JPH11500628A

JPH11500628A - 連続増幅反応

Info

Publication number: JPH11500628A
Application number: JP9512165A
Authority: JP
Inventors: ロリンズ，アッティラ・ティー; デラロサ，アベル
Original assignee: ダイジーン・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド
Priority date: 1995-09-14
Filing date: 1996-09-13
Publication date: 1999-01-19
Also published as: EP0792376A1; US6027897A; AU711130B2; DE69625461D1; AU7072696A; EP0792376B1; IL120865A0; US5981179A; CA2205353C; WO1997010364A1; IL120865A; DE69625461T2; CA2205353A1

Abstract

(57)【要約】連続増幅反応が、反応をサイクルする必要なしに特異性核酸を増幅する方法を提供する。この方法は、種々の方法により検出され得るＲＮＡ転写産物を生成する。増幅及び検出キットも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】連続増幅反応関連出願の情報本出願は、１９９１年１１月１４日出願の米国特許出願０７／７９２，５８５の一部継続出願である。発明の分野本発明は概括的に核酸増幅反応の分野に関し、より詳細には連続増幅反応、そしてＤＮＡ標的から特異的な増幅されたＲＮＡを生じる反応に関する。発明の背景微量で存在する特異的核酸配列の増幅および検出は、微生物を同定および分類するため、感染性疾患を診断するため、遺伝的異常を検出および同定するため、癌に関連する遺伝的変化を同定するため、病気に対する遺伝的感受性を検査するため、そして様々な種類の治療に対する応答を測定するためにますます重要性が高まりつつある技術である。そのような方法は、特異的微生物の存在を調べる必要がある食品、環境サンプル、貯蔵種子、および他の種類の物質における、微生物の検出および定量のためにもまた、広範な用途を有する。他の用途は、核酸配列の関連性の測定が用いられる犯罪容疑者の特定、父親認定の争いの解決、系統図および系統発生枝の作成、種々の生物型の分類の助け、そして病気の状態の特定のための、法廷料学、人類学、考古学、生物学、および臨床医学である。特異的核酸配列の検出および定量の一般的方法は、核酸のハイブリダイゼーションである。核酸ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、主としてプローブの特異性、プローブのハイブリダイゼーションの速度および程度および標識が検出される感度により制約を受ける。最も高感度の方法も、迅速性、経済性、および簡便性などの、日常的な臨床的および環境的試験のために要求される多くの特性を欠いている。さらに、それらの感度は多くの要望される用途にとって不十分である。この種類のアッセイの種々の成分や工程中の相互間の影響のため、感度と特異性の間にはしばしば逆の相関が見られる。したがって、アッセイの感度を増大させる工夫（例えばプローブの特異性の増大）は、擬陽性の試験結果の率を高める可能性がある。感度と特異性の結びつきはハイブリダイゼーションアッセイの感度の向上のための重大な障害であった。この問題の一つの解決法は、増幅手段を用いて存在する標的配列の量を特異的に増大させることである。標的配列のユニークな部分を、サンプル中の残りの配列によりコードされる情報の有意部分の増幅なしに増幅させることは、特異性の減少なしに感度を高めるであろう。核酸アッセイの感度の増大のためには増幅が用いられている。核酸配列を特異的に増幅させる一つの一般的方法は、ポリメラーゼチェーンリアクションまたはＰＣＲと名付けられ、Mullisらにより報告されている（ＵＳＰ４，６８３，２０２および４，６８３，１９５、およびＥＰ８６３０２２９８．４および８６３０２２９８．４，および８７３００２０３．４、およびＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１５５，１９８７，ｐｐ．３３５−３５０）。その方法は、相補配列の各ストランドを鋳型として用いて、同時に起こるプラィマーに依存する核酸配列合成のサイクルの繰り返しを利用する。したがって、ＰＣＲには少なくとも二つのプライマーが必要である。増幅される配列は合成を開始させるプライマー分子により規定される。プライマーは、標的配列の３’末端部分またはその相補鎖に相補性を有し、そして核酸合成が開始されるためには該部分と複合体を形成する必要がある。伸長産物合成の後、対の鎖は一般的には熱変性により分離され、次の合成工程に移される。ＰＣＲ法においては、両鎖のコピーが合成される。幾つかの異なり且つ極端な温度の間で、反応温度を繰り返し変化させることが必要とされることは、ＰＣＲ法の欠点である。ＰＣＲ法は、ＰＣＲ反応に用いられるプライマーの一方の中にプロモーター配列を含ませ、そして次いでＰＣＲ法で何サイクルか増幅させた後、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＲＮＡの転写の鋳型として用いるようにして、ＲＮＡ転写と組合せることも行われた（例えば、Ｍｕｒａｋａｗａら，ＤＮＡ７：８２７−２９５（１９８８））。核酸配列の増幅は他にも幾つかの方法が商業的に利用可能である。そのような方法には、ライゲーション増幅反応（ＬＣＲ）および転写を基礎とする増幅反応が含まれる。ライゲーション増幅反応は、Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．およびＷａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４：５６０−５６９（１９８９）およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｋ．Ｊ．ら，Ｇｅｎｅ８９：１１７−１２２（１９９０）に記載されている。転写を基礎とする増幅反応は、Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３−１１７７（１９８９）に記載されている。これらの方法は、高感度という利点を有するが、反応産物のコンタミネーションのために、擬陽性結果が生じやすいという欠点を有する。したがって、本発明の目的は連続増幅反応により標的核酸を増幅することであり、この方法は増幅の繰り返しサイクルを要求せず、そして標的配列のＲＮＡを多コピー生産する。本発明の他の目的は、連続増幅反応（本明細書中では、ＣＡＲと略称する）を用いた、微量の核酸配列の検出に関する。本発明のさらに別の目的は、ＲＮＡ分子の多コピーを合成および検出することにより、標的ＤＮＡシグナルを間接的に増幅することである。さらに別の本発明の目的は、コストが経済的で、感度が高い、ＣＡＲにより製造されたＲＮＡ転写物の溶液ハイブリダイゼーションアッセイを提供することである。発明の概要本発明は、本明細書中において連続増幅反応（ＣＡＲ）と呼ぶ増幅法を提供することである。ＣＡＲは微量の核酸配列の出発標的領域から検出可能な量のＲＮＡ転写体を製造することができる。このＲＮＡの酵素合成のｉｎｖｉｔｒｏ法は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するオリゴヌクレオチドプライマーである。このオリゴヌクレオチドは、本明細書中でプロモーター−プライマーと称される。プロモーター−プライマー中のプロモーター部分は、一方または両方の側が標的核酸分子の一つまたは二つの分離した領域に相同な領域で挟まれていてよい。あるいは、本発明のプロモーター−プライマーは部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドであってよく、その場合該オリゴヌクレオチドのプロモーター部分で二本鎖で、ブライマー部分で一本鎖である。第三の態様では、オリゴヌクレオチドの中のプロモーター領域でステムループ形成のために二本鎖である一本のオリゴヌクレオチドストランドであるプロモーター−プライマーが提供される。プロモーター−プライマーの中心部分にプロモーターが存在する場合、該プロモーター−プライマーと核酸の標的領域との間のハイブリダイゼーションは、環状の鋳型−プライマーハイブリッドを形成する。その代わりに、プライマー部分は該プロモーター−プライマーのプロモーターの下流に位置させてもよく、その場合は核酸の標的領域へのハイブリダイゼーションは、直線構造を形成する。本発明の方法により、いかなる核酸も増幅できる。核酸は種々の長さの核酸のひもからなる。核酸はその全長を増幅することもでき、あるいは核酸の一部分のみを増幅のために選択することもできる。いずれの場合においても、プロモーター−プライマーハイブリダイゼーションに要求される配列および転写のために選択された配列を含む核酸領域を、本明細書中で標的領域とよぶ。核酸の一部が標的領域である場合には、核酸の３’末端は標的領域を越えて伸長していてもよく、そしてそのような３’側位配列はトリミング工程で削除される。トリミング工程は、独立の酵素または多くの核酸ポリメラーゼが有するエクソヌクレアーゼを含む３’−５’エクソヌクレアーゼにより行うことができる。その代わりに、トリミングプローブを変性させた一本鎖核酸配列にハイブリダイゼーションさせ、ユニークな制限部位を作成してもよい。トリミングプローブは標的領域の３’ジャンクションに相同な配列からなる。標的領域の３’ジャンクションは、標的領域部分に相補的な配列および標的領域に対して３’に位置する核酸の領域に相補的な配列よりなる。したがって、このハイブリッド分子により作成される制限消化部位はトリム化された３’末端を生じ、生じた生成物はプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションの用意ができている。所望により、トリミングプローブは少なくとも一つのリガンドを有して、固相マトリックスに捕捉されうるようにしてもよい。これらの条件のいずれの下でも、鋳型とプロモーター−プライマーとのハイブリッドは核酸ポリメラーゼの酵素活性により延長される。修飾されたヌクレオチドをプロモーター−プライマーの３’部分に取り込んで、多くの核酸ポリメラーゼが有するエクソヌクレアーゼ活性によりプロモーター−プライマーがどの部分においても消化されないようにすることも好ましい。鋳型およびプロモーター領域の長手にそうポリメラーゼ伸長の後、二本鎖核酸が形成される。その生成物を、例えばＲＮＡポリメラーゼを用いて転写する。このようにして、サイクル反応を行う必要なしに、鋳型ＤＮＡを間接的に増幅することができる。そのような転写物はハイブリッド捕捉システムを含む種々の方法により検出することができる。本発明の他の観点においては、ＣＡＲはプロモーター部分では二本鎖でありそしてプライマー部分では一本鎖であるような、部分的に二本鎖のプロモーター− プライマーを用いた増幅反応を提供する。このプロモーター−プライマーによるハイブリダイゼーションに先立ち、３’側位配列は全て除去する。３’側位配列の除去または「トリミング」は、例えば標的領域の３’側の一本鎖配列を全て除去するトリミングプローブを用いて、行うことができる。このプロモーター−プライマーを標的ＤＮＡへハイブリダイゼーションさせてから、転写を行う。所望により、プロモーターと鋳型の間のギャップを埋めるためにライゲーション反応を行ってもよい。さらに、ヌクレオチドポリメラーゼ（好ましくはＤＮＡポリメラーゼ）を用いて、部分的に二本鎖のハイブリッドを先ず伸長させることにより、完全二本鎖の転写鋳型を製造することも好ましい。ＣＡＲで製造されたＲＮＡ転写物によって、サンプル中の特異的核酸標的をスクリーニングするためのキットが提供される。図面の簡単な説明図１はＣＡＲを説明する模式図である。工程Ａは二本鎖標的ＤＮＡ分子と一本鎖プロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションを示す。工程ＢはＤＮＡの余分な一本鎖３’末端を消化する、３’→５’特異的開裂のためのエクソヌクレアーゼの使用を示す。