JPH11503024A

JPH11503024A - 細胞表面のクラスｉｍｈｃタンパク質の低レベルを有する遺伝子学的に修飾された細胞の移植

Info

Publication number: JPH11503024A
Application number: JP8530474A
Authority: JP
Inventors: オッテン，ジリス・アール
Original assignee: Cell Genesys Inc
Current assignee: Cell Genesys Inc
Priority date: 1995-04-04
Filing date: 1996-04-03
Publication date: 1999-03-23
Also published as: CA2217297A1; NO974596D0; NO974596L; WO1996031241A1; EP0820311A4; AU5533896A; EP0820311A1; KR19980703665A; AU712415B2

Abstract

(57)【要約】哺乳動物の細胞は、ウイルス由来ＭＨＣダウンレギュレーションタンパク質をコードする遺伝子の導入により遺伝子学的に修飾される。移植に適した細胞がドナーから取得され、１以上のウイルス由来ＭＨＣダウンレギュレーションタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされる。遺伝子学的に修飾されたドナー細胞は、適切であれば、生体外で増加されて、そして、受容体哺乳類宿主に移植される。クラスＩＭＨＣタンパク質の低下したレベルは、さもなければ非修飾細胞が受容体免疫系による攻撃の対象になるであろう条件で、移植細胞が生存できることを可能にする。ドナー細胞はさらに、標的細胞に修飾され、あるいは哺乳類宿主におけるドナー細胞のエフェクター機能を高め得る。

Description

【発明の詳細な説明】細胞表面のクラスＩＭＨＣタンパク質の低レベルを有する遺伝子学的に修飾された細胞の移植発明の技術分野本発明の技術分野は、医療において、低レベルのクラスＩＭＨＣ分子を発現するように遺伝子学的に修飾された細胞および組織の移植に関する。発明の背景疾患および感染から脊椎動物を保護するために、高度の保護システムが発達している。哺乳動物において、免疫系は、主要な防護体として働き、宿主を保護するために多くの相違するタイプの細胞およびメカニズム、一義的にはリンパ細胞および骨髄細胞を有する。免疫系は、自己と非自己抗原とを区別する能力を生育するリンパ細胞系に由来する。非自己と感知された細胞は、免疫系により破壊される。この感知は、ウイルス感染、疾患、腫瘍抗原の異常な発現、外来組織の移植または他の原因によりなされる。主要な組織適合性複合（ＭＨＣ）タンパク質は、自己−ウイルス−異物認識系において重要な役割を演じる。各個体は、一連のいくつかの相違するクラスＩおよびＩＩＭＨＣタンパク質を有する。ＭＨＣは自己の認識体として働く。外来抗原は一般に“自己＋Ｘ”として認識され、そこでは外来ペプチドとの自己ＭＨＣの結合が認識される。移植が同種異型の宿主からなされると、移植体が宿主にＭＨＣ適合するか、または宿主が免疫無防備状態にない限り、移植体は異物と認識され、免疫系により破壊される。移植体が免疫応答性リンパ球または単球を含んでいると、移植片は異物として宿主を攻撃し、移植片−ウイルス−宿主疾患を起こす。治療のために細胞を受容者に移植したい場合が多々ある。宿主が免疫無防備状態にある場合は、防御免疫応答を提供するために、特殊な白血球細胞、特にＴ細胞などのリンパ球を、エフェクターの機能を高めるために、あるいは感染、疾患または機能異常の細胞や癌細胞を殺すために、遺伝子学的修飾を行いまたは行わずに、注輸することは、興味深いことである。他の事例として、ある種の細胞が欠落している場合、糖尿病におけるランゲルハンス島、パーキンソン病におけるドーパミン分泌細胞、種々の造血関連疾患における骨髄細胞、進行性筋疾患における筋肉細胞あるいは視力障害における網膜上皮細胞などについて、遺伝子産物の発現および分泌により望む機能を遂行できる細胞を提供することが望まれる。移植された細胞が生存するために、宿主による攻撃から安全でなければならない。従って、移植後に機能的であり、受容者の免疫系による攻撃から安全に保たれる細胞を製造する効果的な方法を見つけることは、非常に意義がある。関連文献ウイルス性タンパク質による細胞表面におけるＭＨＣ分子のダウンレギュレーションは、Maudsley及びPound（1994）Immunology Today 19: 429-431 に総説されている。アデノウイルスＥ３／１９ｋｄタンパク質の活性は、Routes et al.( 1993)J．Virol．67: 3176-3181 及び Hermiston et al．（1993）J．Virol．67 ：5289-5298 に論じられている。Ｔ−リンパ腫細胞ラインにおけるアデノウイルスＥ３／１９ｋｄタンパク質の発現は、Korner および Burgert（1994）J．Viro l．68: 1442-1448に記載されている。ＣＤ８⁺ＮＩ対する抗原提示の阻害におけるヘルペス単純ウイルスＩＣＰ４７タンパク質の活性は、York et al．（1994）Cell77: 525-535 に論じられている。ＭＨＣタンパク質ダウンレギュレーションに含まれるヒトサイトメガロウイルスタンパク質は、Gilbert et al．（1993）J．Virol．67: 3461-3469 及び Beer smaet al．（1993）J．Immunol．151: 4455-4464 に記載されている。粘液腫ウイルスに感染した細胞表面からのクラスＩＭＨＣ分子のウイルス誘発欠損は、 Boshnov et al．（1992）J．Immunol．148: 881-887 に記載されている。ベアリンパ球症候群は、Sullivan et al．（1985）J．Clin．Invest．76: 75- 79；Clement et al．（1988）J．Clin．Invest．81: 669-675；および Hume et al．（1989）Human Immunology 25: 1-11 に記載されている。発明の要約ＭＨＣダウンレギュレーションタンパク質の発現の結果として、減少したレベルのクラスＩＭＨＣ分子を細胞表面上に持つ細胞を移植する方法及び組成物が提供される。移殖に適する細胞は、ドナーから採取され、１つ以上のウイルス由来ＭＨＣダウンレギュレーションタンパク質をコードする遺伝子含有の発現ベクターで、トランスフェクトされる。細胞は、適切であれば、生体外で増やし、受容宿主に移植する。クラスＩＭＨＣタンパク質のレベルが減少していることで、遺伝子学的に非修飾の細胞では受容宿主の免疫系により攻撃される条件下でも、移植細胞は生存できる。加えて、細胞は、エフェクター機能を変えるための、又は宿主内における疾病細胞やウイルス感染細胞を標的とするための構築物を含むように、遺伝子学的に修飾され得る。図面の簡単な説明図１は、ＵＳ１１をコードするレトロウイルスで形質導入した１４３Ｂ骨肉腫細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）グラフであり、下記の実施例４に記載するように、ＨＬＡクラスＩに特異的なＦＩＴＣ結合抗体で染色されている。図２は、下記の実施例５に記載するように、ＨＬＡ−Ａ２特異的ＣＴＬによるＣＩＲ−Ａ２.１＋標的物の溶菌を示す。Ｙ軸は特異的溶菌パーセントであり、Ｘ軸はエフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比率である。図３は、下記の実施例５に記載するように、ＵＳ１１及びＣＤ４ζ（上）またはＣＤ４ζ（下）をコードするレトロウイルスで形質導入し、ＰＥ結合アンチＣＤ抗体（Ｙ軸）及びＦＩＴＣ結合アンチＨＬＡ抗体（Ｙ軸）で標識したＣ１Ｒ− Ａ２.１細胞のＦＡＣＳグラフである。図４は、下記の実施例５に記載するように、Ｕ１１をコードするレトロウイルスで形質導入し、ＦＩＴＣ結合アンチＨＬＡクラスＩ抗体で染色した、Ｃ１Ｒ− Ａ２.１のＦＡＣＳグラフである。図５（Ａ）は、下記の実施例５に記載するように、ＵＳ１１をコードするレトロウイルスで形質変換したＣ１Ｒ−Ａ２.１クローンの、ＨＬＡ−Ａ−２特異的ＣＴＬによる溶菌に対する抵抗性を示す。図５（Ｂ）は、下記の実施例５に記載するように、ＣＤ４ζをコードするレトロウイルスで形質転換したＣ１Ｒ−Ａ２ . １細胞の、ＨＬＡ−Ａ２特異的ＣＴＬによる溶菌に対する感受性を示す。Ｙ軸は、特異的溶菌パーセントであり、Ｘ軸はエフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比率である。実施態様の記載１つ以上のウイルス由来ＭＨＣダウンレギュレーションタンパク質をコードする発現構築物を導入することにより、減少したクラスＩＭＨＣタンパク質を細胞表面に有するように、細胞を遺伝子学的に修飾する。修飾された細胞は、細胞または組織の移殖において使用する。なぜなら、それらは移殖受容体免疫系による殺滅に対して抵抗性を有するからである。本法は、形質導入または形質転換が低いレベルであることが分かっている造血幹細胞及びＴリンパ球などの細胞を修飾するのに特に有益である。本法の効果を高める１つ以上の技術を使用して、該細胞においてクラスＩＭＨＣ分子の顕著なダウンレギュレーションが得られる。興味深い技術は、１つのｍＲＮＡ分子に複数のリボソーム侵入を可能とするベクターエレメント（ＩＲＥＳエレメント）と特に関連したダウンレギュレーション遺伝子の組み合わせの使用；in vitro培養中に接着分子又は接着分子に対する抗体を使用することによるin vitroでの形質転換または形質導入の穴進；及び、低いレベルのＭＨＣクラスＩ分子か、又は形質変換または形質導入を指示する高いレベルのマーカーかを発現する細胞の部分母集団の選択を含む。修飾されたＴ細胞の有用性はまた、ナチュラルキラー細胞による溶菌に対する細胞の感受性を減少させるin vitro培養技術により亢進される。移殖『ドナー』細胞の拒絶は、ドナー細胞により発現された移殖抗原により仲介される。主要な移殖抗原はクラスＩおよびクラスIIＭＨＣタンパク質である。クラスＩＭＨＣ分子が欠損している細胞は、一般的に細胞障害性Ｔ細胞により認識されず、それ故、様々な個体に移殖され、維持され得る。本発明のクラスＩＭＨＣタンパク質のダウンレギュレーションは、ウイルス由来遺伝子（その産物は宿主細胞において、クラスＩＭＨＣタンパク質の細胞表面発現を阻害する）を含む発現ベクターを宿主に導入することにより得られる。