類似性を有するものである、請求項１又は８記載の方法。 15．未遺伝子導入親株又は同種の未遺伝子導入植物におけるレベルに比べ低減したレベルのエチレン生産性を花が示す遺伝子導入顕花カーネーション植物を製造するための方法であって、 ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼをコードする又はそれらをコードする配列に相補性である核酸分子又はこの核酸分子の誘導体を含んで成る遺伝子構築体をカーネーション植物の１又は複数の細胞に導入し、そしてこの１又は複数の細胞から遺伝子導入植物を再生することを含んで成る方法。 16．前記核酸分子が SEQ ID NO：３に実質的に記載のヌクレオチド配列を含んで成るものであるか、又はその誘導体であるか、又は低ストリンジェンシー条件下で30℃にて SEQ ID NO：３に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズできる核酸分子であるか、又は SEQ ID NO：３に記載のヌクレオチド配列に対して約60 ％以上の類似性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子である、請求項15記載の方法。 17．前記核酸分子が SEQ ID NO：４に実質的に記載のヌクレオチド配列を含んで成るものであるか、又はその誘導体であるか、又は低ストリンジェンシー条件下で30℃にて SEQ ID NO：４に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズできる核酸分子であるか、又は SEQ ID NO：４に記載のヌクレオチド配列に対して約60 ％以上の類似性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子である、請求項15記載の方法。 18．前記核酸分子が SEQ ID NO：７に実質的に記載のヌクレオチド配列を含んで成るものであるか、又はその誘導体であるか、又は低ストリンジェンシー条件下で30℃にて SEQ ID NO：７に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズできる核酸分子であるか、又は SEQ ID NO：７に記載のヌクレオチド配列に対して約60 ％以上の類似性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子である、請求項15記載の方法。 19．前記核酸分子が SEQ ID NO：３に実質的に記載のアミノ酸配列をコードするものであるか、又はそれに対して約40％以上の類似性を有するものである、請求項15記載の方法。 20．前記核酸分子が SEQ ID NO：４に実質的に記載のアミノ酸配列をコードするものであるか、又はそれに対して約40％以上の類似性を有するものである、請求項15記載の方法。 21．前記核酸分子が SEQ ID NO：７に実質的に記載のアミノ酸配列をコードするものであるか、又はそれに対して約40％以上の類似性を有するものである、請求項15記載の方法。 22．前記遺伝子構築体が受託番号 N95／26121 及び N95／26122 のそれぞれのもとで豪州政府分析研究所に寄託されたプラスミドpWTT2160又はプラスミド pCG P407である、請求項１，７又は15記載の方法。 23． ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼをコードする、又はそれらをコードする配列に対して相補性である核酸分子、又はその核酸分子の誘導体を含んで成る遺伝子導入カーネーション植物であって、１又は複数の以下の特性を示す遺伝子導入植物：（ｉ） ACCシンターゼ特異的mRNAの生産性の低下；（ii） ACCシンターゼ酵素の生産性の低下；（iii）クリマクテリックエチレンの生産性の低下；及び／又は（iv）前記遺伝子導入植物から切り取った花又は花芽の遅延した老化。 24．前記核酸が ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼをコードする核酸分子の非全長フラグメントである、請求項23記載の方法。 25．前記非全長フラグメントが長さ約 800〜1200塩基対である、請求項24記載の方法。 26．前記非全長フラグメントが ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼをコードする核酸分子の内部フラグメントである、請求項25記載の方法。 27．未遺伝子導入親株又は同種の未遺伝子導入器官に比べ長いポストハーベスト寿命特性を有する花又は花芽を担持することのできる遺伝子導入カーネーション植物であって、 ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼをコードする、又はそれに相補性である配列をコードする核酸分子の非全長フラグメントを含んで成り、ここでこの遺伝子導入植物の花又は花芽が１又は複数の下記の特性を示すものである、遺伝子導入植物：（ｉ）未遺伝子導入内生レベルを下廻る、低減したレベルの ACCシンターゼ特異的mRNAもしくは ACCオキシダーゼ；（ii）未遺伝子導入内生レベルを下廻る、低減したレベルの ACCシンターゼもしくは ACCオキシダーゼ；及び／又は（iii）未遺伝子導入内生レベルを下廻る、低減したレベルのエチレン生産性。 28．前記 ACCシンターゼ又は ACCオキシダーゼをコードする核酸分子の非全長フラグメントが長さ約 800〜1200bpであり、そして内生 ACCシンターゼ又は ACC オキシダーゼ遺伝子の発現が同時抑制により低減されるものである、請求項27記載の遺伝子導入植物。 29．前記核酸分子が SEQ ID NO：３に実質的に記載のヌクレオチドの配列を含んで成るものであるか、又はその誘導体であるか、又は低ストリンジェンシー条件下で30℃にて SEQ ID NO：３に記載のヌクレオチドの配列とハイブリダイズできる核酸分子であるか、又は SEQ ID NO：３に記載のヌクレオチドの配列に対して約60％以上の類似性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子である、請求項23又は27記載の方法。 30．前記核酸分子が SEQ ID NO：４に実質的に記載のヌクレオチド配列を含んで成るものであるか、又はその誘導体であるか、又は低ストリンジェンシー条件下で30℃にて SEQ ID NO：４に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズできる核酸分子であるか、又は SEQ ID NO：４に記載のヌクレオチド配列に対して約60％以上の類似性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子である、請求項23又は27記載の方法。 31．前記核酸分子が SEQ ID NO：７に実質的に記載のヌクレオチド配列を含んで成るものであるか、又はその誘導体であるか、又は低ストリンジェンシー条件下で30℃にて SEQ ID NO：７に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズできる核酸分子であるか、又は SEQ ID NO：７に記載のヌクレオチド配列に対して約60 ％以上の類似性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子である、請求項23又は27記載の方法。 32．前記核酸分子が SEQ ID NO：３に実質的に記載のアミノ酸配列をコードするものであるか、又はそれに対して約40％以上の類似性を有するものである、請求項23又は27記載の方法。 33．前記核酸分子が SEQ ID NO：４に実質的に記載のアミノ酸配列をコードするものであるか、又はそれに対して約40％以上の類似性を有するものである、請求項23又は27記載の方法。 34．前記核酸分子が SEQ ID NO：７に実質的に記載のアミノ酸配列をコードするものであるか、又はそれに対して約40％以上の類似性を有するものである、請求項23又は27記載の方法。 35．請求項23〜24のいづれか１項記載の遺伝子導入カーネーション由来の切花。 36．請求項23〜24のいづれか１項記載の遺伝子導入カーネーション由来の種子又はその他の再生材料。