工程Ｃはプロモーター−プローブの３’末端および標的ＤＮＡを伸長させ、それにより５’末端に機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する二本鎖ＤＮＡを製造するための、ＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長反応を示す。工程ＤはＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を示す。工程Ｅは、ＤＮＡプローブへの転写ハイブリダイゼーションによるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの形成を示し、これはＣＡＲで製造された転写物を検出する一方法を提供する。図２：プラスミドであり、ＣＡＲ標的を製造するために用いられる複数内部制限部位を持つＨＩＶ−１ＤＮＡ領域を示している。図３：ＣＡＲに有用な種々の組み合わせのハイブリッドの模式図である。図４：捕捉テイル態様の模式図である。図５：部分的二本鎖の状態のプロモーター−プライマーおよび制限部位トリミングプローブを用いたリガーゼＣＡＲである。図６：ループ式プロモーター−プライマーおよびトリミングプローブを用いたリガーゼＣＡＲである。発明の詳細な説明本発明は標的核酸の増幅に関する。本発明による増幅の方法は、標的核酸を変性させて一本鎖の核酸鎖を生じさせ；該一本鎖核酸をプロモーター−プライマーにハイブリダイズさせてハイブリッドを形成し；核酸鎖の３’末端をトリミング除去し；プロモーター−プライマーの３’末端とトリミングした標的鎖の３’末端を核酸ポリメラーゼで伸長させて、機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する二本鎖核酸を形成させ；二本鎖核酸を転写して標的配列の多数ＲＮＡコピーを生じさせる；ことからなる。標的依存性に機能的プロモーターを特異的部位に導入する能力は、各特異的核酸標的分子から少なくとも１００ＲＮＡ転写物の形成を可能にする。ＣＡＲ法を特異的および高感度検出システム（例えば本明細書に記載されるハイブリッド捕捉システム（Hybrid Capture system）と組み合わせて、検出アッセイを二つのレベルの特異性と組み合わせることができる。第一の特異性レベルは、プロモーター−プライマーを用いて核酸の特定領域を標的として増幅を行うことにより提供され、そして第二の特異性レベルは、新たに転写されるＲＮＡを検出するためのプローブを用いることにより達成される。ＤＮＡ標的分子をＣＡＲにより間接的に増幅する能力は、特異的ＤＮＡ配列の検出のレベルを本来的に高める。本発明は、核酸配列の特異的検出限界を引き下けることを可能にするＣＡＲ方法を提供する。精製されたまたは精製されていない種類のいかなる核酸源も、テストサンプルとして用いることができる。例えば、テストサンプルは食品または農業製品であってよく、またはヒトまたは獣医分野の臨床検体であってもよい。典型的には、テストサンプルは、尿、血液、血漿、血清、タンその他の生物学的液体である。その代わりに、テストサンプルは興味対象の核酸を含むと思われる組織検体でありうる。テストサンプル中の検出すべき核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡを含む）であり、任意の供給源からのものであり、供給源にはバクテリア、酵母、ウイルス、および植物または動物のような高等生物の細胞または組織が含まれる。そのような核酸の抽出および／または精製の方法は、例えば、マニアチスら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York，Cold Spri ng Harbor Laboratory，1982)に記載されている。テストサンプル中の検出すべき核酸配列は、最初は別の分子として存在してもよく、そのため検出すべき配列が全核酸を構成してもよく、またはより大きい分子のほんの一成分であってもよい。検出すべき核酸配列が最初から純粋な形で存在することは必要とされない。テストサンプルは、複雑な核酸混合物を含み、その中の検出すべき核酸配列が、全ヒトゲノムＤＮＡ中に含まれる興味対象の遺伝子に相当、または臨床サンプル中の微量成分である病原生物の核酸配列の一部に相当してもよい。本明細書において、「オリゴヌクレオチド」の語は、二つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる核酸分子をいう。所望のオリゴヌクレオチドを任意の適当な方法、例えば天然に存在する核酸からの精製またはデノボ合成により調製できる。オリゴヌクレオチドの例は、本明細書中に記載されるプローブおよびプロモーター−プライマーである。本明細書で使用される用語「ＲＮＡ転写物」は、プロモーター−プライマーのコントロール下にＲＮＡポリメラーゼ酵素により合成されるリボ核酸分子をいう。特定の核酸配列のＲＮＡ転写物は、当該特定の配列に相同であるか相補的である。連続増幅反応(Continuous Amplification Reaction(CAR))は、検出可能な量のＲＮＡ産物を製造するために、核酸鋳型を増幅する能力を有する。この増幅方法は１０〜１００分子もの少量の核酸を検出できる。この方法は、標的配列の一方の鎖に相補する少なくとも一つのセグメントおよびプロモーターを含むセグメントを有するオリゴヌクレオチドを使用する。このオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型の一つの鎖（好ましくはアンチセンス鎖）にハイブリダイズして伸長すると、付加されたプロモーター配列により転写能力を有する標的核酸を１コピー生じることができる。このプロモーターは、転写される鎖の５’末端に付加されている。標的領域のアンチセンス鎖がハイブリダイゼーション工程に使用されると、プロモーターは標的核酸のコード鎖の５’末端に付加される。一つの好ましい態様において、核酸およびプロモーター−プライマーはハイブリダイズされる。プロモーター−プライマーのプライマー部分は標的領域の不連続の部分に相補するように設計される。例えば、核酸の標的領域の両末端部分をハイブリダイゼーションのために選択できる。さらに、プロモーター−プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むように設計される。ハイブリダイゼーションがおこると、プロモーター−プライマーのプライマー部分が、核酸の標的領域の５’末端部分および３’末端部分にリンクし、プロモーター配列部分が二つのハイブリダイズした末端配列に挟まれる。このハイブリダイゼーションの結果、サークルが形成される。以下、この態様を「環状ＣＡＲ」と呼ぶ。標的領域がより大きな核酸のセグメントである場合、プロモーター−プライマーのハイブリダイゼーションは、少なくとも一つの突出末端を有するサークルの形成をもたらす。次いで、任意の標的領域に近接する一本鎖３’配列をトリムバックし（trim b ack）、ハイブリダイズしたプロモーター−プライマーとフラッシュした（ｆｌｕｓｈ）標的配列の３’末端を生成させてもよい。本明細書において用いられる “フラッシュした”という用語は、標的核酸の端において一本鎖配列を有しない二本鎖末端を意味する：例えば、３’フラッシュ末端は、トリミング工程によって生成することができる。トリミングバック工程と同時にまたはその後に、核酸ポリメラーゼを介してハイブリッド構造の３’末端を伸長させて、伸長産物を形成する伸長工程を行う。核酸ポリメラーゼは、プロモーター−プライマーの３’ 末端を鋳型に沿って伸長し、二本鎖中間体を形成する。ポリメラーゼはまた、鋳型のトリミングされた３’末端を伸長して核酸を伸長し、得られる中間生成物が全長に亙って二本鎖となり、そして機能的な転写プロモーターを有するようにする。最後に、二本鎖伸長産物はＲＮＡポリメラーゼによって転写され、各転写産物から複数のＲＮＡ転写産物が生じる。元来プロモーター−プライマーの一部であったプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの働きを促進し、コピーされた標的核酸配列から多数のＲＮＡ転写産物の生成をもたらす。本発明の他の態様はオリゴヌクレオチドプロモータープライマーの使用である。ここにおいて、プライマー部分は核酸配列内の標的領域の３’末端に相補的である。本態様は本明細書において以後“線状ＣＡＲ”と呼称する。プロモーター −プライマーのプロモーター部分は５’末端に存在する。ハイブリダイゼーション終了後、標的領域に近接する３’一本鎖配列をトリムバックして３’フラッシュ末端を生成してもよい。一本鎖３’近接配列の除去と同時にまたはそれに続いて核酸ポリメラーゼの活性を介して伸長を行い、新規に追加されたプロモーター領域を有する伸長産物を生成する。次いで得られた二本鎖核酸は、新規に追加されたプロモーター配列によって促進されて、ＲＮＡポリメラーゼによって転写される。二本鎖ＣＡＲ（“ｄｓ−ＣＡＲ”）と呼称される本発明のさらに別の態様は、部分的に二本鎖であるプロモーター−プライマー（“ｄｓ−プロモーター−プライマー”と呼称する）の使用に関する。ここにおいて、プロモーター−プライマーはプロモーター部分内において二本鎖であり、そして、標的領域の３’末端と相補的なプロモーターの下流の領域内において一本鎖である。ｄｓ−ＣＡＲの一つの態様において、ハイブリダイゼーションの際にＤＮＡ標的の３’末端は、ｄｓ−プロモーター−プライマーの短鎖の５’末端に直接隣接する。このハイブリッド構造は直接転写を受けることができる。所望により、ライゲースをこのハイブリッドと反応させて連続した部分的に二本鎖状の鋳型を形成し、同様に転写可能な状態にすることもできる。さらに別の所望の工程は、前記転写された部分的に二本鎖の分子（ライゲーションされていても、されていないくてもよい）のいずれかをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、これにより完全に二本鎖の鋳型を生成し、同様に転写可能な状態にすることを含んでもよい（例えば、Ｚｈｏｕら、１９９５，Ｃｅｌｌ８２，５７７−５８５を参照）。続いてＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行い、多くのＲＮＡ転写産物を生成する。本発明の部分的に二本鎖のプロモーター−プライマーは、ハイブリダイズしているかまたは共有結合している多数のオリゴヌクレオチドからなる。または、ｄｓ−プロモーター−プライマーは、ステム−ループ構造が形成されるように分子内折りたたみが可能な一本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。ここにおいて、ステムはプロモーター領域内に形成され、プライマー領域は一本鎖のままである。いずれの場合も、プロモーター−プライマーの二本鎖部分はＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、一方、一本鎖部分は核酸の標的領域の３’部分に相補的な配列を含む。ＣＡＲの別の態様においては、一本鎖（即ち、変性された）標的ＤＮＡを固体マトリックスに固定された相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせてもよい（図４参照）。この工程は目的の核酸を試料中の他の分子から分離するのに役立つことができる。標的配列が固定化されたオリゴヌクレオチドにその５’ 近接配列によってハイブリダイズしている場合、次いで固定化された標的を本発明のプロモーター−プライマーとハイブリダイズさせてもよく、そして前述したそして後述するように増幅工程を行ってもよい。標的核酸が二本鎖型で見いだされるか、または堅い構造を維持する傾向があるような場合、本発明の分析を実施するのに試料を変性させることが必要であろう。変性は一本鎖核酸を生成する工程であり、当該技術分野においてよく知られているいくつかの方法によって行うことができる（Sambrook et al.(1989)in“Molec ular Cloning： A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Press，Plainview ，New York）。変性のための好ましい方法の一つは、加熱、例えば９０−１００ ℃、約２−２０分加熱することである。あるいは、核酸がＤＮＡの場合には変性剤として塩基を使用することができる。多くの既知の塩基溶剤が変性のために有用であり、これらは当該技術分野においてよく知られている。