哺乳動物のＭＨＣクラスＩ分子は、ＭＨＣ内の遺伝子によりコードされたα鎖、β₂−ミクログロブリン軽鎖および内因性細胞タンパク質または外来タンパク質の細胞内タンパク質分解から誘導された小ペプチドからなる、非共有結合的な３分子複合体である。完全なクラスＩ分子は、小胞内で、細胞内成分から組み立てられる。完全な複合体が組み立てられたときにのみ、完全なクラスＩＭＨＣ分子が形質膜に輸送される。本発明において、クラスＩＭＨＣ発現の翻訳後阻害は、ウイルス由来ＭＨＣダウンレギュレーションタンパク質の導入により得られる。興味あるＭＨＣダウンレギュレーションタンパク質は、ヒトアデノウイルス２型Ｅ３／１９ｋｄ遺伝子（配列番号１）およびヒトアデノウイルス５型Ｅ３／１９ｋｄ遺伝子（配列番号２）；単純ヘルペスウイルスＩＣＰ４７遺伝子（配列番号３）；ヒトサイトメガロウイルス遺伝子ＵＳ１１（配列番号４）；ヒトサイトメガロウイルス遺伝子ＵＳ５（配列番号５）等を含む。クラスＩＭＨＣ発現をダウンレギュレーションすることが知られているその他のウイルスに、粘液腫ウイルスおよび繊維腫ウイルスがあり、これらから本発明に有益なダウンレギュレーション遺伝子を使用し得る。修飾を受ける細胞は、興味ある、全ての正常な（すなわち、形質転換されていない）哺乳動物の細胞であり得、これは、細胞療法、研究、in vitroにおけるその他の細胞との相互作用、またはその他において使用できる。適当な細胞には、角質細胞などの表皮細胞；網膜上皮細胞；筋芽細胞；造血幹細胞およびＴリンパ球などの造血細胞；静脈および動脈上皮細胞を含む上皮細胞；筋芽細胞；ランゲルハンス島のβ細胞；in vitroで容易に扱えるその他の細胞などがある。細胞は、所望により、培養中で維持および増殖し得、細胞が長期間において生存でき機能する宿主に導入し得る。興味ある造血細胞は、リンパ節、末梢血などから単離したＴ細胞などの未熟または成熟リンパ球を含む。採取後に、Ｔ細胞を特定の部分集合または特異性に関して分離し得る。特に興味深いのは、抗原特異的Ｔ細胞である。特定の抗原特異性を有する大量のＴ細胞を、当分野で知られているように（Lamers et al.(1992 )Int.J.Cancer 51:973-979）、抗原刺激およびin vitro培養により産生し得る。特に興味深いのは、異なるエフェクター機能を有するように、または、特異的標的に対して、例えば細胞障害性などの反応性を有するように、遺伝子学的に修飾された同種異型のＴ細胞である。例えば、Ｔ細胞を、１９９４年１０月２５日発行米国特許５,３５９,０４６号に記載されているように、ＭＨＣダウンレギュレーション遺伝子の発現に加えて、疾病又は感染細胞、又は癌細胞を標的とするキメラレセプターを発現するように、遺伝子学的に修飾し得る。表皮細胞は、当分野で既知である慣用的な方法により、組織サンプルの成分分割、および興味ある部分集合の分離により、皮膚部分から採取される。修飾する細胞は、哺乳動物の宿主に導入する時、又は研究、あるいは、その他の目的に使用する時に、特定の機能が得られるように選ばれる。興味深いものはまた、上記した全ての細胞の前駆体として働く幹細胞であり、これは、元の前駆体またはすでに特定の系統を担っている前駆体細胞であり得る。修飾を受ける細胞は適当なドナーから採取される。一般的に、ドナーは、受容体に関して、例えば同種異型移植などの非自己由来である。しかしながら、ある場合においては、特に自己免疫疾患に関連するものにおいては、ドナーは自己由来である。細胞は、マウスおよびその他のネズミ、ウサギ、豚、ネコ、ウシ、イヌ、霊長類等、特にヒトを含む、あらゆる哺乳動物宿主から得ることができる。採取の方法は細胞の性質により異なる。造血細胞は、胎児、新生児、又は成人（ヒトを含む哺乳動物における）であり得、胎肝臓、骨髄、リンパ系組織または血液、特に、例えば当分野で知られているようなＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ等の前駆細胞起動剤で処理した末梢血から集められる。造血細胞の興味深い部分集合への分割は、水簸、密度分割、ロイコフォレシス、フローサイトメーター、高又は低勾配磁気分割等を含む、当分野で知られている数多くの技術により行い得る。特に興味深いものは基底層由来の角質幹細胞である。正常筋芽細胞は、胎児、新生児、または成人（ヒトを含む哺乳動物における）の組織を含む組織サンプルから得られる。手足、体幹および外眼筋などの様々な筋肉を使用し得る。細胞は、遺伝子学的に修飾する前に分離し得る。採取後、ウイルス由来ＭＨＣダウンレギュレーション遺伝子の発現を提供するＤＮＡ又はＲＮＡ構築物を、核酸を導入する標準的な方法を用いて、細胞に導入する。このような組み換え構築物は、前述したように、少なくとも１つのダウンレギュレーション遺伝子を含む。多くの場合、相加効果又は相乗効果を得るために、複数のダウンレギュレーションタンパク質を、特に異なる作用機序をもつタンパク質を組み合わせて導入することが望ましい。興味深い組み合わせは、配列番号３と組み合わせた配列番号１または配列番号２；配列番号４と組み合わせた配列番号１または配列番号２；配列番号５と組み合わせた配列番号１または配列番号２；配列番号４と組み合わせた配列番号３；配列番号５と組み合わせた配列番号３；配列番号５と組み合わせた配列番号４等を含む。組み合わせた配列は、単一のベクター上に存在するか、または、順次または共に細胞内に導入した別々のベクターに導入し得る。ダウンレギュレーション遺伝子または遺伝子の組み合わせの発現は、好ましくは、非修飾の細胞に比べて、少なくとも約７０％、通常は少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、表面ＭＨＣクラスＩ分子のレベルを減少させる。発現のレベルは細胞の活性化状態により影響され、静止細胞は活性化細胞に比べると減少したＭＨＣ分子を有し得る。ＭＨＣ分子の表面発現の検出および定量は、当分野で知られているように、標準イムノアッセイ、抗体染色およびフローサイトメーターにより行い得る。ある場合においては、１つの遺伝子よりも２つ以上のクラスＩ阻害遺伝子の組み合わせを用いる方が、ＨＬＡクラスＩを大いに減少させることが可能となる。結果として、同種異型細胞は、クラスＩ反応性ＣＴＬに対して、より抵抗性を示し、免疫拒絶に対して、より抵抗性を有するため、同種受容体への移殖時に、より長く生存し得る。様々なクラスＩ阻害遺伝子が、ＨＬＡクラスＩ発現を減少する別個の機構を使用している。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のＵＳ１１は、小胞体からサイトゾルへのＨＬＡクラスＩ重鎖の転位を生ぜしめ、ここで重鎖は急速に分解される（Wiertz(1996)Cell84:769;Jones(1995)J.Virol. 69:4830）。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のＩＣＰ４７は、ＴＡＰペプチド輸送複合体に結合し、重鎖結合ペプチドのサイトゾルから小胞体への転座を遮断し、かくして、重鎖−ペプチド−β₂ミクログロブリン３量体複合体の形成および輸送を防ぐ。結果として、クラスＩ重鎖は、安定な複合体を形成せず、小 rk et al.(1994)）。アデノウイルス２型および５型のＥ３／１９タンパク質は、小胞体に存在し、クラスＩＨＬＡ重鎖の内腔ドメインに結合し、かくして、これ ancer Res.52:151;Wold(1989)Mol.Biol.Med.6:433;Wold(1991)Life Sci.Adv.10: 89;Wold(1991)Virol.184:1）。ＨＬＡクラスＩの阻害機構が異なる結果、２つの遺伝子の同時発現はクラスＩ減少に対して複合的な効果を示し得る。使用する構築物は、通常、クラスＩ阻害遺伝子を有するＤＮＡが融合されている細胞を、組み換え構築物を融合していない細胞から選別することを可能とするマーカーを含有している。様々なマーカー、特にＧ４１８、ハイグロマイシン等に抵抗性を有する抗生物質耐性マーカーが存在する。別に、マーカーがＨＳＶ− ｔｋ遺伝子である場合、負の淘汰を使用し得、これにより、細胞はアシクロビアおよびガンシクロビアなどの薬剤に対して感受性をもつようになる。構築物は様々な慣用的な方法で製造し得る。現在、数多くのベクターが入手可能であり、これは、長い末端反復配列、マーカー遺伝子、および制限部位などの望ましい特徴を付与する。適当なプラスミド中にベクターを導入し、適当な転写および翻訳開始および終結領域を用いて望ましい遺伝子を制限、挿入することにより、ベクターを操作し、次いで、適当なパッケージング宿主にプラスミドを導入する。各操作において、適当な原核宿主内でプラスミドを増殖させ、望む構築物が得られたことを確認するために構築物を分析し、次いで、構築物を続いて操作する。完了すれば、次いで、遺伝子学的修飾において使用するウイルス粒子をパッケーングし単離するために、プラスミド又は切り出しウイルスをパッケージング宿主に導入し得る。組換え構築物は、構築物の調製、増幅、宿主細胞の形質転換などに使用し得るダウンレギュレーション配列以外の機能体を含むように更に修飾され得る。ダウンレギュレーション遺伝子の挿入において有益な構築物には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターが含まれる。レトロウイルスベクターに関しては、レトロウイルスおよび適当なパッケージング系（ここで、カプシドタンパク質はヒト細胞を感染する機能を有する）の組み合わせが、本発明に適当であり得る。ＰＡ１２（Miller et al.(1985)M ol.Cell.Biol .5:431-437）；ＰＡ３１７（Miller et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6 :2895-2902）；およびＣＲＩＰ（Danos et al.(1988)PNAS85:6460-6464）などの、様々な両種指向性ウイルス産生細胞系が知られている。特に興味深いものとしては、一次ヒトＴリンパ球の形質導入のｋａｔレトロウイルスシステムがある（ Finer et al.(1994)Blood83:43-50およびＷＯ９４／２９４３８）。ダウンレギュレーション遺伝子の転写は、レトロウイルスＬＴＲ、または例えば哺乳動物のホスホグリセリン酸キナーゼなどの内部プロモーター、βアクチンプロモーター、または例えばＳＲ−αプロモーターなどのハイブリッドＳＶ４０／ＨＴＬＶ−１プロモーターから制御し得る（Takebe et al.