JPH11503524A - Ｈｉｖ−ｔａｔの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、工程：（ａ）体試料を採取し、該体試料をデターゼント及び高濃度の塩と共にインキュベートする工程、（ｂ）工程（ａ）由来の体試料をサイズ分画する工程、及び（ｃ）工程（ｂ）由来の体試料を抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体と共にインキュベートする工程を有する体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴの検出方法に関する。また、本発明は、該方法を実行するために適切なキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ−ＴＡＴの検出方法 本発明は、体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴの検出方法及び本目的に使用されるキッ トに関する。 ＡＩＤＳの場合、Ｔ細胞は、しばしばプログラムされた細胞死をこうむること がよく知られている。該細胞死はＴ細胞アポトーシスとして述べられる。最近の よってＴ細胞アポトーシスが増すという事実に言及している。 この知見は、現在、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳを、それぞれ、より良く理解すし 、新しい治療方法を考える可能性を提供する。しかしながら、本目的のために、 体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴを検出することができることが必要である。しかし、 これは、これまでは可能ではなかった。 したがって、本発明の目的は、体試料中にＨＩＶ−ＴＡＴを検出できる方法を 提供することにある。 本発明によって、これは下記工程を有する方法により達成される： （ａ）体試料を採取し、該体試料をデターゼント（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｓ）及び高 濃度の塩と共にインキュベートする工程、 （ｂ）工程（ａ）由来の体試料をサイズ分画する工程、及び （ｃ）工程（ｂ）由来の体試料を抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体と共にインキュベートす る工程。 「体試料」という用語は、人間及び動物由来のいかなる種類でもよい体試料を 有する。特に、これらは、血液、痰、尿、大便、体液、胆汁、胃腸の分泌物、臓 器の吸引物又は斑（Ｏｒｇａｎｐｕｎｋｔａｔｅ）、生検試料及びリンパ液であ る。 体試料を採取するために、慣用の方法を使うことができる。ついで、該体試料 を、慣用のデターゼント、例えば、ＮＰ−４０又はｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と 共にインキュベートする。また複数のデターゼントを同時に又は連続的に使用す ることが可能である。全体で１％のデターゼントを用いることが好ましい。さら に、該体試料に高濃度の塩を添加する。それは慣用の塩、例えばＮａＣｌであっ てもよい。また、複数の塩を同時に又は連続的に用いることが可能である。全体 で０．１〜１Ｍの塩を使用することが好ましい。ＨＩＶ−ＴＡＴを、デターゼン ト及び高濃度の塩の使用によって、結合したタンパク質及び核酸から遊離する。 さらに、デターゼントによって、該体試料中でＨＩＶ粒子を不活性化する。 さらに、該体試料をサイズ分画に供する。本目的のために、慣用の方法、例え ば、Ｆｉｌｔｒｏｎ社、ノースボロー（Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ）、マサチュ ッツ州、Ｕ．Ｓ．Ａの遠心分離（分画）カラムによる分画を使用することが可能 である。５〜３０ｋＤの範囲以内で分画を行うことが好ましい。 また、該体試料を、抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体と共にインキュベートする。「ＨＩ Ｖ−ＴＡＴ」という用語は、ＨＩＶ感染を引き起こす及び／又はＡＩＤＳを生じ るウイルスから生じるいかなるＴＡＴ及びその断片をも有する。該用語は、合成 的に作成した、いかなるＴＡＴ及びその断片にも関する。該抗体はポリクローナ ル又はモノクローナルであってよく、モノクローナル抗体が好ましい。さらに、 該抗体は、合成であってもよく、任意にＨＩＶ−ＴＡＴを認識するために必要で ない部分を一部又は全部欠損してもよく、これらの部分をそれぞれ、さらに好ま しい性質を有する抗体を提供する他の部分によって置き換えてもよい。また、多 様な抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体を同時に又は連続的に使用することが有利であろう。 特に、該１又は複数の抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体をインキュベートすることと並行し て、該体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴの定量的検出をしやすいように、一定のＴＡＴ 標品と共に前記インキュベートすることが好ましい。 １又は複数の抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体との該体試料のインキュベーション並びに ＴＡＴ標品との後者のインキュベーションは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ 、例えばサンドウィッチ若しくは競合ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法又は免疫沈降法等 の慣用の方法の一部となってもよい。本目的のために、該抗体はラベルしてもよ く、もし適切ならば、又は該抗体に対するラベルされた抗体を組み合わせて用い てもよい。 本発明による方法は、ＨＩＶ−ＴＡＴを体試料中で検出できるという点が特徴 である。該方法は、特異的に及び迅速に行うことができる。したがって、ＨＩＶ 感染を診断すること及び／又はＡＩＤＳ症状を追跡することのために完全に適す る。