好ましい方法の一つは、ＮａＯＨ等の塩基を用いるものであり、例えば、０.１−２.０ＮＮａＯＨの濃度で２０−１００℃の温度で５− １２０分間インキュベートする。水酸化ナトリウム等の塩基による処理は、試料の粘性を低下させて、それ自体で続く酵素反応の速度を増加させるだけでなく、試料を均一化させ、試料中に存在するあらゆるＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを破壊してバックグラウンドを低下させる助けにもなる。標的核酸分子は核酸の標的領域と相補的なプロモーター−プライマーとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、当業者によく知られている標準的なハイブリダイゼーション条件下において行われる。オリゴヌクレオチドプロモーター−プライマーの核酸配列に対するハイブリダイゼーションの反応条件は、オリゴヌクレオチド毎によって異なり、オリゴヌクレオチドの長さ、ＧおよびＣヌクレオチドの数、およびハイブリダイゼーション反応において用いられる緩衝液の組成等の因子に依存する。適当な強度のハイブリダイゼーション条件とは、完全に塩基対合した二本鎖ＤＮＡの融解温度の約２５℃下の条件として、当業者に一般に理解される。より高い特異性は一般に、より高温のインキュベーション条件、言い換えればよりストリンジェントな条件を採用することによって達成される。よく知られたサンブルークらの研究室マニュアル、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press ，New York（1990）（本明細書中に参照文献として援用される）の第１１章には、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーのハイブリダイゼーション条件が、関与する因子および特異性のあるハイブリダイゼーションを保証するのに必要なストリンジェンシーの程度の記載を含め、詳細に記載されている。プロモーター−プライマーおよび標的核酸は、ハイブリダイゼーションを行うために約５−１２０分間、約２０−８０℃でインキュベートされる。好ましくは、プロモーター−プライマーおよび標的核酸は、約２０−６０分間、約３０−７０℃でインキュベートされる。最も好ましくは、試料中のプロモーター−プライマーおよび標的核酸は、約３０分間、約３５−５０℃でインキュベートされる。ハイブリダイゼーションは典型的には、プロモーター−プライマーが標的核酸配列には特異的にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしないような、十分なストリンジェンシーを提供するために選択された温度、塩濃度およびｐＨの条件を有する緩衝水性溶液中で行われる。一般に、プロモーター−プライマーと標的間のハイブリダイゼーションの効率は、加えられるプロモーター−プライマーの量が鋳型に対してモル過剰である場合、好ましくは１０００から１０⁶ モル過剰であるような条件下において促進されるであろう。しかしながら、披験試料中の標的核酸の量は知られていないであろうから、鋳型に対するプロモーター−プライマーの量を確実に定めることはできないことは理解される。あるいは、標的ＤＮＡが塩基で処理されている場合、中和ハイブリダイゼーション緩衝液としても機能するプローブ希釈剤中でプロモーター−プライマーを希釈する。このようにして試料中のｐＨをｐＨ６およびｐＨ９の間に保つことができる。これは、ハイブリダイゼーション反応に好ましく、続く酵素反応を干渉しないであろう。好ましくは、中和緩衝液は２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（“ＢＥＳ”）（Sigma,St.Louis,MO）および酢酸ナトリウム緩衝液である。最も好ましくは、中和ハイブリダイゼーション緩衝液は、２ＭＢＥＳ、１Ｍ酢酸ナトリウム、０．０５％の抗菌剤（例えば、ＮａＮ₃ ）、５ｍＭのキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、０．４％の洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０^-）および２０％のハイブリダイゼーション促進剤（例えば、硫酸デキストラン）の混合物である。中和ハイブリダイゼーション緩衝液のｐＨは約５と５．５の間である。本発明のプロモーター−プライマーは、プロモーター部分とプライマー部分を含む。プライマー部分は標的配列に応じて配列が異なるであろう。プライマー部分は最低８塩基の長さを含み、そして、例えばハイブリダイゼーションの特異性を最大にするように、望む限り長くしてもよい。プロモーター部分は、ＣｈａｍｂｅｒｌｉｎおよびＲｙａｎ（1982 In: The Enzymes．San Diego，CA，Academi c Press: 15:87-108）並びにＪｏｒｇｅｎｓｅｎ（1991 J.Biol.Chem．266:645- 655）に記載されているような当該技術分野において既知である任意のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列も含んでもよい。いくつかの好ましいＲＮＡポリメラーゼプロモーターがある。これらには以下のようなものが含まれるが、これらに限定されるものではない：ＳＰ６（Zhou & Doetsch，1993，Proc.Natl.Acad.S ci．USA 90: 6601-6605）、Ｔ７（Martin & Coleman，1987，Biochemistry，26: 2690-2696）およびＴ３（McGraw，et al.,1985，Nucl.Acid.Res.，13: 6753-67 66）に由来するプロモーター。好ましいのはThermus thermophilusに由来するＲＮＡプロモーター配列である（Wendt et al.，1990，Eur．J．Biochem.，191: 4 67-472; Faraldo et al.，1992，J．Bact.，174: 7458-62; Hartmann et al.，1 987．Biochem.，69: 1097-1104，Hartmann et al.，1991，Nucl.Acids.Res．19: 5957-5964）。プロモーター−プライマーのプロモーター部分の長さは、選択されたプロモーター配列に応じて異なるであろう。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは機能的なプロモーターとして働くのに長さ２５塩基と短いが、他のプロモーター配列は機能的なプロモーターを提供するのに５０あるいはそれ以上の塩基が必要である。プロモーター−プライマーは、化学合成、天然資源からの単離、組換え発現および非対称ＰＣＲ（McCabe，1990 In: PCR Protocols: A guide to methods and applications．San Diego，CA.，Academic Press，76-83）を含む、当該技術分野において既知の任意の適当な方法によって生成することができる。プロモーター−プライマーの一つまたは複数の断片を化学合成し、その後断片を結合させるのが好ましいであろう。いくつかの化学合成方法が、Ｎａｒａｎｇら（1979，Me th．Enzymol．68: 90）、Ｂｒｏｗｎら（1979，Meth．Enzymol．68: 109）およびＣａｒｕｔｈｅｒｓら（1985，Meth.Enzymol．154:287）に記載されている。これらは参考文献として本明細書中に援用される。あるいは、クローニング法によってプロモーター−プライマーとして使用するために単離できた適当な核酸断片を提供してもよい。プロモーター−プライマーの全核酸組成は、選択された標的核酸および適用されたＣＡＲの型に応じて異なるであろう。プロモーター−プライマーの長さも、選択された標的核酸およびプロモーター、並びに所望のハイブリダイゼーション特異性の程度に応じて異なるであろう。本発明のプロモーター−プライマーを製造する際に、プロモーター−プライマーひとつまたはそれ以上の部分においてヌクレオチドまたはホスホジエステル結合を修飾することが望ましいであろう。例えば、少なくともプロモーター−プライマーの３’部分を修飾することは有効であろう。そのような修飾はエキソヌクレアーゼ活性がプロモーター−プライマーのいずれかの箇所を消化するのを阻止する。少なくとも一番最後のおよび最後から２番目のヌクレオチドまたはホスホジエステル結合が修飾されていることが望ましい。そのような修飾の一つはホスホロチオエート化合物を含み、これは一旦取り込まれるとプロモーター−プライマー上の３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する。エキソヌクレアーゼ活性を阻害できるプロモーター−プライマーの他の修飾も、所望の酵素阻害を達成するために使用できることは当業者によって理解されるであろう。本発明のトリミング工程は種々の方法によって実施することができる。３’末端をトリミングバックするための最も一般的な方法は、エキソヌクレアーゼの酵素活性を利用する。特に、特異的に方向づけされたエキソヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ−プロモータープライマーバイブリッドの３'−５'トリミングバックを促進する。そのようなエキソヌクレアーゼは当該技術分野において知られており、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩを含むが、それらに限定されるわけではない。しかしながら、多くの核酸ポリメラーゼと関連する３'−５'エキソヌクレアーゼ活性が好ましい。そのような核酸ポリメラーゼの使用は反応において必要な酵素の数を減らし、標識ＤＮＡの遊離の３’近接末端をトリムバックするための適当な活性を提供する。あるいは、トリミングプローブ法を用いることも好ましいであろう。核酸のプロモーター−プライマーへのハイブリダイゼーションによって、標的領域の３’ に長い一本鎖配列が生じるような場合には、トリミングプローブは特に有用であろう。トリミングプローブ技術はプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションの前に行われる。トリミングプローブは核酸の標的領域の３’部分に相補的な配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。３’接合部位はさらに潜在的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むが、実際はそれは一本鎖としてのみ存在する。制限エンドヌクレアーゼは核酸配列を特異的に認識して切断する酵素である。制限エンドヌクレアーゼ認識配列は長さが様々であるが、二本鎖配列が要求される。これらの認識部位は当技術分野においてよく知られている。同様に制限エンドヌクレアーゼは多数あり、当技術分野においてよく知られている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（19 90 Molecular Cloning: A Laboratory Manual，second edition，Cold Spring H arbor Press，N.Y.）は多くの制限エンドヌクレアーゼおよびそれらの認識配列の総説を提供しており、本明細書中に参考文献として援用される。トリミングプローブ工程は、一本鎖標的配列をトリミングプローブにハイブリダイゼーションさせることを要求する。ハイブリダイゼーションにより短い二本鎖領域が生じ、機能的な制限エンドヌクレアーゼ認識配列が形成される。次いで、制限エンドヌクレアーゼは制限切断部位によって規定されるように標的配列を消化することができる。好ましくは、この制限消化反応はフラッシュされた３’ 末端を有する標的領域を生成する。所望により、トリミングプローブは一つまたはそれ以上の部位において、固体マトリックス上に捕捉され得るリガンドを有していてもよい。リガンド結合−トリミングプローブは、標的ＤＮＡを臨床試料中に存在する他の分子から分離するための簡便な方法を提供する。リガンド結合−捕捉プローブ−標的配列ハイブリッドがリガンドを介して一旦固体マトリックス上に捕捉されると、固体マトリックスを洗浄することによってハイブリッドを試料中の他の全ての成分から分離する。洗浄され固定化されたハイブリッドは制限エンドヌクレアーゼ消化される。