(1988)Mol.and Cel l.Biol .8:466）。複数のダウンレギュレーション遺伝子を含むか、又は、選択可能なマーカーなどの他の遺伝子をも含むレトロウイルスベクターは、マルチシストロン性メッセンジャーＲＮＡを発現するレトロウイルスを調製することにより構築され得る。これらのマルチシストロン性ｍＲＮＡは、１つのＲＮＡ分子から１つ以上のタンパク質を有効に翻訳できる細胞内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳエレメント）を含む。ＩＲＥＳエレメントは、例えば、ポリオウイルス、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）および関連ウイルスなどのピコナウイルス（Pelletier およびSonenberg(1988)Nature334:320-325;Jang et.al(1989)J.Virol.63:1651-1 660;Ghatta et al.(1991)Mol.Cell.Biol.11:5848-5859）、またはその他のウイルス性又は細胞性遺伝子におけるその機能的等価体から誘導し得る。２つ以上のダウンレギュレーション遺伝子を含むレトロウイルスは、例えば、造血幹細胞およびその他の一次リンパ球細胞などの、形質導入しにくい細胞において、クラスＩ分子の発現を減少させるのに特に有効である。ＩＲＥＳエレメントはまた、例えば新規ホルモンレセプター、サイトカイン、サイトカインレセプター、細胞生存遺伝子、および自滅遺伝子などの、追加的なタンパク質を発現するレトロウイルスを構築するのに用い得る。アデノウイルスベクターに関しては、例えば、Wang et al.(1995)Gene Therapy2:775-783に記載されているような、当分野で良く知られている方法を使用し得る。複数のダウンレギュレーション遺伝子は、当分野で良く知られている技術により、単一のダウンレギュレーション遺伝子をコードするレトロウイルスを用いて、標的細胞に続けて形質導入することにより、標的細胞に導入され得る。別法として、２つ以上のダウンレギュレーション遺伝子は、標的細胞の表面にある異なるレセプターと相互作用するエンベロープタンパク質を含むウイルスにパッケージした組換えレトロウイルスベクターを用いて、標的細胞を同時に形質導入することにより、標的細胞に導入され得る。例えば、ＵＳ１１をコードしている構築物は、両種指向性エンベロープタンパク質を含むウイルスにパッケージされ、そしてＡｄ２Ｅ３／Ｅ１９をコードする構築物はテナガザル白血球ウイルスエンベロープタンパク質を含むウイルスにパッケージされ得る（米国特許５,４７０, ７２６号）。細胞の形質導入は、培養培地で少なくとも２４時間、細胞およびウイルスをインキュベートすることにより行い得る。次いで、細胞は、少なくとも約２週間、培養培地で生育させ、移植前に少なくとも約５週間またはそれ以上、生育させることができる。ＤＮＡ構築物の導入後、次いで、望ましい発現型を示す細胞は、制限解析、電気泳動、サザンブロット解析、ポリメラーゼ鎖反応、ドナーＭＨＣクラスＩα鎖またはβ₂ミクログロブリンに特異的な抗体を用いた染色、またはその他により、さらに解析し得る。次いで、得られた細胞をスクリーニングして、実質的に全くクラスＩＭＨＣ抗原が表面に発現されていないことを確認する。必要であれば、例えばフローサイトメーター、高勾配磁気分離等の選択法を使用して、低いＭＨＣクラスＩ発現をする細胞を増殖し得る。分離のマーカーとして、様々な種類の蛍光または磁気的に標識した分子が使用でき、これは、標識として、ＭＨＣ抗原を同定する細胞マーカーに特異的な抗体に結合させ得る。入手できる蛍光マーカーには、表面マーカー用の、フルオレセイン、テキサスレッド、フィコビリタンパク質、アロフィコシアニン、シアニン誘導体、ローダミン、およびタンデムコンジュゲートが含まれる。次いで、細胞は、増殖するために適当な栄養培地で生育し、様々な方法で使用し得る。細胞は、移植に使用し、現存する組織の一部となし、または、成育させて非同系宿主への移植用の組織となすことができる。例えば、角質細胞については、火傷の場合に細胞を皮膚の代わりに使用でき、その場合、角質細胞は適用前に成育させて連続膜を形成せしめる。同様に、角質細胞は、形成外科の場合に、宿主から取り去った皮膚を他の部位で置き換えて使用され得る。角質細胞の他の用途には褥瘡性潰瘍における移植が含まれる。ランゲルハンス島の場合は、細胞は、成長させて爽膜とするか、又はインシュリンの産生のために宿主に挿入し得る。網膜上皮細胞の場合は、黄斑変性症などの視覚障害を処置するために目の網膜下の部分に注入し得る。免疫細胞の場合は、免疫不全を処置するために、血流またはどこにでも注入し得る。筋芽細胞の場合は、デュシュンヌ型筋ジストロフィーなどの筋肉症消耗性疾患を処置するために様々な部位に注入し得る。器官移植については、心臓または肝臓の異種移植片などの非同系組織の移植は、関連した種の間で行い得る。遺伝子学的に修飾されたドナー細胞を移植に、特にリンパ球細胞および造血幹細胞の移植に使用する上での１つの障害は、in vitroにおいてこれらの細胞の有効な形質導入を得ることが困難であるということである。形質導入をする間、組織培養プレートのコーティングとして接着分子および接着分子の抗体を使用することで、レトロウイルスの形質導入の有効性が上昇する（共出願中の米国特許出願０８／５１７,４８８記載）。幹細胞については、接着分子は、フィブロネクチンまたはフィブロネクチンのＣＳ−１ドメインであり得る。ＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＣＤ２９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ４４に対する抗体もまた、使用し得る。Ｔ細胞ついては、ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−３接着分子、またはＣＤ２またはＬＦＡ−１に対する抗体もまた、使用し得る。Ｂ細胞については、ｇｐ３９分子またはＣＤ４０に対する抗体を使用し得る。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはＡＡＶベクターもまた、移植細胞において治療タンパク質を導入するのに用いられ、タンパク質は細胞内にとどまるか、または分泌される。タンパク質の産生は、例えばＧ−、Ｍ− 、およびＧＭ−ＣＳＦなどの成長因子、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、悪性化増殖因子等；例えばインターロイキンなどのリンホカイン；例えばＡＣＴＨ、ソマトメジン、インシュリン、アンギオテンシン等などのホルモン、第ＶＩＩＩＣ因子などの血液凝固因子；アデノシンデアミナーゼなどの遺伝病に関連する正常のタンパク質、又は嚢胞性繊維症に関連するタンパク質；例えばα１−アンチトリプシンなどの保護剤；Ｌ−ドーパミンの産生のためのチロシンヒドロキシラーゼの発現といったアミノ酸遊離生成物の産生に関連する調節タンパク質又は酵素等を含み得る。遺伝子は、構成プロモーターまたは誘導プロモーターの転写制御下にあり得る（エンハンサーの配列を含む）。後者の場合、調節は、自然発生シグナルによる誘導により生じ得るか、または外来シグナルの宿主への導入の結果として生じ得る。治療タンパク質に加えて、ドナー細胞を疾病または機能不全細胞を標的とするように、又はエフェクター機能を亢進するように指向せしめるタンパク質をコードする遺伝子が、ドナー細胞に導入するために、ベクター上に、または別々のベクター上に含まれ得る。細胞の、関連治療法および疾患の性質に依存して、細胞は、特定の部位で維持するために容器に入れた薄層として、または不活性マトリックス中またはマトリックスとは無関係に注入した固形塊として使用され得る。投与する細胞数は、細胞を投与する特定の適用及び方法に依存して幅広く変化し得る。投与は、適当な部位における、注射、局所適用、または切断および配置により行い得る。修飾された細胞で使用する免疫抑制療法のレベルは、非修飾の細胞での同等処理において通常使用されるよりも、実質的により厳密ではない。修飾細胞の維持に必要とされる免疫抑制の量は、最小の組織免疫適合遺伝子座でのドナーおよび受容細胞間での適合性、宿主免疫系の活性化レベル、細胞の導入法、外来細胞を導入した特定部位、移植細胞の型および数に依存して幅広く変化する。使用し得る方法は、同種異型組織の移植に関する現存の治療法を基礎とする。それに基づいて、異なる状態および異なる患者における、用量レベル、投与の頻度、投与および処方の方法を確立する。本発明は免疫抑制の副作用の減少をもたらし、この減少は低用量、投与回数の減少、薬剤の投与開始の遅延、またはそれらの組み合わせの結果である。免疫抑制療法は、移植片を拒絶開始時又は好ましくはそれ以下の状態に維持するために、移植および／または免疫系をモニターし、免疫抑制剤の投与を調節することにより拒絶の開始を防ぐために、持続することができる。免疫抑制療法は、多くの形をとり得、それらの形の組み合わせであり得る。免疫抑制療法には、照射、化学療法、特異的免疫抑制剤等が含まれる。特に興味深いのは、例えばシクロスポリンＡ、シクロスポリンＧおよびＦＫ−５０６などの免疫抑制剤；アザチオプリン、例えばプレドニゾロンおよびメチルプレドニゾロンなどのコルチコステロイド、リンパ球および／又は骨髄系等の様々な表面膜タンパク質に対するモノクローナル抗体である。投与開始レベルとして通常使用されるものと同等か、または幾分少ないレベルの免疫抑制を始めに使用し、次いで、投与のレベルを元のレベルの７５％以下、好ましくは元のレベルの約６０％以下に、急速に減少させる。５０％またはそれ以下が頻繁に使用され得る。以下の実施例は、説明するためのものであって、制限するためのものではない。実験実施例１ＭＨＣダウンレギュレーション遺伝子発現ベクターの構築ＵＳ５およびＵＳ１１ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）遺伝子の単離。本実施例は、ＵＳ１１遺伝子をコードするｐＴＵＳ１１.４Ｎの構築について記載する。１０⁷個のヒト繊維芽細胞をＨＣＭＶのＴｏｗｎｅ株で感染させた。３日後、細胞変性効果が１００％である時に、ウイルスを高速遠心により培養上澄みから集め、次いで、−７０℃で凍結させた。ウイルスＤＮＡを標準的な方法で凍結ウイルスから単離した。単離したウイルスＤＮＡを製造業者の指示に従って、Ｔａｑポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させた。