また、後者は、特にＨＩＶ−ＴＡＴに対しておこなわれる治療方法の効果を 直接的に追跡する大きな利点を有する。 また、本発明によって、体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴの検出のためのキットが提 供される。かかるキットは、好ましくは、下記を有する。 （ａ）デターゼント、 （ｂ）高濃度の塩の溶液、 （ｃ）サイズ分画カラム、 （ｄ）１又は複数の抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体、 （ｅ）ＨＩＶ−ＴＡＴ標品、並びに （ｆ）慣用の補助剤及び担体材料。 本発明による方法と関連して作られた前記説明は、ここで相応して考慮されな ければならない。図面の簡単な説明 図はＨＩＶ−１感染した人間の体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴの特異的検出を示す 。 本発明を以下の実施例により説明する。実施例：ＨＩＶ−１感染した人間の体試料中のＴＡＴの検出 ３３人のＨＩＶ−１感染した人間から血清試料を採取した。２０人のＨＩＶの 人間由来の血清及びＨＩＶ−１感染したＨ９細胞の上清と共に、それらをＴＡＴ の存在を試験した。さらに、一定の標品を得るために、対照血清に合成ＴＡＴを 添加した。 前記血清を１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び１ＭＮａＣｌと共に、それぞれ インキュベートした。ついで、Ｆｉｌｔｒｏｎ社の遠心分離（分画）カラム、前 記参照、を用いて、該血清を５〜３０ｋＤの範囲のサイズ分画に供した。該血清 はドットブロット法にかけた。本目的のために、それらをニトロセルロース膜に 滴下することによりアプライし、熱によって固定した。タンパク質結合部位の残 りをブロックするために、該ニトロセルロース膜を、ＰＢＳ（０．０１％ Ｎ３ ）に溶かした５％のミルク粉末と共に室温で２時間インキュベートした。該ニト ロセルロース膜をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で室温で３０分間洗浄し た。ついで、該ニトロセルロース膜を購入可能なＴＡＴ−特異的抗体と共に室温 で２時間インキュベートした後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で６回、 それぞれ、５分間洗浄した。該ニトロセルロース膜は、ＴＡＴ−特異的一次抗体 の定常領域に対する、ペルオキシダーゼ−結合二次抗体と共に、室温で２時間イ ンキュベートした。その後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で６回、それ ぞれ５分間洗浄した後、該ニトロセルロース膜を、抗ペルオキシダーゼ複合体と 共に室温で２時間インキュベートした。該ニトロセルロース膜を、ＰＢＳ／０． ０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で６回、それぞれ５分間洗浄した後、シグナルが比色反 応によって生成した（図を参照）。 本発明による方法によって、体試料中に特異的にＨＩＶ−ＴＡＴを検出できる ことを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴェステン−ドルプ，ミカエル ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69120 ラデンブルゲル シュトラーセ 55 (72)発明者 フランク，ライネル ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69120 ハンス−トーマ−シュトラーセ 76 (72)発明者 ベルント，クリスチーナ ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69120 ベルクハイメル シュトラーセ 100

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記工程を有する体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴの検出方法。 （ａ）体試料を採取し、該体試料をデターゼント（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｓ）及び高 濃度の塩と共にインキュベートする工程、 （ｂ）工程（ａ）由来の体試料をサイズ分画する工程、及び （ｃ）工程（ｂ）由来の体試料を抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体と共にインキュベートす る工程。 ２．該体試料が、血液、痰、尿、大便、体液、胆汁、胃腸の分泌物、臓器の吸引 物又は斑（Ｏｒｇａｎｐｕｎｋｔａｔ）、生検試料及び／又はリンパ液であるこ とを特徴とする請求項１記載の方法。 ３．工程（ａ）において、１％のデターゼント及び０．１〜１Ｍの塩を使用する ことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。 ４．工程（ｂ）において、５〜３０ｋＤのサイズ分画を行うことを特徴とする請 求項１〜３いずれか記載の方法。 ５．該方法が、さらに、工程（ｃ）の抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体をＴＡＴ標品と共に インキュベートする工程（ｄ）を有することを特徴とする請求項１〜４いずれか 記載の方法。 ６．工程（ｃ）及び工程（ｄ）がウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法 又は免疫沈降法の一部となることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の方法 。 ７．（ａ）デターゼント、 （ｂ）高濃度の塩の溶液、 （ｃ）サイズ分画カラム、 （ｄ）１又は複数の抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体、 （ｅ）ＨＩＶ−ＴＡＴ標品、並びに （ｆ）慣用の補助剤及び担体材料、 を有する体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴの検出のためのキット。