消化の後、標的配列は固定化マトリックスから遊離され、一方プローブの５’末端は固体マトリックスに固定化されたまま残される。小さな変性工程によりトリミングプローブの残留部分を除去し、次いで、増幅のために標的配列をプロモーター−プライマー分子にハイブリダイズさせることができる。トリミングプローブの使用は５’配列が標的領域に近接するような状況のライゲースＣＡＲにおいて特に有用である。ビタミン誘導体、抗原−抗体複合体、金属誘導体等を含む多くの既知のリガンドをトリミングプローブにおいて使用することができるであろう。一つの好ましい態様においてビオチンをリガンドとして使用する。ここにおいて、トリミングプローブにはビオチンを付け、そして固体マトリックスは強い結合分子、例えばアビジン、ストレプトアビジン、またはそれらの誘導体でコーティングする。様々な組み合わせのリガンドおよびリガンド結合剤がよく知られており、ハイブリッドを固体マトリックス上に捕捉するために使用できる。例えば、ディゴキシゲニンおよび抗ディゴキシゲニン２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）および抗−ＤＮＰを使用することもできる。フルオロセイン、フィコエリトリン、アロ −フィコシアニン、フィコシアニン−ローダミン、テキサス−レッドまたはその他の登録商標を持つ蛍光色素等の蛍光色素を、抗蛍光色素特異的抗体と組み合わせて使用することができる。リガンド−結合プローブを捕捉するのに有用な固体マトリックスは当業者に利用可能である。本発明のマトリックスとして役立つのに有用なリガンド結合プローブは、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたは任意の試験管型の固体プラスチック材料、ビーズ微粒子、計深捧（ｄｉｐ−ｓｔｉｃｋ）等を含むが、これらに限定されない。さらに、マトリックスは、膜、９６穴マイクロタイタープレート、試験管およびエッペンドルフチューブを含むが、これらに限定されない。固相はまた、ガラスビーズ、ガラス試験管、およびその他の任意の適当な形状のガラス性のものを含む。表面がカルボキシル基、アミノ基、ヒドラジド基もしくはアルデヒド基を有するように修飾されたプラスチック性またはガラス性等の機能的な固相を使用することもできる。一般に、そのようなマトリックスは、リガンド結合剤が結合できるような、あるいはそれ自体がリガンド結合部位を提供するような任意の表面を含む。一本鎖標的核酸はプロモータープライマーにハイブリダイズされる。上述のようにトリミングは伸長段階の前あるいは同時のいずれかに行われる。ここで使用される用語「伸長」は、ヌクレオチドを核酸の３’ヒドロキシル末端に付加することである（ここで、該付加は鋳型の核酸配列によって指示される）。最もしばしば、伸長段階はオリゴヌクレオチドプライマーおよび鋳型からＤＮＡを合成できる酵素によって促進される。これらの目的に適した酵素は、たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ^TM（エクソヌクレアーゼプラス）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ^TM（エクソヌクレアーゼマイナス）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶｅｎｔ^TM（エクソヌクレアーゼプラス）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶｅｎｔ^TM（エクソヌクレアーゼマイナス）ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｆｉＤＮＡポリメラーゼ（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、Ｒｅｐｌｉｔｈｅｒｍで^TM温度安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素であるが、これらに限定されない。これらの試薬の１つ以上をＣＡＲの伸長段階に使用できる。効果を最大にするため、伸長段階およびトリミング段階の両方に１つの試薬を使用するのが望ましい。必要に応じてさらに試薬を追加してポリメラーゼ酵素の動力学的パラメーターをシフトさせてその伸長速度および／または３’−５’および５’−３’エキソヌクレアーゼによる分解活性を増加あるいは低下させることができる。伸長段階により、その５’末端に機能性プロモーターを有する二本鎖一本鎖標的核酸を生じる。一旦形成したら、二本鎖伸長生成物はＲＮＡ転写形成のための鋳型として役立つ。機能的プロモーター配列を有する二本鎖伸長生成物または部分的二本鎖ライゲーション生成物の転写はＲＮＡポリメラーゼによって促進される。多くのそのようなポリメラーゼは当分野において公知であり、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ３ＲＮＡポリメラーゼがあるが、これらに限定されない。好適なＲＮＡポリメラーゼはテルムス・テモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から得られたＲＮＡポリメラーゼである。１つ以上のそのようなＲＮＡポリメラーゼを上記ＣＡＲ法の転写段階に使用できる。必要な試薬の存在を含めて適当な反応条件下に、ＲＮＡ転写物の合成が連続的に、且つ試料に本来存在していた検出されるべき核酸配列の量に比例して起こるであろう。必要なら、追加の試薬を添加して所望量のＲＮＡ転写物を調製できる。これらの試薬を使用して所望に応じて転写反応の平衡を転写速度および効率を増加させたり低下させたりできる。そのような試薬の１つである、無機ピロホスファターゼを使用して転写収量を増加し、転写反応物におけるマグネシウムイオン濃度の作用を最小にすることができる（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＯｆｅｎｇｎｄ、１９９０ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９：７１３−７１４）。好ましくは、外来のリボヌクレアーゼ混入物による転写物の有り得る分解を防ぐためＲＮＡ転写物の合成リボヌクレアーゼ阻害剤、たとえば、バナジル−リボヌクレオシド複合体または人胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤の存在下に行うことができる。（Ｂｅｒｇｅｒ，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：２２７；ｄｅＭａｒｔｙｎｏｆｆら，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９３：６４５；Ｓｈｅｅｌら，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ７６：４８９８）。所望量のＲＮＡ転写物を生成するための適当な時間経過後、ＲＮＡポリメラーゼを不活性化するかまたは反応物から成分を分離することによって反応を停止させることができる。本発明の増幅反応により種々の方法を使用して検出できる転写物を生成する。たとえば、転写反応において標識ヌクレオチドを添加することによって転写物を直接に検出できる。このヌクレオチドはＲＮＡ分子に特異的でありその混入が転写反応生成物に限定されるであろうので、多くの場合、標識ｄＵＴＰを使用することが好ましい。多くの異なる標識を使用して検出転写物を化合物するのに使用できる。ＲＮＡ転写物を標識する好ましい方法は³²Ｐまたは³⁵Ｓを使用したＲＮＡポリメラーゼによるものである。さらに、信号増幅のためには化学的部分をピリミジンおよびプリン環に付加する方法（Ｄａｌｅ，Ｒ．Ｎ．Ｋ．ら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７０：２２３８−２２４２；Ｈｅｃｋ，Ｒ．Ｆ．（１９６８）Ｓ．Ａｍ．Ｃｈｅ．Ｓｏｃ．，９０：５５１８−５５２３），化学発光によって検出させる方法（Ｂａｒｔｏｎ，Ｓ．Ｋ．ら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：８７３６−８７４０）およびビオチニル化された核酸プローブを利用する方法（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ｋ．（１９８３）ＡｎａｌＢｉｏｃｈeｍ．，１３３：１２５−１３１；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．ら（１９８２）Ｊ．ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＭｅｔｈｏｄｓ、１５７：１２３−１２８）および市販の生成物を使用した蛍光によって検出させる方法を含む公知の非放射性技術がある。別法として、核酸プローブを使用してＣＡＲ生成ＲＮＡ転写物を検出できる。核酸プローブは、試料中の相補性ＲＮＡまたはＤＮＡ配列にハイブリダイズする検出可能な核酸配列である。該プロープの検出は、該プローブが特異的である試料中の特定の核酸配列の存在を示す。科学的研究を助けることに加えて、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを使用してウイルス、および細菌、酵母および原虫のような微生物ならびに患者の試料中の特定の疾患に関連した遺伝的変異の存在を検出することができる。Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７２：３９６１（１９７５）およびＡｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｄ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５）は放射線標識された核酸プローブを使用したハイブリダイゼーション技術を記載している。核酸ハイブリダイゼーションプローブは他の検出方法よりも高い感受性と特異性を有し、生存できる微生物を必要としない。ハイブリダイゼーションプローブはしばしば容易に検出できる物質で標識される。たとえば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のための放射性ハイブリダイゼーション検定は現在Ｐｒｏｆｉｌｅ^TMキットとしてＤｉｇｅｎｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（メリーランド州、シルバースプリング）から市販されている。ハイブリダイゼーションはＣａｒｒｉｃｏに対する米国特許第４，７４３，５３５号に記載の標識されたプローブに特異的な抗体によって検出することもできる。このプローブはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）または蛍光剤のような検出可能な物質で標識される。上記標識されたプローブに特異的な抗体は試料の核酸にハイブリダイズした後、生化学的反応によって検出される。標識されない転写物もまた本発明で検出できる。これらの転写物は当分野で公知の多くの技術によって検出できる。たとえば、ＲＮＡのためのハイブリダイゼーション保護アッセイはＧｅｎ−ＰｒｏｂｅＩｎｃ．（カルフォルニア州、サンヂエゴ）から市販されている。ハイブリダイゼーション保護アッセイは、Ｅｎｇｌｅｂｅｒｇ，Ｎ．Ｃ．，ＡＳＭＮｅｗｓ５７：１８３−１８６（１９９１）、Ａｒｎｏｌｄら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈeｍ．３５：１５８８−１５９４（１９８９）および米国特許第４，８５１，３３０号に記載のようにアクリジニウムエステルに結合した一本鎖核酸プローブを使用している。上記プローブの標的ＲＮＡ分子へのハイブリダイゼーションにより、アクリジニウムエステル結合を塩基加水分解から保護することによって検出された化学発光信号が試料中の標的ＲＮＡの量に比例するようにする。転写物を逆転写酵素反応させて分析できるｃＤＮＡを生成することもできる。たとえば、転写物のそのようなｃＤＮＡコピーを変異の存在について分析できる。変異分析は点変異、削除および挿入であるが、それらに限定されない。