オリゴヌクレオチドを設計し、ＵＳ５（配列番号５）およびＵＳ１１（配列番号４）リーディングフレームを特異的に増幅させるように作成した。ＵＳ５５のプライマーは以下の通りである：（配列番号６）５'ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＡＣＡＣＡＡＣＧＧＧＣＣ３'；（配列番号７）５'ＴＣＣＴＡＧＣＣＡＣＣＧＧＴＴＧＴＴＡ３'。ＵＳ１１のプライマーは以下の通りである：（配列番号８）５'ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＣＴＴＧＴＡＡＴＧＣ３'；（配列番号９）５'ＴＣＡＧＴＣＴＡＴＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＧＧ３'。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ産物を分取アガロースゲル（０.８％アガロース、１×ＴＡＥ緩衝液）上で電気泳動を行った。６４８および３８１ｂｐのバンドを切り取り、２回フェノールクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させ、１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡで再懸濁した。単離したフラグメントをＰＣＲＩＩクローニングベクターに連結させた（Invitrogen、製造業者の指示に従う）。コンピテントＥ.ｃｏｌｉＯｎｅＳｈｏｔ^TM（Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア）を連結ベクターを用いて形質転換した。形質転換体をアンピシリン存在下で成育させることにより選択した。正しい挿入物含有の形質転換体は、適当なプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、続いて、増幅産物をゲル電気泳動し、適当なサイズのバンドを検知することにより同定した。次いで、正しいＤＮＡ配列を含むプラスミドを精製した。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ＩＣＰ４７遺伝子の単離。本実施例は、ＩＣＰ４７遺伝子をコードするｐＩＣＰ４７の構築について記載する。１０⁷個のＶｅｒｏ細胞を０.０１の感染多重度（ＭＯＩ）でＨＳＶ−１を用いて感染させた。４日後、ウイルスを高速遠心により培養物から取得し、次いで− ７０℃で凍結させた。ウイルスＤＮＡを標準的な方法により凍結ウイルスから単離した。ＩＣＰ４７遺伝子を、（配列番号３，１−２０）および（配列番号３，２４７−２６７）に対応するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。増幅産物を上記したようにｐＣＲＩＩベクターに連結させた。アデノウイルス２型（Ａｄ２）Ｅ３／１９ＫＤ遺伝子の単離。本実施例は、アデノウイルス２由来のＥ３／１９遺伝子をコードするｐＣＲＩＩ.Ａｄ２.Ｅ３／１９の構築について記載する。Ａｄ２のＥ３転写単位を含むＥｃｏＲＶＣフラグメントを、Korner et al.( 1992)P.N.A.S.89:11857-11861で記載されているように、クローン化した。Ｅ３遺伝子を、完全なＥ３／１９ｋｄ遺伝子の側面に位置するオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによりプラスミドから増幅した。増幅産物を上記したように、ｐＣＲＩＩベクターに連結させた。アデノウイルス５型（Ａｄ５）Ｅ３／１９ＫＤ遺伝子の単離。本実施例は、アテノウイルス５由来のＥ３／１９遺伝子をコードする、ｐＣＲ３.Ａｄ５Ｅ３／１９の構築を記載している。遺伝子をWold et al.(1985)J.Biol.Chem.260:2424-2431に記載されているように単離し、ｐＣＲ３−Ｕｎｉベクター（Invitrogen）にクローン化した。レトロウイルスベクターの構築およびウイルスの産生。Finer et al.(1994)Bl ood 83:43に記載されているのと同様の、レトロウイルスベクターおよびパッケージング細胞系を用いる。配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；および配列番号５をコードするＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することによりプラスミドから切り出し、分取ゲル電気泳動により精製した。精製したＤＮＡフラグメントをレトロウイルスベクターｒｋａｔ２（上記Finer et al.）に連結させる。レトロウイルスベクターに挿入したダウンレギュレーション遺伝子を含む組換えプラスミドは、適当なプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、続いて、増幅産物をゲル電気泳動し、適当なサイズのバンドを同定することにより、同定する。ダウンレギュレーション遺伝子を含む組換えプラスミドは、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、J.Sambroo k、E.F.Fritsch、T.Maniatis監修、CSHL、Cold Spring Harbor、NY、1989に記載されているように調製する。ヒトＴリンパ球の精製、刺激および培養。Ｔ細胞を適当な免疫適合ヒトドナー由来の末梢血のサンプルから単離する。単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）密度勾配遠心機（２０℃、６００ｇで２０分間）により単離する。遠心後、間期の細胞を集め、緩衝液中に再び懸濁し、３００×ｇで遠心し、次いで、もう一度緩衝液に再び懸濁し、２００×ｇで遠心して、血小板を除去した。ポリクローナルマウスアンチＣＤ８又はアンチＣＤ４を細胞懸濁液に加え、１５分間、氷上でインキュベートする。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合アンチマウス抗体を細胞に加えた。細胞をインキュベートし、洗浄し、ＣＤ８陽性およびＣＤ４陽性細胞について、フローサイトメーターにより分離する。精製されたＴ細胞をインターロイキン２、およびLamers et al.(1992 )Int.J.Cancer51:973-979、およびRiddelおよびGreenberg(1990)J.Immunologica l Methods 128:189-201に記載されているように、アンチＣＤ３などのＴ細胞レセプター／ＣＤ３複合体と反応性を示す抗体を用いてin vitroで培養する。レトロウイルス仲介遺伝子転移。５日間培養した後、レトロウイルスを１−１０ＭＯＩで、２−８μｇ／ｍｌのポリブレンと共に細胞に加える。ウイルスの１〜３の一定量を２−３日間に１日置きに加える。続いて、細胞を洗浄し、次いでＩＬ−２の存在下で再培養する。幾日かの形質導入の間に、Ｔ細胞を形質導入の発現に関して解析し、発現細胞を非発現細胞から分離する。細胞は、受容体特異的、またはドナー特異的アンチクラスＩＭＨＣモノクローナル抗体を用いて、細胞表面クラスＩＭＨＣ分子の発現について染色する。遺伝子発現、クラスＩ欠失形質導入細胞を、蛍光活性セルソーターにより非発現形質導入細胞から分離する。形質導入遺伝子の存在の確認は、ウイルス由来遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅することにより行う。ダウンレギュレーション遺伝子の組み合わせ。次いで、上記で調製したＴ細胞を、ウイルス感染と同じ方法を用いて、第２番目のダウンレギュレーション遺伝子を用いて形質導入する。実施例２同種異型造血幹細胞の移植本実施例は、表面上においてクラスＩＭＨＣ分子をダウンレギュレートするように遺伝子学的に修飾した同種異型造血幹細胞のヒト受容体に移植するプロトコール提供する。ドナーに、５μｇ／ｋｇ／日の用量でＧＭ−ＣＳＦを皮下投与する。起動後の６、８及び９日目に、末梢血を採取する。ロイコフォレシスを、９リットル、３時間の処理を行うことにより、末梢血単核細胞を集める（L.Campos、et al(1993 )Leukemia7:1409-15;A.Grigg、et al.(1993)Bone Marrow Transplant11、Supp1. 2:23-9参照）。トランスフェクションさせた日に、ＣＤ３４⁺細胞をＣｅｌｌＰｒｏＬＣ３４アフィニティーカラム（CellPro、Bothell、WA）を用いて単離する。回収した細胞を、１００ｎｇ／ｍｌｈｕＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌｈｕＩＬ− ３、１０ｎｇ／ｍｌｈｕＩＬ−６および１０^-6Ｍヒドロコルチゾンを含むＭｙｅｌｏｃｕｔＨ５１００培地（Stem Cell Technologies Inc.、バンクーバー、ブリティシュコロンビア）で、『前刺激』のために４８時間培養する。ダウンレギュレーションを幹細胞を導入する形質導入法は、本質的に、実施例１に記載したのと同様である。形質導入後、細胞は、in vitroで、２９３細胞増殖を阻害するために、Ｍｙｅｌｏｃｕｔ培地で、１００ｎｇ／ｍｌｈｕＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌｈｕＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌｈｕＩＬ−６および１０μＭガンシクロビアを添加して、増殖分化させる。これらの２９３個の細胞は、チミジンキナーゼ遺伝子を用いてトランスフェクショさせているため、ガンシクロビア選択下では生存しない。トランスフェクションの約１０日後に、細胞を、商業的に入手できるＦＩＴＣ結合ポリクローナルアンチヒトβ₂ミクログロブリンを用いて染色することによりＭＨＣクラスＩ発現について、解析を行う。必要であれば、低いレベルの表面クラスＩ分子をもつ細胞を選択するように細胞を分離する。受容体に、１０⁶細胞／ｍｌを１０ｃｃ／分の速度で静脈注射した遺伝子学的に修飾された細胞を投与する。上記の結果に従って、宿主細胞障害性Ｔリンパ球またはＨＬＡクラス１特異抗体による免疫破壊に抵抗性を有するドナー細胞が提供される。遺伝子学的に細胞を修飾する方法は、移植された同種異型の細胞が受容体により拒絶される場合における、治療的移植に使用できる。