これらの変異は当業者に周知の方法、たとえば、直接ＤＮＡ配列（ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ，１９８０ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．６５：４９９−５９９；Ｓａｎｇｅｒら、１９７７Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７）および一本鎖コンフォーメイションポリモルフィズム（ＳＳＣＰ）分析（Ｌｅｏｎｅら、１９９３Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、８：８５５−８６５）によって検出できる。さらに、転写物は、適当なオリゴデオキシヌクレオチドとともに逆転写酵素を使用して直接に配列化てきる（ＭｉｅｒｅｎｄｏｒｆおよびＰｆｅｆｆｅｒ１９８７Ｍｅｔｈｏｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ。、１５：５６３−５６６）。いかなる逆転写酵素を使用してもこの活性を達成できるが、好ましくはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＮＡ分解酵素ＨのようなＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を欠くものがよい（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を欠くことにより第１鎖ｃＤＮＡ合成の間のＲＮＡ分子分解が防止でき、それによりＲＮＡ鋳型を直接に配列化できる。ＣＡＲ法により生成したＲＮＡ転写物を検出するのに使用されたＤＮＡプローブはＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ニューヨーク（１９９０）に記載されたような当分野で周知の方法によって合成あるいは単離される。プローブは二本鎖または一本鎖ＤＮＡ分子でもよい。二本鎖ＤＮＡプローブは標的ＲＮＡ転写物へのハイブリダイゼーションの前にまず塩基中または熱で変性されて一本鎖になる。塩基を使用して二本鎖プローブを変性するなら、塩基は０．１ないし２．０Ｍの濃度の水酸化ナトリウムであってプローブとともに２０℃ ないし１００℃で５ないし１２０分間インキュベートするのが好ましい。さらに好ましくは、該塩基は１．２５ＮのＮａＯＨで上記プローブとともに室温で１０分間インキュベートする。熱を使用してプローブを変性したときは、該プローブは９０−１００℃で５ないし１００分間インキュベートするのが好ましい。より好ましくは、該プローブを９０−１００℃で１０−１５分間加熱する。変性ＤＮＡプローブの復元を避けるために、ＲＮＡ転写物は中性バッファーまたは中和用プローブ希釈剤により希釈することが好ましく、そして希釈されたＲＮＡは次に変性ＤＮＡプローブに加えられることにより、塩基を中和すると同時に標的ＲＮＡをハイブリダイゼーションのために変性されたＤＮＡプローブに露出する。当業者には理解されるとおり、中和用プローブ希釈剤は本明細害において塩基を効果的に中和するバッファーと定義される。多くの中和バッファーは、当業者によく知られている。好ましくは、中和用プローブ希釈剤は２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸および酢酸ナトリウムバッファー（ＢＥＳ／酢酸ナトリウムバッファー）である。塩基または加熱処理は、一本鎖ＤＮＡプローブには必要ない。しかしながら、一本鎖ＤＮＡプローブは通常環状分子でありＭ１３バクテリオファージ等のファージにより生産されるから、環状ＤＮＡの塩基処理により環状にニックが入り、一般的に改良されたハイブリダイゼーションを生じる直鎖状ＤＮＡプローブをもたらす。ＤＮＡ検出プローブはリガンドで標識されていてよく、そしてリガンド標識されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、リガンドが特異的に結合する基質でコートされた固相上に得られる。得られたハイブリッドは、次に以下において詳細に記載されるとおりに検出される。当業者には理解されるとおり、固相はポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたはあらゆる固体プラスチック材料を含み、試験管、ビーズ、マイクロ粒子、ディップスティック等の形状である。固相は、ガラスビーズ、ガラス試験管およびガラスで作られるあらゆる他の適切な形状を含む。官能化固相、例えば修飾されることにより表面がカルボキシル、アミノ、ヒドラジドまたはアルデヒド基を含むプラスチックまたはガラスも使用できる。したがって、あらゆる固相、例えはプラスチックまたはガラスマイクロ粒子、ビーズ、ディップスティック、試験管または、好ましくはマイクロタイタープレートを使用できる。本発明において使用されるあらゆるＤＮＡプローブは当業者には公知の方法により少なくとも一つのリガンドにより標識されていてよく、例えば、ニックトランスレーション、化学または光化学混合（incorporation）、およびＰＣＲ産物等の増幅産物へのリガンド標識プライマーの取り込みを含む。さらに、ＤＮＡプローブは、複数の位置においてひとつまたは複数の種類の標識により標識される。好ましくは、ＤＮＡプローブおよび取得用プローブは、ストレプトアビジンに結合するビオチン；抗ジゴキシゲニンに結合するジゴキシゲニン；または抗−ＤＮＰに結合する２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）により標識される。蛍光源もプローブを標識するのに用いることができる。蛍光源の例は、フルオレセインおよび誘導体、フィコエリスリン、アロ−フィコシアニン、フィコシアニン、ローダミン、テキサスレッドまたは他の適当な蛍光源を含む。蛍光源は、一般的に化学修飾により付加されて蛍光源特異的抗体、例えば抗フルオレセインに結合する。当業者には理解されるとおり、プローブは、特異的抗体により認識されうるあらゆる化学官能基を含む修飾塩基の取り込みにより標識されうる。他の標識および基質でコートされた固相上での取得のためのヌクレオチド配列標識法は、当業者にはよく知られている。核酸標識の総説は、ランデグレン（Landegren）らによる文献、「ＤＮＡ診断一分子技術および自動化」、Science，242：229-23 7（1988）に見いだすことができ、該文献は引用により本明細害の一部をなす。もっとも好ましくは、標識はビオチンであり、ビオチン−ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドがストレプトアビジンでコートされた固相上で取得され、そして取得されたハイブリッドは抗−ＤＮＡ−ＲＮＡアルカリホスファターゼコンジュゲートを用いて検出される。好ましくは、ストレプトアビジンでコートされたマイクロタイタープレートを用いる。これらのプレートは、受動的にコートされるかまたはゼノポア（Xenopore）（Saddle Brook，NJ）から購入するかまたは抗ハイブリッド抗体の固定化に関して以下に記載される方法を用いて調製される。検出用プローブは未標識でよく、そして抗ハイブリッド抗体、ポリクローナルまたはモノクローナルは固相上に固定化されてよい。当業者には理解されるとおり、固定化された抗体は直接固相に結合するか、または固相に結合しており続いて抗ハイブリッド抗体、誘導化抗ハイブリッド抗体、抗ハイブリッド抗体の官能性断片または抗ハイブリッド抗体の誘導化官能性断片を結合する、一次結合抗体または蛋白質例えばストレプトアビジンまたはプロテインＧを用いて間接に結合することができる。サンプル中の過剰なＤＮＡプローブは、好ましくは、シグマケミカル社（St． Louis，MO）から市販されている、ＲＮＡアーゼを含まないＤＮＡアーゼによる酵素処理により分解される。抗体が二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに特異的である限り、あらゆる抗ハイブリッド抗体を用いて固相上でハイブリッドを取得してよい。そのようなポリクローナル抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドで免疫されたヤギから誘導される。ハイブリッド特異的抗体は、固相上に固定化されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対する親和性精製により、ヤギの血清から精製される。標準技術を用いて調製されたモノクローナル抗体を、ポリクローナル抗体に代えて使用することができる。取得用または検出用ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体は、キタガワ（Kitagawa ，Y.）とストラー（Stollar，B．D.）、Mol．Ｉmmunology 19：413-420（1982）またはスチュアート（Stuart）らへの米国特許第4,732,847号（1988年３月22日発行）の方法に従って調製され、両文献は引用により本明細書の一部をなす。当業者には理解されるとおり、ポリクローナルまたはモノクローナル抗ハイブリッド抗体の何れかは、以下に記載される本発明のアッセイにおいて固相上に固定化することができる。抗ハイブリッド抗体は、固相上、例えば試験管表面または96-ウエルのマイクロタイタープレート上に固定化される。抗体の固定化は直接でも間接でもありうる。好ましくは、固相は、当業者には公知の方法または以下に簡単に記載される方法により抗ハイブリッド抗体で直接コートされる。抗体はビオチン化されて、次にストレプトアビジンコートされた表面上に固定化されるか、または固相に共有結合させる他の手段を用いて修飾することもできる。可溶化されたビオチン化抗体は、以下に記載されるとおりハイブリダイズしたサンプルの取得前、または以下に記載されるとおりハイブリダイズしたサンプルの添加と共に、またはビオチン化抗体の固定化とハイブリッドの取得を同時に行うためにハイブリダイズしたサンプルの添加と共に、ストレプトアビジンコートされた表面上に固定化されうる。より好ましくは、抗体は、フレミンガー（Fleminger）ら、Appl．Biochem．Bi otech．23：123-137（1990）の方法により、抗体の糖鎖部分を過ヨウ素酸塩で酸化することにより反応性アルデヒト基を生じさせて固相上に付加する。次に、アルデヒド基はヒドラジド修飾固相、例えばダイナテックラボラトリーズ（Dynate ch Laboratories）（Chantilly，VA）から市販されているミクロバインド（Micr oBind）-HZ（商標名）プレートと反応させる。エッサー（Esser，P.）、Nunc Bu lletein No．6（1988年11月）（Nunc，Roskilde，Denmark）の公知の方法による抗体の受動的コーティングも使用できる。別法としては、ベントレックスター（Ventrex Star：商標名）チューブ（ベントレックスラボラトリーズ社、Portland，ME）を、ハウン（Haun，M.）とワシ（ Wasi，S.）、Anal．Biochem．191：337-342（1990）の方法によりストレプトアビジンでコートする。ストレプトアビジンの結合後、上記または当業者には公知の他の方法により生産されたビオチン化ヤギポリクローナル抗体を、固定化されたストレプトアビジンに結合させる。抗体の結合に続き、エッサー（Esser，P. ）、Nunc Bulletein No．8，pp．1-5（1990年12月）およびNunc Bulletein No． 9，pp．1-4（1991年６月）（Nunc，Roskilde，Denmark）およびアンサリ（Ansar i）ら、J．Immunol．Methods 84：117-124（1985）に記載されたように、固体マトリックスを界面活性剤、例えばツイーン（Tween：商標名）20および蔗糖で後コートすることにより、表面上の未結合部位をブロックして結合蛋白質を安定化することができる。以下に記載されるとおり、固相は、官能性抗体断片でコートされているか、または抗ハイブリッド抗体の誘導化官能性断片でありうる。ＣＡＲにより生産されるＲＮＡ：ＤＮＡプローブのハイブリッドは固相に暴露されるが、固相は、固定化されたされた抗体または基質によりハイブリッドを結合または取得するのに十分な時間、上記のとおり、リガンドまたはリガンドでコンジュゲートされたプローブまたは抗ハイブリッド抗体に特異的に結合する基質の何れかでコートされている。