当法はまた、宿主免疫系により細胞が攻撃されるような、自己免疫疾患に苦しむ患者の自己細胞を修飾するのに有益である。このようにして、細胞の数および／または機能の欠失から生じる幅広い範囲の疾病は、導入された細胞が、生存し、増殖し、機能して、処置される。動物細胞は、本法により遺伝子学的に修飾され、そして、移植用の組織および細胞の源として、移植治療法のモデルとして、および実験的に薬物の効果を試験するために、使用される。実施例３レトロウイルスベクターの産生本実施例は、ダウンレギュレーション遺伝子を含むレトロウイルスベクターの構築、および宿主細胞における形質導入で使用する組換えレトロウイルスの産生について記載する。表１は、実施例１に記載したプラスミドから産生されたレトロウイルスベクターを示す。産生されたこれらのレトロウイルスは、ダウンレギュレーション遺伝子のみ（モノシストロン性レトロウイルスベクター）、または、宿主細胞の形質導入のマーカーとしての、他の遺伝子であるＣＤ４／ζ遺伝子と組み合わせたダウンレギュレーション遺伝子（ビシストロン性レトロウイルスベクター）のいずれかをコードする。Ａ．モノシストロン性レトロウイルスベクター。モノシストロン性ベクターを、クローン化したウイルス遺伝子をｐＲＴ４３.２６７ベクターに挿入することにより構築した。このレトロウイルスプラスミドは、５'から３'の方向に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の極めて初期のエンハンサー／プロモーター領域、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）Ｒ／Ｕ５領域、スプライスドナー部位、モロニーマウス白血球ウイルス（ＭＭＬＶ）ｇａｇ遺伝子の一部、ＭＭＬＶスプライス受容体、下記のポリリンカー、およびＭＭＬＶ３'ＬＴＲを含む。実施例１に記載したプラスミド由来のＵＳ１１およびＩＣＰ４７遺伝子を含む配列を、下記の例ＣおよびＧで記載したようなポリリンカーに挿入した。レトロウイルスベクターｐＲＴ４３.２６７を以下の段階に従ってｐＲＴ４３. ２Ｆ３（ＷＯ９４／２９３４８に記載）から誘導した：ｐＲＴ４３.２Ｆ３をＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩで消化し、ベクターフラグメントを単離した。ＢａｍＨＩ部位、ＮｏｔＩ部位およびＳａｌＩ部位を含むオリゴヌクレオチドをベクターフラグメント上のＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩの間のベクターフラグメントに連結させた。Ｂ．ビシストロン性レトロウイルスベクター。ビシストロン性ベクターを、クローン化したウイルス遺伝子をｐＲＴ４３.２６７ＴＮＦｇｓｉｇ．ｉｃ.に挿入することにより構築した。このレトロウイルスプラスミドは、５'から３'の方向に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の極めて初期のエンハンサー／プロモーター領域、ＭＭＳＶＲ／Ｕ５領域、スプライスドナー部位、ＭＭＬＶｇａｇ遺伝子の一部、ＭＭＬＶスプライス受容体、下記のポリリンカー、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）ＩＲＥＳエレメント、ＣＤ４ζ遺伝子およびＭＭＬＶ３'ＬＴＲを含む。実施例１に記載した、プラスミド由来のＵＳ１１、ＩＣＰ４７、Ａｄ２Ｅ３／１９およびＡｄ５Ｅ３／１９遺伝子を含む配列を、例Ｄ、Ｅ、ＦおよびＨで記載したポリリンカーに挿入し、ダウンレギュレーション遺伝子およびＣＤ４ ζ遺伝子の両方をコードするビシストロン性ベクターを作成した。レトロウイルスベクターｐＲＴ４３.２６７ｇｓｉｇ．ｉｃは、以下のように変化させてｐＲＴ４３.２Ｆ３から誘導した：ＥＭＣＶ由来ＩＲＥＳエレメント（Ｇｅｎｂａｎｋ遺伝子座ＥＶＣＧＡＡの２８６−８７１残基、受け入れ番号Ｘ７４３１２）を、ｐＲＴ４３.２Ｆ３中のＣＤ４ζ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの５'のすぐ近くに挿入した。ＡＴＧ開始コドンの上流にある、ＣＤ４ζ遺伝子の５'未翻訳部分の１０２ｂｐを削除した。ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩの認識部位を含むポリリンカー配列をＩＲＥＳエレメントの５'に挿入した。ｐＲＴ４３.２Ｆ３におけるこれらの変化は、当分野で良く知られている技術を用いてなされた。Ｃ．ｐＲＴ.ＵＳ１１の構築。ｐＵＳ１１をＥｃｏＲＩで消化し、６８２塩基対のＵＳ１１挿入物をゲル電気泳動により単離した。ｐＲＴ４３.２６７レトロウイルスベクターをＥｃｏＲＩで消化し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理し、ゲル電気泳動により精製した。ＵＳ１１挿入物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてベクターに連結させた。連結混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換させ、細胞をアンピシリン入りのＬＢプレート上に置き、正しい方向の挿入物のコロニーをスクリーニングした。Ｄ．ｐＣＤ４.ＵＳ１１の構築。ＵＳ１１挿入物を上記のように単離した。ｐＲＴ４３.２６７ＴＮＦｇｓｉｇ.ｉｃレトロウイルスベクターを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、９１４３ｂｐベクターを調製した。９１４３ｂｐのベクターフラグメントを、ゲル電気泳動により精製し、ＵＳ１１挿入物に連結させた。組換ベクターを上記のように単離した。Ｅ．ｐＣＤ４.Ａｄ２Ｅ３／１９の構築。ｐＣＲＩＩ.Ａｄ.Ｅ３／Ｅ１９をＳｐｅＩで消化し、ＫｌｅｎｏｗｐｏｌＩで処理し、次いで、ＮｏｔＩで消化して、Ａｄ２.Ｅ３／Ｅ１８を含む５５３ｂｐのフラグメントを精製した。９１４３ｂｐベクターフラグメントを上記のように、ｐＲＴ４３.２６７ＴＮＦｇｓｉｇ.ｉｃから調製し、次いで、Ａｄ２.Ｅ３／１９遺伝子フラグメントに連結させた。組換えベクターを上記のように単離した。Ｆ．ｐＣＤ４.Ａｄ４.Ａｄ５Ｅ３／１９の構築。ｐＣＲ３.Ａｄ５.Ｅ３／１９を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、Ａｄ５Ｅ３／Ｅ１９遺伝子を含む５５１ｂｐのフラグメントを調製した。５５１ｂｐのフラグメントを、ｐＲＴ４３.２６７ＴＮＦｇＳｉｇ.ｉｃのＮｏｔＩおよびＳａｌＩ消化により調製した９１４３ｂｐのベクターフラグメントに連結させ、組換えレトロウイルスベクターを単離した。Ｇ．ｐＲＴ.ＩＣＰ４７.の構築。ｐＩＣＰ４７をＥｃｏＲＩで消化し、ＩＣＰ４７遺伝子を含む２９３ｂｐのフラグメントを精製した。次いで、このフラグメントをＥｃｏＲＩで消化しておいたｐＲＴ４３.２６７に連結させた。組換えレトロウイルスベクターを上記のようにして調製した。Ｈ．ｐＣＤ４.ＩＣＰ４７の構築。ｐＩＣＰ４７を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで、ＫｌｅｎｏｗｐｏｌＩで処理した。追加してＮｏｔＩで消化した後、ＩＣＰ４７遺伝子を含む３６８ｂｐフラグメントを精製した。このフラグメントを、ｐＲＴ４３.２６７ＴＮＦｇｓｉｇ．ｉｃから調製した９１４３ｂｐのベクターフラグメントに連結させ、組換えレトロウイルスベクターを単離した。組換えレトロウイルスを産生するために、上記したレトロウイルスベクターをｐＩＫ６.１ＭＣＶａｍｐａｃプラスミド（これは、ＷＯ９４／２９４３８に記載のｇａｇ−ｐｏｌ−両種指向性ｅｎｖをコードする）と共に、ＴＳＡ２０１２９３細胞（Heinzel et al.(1988)J.Virol.62(10):3738-3746）に、共トランスフェクトさせた。細胞培養上澄みを含むレトロウイルスを４８時間後に回収し、濾過し、等分し、凍結させた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞のタイターを測定し、約１×１０⁶ −１×１０⁷／ｍｌであった。実施例４ＵＳ１１は、いくつかの異なるヒト細胞型におけるクラスＩ複対立遺伝子の発現を阻害する本実施例は、ＨＣＭＶＵＳ１１ダウンレギュレーション遺伝子を含むレトロウイルスベクターをもつ様々な異なるヒト細胞型の形質導入、およびＵＳ１１遺伝子の発現時にこれらの細胞におけるＨＬＡクラスＩ発現の減少について記載する。Ａ．ＵＳ１１をコードするビシストロン性レトロウイルスは、ＨＬＡ発現を阻害する細胞を、ＨＣＭＶＵＳ１１およびＣＤ４／ζをコードする実施例３に記載のビシストロン性（ＩＲＥＳを含む）レトロウイルスで形質導入した。以下の細胞を形質導入した：１４３Ｂ（ヒト骨肉腫細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−８３０３）；Ｒａｊｉヒトバーキットリンパ腫細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−８６、J.Natl.Cance r Inst .34:231、1965）；ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞白血球細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ−１５２、J.Immunol.133:123-128、1984）；およびＣＤ８⁺／ＣＤ４^- ＩＬ− ２−依存性正常ヒトＴ細胞（ＳＪ２７指向）、これらは、上記のFiner er al.およびMorecki et al.(1991)Cancer Immunol.Immother.32:342に記載のように誘導した。培養上澄み液の形のレトロウイルスを、ポリブレン（２−２．５μｇ／ｍｌ）の存在下で細胞に加えた。典型的には、ウイルス０．７５ｍｌ（非希釈または約１：４に希釈）を１×１０⁶個の細胞に加えた。一晩、３７℃で感染させた。ある場合においては、形質導入した細胞の数を増やすために、１日置きに２つの新鮮なウイルスを追加した。対照として、細胞を、ＣＤ４／ζのみをコードしているレトロウイルスで形質導入させた。形質導入の４日以上後に、細胞をＨＬＡクラスＩおよびＣＤ４／ζについて、２色の免疫蛍光により染色し、フローサイトメーターにより解析した。ＨＬＡクラスＩを検知するために使用した抗体は、ＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＣクラスＩ分子上の同一構造の決定基と反応する（J.Immuno l .(1982)128:129-135;Cell(1979)14:9-20）。形質導入した細胞のパーセンテージは細胞表面のＣＤ４発現を検知することにより決定し、ＨＬＡクラスＩ表面染色強度を非形質転換細胞（ＣＤ４／ζ陰性部分母集団）のものと比較した。結果を下の表２に示す。表２に示されているように、ＨＬＡクラスＩ発現における減少は、１４３Ｂ骨肉腫細胞およびＲａｊｉＢ細胞において最も高く、ＪｕｒｋａｔＴ細胞およびＳＪ２７正常Ｔ細胞において最も低かった（それぞれ４０倍および１４倍の増加対それぞれ３.５倍および１.８倍の増加）。加えて、ＣＤ４／ζ発現はまた、ＨＬＡクラスＩ発現が最も大きく減少したこれらの細胞系（１４３Ｂおよびｒａｊｉ）において、最も強く、ＨＬＡクラスＩ発現（ＪｕｒｋａｔおよびＳＪ２７Ｔ細胞）が最も低い減少であった細胞において最も弱かった。ＵＳ１１およびＣＤ４／ζはビシストロン性メッセージから発現されているので、ＣＤ４／ζ発現のレベルは、ＵＳ１１発現レベルの間接的な指標として使用された。それ故、ＨＬＡＩ発現の減少は、直接、ＵＳ１１の発現推定レベルと関連する。Ｔ細胞系における弱い発現の理由は分かっていない。本実施例は、ＵＳ１１が効率的に発現されたときに、様々な細胞型においてＭＨＣクラスＩ発現を阻害するのに効果的である。Ｂ．ＵＳ１１をコードするモノシストロン性レトロウイルスはＨＬＡ発現を阻害する本実施例は、ＵＳ１１のみをコードするレトロウイルスもまた、ＩＲＥＳエレメントおよびＣＤ４ζ遺伝子の発現の非存在下において、宿主細胞に形質転換されたときＨＬＡの発現を阻害することができることを示している。１４３Ｂ骨肉腫細胞を、ＵＳ１１のみをコードするレトロウイルスベクターで形質転換させた。培養の４時間後またはそれ以上後に細胞を採取し、上記した非多型性ＨＬＡクラスＩ決定基と反応するＷ６／３２クラスＩ特異的ｍＡｂを用いて、免疫蛍光法およびフローサイトメーターによりクラスＩ表面レベルを測定した。図１に示したように、細胞の１７％が、非形質導入１４３Ｂ細胞により発現されたもの又はＣＤ４／ζのみをコードする単一の遺伝子レトロウイルスベクターで形質転換した１４３Ｂ細胞により発現されたものよりも３０倍少ないレベルで、ＨＬＡクラスＩを発現した。実施例５ＨＬＡ−Ａ２.１の発現および同種特異的ＣＴＬによる同種認識のＵＳ１１阻害本実施例は、ダウンレギュレーションＵＳ１１遺伝子で形質導入した細胞系の表面におけるＨＬＡ発現の減少が、これらの細胞は、ＨＬＡに特異的なＴ細胞の細胞障害性効果に対する抵抗性を起こすことを示す。Ｃ１Ｒ細胞は、全くＨＬＡ−Ａを発現しないＨＬＡ−Ａ(陰性)ヒトＢリンパ球芽細胞系（(Ｂ−ＬＣＬ)、ＡＴＣＣＣＲＬ−１９９３）、およびＨＬＡ−Ｂ３５(低い)およびＨＬＡ−Ｃｗ４(陽性)である（Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2361- 2364、1989;J.Immunol.148:1941、1992）。ＨＬＡ−Ａ２−特異的ヒト細胞障害性エフェクター細胞（ＣＴＬ）による溶菌に対して感受性を有する細胞を提供するために、Ｃ１Ｒ細胞をＨＬＡ−Ａ２.１遺伝子でトランスフェクトさせ、ＨＬＡ−Ａ２.１⁺系、Ｃ１Ｒ−Ａ２.１を得る（Hogan et al.(1988)J.Exp.Med.168:7 25）。図２に示しているように、Ｃ１Ｒ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２−特異的ＣＴＬによる溶菌に対して抵抗性を有すが、Ｃ１Ｒ−Ａ２.１細胞はＣＴＬによる溶菌に対して感受性があった。ＨＬＡ−Ａ２.１(陽性)Ｃ１Ｒトランスフェクタントを、ＨＣＭＶＵＳ１１およびＣＤ４／ζの両方をコードするビシストロン性（ＩＲＥＳエレメントを含む〕レトロウイルスベクターを用いて形質導入させた。細胞をＭＨＣクラスＩおよびＣＤ４分子について染色し、２色のＦＡＣＳにより解析した。図３に示されているように、大半の形質導入細胞（ＣＤ４⁺）は、非形質導入（ＣＤ４^-）細胞に比べて大変低いＭＨＣクラスＩを有することが分かった。ＣＤ４⁺細胞をクローン化し、３つのクローンを選択し、さらに解析した。フローサイトメーターで測定すると、全てのクローンが、大変低いレベルのＨＬＡクラスＩを有していた（図４）。加えて、クローン８は、検知できる細胞表面ＨＬＡ−Ａ２.１を全く有していないことが分かった。クローンを⁵¹Ｃｒで標識し、Ａ２.１−特異的ヒトＴ細胞エフェクターを用いて、４時間の細胞溶解性解析において標的として使用した。図５に示されているように、ＵＳ１１−形質導入Ｃ１Ｒ−Ａ２.１⁺クローンの溶菌は、非トランスフェクト、親（ＨＬＡ−Ａ２(陰性)）Ｃ１Ｒ細胞の溶菌のバックグラウンドレベルに等しかった。このように、ＵＳ１１は、ＨＬＡ−Ａ２ .１の発現を完全に抑制し、同種反応性ＣＴＬによる認識を遮断することが示された。形質導入されたレトロウイルスも、ＣＤ４／ζをコードしているので、ＣＤ４／ζ自体がＨＬＡ−Ａ２.１に対して効果を全く及ぼさないことを示すことは重要であった。実際、ＣＤ４／ζのレトロウイルスベクターで形質導入したＣ１Ｒ−Ａ２.１細胞は、ＨＬＡ−Ａ２.１において全く減少を示さず、ＣＴＬ溶菌に対して非形質導入Ｃ１Ｒ−Ａ２.１細胞と同じぐらい感受性を示した。実施例６ＨＬＡ−Ａ３発現および同種−特異的ＣＴＬによる認識のＵＳ１１阻害本実施例は、異なるＨＬＡ対立遺伝子の発現に対するＵＳ１１遺伝子の効果、およびＵＳ１１遺伝子を発現する細胞の、二番目のＨＬＡ対立遺伝子に特異的なエフェクターＴ細胞による特異的な細胞溶解性に対する抵抗性に関する効果を示す。ＨＬＡ−Ａ３−特異的ヒトＣＴＬ系は、照射したＨＬＡ−Ａ３(陽性)同種異型細胞を用いて、ＨＬＡ−Ａ３(陰性)末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を反復刺激することにより誘導される。以下の細胞を、同種異型刺激細胞として使用する：ＰＢＭＣ（２０００Ｒで照射）（Jelachich、J.Immunol.141:1108、1988）、ＨＬＡ −Ａ３(陽性)Ｃ１Ｒトランスフェクタント（１０,０００Ｒ）、Ｊｕｒｋａｔ（１０,０００Ｒ）、またはＲａｊｉ細胞（１０,０００Ｒ）。始めにこのＣＴＬ系を、親（ＨＬＡ−Ａ３(陰性)）Ｃ１Ｒ細胞ではなく、ＨＬＡ−Ａ３(陽性)Ｃ１Ｒトランスフェクタントを溶解する能力に関して試験する。次いで、ＨＬＡ−Ａ３(陽性)Ｃ１Ｒ細胞を、ＵＳ１１／ＣＤ４／ζビシストロン性レトロウイルスおよびＣＤ４／ζ⁺で形質導入し、ＨＬＡ−Ａ３(低い)細胞を精製し、ＨＬＡ−Ａ３反応性ＣＴＬの標的として使用する。ＵＳ１１−形質導入ＨＬＡ−Ａ３(低い)Ｃ１Ｒ細胞は、ＨＬＡ−Ａ３特異的ＣＴＬによりごく僅かに溶解されるか、または全く溶解されない。本実施例は、実施例５と組み合わせて、ＵＳ１１遺伝子が異なるＨＬＡクラスＩ対立遺伝子をダウンレギュレーションし得ることを示す。実施例７ＵＳ１１発現細胞は、クラスＩ特異的ＣＴＬ前駆体からＣＴＬエフェクターへの分化を刺激しない前述の実施例は、分化したＣＴＬエフェクター細胞が、ＵＳ１１形質導入ＨＬＡクラスＩ(弱い)またはクラスＩ(陰性)標的細胞を認識し得ないことを示した。移植の状況では、細胞を溶解しないＣＴＬ前駆体（ＣＴＬｐ）は、ドナー同種クラスＩ抗原を認識し、次いで、細胞溶解性ＣＴＬエフェクターへと分化する。ＣＴＬｐの分化は、『一方方向の』リンパ球混合培養（ＭＬＣ）又はリンパ球腫瘍混合培養（ＭＴＬＣ）の使用によりin vitroで示し得る。本実施例は、ＭＬＴＣ系を用いて、ＵＳ１１−形質導入ＨＬＡクラスＩ(弱い又は陰性)細胞が、クラスＩ特異的ＣＴＬｐのＣＴＬエフェクターへの分化を刺激し得ないことを示す。ＣＴＬｐを含むＨＬＡ−Ａ２．１(陰性)またはＨＬＡ−Ａ３(陰性)ヒトＰＢＭＣを、ＵＳ１１で形質導入した照射（２０００Ｒ）同種異型ＨＬＡ−Ａ２⁺又はＨＬＡ−Ａ３⁺リンパ球を用いて１：１の比で培養するか、またはＵＳ１１遺伝子で形質導入した照射（１０,０００Ｒ）刺激細胞系を用いて１０：１の比で培養する。これらの刺激細胞系は、ＨＬＡ−Ａ２.１⁺Ｃ１Ｒ細胞系、ＨＬＡ−Ａ２⁺ ＪＹ細胞系、又はＨＬＡ−Ａ３⁺Ｃ１Ｒ細胞系から誘導し得る(Takahashi et al .、Proc.Natl.Acad.Sci88:10277、1991）。培養の５−７日後に、細胞を採取し、４時間の⁵¹Ｃｒ放出解析において、ＨＬＡ−Ａ２.１⁺標的（例えば、ＨＬＡ− Ａ２. １⁺Ｃ１Ｒ又はＪＹ）またはＨＬＡ−Ａ３⁺標的（例えば、ＨＬＡ−Ａ３⁺Ｃ１ＲまたはＪｕｒｋａｔ）に対する細胞溶解活性について試験する。非ＨＬＡ特異的細胞溶解性ＣＤ５６⁺細胞を、Kos et al.J.Immunol.155:578(1995)に記載されているように、ＨＬＡ−Ａ２.１又はＨＬＡ−Ａ３−特異的ＣＴＬ活性を測定する前に、培養物から除去し得る。ＣＴＬ活性を測定することによって、ほとんど又は全くＨＬＡクラスＩ−特異的ＣＴＬ活性が、ＵＳ１１で形質転換し、ＨＬＡ( 弱い又は陰性)細胞で刺激したＰＢＭＣ培養物中に見られなかったことが示される。クラスＩ−特異的ＣＴＬｐの存在を実証するための正の対照として、ＰＢＭＣをＭＨＣクラスＩ陽性非形質導入細胞で刺激する。加えて、ＵＳ１１の効果がＡ２.１又はＨＬＡ−Ａ３に制限されないことを示すために、異なるＨＬＡ対立遺伝子に特異的なＣＴＬｐ細胞の成熟を、適当な標的に対して測定する。実施例８Ａｄ２Ｅ３／１９およびＡｄ５Ｅ３／１９は１４３Ｂ骨肉腫細胞により発現されたクラスＩ複対立遺伝子の発現を遮断する本実施例は、アデノウイルスダウンレギュレーション遺伝子である、Ａｄ２Ｅ３／１９およびＡｄ５Ｅ３／１９もまた、宿主細胞をこれらの遺伝子を含むレトロウイルスで形質導入した場合、宿主細胞上のＨＬＡクラスＩ分子の発現を防ぎ得ることを示す。１４３Ｂは、細胞表面上に高いレベルのＨＬＡクラスＩを発現するヒト骨肉腫細胞系である。細胞は、ビシストロン性（ＡｄＥ３／１９；ＣＤ４／ζ）レトロウイルスベクター、又はＣＤ４／ζ分子をコードする対照モノシストロン性ベクターで形質導入した。培養の４日後またはそれ以上後に、サンプルをとり、免疫蛍光法およびフローサイトメーターにより細胞表面ＨＬＡクラスＩのレベルを測定した。形質導入した細胞のパーセンテージを細胞表面上のＣＤ４／ζ分子の発現により測定した。次いで、ＣＤ４(陽性)細胞をＨＬＡクラスＩ発現について解析した。表３に示されているように、Ａｄ５Ｅ３／１９遺伝子は、形質導入した（ＣＤ４⁺）数において、ＨＬＡ発現を６.６倍減少させ、Ａｄ２Ｅ３／１９遺伝子は７.５倍減少させた。