ハイブリッドは約５分から約24時間、約15℃から 65℃、プラットフォームシェーカー上で、０から1500rpmの撹拌速度のインキュベーションにより固定化された抗体または基質に結合させる。好ましくは、インキュベーション時間は約30分から約120分で、約20℃から約40℃で、300から1200 rpmの撹拌である。より好ましくは、取得は１時間の室温における回転プラットフォームシェーカー上での激しい撹拌で、約300から1000rpmの間の回転撹拌速度のインキュベーションで生じる。当業者には理解されるとおり、インキュベーション時間、温度、および撹拌は記載された別の取得キネティックスを達成するために変更しうる。ハイブリダイゼーションは、当業界において公知の慣用的手段、例えばハイブリッドまたは標識抗体に特異的な直接標識されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体により検出される。別法としては、好ましい態様において上記されたようにプローブをリガンドで標識するならば、ハイブリッドは、標識された抗ハイブリッド抗体または標識基質、例えばストレプトアビジン−アルカリホスフェートのコンジュゲートの何れかにより検出されうる。好ましい態様において、標的ＲＮＡは、標識されたプローブとハイブリダイズさせ、ハイブリッドは基質コートされた固相上で取得され、そして取得されたハイブリッドは基質コートされた固相上で検出され、そして取得されたハイブリッドは標識された抗ハイブリッド抗体で検出される。より好ましくは、抗ハイブリッド抗体の標識は酵素、蛍光分子またはビオチン −アビジンコンジュゲートであり、且つ非放射性である。次に、標識は当業界において公知の慣用手段、例えば比色計、ルミノメーターまたは蛍光検出器により検出されうる。好ましい標識はアルカリホスファターゼである。取得されたハイブリッドの検出は、好ましくは、インキュベーションの間に上記コンジュゲートされた抗ハイブリッド分子をハイブリッドに結合させることにより達成される。そして表面を上記洗浄バッファーで洗浄することによりあらゆる過剰なコンジュゲートを除去する。好ましくは、50mlのコンビチップ（Combit ip：商標名）（Eppendorf，Hamburg，ドイツ）と共にエッペンドルフ（Eppendor f：商標名）リピートピペッターを用いるか、コーニング（Corning）リピートシリンジ（Corning，Corning，NY）を用いるか、バリオスタットにより制御された単純なポンプを用いるか、または付随のチューブを伴う溜めからの重力流により、５回のマニュアル洗浄を実施する。ソースサイエンティフィックシステムズ（ Garden Grove，CA）から市販されているチューブ洗浄システムを用いることもできる。上記のとおり、取得されたハイブリッドは、直接標識されたＤＮＡプローブ、例えば酵素でコンジュゲートされたハイブリダイゼーションプローブ、または次に標識抗ハプテン抗体で検出されるハプテン修飾プローブで検出することもできる。結合コンジュゲートは次に、コートリー（Coutlee）ら、J．Clin．Microbiol. 27：1002-1007（1989）により記載されるとおり、比色または化学発光により検出される。好ましくは、結合したアルカリホスファターゼコンジュゲートは、例えばルミフォス（Lumi-Phos：商標名）Ｓ３０試薬（Lumigen，Detroit，MI）のような試薬を用いて、例えば、E/ルミナ（Lumina：商標名）ルミノメーター（So urce Scieitific Systems，Inc.，Garden Grove，CA）またはオプトコンプ（Opt ocomp）Ｉ（商標名）ルミノメーター（MGM Instruments，Harden，CT）等の検出器を用いて検出される。本発明のさらなる態様は、自動化方法として実施されるＣＡＲ法に関する。そのような方法は、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ伸長合成、転写および検出反応をひとつ以上の容器で実施するための自動化装置を使用する。この方法は、連続または同時に複数のサンプルを分析することができる。この方法は、ロボット工学、例えばバイオメック（Biomek）2000（商標名）またはプラト（Plat o）1300（商標名）（Rosys，Wilmington，DE）またはラブテック（LABTECH）（商標名）（Biochem Immunosystems，Allentown，PA）の使用を含むように自動化されてよい。ロボット工学と組合わされた自動化温度制御器は、ＣＡＲのための自動化システムにおいて特に有利であり、ロボサイクラー96（商標名）またはロボサイクラー40（商標名）（Stratagene，LaJoLLa，CA）のようなシステムを用いることができる。ＣＡＲ法を自動化するための他のシステムは当業界において公知であり、ＣＡＲ発明の範囲内である。一つの非放射性ＣＡＲアッセイキットは、ＣＡＲ増幅反応および非放射性ハイブリダイゼーションアッセイを実施するために必要な装置および試薬を含み、上記のとおり、適当なサンプル回収装置、例えば、剥離された細胞サンプルの回収のためのダクロン製スワブ；分析のために研究室に輸送される間サンプルを安定化させるためのサンプル輸送培地；特定の核酸標的のためのプロモーター−プライマー：トリミングプローブまたは少なくとも一つの３'-５'エキソヌクレアーゼまたは核酸中の標的領域のあらゆる配列の３'をトリミングバックするための少なくとも一つの３'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ；一つ以上のＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡポリメラーゼ（一つまたは複数）；検出される転写物に特異的な一つ以上のプローブ；中和用プローブ希釈剤；抗ハイブリッド抗体または基質でコートされた試験管またはマイクロタイターウエル；ヌクレアーゼ例えばRNアーゼ、好ましくは慣用手段により検出されうるコンジュゲートされた抗ハイブリッド抗体も含む溶液中に含まれる；および他の必要なコントロールを含む。キットは、各々の検出プローブのためのネガティブコントロールおよびポジティブコントロールを含むべきである。好ましくは、ネガティブコントロールは、検出プローブに相補でない配列の酵素合成ＲＮＡである。ポジティブコントロールは、好ましくは、プローブに相補な配列の酵素合成ＲＮＡである。一般的には、アッセイを用いることにより、典型的な検体体積100μlを用いて検体mlあたり１pgのＲＮＡを検出することができる。以下の実施例は、本発明の増幅方法および検出アッセイおよびキットの使用を例示する。これらの実施例は、例示のために提供され、そしてあらゆる様式において本発明を限定することを意図しない。本明細害にて引用されたすべての文献は、引用により特別に編入される。実施例１合成ポリマーＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモーターコア配列およびＨＩＶ−１に相補な２０塩基領域を周辺に有する６２塩基のオリゴヌクレオチドプロモーター−プライマーを化学合成した。プロモーター−プライマーのHIV-1領域はHIVに関して非近接であり、そしてゲノムのgag領域中の塩基665から684および塩基1415に伸びる（アダチ（Adachi A ）ら、1986，J．Virol 59：284-291［受け入れ番号 M19921］）。Ｔ７ポリメラーゼプロモーター領域のコンスンサス配列は、よく特徴付けされており（オークリー（Oakley，J．L.）とコールマン（Coleman，J．E.），1977，Proc．Natl．A cad．Sci．USA 74：4266-4270；ダン（Dunn，J．J.）とシュツディア（Studier ，F.W.），1983，J．Mol．Biol.，166：477-535）、二本鎖の場合のみ機能する（ミリガン（Milligan，J．F.）ら、1987，Nuc．Acids Res 15：8783-8799）。一本鎖のプロモーター−プライマーは、従って、ＲＮＡ合成の前に３'→５'エキソヌクレアーゼ／５'→３'ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性を組み合わせることにより二本鎖に作成した。プロモーター−プライマーオリゴヌクレオチドの配列は、転写開始部位（＋１を付した）の17塩基上流からのＴ７プロモーター保存コア領域を含む。１７塩基コア領域のすぐ下流のＧＧＧＡヌクレオチド配列は、転写開始の好ましい部位である（ミリガン（Milligan，J．F.）ら、1987，Nuc Acids R es 15：8783-8799）。プロモーター領域とHIV-1配列の間のヌクレオチドは、便宜上挿入されたEcoRI制限部位を生じる。ＣＡＲ法を例示するために、プラスミドを構築および修飾してさまざまなＤＮＡモデル標的を生じさせた。異なる標的を生じるように使用されたＤＮＡは、HI V-1のgag領域からの1181bpのHindIII断片である。この断片を、プラスミドpNL4- 3（アダチ（Adachi）ら、1986，J Virol 59：284-291）からpIC20H（マーシュ（ M arsh，J.）ら、1984，Gene 32：481-485）のHindIII部位にサブクローン化して、プラスミドpRK15（図２）を作成した。異なる制限エンドヌクレアーゼを用いたプラスミドpRK15の消化、続く断片のゲル精製により、さまざまな異なる標的種が形成される。これらは図３に示され、そして各々の標的断片を用いたプロモーター−プライマーのハイブリダイゼーションの後に精製された構造を示す。直鎖状および環状構造の両者がpRK15を切断する特定の制限エンドヌクレアーゼに依存して形成されうる。直鎖状および環状ハイブリッド構造の両者に関して、二本鎖プロモーター領域を合成する前に、標的領域の３'のあらゆる一本鎖配列（本明細書では「３'エンドテイル」と呼ぶ）を３'→５'エキソヌクレアーゼにより除去してよい。標的ＤＮＡに依存して、３'エンドテイルの長さは０から736塩基であった。各標的を生じさせるためにpRK15を消化するのに使用された酵素を表１に示す。ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメラーゼ反応それぞれの標的（反応あたり、０、５×１０⁴、５×１０⁶、５×１０⁷または５×１０⁸分子）を、１×Ｖｅｎｔ（商標）ポリメラーゼ緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）（１０ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ₄）ＳＯ ₄ ，２０ｍＭＴｒｉs−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），２ｍＭＭｇＳＯ₄および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）、５５ｎＭプロモーター−プライマー、０．５ｍＭ各ｄＮＴＰおよび２ユニットのＶｅｎｔ（商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を含む、最終容量１５ μｌのハイブリダイゼーションミックスに加えた。まずＤＮＡを１００℃で５分間変性し、次にプロモーター−プライマーと４８℃で３０分間ハイブリダイズさせた。この期間の終わりに、１ユニット（１μｌ）のＶｅｎｔ（商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）をそれぞれのチューブに加えた。次にチューブを７５℃で３０分間インキュベートし、試料をＨ₂Ｏで１００μｌに希釈することにより反応を停止させた。次に試料をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（４９．５／４９．５／１）で抽出し、さらにＨ₂Ｏで容量５００ μｌに希釈した。全てのＤＮＡ試料を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−３０濾過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ）で最終容量１０μｌに濃縮した。転写反応ＤＮＡ試料(１０μｌ)を、１０ｍＭＤＴＴ，２ｍＭ各ＮＴＰ，４０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ８．