実施例９組み合わせたダウンレギュレーション遺伝子によるＨＬＡ発現の遮断本実施例は、標的細胞におけるＨＬＡクラスＩの発現を阻害するための複数のダウンレギュレーション遺伝子の使用について示す。特に、以下の組み合わせが用いられる：１）ＨＣＭＶＵＳ１１およびＡｄ２Ｅ３／１９又はＡｄ５Ｅ３／１９；２）ＵＳ１１およびＩＣＰ４７；および３）ＩＣＰ４７およびＡｄ２Ｅ３／１９又はＡｄ５Ｅ１／９。実施例１に記載した組換えレトロウイルス（ビシストロン性またはモノシストロン性）の組み合わせを使用して、当分野で良く知られている方法に従って、連続的に哺乳動物の細胞に形質導入する。別に、細胞を同時に異なるレトロウイルスで形質導入する。同時にトランスフェクトするために、レトロウイルスベクターを、異なるレセプターと相互作用する異なるウイルス性エンベロープタンパク質を発現する細胞中にパッケージングする。両種指向性ｅｎｖ（ＷＯ９４／２９４３８に記載）をコードするｐＩＫ６.１ＭＣＶａｍｐａｃパッケージングベクターを使用して、組換えウイルスの１つをパッケージングし、およびテナガザル白血球ＳＥＡＴＯウイルスエンベロープタンパク質（米国特許５,４７０,７２６号に記載）をコードするｐＭＯＶ−ＧａＬＶを用いてその他の組換えウイルスをパッケージングする。さらに、第２番目のダウンレギュレーション遺伝子がＣＤ４ζ遺伝子で置換され、ダウンレギュレーション遺伝子の組み合わせをコードする、ビシストロン性ベクターを、実施例１のプロトコールに従って調製する。これらのビシストロン性ベクターを用いて、前述の実施例のように標的細胞を形質導入する。実施例１０クラスＩ欠失ヒト造血幹細胞およびＴ細胞の産生本実施例は、１つ以上のダウンレギュレーション遺伝子を含むベクターを用いて形質導入したヒト造血幹細胞およびＴ細胞の産生について示す。これらの細胞の有効な形質導入およびＨＬＡクラスＩ発現の欠失を確認するために、細胞を形質導入過程の間に、接着分子上、又は接着分子の抗体上に植える。Ａ．一次ヒト造血幹細胞の高レベルの形質導入幹細胞由来の細胞の自己再生数および分化数の両方を維持する能力は、骨髄における幹細胞および間質細胞の細胞−細胞接触に依存する（GordonおよびGreave s、Bone Marrow Transplantation、4:335-338(1989)）。間質細胞および造血幹細胞の接触は、間質細胞上のｋｉｔリガンドおよび幹細胞上に見られるｃ−ｋｉｔレセプター（Zsebo et al.Cell、63:213-224(1990)）に例示される増殖因子、および間質細胞上のフィブロネクチィンおよび造血幹細胞上のＶＬＡ−４などの接着分子（Williams et al.、Nature352:438-441(1991)）に例示される増殖因子を含む、数多くの分子が関与する。これらの接触分子は、膜貫通、または細胞外に位置すれば、膜貫通タンパク質と接触し、自己再生または分化のシグナルを間質細胞および幹細胞の間に送達することを可能とするタンパク質である。上澄み感染により、造血幹細胞へのレトロウイルス遺伝子の転移を亢進させるために、共願中の米国特許出願０８／５１７,４８８号、Finer et al.に記載の細胞−細胞接触の再生を使用し得る。フィブロネクチン、フィブロネクチンのＣＳ−１ドメインまたはＶＬＡ−４に対する抗体を、下記のように培養皿に加える。ＣＤ３４⁺細胞を、シクロフォスファミドおよびＧ−ＣＳＦ処置を受けている患者の末梢血から単離する。単核細胞を標準的なＦｉｃｏｌｌｇｒａｄｉｅｎｔ（ファルマシア、Piscataway、NJ）を用いて、分画化によりロイコホレス（le ukophoresed）血から単離する。ＣＤ３４⁺細胞を、ＣｅｌｌＰｒｏＣＥＰＲＡＴＥＬＣアフィニティーカラム（CellPro、Bothell、WA）上での正の淘汰を用いて単離する。次いで、この細胞の集団を、ＴｅｒｒｙＦｏｘＬａｂｓ(バンクーバー、カナダ) からの完全な培地として供給されたＭｙｅｌｏｉｄＬｏｎｇＴｅｒｍＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍに、１００ｎｇ／ｍｌヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、５０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３、および１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ −６（Genzyme、ケンブリッジ、マサチューセッツ）を添加したものを含む『前刺激培地』中で、０.５−１×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で４８−７２時間培養する。ＣＤ３４⁺細胞を感染するためのウイルス上澄みは、以下のように調製する。２９３個の細胞を、トランスフェクションする２４時間前に１.４×１０⁶細胞／１０ｃｍ皿の濃度で、始めに置き、次いで、前述の実施例で記載したレトロウイルスベクターおよび７.５μｇのパッケージングプラスミドｐＩＫ６.１ＭＣＶａｍｐａｃを用いて共トランスフェクションすることによりトランスフェクションする。１８時間後、トランスフェクション培地を除去し、１０ｍｌＩＭＤＭ（JR H Biosciences、Woodland ＣＡ）＋１０％ＦＢＳで置き換える。次いで、ウイルス上澄みを２４−３６時間後に取得し、１００ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６および８μｇ／ｍｌポリブレンを加える。抗体コーティングプレートを作成するために、抗体または抗体の組み合わせ（ Immunotech、Westbrook ME）１０μｇを、１ｍｌＰＢＳに溶かし、上記したように組織培養プレート中で一晩インキュベートする。接着分子ＶＬＡ−４、ＶＬＡ −５、ＣＤ２９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、および／又はＣＤ４４に対するモノクローナル抗体を、抗体のコーティングに使用する。インキュベートした後、プレートをＰＢＳで穏やかに洗浄し、細胞およびウイルス上澄みを直ちに加える。比較として、組織培養プレートを、Williams et al．(Nature352:438-441(1991) )およびMoritz et al．(J.Clin.Invest93:1451-1457(1994))により報告されているように、フィブロネクチンまたはフィブロネクチンのキモトリプシンフラグメント、ＣＳ−１で覆う。フィブロネクチンおよびＣＳ−１で覆われたプレートは、ヒト血漿由来フィブロネクチン３０μｇ／ｍｌＰＢＳ、又はＣＳ−１（Sigma 、セントルイス、ＭＯ）を組織培養プレートに加えることにより作成される。次いで平板を３７℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで洗浄する（『２４時間法』）。別に、プレートを１時間、蓋をしないでＵＶ下に置き、次いで、さらに追加して１時間、蓋をして置き、ＰＢＳを除去し、１ｍｌ２％ＢＳＡを２０分間で加え、プレートをＤＰＢＳ／０.２％ＨＥＰＥＳで洗浄する（『２時間法』）（上記のW illiams et al.）。Ａ．一次ヒトＴ細胞の高レベル形質導入細胞−細胞接触は、造血系の多くの細胞における活性化および成長に重要な役割を果している。例えば、ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１、およびＣＤ−２とＬＦＡ −３のような、Ｔリンパ球上のレセプター／共レセプター対と抗原提示細胞との相互作用を含む、Ｔ細胞の活性化（Bouhuis et al.Cancer Immunol.Immunother. 34:1-8(1991)）に不可欠である多くの細胞−細胞接触が同定されている。Ｂリンパ球においては、ＣＤ４０／ｇｄ３９相互作用は、Ｂリンパ球とＴリンパ球の間で起こり、Ｂリンパ球の活性化に必要である（Armitage et al.、Sem.Immunol. 、6:267-278(1994)）。ＣＤ２（Springer et al.Nature323:262(1987)）又はＣＤ４０に対する抗体は、リガンドと置換し得、細胞−細胞相互作用および活性化を仲介する。ＴおよびＢリンパ球の上澄み感染による形質導入は、有効性が低いことが報告されている（Hwu et al.、J.Immunol.9:4104-4115(1993);Baker et a l.、Nucleic Acids Res.20:5234(1992)）。幹細胞と同様の試みを用いて、それぞれの細胞型を活性化することが示されている標的細胞上に存在する抗体（すなわち、Ｔリンパ球の抗ＣＤ２又はＬＦＡ１抗体、およびＢリンパ球の抗ＣＤ４０抗体）は、これらの細胞の上澄み形質導入有効性を高めるために使用し得る。一次ヒトＣＤ８⁺Ｔ細胞は、以下のように健康なドナーの末梢血から精製される：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心機によりヒト血液から単離する。ＰＭＢＣを、Ｄ−ＰＢＳＥ／ＣＭＦ（１ｍＭＥＤＴＡを含む、ＣａおよびＭｇを含まない）で３回洗浄し、０.５％ヒトγグロブリンを含む４ｍｌＤ−ＰＢＳＥ／ＣＭＦ中に５×１０⁷細胞で懸濁し、室温で少なくとも１５分間インキュベートする。インキュベート後に、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を正のふるい分けによりＰＢＭＣ細胞懸濁液から精製する。特に、ＰＢＭＣ懸濁液を、４ｍｌＴ−２５フラスコあたり５×１０⁷細胞の濃度で、ヒトＣＤ８タンパク質（ＡＩＳＣＤ８選択フラスコ(Applied Immune Sciences、Santa Clar a、CA)）に特異的な抗体で覆った予備洗浄Ｔ−２５組織培養フラスコに流す。細胞を１時間室温でインキュベートし、非接着分子細胞を穏やかにピペッティングし、Ｄ−ＰＢＳＥ／ＣＭＦで３回フラスコを洗浄することにより除去する。ＣＤ８⁺Ｔ細胞をフラスコから同時に出し、１０ｎｇ／ｍｌＯＫＴ３（Ortho Pharmac euticals、Raritan、NJ）および１０％ＩＬ２（ファルマシア）を含む１０ｍｌＴ細胞培地に加えることにより活性化する。別に、物理的分離を、補体仲介溶菌、蛍光活性セルソーター、磁気ビーズ、アフィニティークロマトグラフィー、又はその他を用いてなされる。次いで、細胞をＴ細胞培地で４８時間インキュベートし、フラスコから採取し、一度Ｔ細胞培地で洗浄し、最後に、２４穴プレートの０.５−１.０×１０⁶／ｍｌの濃度で、新鮮なＴ細胞培地（１０％、ＦＣＳ、H yclone；ＲＰＭＩ１６４０、CellGro；１０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液（Gibco）；１％ピルビン酸ナトリウム（Gibco）；１％非必須アミノ酸（Gibco）；２ｍＭグルタミン（Gibco）；２５μＭ２−メルカプトエタノール（シグマ）および１％ストレプトマイシン／ペニシリン）と１０％ＩＬ２中に再び懸濁する。組換えレトロウイルスを調製するために、２９３個の細胞を１×１０⁶細胞／６穴プレートに置き、次いで、４８時間後に適当な構築物でトランスフェクションさせる。トランスフェクションの２４時間に、トランスフェクション培地を除去し、Ｔ細胞成長培地で置き換える。抗体プレートを上記のように調製する。上記のようにして調製した、０.５× １０⁶精製および活性化ヒトＣＤ８⁺Ｔ細胞を抗体で覆ったプレートに置き、上記した２９３個の一過性トランスフェクションシステムから得られた１ｍｌウイルス上清と共に、新鮮な１ｍｌＴ細胞培地（それに加えて１０％ＩＬ２および２μ ｇ／ｍｌポリブレン）を用いてインキュベートする。８時間インキュベートした後、１.５ｍｌ培地を各穴から除去し、１.０ｍｌウイルス上清（２μｇ／ｍｌポリブレンおよび１０％ＩＬ２）と共に、新鮮なＴ細胞培地１.５ｍｌで置き換える。１２時間インキュベートした後、２段階の上清法を繰り返す。形質導入したＣＤ８⁺Ｔ細胞集団を続いて、Ｔ細胞培地に維持する。Ｔ細胞を１０ｎｇ／ｍｌＯＫＴ３を添加することにより、又は１−２×１０⁷ＣＤ８＋Ｔ細胞／１０ｍｌＴ細胞培地と１０％ＩＬ２の濃度のＴ−２５組織培養フラスコ中の固定ＯＫＴ３に細胞をさらすことにより、７〜１０日毎に定期的に再刺激する。細胞を４８時間インキュベートし、Ｔ細胞培地で１回洗浄し、０.５−１.０× １０⁶／ｍｌで新鮮な培地に１０％ＩＬ２を加えた中に再び懸濁する。上記のように調製したＨＬＡクラスＩ欠失Ｔ細胞および幹細胞部分母集団は、所望により、例えばＨＬＡクラスＩ特異的抗体と補体仲介溶菌、蛍光活性化セルソーター、プラスチック基層への付着、磁気ビーズ、アフィニティークロマトグラフィー、又はその他などのイムノアフィニティーにより増殖される。Ｐａｎ特異的Ｗ６／３２抗ＨＬＡクラスＩ抗体および／又は対立遺伝子特異的ＢＢ７.２抗ＨＬＡ−Ａ２.１クラスＩ抗体を使用する（ＡＴＣＣＨＢ−８２；Hum.Immun ol.3:277-299、1981）。実施例１１クラスＩ欠失細胞のＮＫ細胞による溶菌からの保護本実施例は、移植後に、ＨＬＡクラスＩ欠失ヒトＴ細胞の生存を可能とする方法について記載する。ＨＬＡクラスエ欠失ヒトＴ細胞を使用する上での障害は、細胞表面クラスＩＨＬＡが欠失しているリンパ球は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による溶菌に対して感受性を有することが分かったことである。さらに、ヒトＮＫ細胞は、in vitroにおいてクラスＩ−異種同種リンパ芽球を認識し、溶菌する。この問題を克服するために、ＨＬＡクラスＩ欠失ヒト又はマウスＹ細胞を、ＮＫ認識に対する感受性および溶菌を減少させるために、移植する前にin viv oで長い期間（例えば５日間）インキュベートする。Ａ．正常ヒトＴ細胞のＮＫ細胞による細胞溶解性に対する抵抗性。正常ヒトＴ細胞を、上記のように単離し、ポリクローナルアクチベーターＰＨＡで刺激し、２又は５日間培養する。次いで、得られたＴリンパ芽球を⁵¹Ｃｒで標識し、新しく単離した同種ＮＫ細胞による溶菌に対する標的として試験した。５日目のリンパ芽球はＮＫ溶菌に対して抵抗性を有したが、２日目のリンパ芽球は溶菌に対して感受性を有した。Ｂ．クラスＩ欠失マウスＴ細胞のＮＫ溶菌に対する抵抗性ＨＬＡクラスＩ欠失ヒトリンパ球のモデルとして、クラスＩ欠失マウスＴリンパ球（ＷＯ９３／１６１７７に記載のβ₂ミクログロブリンノックアウトマウス由来）のＮＫ溶菌に対する感受性を調べた。驚くべきことに、Ｔリンパ球が５日間以上培養されれば、クラスＩ欠失マウスＴリンパ球は、ＮＫ溶菌に対して高度に抵抗性を有した。対照的に、２日目のリンパ芽球は、先行技術から予期された通り感受性を有した。一方、ＨＬＡクラスＩ欠失ＬＰＳ活性化Ｂリンパ芽球は５日間培養した後でもＮＫ溶菌に対して完全に感受性が残っていた。本明細書に記載の全ての文献および特許出願は、各個々の文献又は特許出願の参照による合体が特別にまたは個々に指示された場合と同様に、参照により明細書に合体される。上述の発明は、説明および実施例を用いて明瞭に理解する目的のために詳細に記載したが、何らかの変更および修飾が本請求の範囲の精神および範囲からそれることなしに得られることは、本発明の教示からして、当分野の通常の理解力をもつ人には非常に明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/04 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．非形質転換細胞を受容体以外から採取し、１以上のウイルス由来ＭＨＣクラスＩダウンレギュレーション遺伝子含有の核酸構築物を非自己細胞中に導入してドナー細胞（その中で、ＭＨＣクラスＩ分子の表面発現は該核酸構築物を導入した結果として該細胞上で少なくとも７０％にまで低下されている）を形成し、該ドナー細胞を哺乳類宿主に移植することを含む、非自己細胞を哺乳類宿主に移植する方法。２．該ウイルス由来ＭＨＣクラスＩダウンレギュレーション遺伝子が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５よりなる群から選ばれる、請求項１の方法。３．該核酸構築物が配列番号１または配列番号２と配列番号３；配列番号１または配列番号２と配列番号４；配列番号１または配列番号２と配列番号５；配列番号３と配列番号４；配列番号３と配列番号５；および配列番号４と配列番号５よりなる群から選ばれるウイルス由来ＭＨＣクラスＩダウンレギュレーション遺伝子の組み合せを含む、請求項２の方法。４．該核酸構築物が該ウイルス由来ＭＨＣクラスＩダウンレギュレーション遺伝子の間に位置するＩＲＥＳエレメントを含む、請求項３の方法。５．該核酸構築物がレトロウイルスベクターを含む、請求項２の方法。６．該哺乳類宿主がヒトである、請求項２の方法。７．該細胞が造血細胞である、請求項６の方法。８．該造血細胞が接着分子または接着分子特異抗体の少なくとも１つを含む培養表面上の該レトロウイルスで形質導入される、請求項７の方法。９．該接着分子および接着分子特異抗体がフィブロネクチン、フィブロネクチンのＣＤ−１ドメイン、アンチＶＬＡ−４、アンチＶＬＡ−５、アンチＣＤ２９、アンチＣＤ１１ａ、アンチＣＤ１１ｂ、アンチＣＤ４４、アンチＬＦＡ−１、アンチＩＣＡＭ−１、アンチＬＦＡ−３、アンチＣＤ２およびアンチＣＤ４０よりなる群から選ばれる、請求項８の方法。１０．該造血細胞が造血幹細胞である、請求項７の方法。１１．該細胞がＴ細胞である、請求項７の方法。１２．該移植の前に in vitro で該細胞を培養する工程をさらに含む、請求項６の方法。１３．該ドナー細胞が哺乳類宿主における疾患細胞、感染細胞または癌細胞を標的とするために該細胞を指向する少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子含有の構築物をさらに含む、請求項１の方法。１４．該ドナー細胞がその細胞のエフェクター機能を高めるための少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子含有の構築物をさらに含む、請求項１の方法。１５．１以上のウイルス由来ＭＨＣクラスＩダウンレギュレーション遺伝子含有の核酸構築物（その中で、ＭＨＣクラスＩ分子の表面発現は該核酸構築物を導入した結果として該細胞上で少なくとも７０％にまで低下されている）を含む、非形質転換哺乳類ドナー細胞。１６．該核酸構築物がレトロウイルスベクターを含む、請求項１５のドナー細胞。１７．該ウイルス由来ＭＨＣクラスＩダウンレギュレーション遺伝子が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５よりなる群から選ばれる、請求項１５の非形質転換哺乳類ドナー細胞。１８．該ウイルス由来ＭＨＣクラスＩダウンレギュレーション遺伝子が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５よりなる群から選ばれる、請求項１５のドナー細胞。１９．該核酸構築物が配列番号１または配列番号２と配列番号３；配列番号１または配列番号２と配列番号４；配列番号１または配列番号２と配列番号５；配列番号３と配列番号４；配列番号３と配列番号５；および配列番号４と配列番号５よりなる群から選ばれるウイルス由来ＭＨＣクラスＩダウンレギュレーション遺伝子の組み合せを含む、請求項１８のドナー細胞。２０．該核酸構築物が該ウイルス由来ＭＨＣクラスＩダウンレギュレーション遺伝子の間に位置するＩＲＥＳエレメントを含む、請求項１９のドナー細胞。２１．該細胞が造血細胞である、請求項１７のドナー細胞。２２．該造血細胞が接着分子または接着分子特異抗体の少なくとも１つを含む培養表面上の該レトロウイルスで形質導入されている、請求項２１のドナー細胞。２３．該接着分子および接着分子特異抗体がフィブロネクチン、フィブロネクチンのＣＤ−１ドメイン、アンチＶＬＡ−４、アンチＶＬＡ−５、アンチＣＤ２９、アンチＣＤ１１ａ、アンチＣＤ１１ｂ、アンチＣＤ４４、アンチＬＦＡ−１、アンチＩＣＡＭ−１、アンチＬＦＡ−３、アンチＣＤ２およびアンチＣＤ４０よりなる群から選ばれる、請求項２２のドナー細胞。２４．該造血細胞が造血幹細胞である、請求項２１のドナー細胞。２５．該細胞がＴ細胞である、請求項２１のドナー細胞。２６．該ドナー細胞の受容哺乳類宿主における疾患細胞、感染細胞または癌細胞を標的とするために該細胞を指向する少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子含有の構築物をさらに含む、請求項１５のドナー細胞。２７．該ドナー細胞のエフェクター機能を高めるための少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子含有の構築物をさらに含む、請求項１５のドナー細胞。２８．哺乳動物のＴ細胞を in vitro 培養に少なくとも約５日間保持することを含む、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）による溶菌に対する該Ｔ細胞の感受性を減少するための方法。