０，８ｍＭＭｇＣｌ₂，７５ｍＭＮａＣｌ，１００μ ｇ／ｍｌＢＳＡ，５ユニット／μｌＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ），０．０２５ユニット／μｌ無機ピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）および６ユニット／μｌＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む最終容量５０μｌ中で転写させた。転写反応は３７℃で２時間実施した。実施例２増幅されたＲＮＡ転写産物の検出単一のビオチニル化プライマー（ＰｒｏｍｅｇａｐＧＥＭ３Ｚの８６４−８８５位）および非ビオチニル化プライマー（ＰｒｏｍｅｇａｐＧＥＭ３Ｚの１８０−２０２位）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により５’末端ビオチニル化ＤＮＡプローブを合成した。ｐＲＫ１５およびｐＧＥＭ３ＺのＤＮＡ配列はこれらの領域内で同一であるが、ｐＲＫ１５をＰＣＲテンプレートとして用いた。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓＧｅｎｅＡｍｐ（商標）キットからの試薬、２ｍＭＭｇＣｌ₂および０．５μＭの各プライマーを用いて、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＤＮＡ熱サイクラーを用いて実施した。ＰＣＲ増幅に用いた熱サイクルのプロファイルは、最初に９５℃で３分間の変性段階、続いて４０回の増幅サイクル（９４℃で１分間、５５℃で２分間、および７２℃で２分間）を含み、７２℃で１０分間の伸長で終了した。７０４塩基のＰＣＲ生成物をＭａｇｉｃ（商標）ＰＣＲ調製ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。ＣＡＲ合成ＲＮＡの検出は、ＳＨＡＲＰＳｉｇｎａｌ（商標）システム（ＤｉｇｅｎｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＳｉｌｖｅｒＳｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を変更して用いて測定した。ビオチニル化ＤＮＡの５μｌのアリコートをＳＨＡＲＰ（商標）試料希釈液５μｌおよびＳＨＡＲＰ（商標）変性試薬（ＤｉｇｅｎｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）２５μｌを含む混合物中で、室温で１０分間変性した。最初のインキュベーション期間の後、ＳＨＡＲＰ（商標）プローブ希釈液（ＤｉｇｅｎｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）２５μｌを反応に加え、全容量（６０μｌ）を転写反応試料チューブに移した。ビオチニル化ＤＮＡプローブはハイブリダイゼーションカクテル中に１ｎＭの最終濃度で存在していたことに注目されたい。ハイブリダイゼーションは、６５℃で３０分間実施した。ハイブリダイゼーションの後、混合物をストレプトアビジン被覆プレートに移し、室温で１１００ｒｐｍで３０分間振とうした。混合物をウエルからデカントし、ＳＨＡＲＰ（商標）検出試薬（ＤｉｇｅｎｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）１００μｌを加え、プレートを室温で１１００ｒｐｍで３０分間振とうした。次に、ウエルをＳＨＡＲＰ（商標）洗浄溶液（ＤｉｇｅｎｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）で５回、Ｈ₂ Ｏで２回洗浄し、ペーパータオル上にブロットして過剰の液体を除去した。最後に、ＳＨＡＲＰ（商標）基質１００μｌを加え、プレートを３７℃で１−１２時間インキュベートした後、プレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で４１０ｎｍの吸収の読みを得た。実施例３３’テイルおよびテンプレートのタイプのＣＡＲに及ぼす影響３’テイルおよびテンプレートのタイプのＣＡＲに及ぼす影響を表２にまとめる。バックグラウンドは試料１で表され、これは標的ゼロの対照である。環状標的（試料２−６）から得られたシグナルと線状標的６（試料７−１１）から得られたシグナルとの比較、または環状標的４（試料１２−１６）から得られたシグナルと線状標的７（試料７−２１）から得られたシグナルとの比較は、線状と環状と標的増幅の間には有意な相違がなかったことを示す。しかし、３’テイルを欠失する標的からのシグナルと３’テイルのエキソヌクレアーゼ分解除去を必要とする標的から得られたものとを比較したとき、増幅に大きな相違が認められた。３’テイルを有する標的についてはシグナルは約１００倍少なかった。これらのデータは、ＤＮＡポリメラーゼによる２本鎖プロモーターの合成の前に３’テイルをエキソヌクレアーゼ分解除去することは反応を制限したことを示す。実施例４別のＤＮＡポリメラーゼの影響ＤＮＡポリメラーゼとエキソヌクレアーゼのいくつかの別の組み合わせを同時にまたは順番に用いて、ＣＡＲ法において機能的２本鎖プロモーターを生成することができる。反応条件によって、熱安定性酵素および非熱安定性酵素の両方を用いることができる。本発明のこの態様における第１の要件は、特定の標的が存在しない限りプロモーター領域が非機能性のままでいることである。上述した方法の別法として、ＤＮＡ合成反応の第２段階において、Ｖｅｎｔ（商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼのかわりにＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いた。実施例１に記載した反応条件は実質的に変更しなかったが、ただし次の点を変更した：標的７（図３を参照）を５×１０⁶から５×１０⁸の量で用いた。このＤＮＡ／プロモーター−プライマーハイブリッド構造は、３’テイル（１６８ヌクレオチド長さ）を残す。実施例１に記載したハイブリダイゼーション反応の第１段階において、Ｖｅｎｔ（商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼをＤｅｅｐＶｅｎｔ（商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で置き換えた。反応の第２段階においては、追加のＤＮＡポリメラーゼなしで反応を７５℃でインキュベートしたか、またはＤｅｅｐＶｅｎｔ（商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼを７５℃で加えたか、またはＴ７ＤＮＡポリメラーゼを加えて反応を３７℃でインキュベートした。結果を表３に示す。データは、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを用いると、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼの場合よりシグナルが５から１０倍増加することを示す。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼがＤｅｅｐＶｅｎｔ（商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼより高いかまたはより連続移動性の大きい（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、したがって３’テイルをより効率的に除去しうるためであるという仮説を立てることができる。３’テイルの除去は、酵素の５’→３’ポリメラーゼ活性が相補鎖を埋めて２本鎖Ｔ７ポリメラーゼ領域を生成することを可能とした。このことは最終的にＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる首尾よい転写に要求される。ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメラーゼ反応の条件は、２段階反応において最適化した。まず、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（第１ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下でハイブリダイゼーションを実施した。この第１段階における３’エキソヌクレアーゼ活性の欠失は１本鎖プロモーターの分解を防ぐが、同時にハイブリダイゼーションプロセスはアニーリングプロセスの間のプロモーター−プローブの３’末端の伸長により増強される（より長いプローブはハイブリッドをさらに安定化させる）。第２段階においては、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼまたはＴ７ＤＮＡポリメラーゼを加える。第２ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性（３’末端テイルを除去する）および５’→３’ポリマー化活性を有しており、このことにより２本鎖ＤＮＡ転写標的が合成される。前述のＴ７ＤＮＡポリメラーゼ法を用いるＣＡＲ技術を、より低い標的ＤＮＡ投入量を用いて繰り返した。この実験の結果を表４にまとめる。これらのデータは、システムが５×１０⁵の投入量のＤＮＡ標的分子を容易に検出しうることを明らかにする。実施例５Ｂ型肝炎ウイルスＣＡＲモデルシステムヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムは小さく、約３２００ｂｐであり、部分的に２本鎖のＤＮＡからなる。ｉｎｖｉｖｏでのウイルスの転写のための基質は、完全（−）ＤＮＡ鎖である。（−）鎖ＤＮＡは、全（＋）鎖ＤＮＡを欠失しているため、ＣＡＲプロモーター−プライマーとハイブリダイズさせるのに便利である。ＨＢＶの全ＤＮＡ配列がｉｎｖｉｖｏで単一のメッセージとして転写される（ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド形成を介して検出される）という事実は、上述のゲノムの性質と一緒になって、ＨＢＶをＣＡＲ技術の適切なモデル標的とする。合成プロモーターＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターコア配列を含み、ＨＢＶ配列に相補的な２５塩基領域でフランクされた２つの７５塩基オリゴヌクレオチドプロモーター−プライマーを化学的に合成した。プロモーター−プライマーＨＢＶ−３２（１．６ｋｂＨＢＶを用いる環状ＣＡＲ用）５’−Ｐ−ＣＴＣＣＣＣＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｔ３’ プロモーター−プライマーＨＢＶ−３１（ＨＢＶの全ゲノムを用いる環状および線状ＣＡＲ用）５’−Ｐ−ＣＴＣＣＣＣＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ａ−３’ 主要サブタイプ（ａｄｗ２，ａｄｗ，ａｄｒ１，ａｄｒ２，ａｙｒ，ａｙｗ１およびａｙｗ２）からのＨＢＶＤＮＡ配列の並置は、高度に保存されたヌクレオチド配列のストレッチを示し、これを用いて上述のＣＡＲプロモーター−プライマーを生成した。プロモーター−プライマーのＨＢＶ領域は、ＨＢＶに関して連続的ではなく、分析した全ての主要ＨＢＶＤＮＡサブタイプにわたって保存されている。このことは、ＣＡＲ法を用いて異なるＨＢＶサブタイプを増幅し検出することを可能とした。プロモーター−プライマー中のＨＢＶ配列は、ＨＢＶ −３２プロモーター−プローブについてはゲノムの塩基１５４７から塩基１５７１まで（Ｘ遺伝子コード領域）および塩基２２４から２６８まで（ＨＢｓＡｇコード領域）、ＨＢＶ−３１プロモーター−プローブについては塩基１５４７から塩基１５７１まで（Ｘ遺伝子コード領域）および塩基２４１５から２４３９まで（ＨＢｃＡｇコード領域）伸長された（ＡｎｎｅｋｅＫ．ＲａｎｅｙａｎｄＡｌａｎＭｃＬａｃｈｌａｎ，ＴｈｅＢｉｏｌｏｇｙＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＶｉｒｕｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＶｉｒｕｓ，ＡｌａｎＭｃＬａｃｈｌａｎ，Ｅｄｓ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓＩｎｃ．，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９９１，５−１３）。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域のコンセンサス配列はよく特徴付けされており（Ｏａｋｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄＣｏｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｅ．１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：４２６６−４２７０；Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．１９８３，ＪＭｏｌＢｉｏｌ１６６：４７７−５３５）、２本鎖であるときにのみ機能性である（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｆ．ｅｔａｌ．，１９８７，ＮｕｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１５：８７８３−８７９９）。１本鎖プロモーター−プライマーは、好ましくは、３’→５’エキソヌクレアーゼ／５’→３’ ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性の組み合わせにより、ＤＮＡ合成の前に、デュープレックスになるように作成される。プロモーター−プライマーオリゴヌクレオチドの配列は、転写開始部位（＋１と表される）から１７塩基上流に延びたＴ７プロモーター保存コア領域を含有していた。１７塩基コア領域からすぐ下流のＧＧＧＡヌクレオチド配列は、転写開始に関して好ましい部位である（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，１９８７ＮｕｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１５：８７８３−８７９９）。プロモーター領域とＨＢＶ配列との間のヌクレオチドは、便宜のために挿入されたＥｃｏＲＩ制限部位を生成した。７５−ｍｅｒのプロモーター−プライマーも、最後、最後から２番目及び最後から３番目のヌクレオチド間（ブロックされた末端）に、５’末端リン酸結合と３’末端ホスホロチオエート結合をもっていた。２つのタンデムなホスホロチオエート結合は、酵素の５’−３’重合活性に干渉することなく、ＤＮＡポリメラーゼによるプロモーター−プライマーの３’−５’エキソヌクレアーゼ的順次切断（processive cleavage）を妨げた。２つの異なるプロモーター−プライマーを用いて、ＣＡＲによってコピーし転写すべき標的ＤＮＡの大きさと配列に依存して、長さが異なる５’及び／又は３ ’テイルをもつ、異なる寸法のハイブリダイズ化サークルを作製した。実施例６環状ＣＡＲを説明するために、２つのプラスミドを構築し、修飾して種々のＤＮＡ標的を作製した。異なる標的作製に用いたＤＮＡは、ＨＢＶａｙｗ及びａｄｗ２株由来の１５８１ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＢｓｉＨＫＡＩ断片であった。ｐＧＥＭ３ＺをＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで二重消化した後、これらの断片をプラスミドｐＧＥＭ３Ｚ（Promega）にクローン化してプラスミドｐＡＤＲＡＹＷ及びｐＡＤＲＡＤＷ２をそれぞれ作製した。プラスミドｐＡＤＲＡＹＷ及び／又はｐＡＤＲＡＤＷ２を異なる制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いで断片をゲル精製し、種々の異なる標的型を形成した。ｐＡＤＲＡＹＷ及び／又はｐＡＤＲＡＤＷ２を切断するのに用いた特定の制限エンドヌクレアーゼに依存して線状と環状の両方の構造が形成できる。線状及び環状ハイブリッド構造の両方にとって、標的の３’末端テイルがもし存在するならば、二本鎖プロモーター領域を合成する前にこれを３’→５’エキソヌクレアーゼによって除去しなければならない。ハイブリダイゼーション、ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼ反応（単一緩衝液／単一チューブ様式）反応緩衝液には、塩、ＤＴＴ、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、４種のＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）、１以上の適当なＲＮａｓｅ阻害剤及び１以上の適当な担体タンパク質を含んでいた。最終反応容量は２５μｌであり、反応緩衝液、標的ＤＮＡ（１０⁹分子）及びプロモーター−プライマー（１０¹³分子）を含んでいた。反応緩衝液、ＤＮＡ及びプロモーター−プライマーを混合し、１００℃で１分加熱した。加熱混合物を次いで３７℃で１０分冷却した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを５ユニットと、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを５ユニット混合物に加えて、３７℃で２時間インキュベートした。ＣＡＲ合成したＲＮＡの検出は、反応物を変性ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで染色して生成物を可視化することにより行った。特定ＲＮＡ転写物が観察され、これによってＣＡＲ法をＨＢＶモデル系に応用できることが示された。本発明のこれまでの記載から連続増幅反応及び対応のキットについての修飾や変更が当業者には自明であろう。このような修飾や変更は付属の請求の範囲内のものであることを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者デラロサ，アベルアメリカ合衆国メリーランド州20814，ベセスダ，ブリストル・スクウェアー・レーン 9803，ナンバー 103

Claims

【特許請求の範囲】１．標的核酸を増幅する方法であって：標的領域を含有する一本鎖核酸を用意する工程；前記核酸の標的領域を、中央プロモーター部分と該標的領域の非近接部分に相同性の２領域とを有するプロモーター−プライマーにハイブリダイズさせて、環状ハイブリッドを形成する工程；一本鎖配列３'を該標的領域の方へ刈り込んで、前記ハイブリッドの平坦な３'末端を生じさせる工程；該標的領域と該プロモーター−プライマーとの３'末端を伸長させて、二本鎖中間体を形成する工程；及び該二本鎖中間体を転写して、多くのＲＮＡ転写産物を各標的領域から作る工程；を含む方法。２．二本鎖核酸を変性し、それによって一本鎖核酸を用意することを更に含む、請求項１記載の方法。３．変性が、前記核酸を塩基で処理し；そしてハイブリダイゼーション中和緩衝液で中和することを含む、請求項２記載の方法。４．一本鎖核酸を捕捉プローブにハイブリダイズさせる、請求項１記載の方法。５．刈り込み及び伸長工程が、エキソヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１のＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる、請求項１記載の方法。６．刈り込み及び伸長工程が、少なくとも１のＤＮＡポリメラーゼと少なくとも１のエキソヌクレアーゼとを用いて行われる、請求項１記載の方法。７．プロモーター−プライマーが、修飾ヌクレオチド又はホスホジエステル結合を少なくとも１の究極３'末端位置において含む、請求項１記載の方法。８．標的領域を含有する核酸を検出する方法であって：前記標的領域を含む一本鎖核酸を用意する工程；前記核酸を、５'プロモーター部分と３'プライマー部分とを有する一本鎖プロモーター−プライマーにハイブリダイズさせてハイブリッドを形成する工程であって、前記３'プライマー部分が前記標的領域の３'部分に相補的な配列を含み、前記３'プライマー部分が少なくとも１の修飾ヌクレオチド又はホスホジエステル結合を更に含む工程；一本鎖配列３'を該標的領域の方へ刈り込んで、前記ハイブリッドの平坦な３'末端を生じさせる工程；前記標的領域と該プロモーター−プライマーとの３’末端を伸長させて、二本鎖中間体を形成する工程；該二本鎖中間体を転写して、多くのＲＮＡ転写産物を各標的領域から作る工程；及びＲＮＡ転写産物を検出工程；を含む方法。９．二本鎖核酸を変性し、それによって一本鎖核酸を用意することを更に含む、請求項８記載の方法。１０．変性が、前記核酸を塩基で処理し；そしてハイブリダイゼーション中和緩衝液で中和することを含む、請求項９記載の方法。１１．一本鎖核酸を捕捉プローブにハイブリダイズさせる、請求項８記載の方法。１２．刈り込み及び伸長工程が、エキソヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１のＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる、請求項８記載の方法。１３．刈り込み及び伸長工程が、少なくとも１のＤＮＡポリメラーゼと少なくとも１のエキソヌクレアーゼとを用いて行われる、請求項８記載の方法。１４．標的領域を含有する核酸を増幅する方法であって：前記標的領域を含有する一本鎖核酸を用意する工程；前記核酸を、前記標的領域の３'接合部に相補的な配列を含む刈り込みプローブにハイブリダイズさせて、機能性制限エンドヌクレアーゼ認識部位ハイブリッドを形成する工程；制限エンドヌクレアーゼ認識部位ハイブリッドを対応する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それによって刈り込まれた標的核酸を形成する工程；刈り込まれた標的核酸を変性して前記刈り込みプローブの残存部分を除去し、刈り込まれた一本鎖核酸を形成する工程；前記刈り込まれた一本鎖核酸を、二本鎖プロモーター部分と一本鎖プライマー配列とを有する部分的に二本鎖のプロモーター−プライマーにハイブリダイズさせて部分的に二本鎖のハイブリッドを形成する工程であって、前記配列が前記標的核酸の刈り込まれた３'末端領域に相補的であり、該二本鎖プロモータ一部分がハイブリダイゼーションで前記標的核酸の刈り込まれた３'末端に直接に接することになる工程；及び前記部分的に二本鎖のハイブリッドを転写して、多くのＲＮＡ転写産物を各標的領域から作る工程；を含む方法。１５．前記部分的に二本鎖のハイブリッドのプライマー部分を前記標的核酸の３'末端に連結することを更に含む、請求項１４記載の方法。１６．該部分的に二本鎖のハイブリッドを前記転写工程の前に伸長することを更に含む、請求項１４又は１５に記載の方法。１７．二本鎖核酸を変性し、それによって一本鎖核酸を用意することを更に含む、請求項１４記載の方法。１８．変性が、前記核酸を塩基で処理し；そしてハイブリダイゼーション中和緩衝液で中和することを含む、請求項１７記載の方法。１９．一本鎖核酸を捕捉プローブにハイブリダイズさせる、請求項１４記載の方法。２０．前記刈り込みプローブが少なくとも１のリガンドを保持する請求項１４記載の方法であって、更に：前記核酸にハイブリダイズした前記刈り込みプローブを、前記リガンドのための捕捉剤を保持する固体マトリックスに結合させ、それによって前記制限エンドヌクレアーゼ認識部位ハイブリッドを固定化する工程；前記マトリックスを洗浄する工程；前記制限エンドヌクレアーゼ認識部位ハイブリッドを対応する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それによって固定化されていない刈り込まれた標的核酸を形成する工程；及び固定化されていない標的核酸を固体マトリックスから分離する工程；を含む方法。２１．ＲＮＡ転写産物が、ａ．該ＲＮＡ転写産物を相補的ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせて、二本鎖ハイブリッドを形成する工程；ｂ．工程ａのハイブリッドを固相上に捕捉して、結合型ハイブリッドを形成する工程；ｃ．ハイブリダイズしなかった核酸を排除する工程；及びｄ．該結合型ハイブリッドを検出する工程；を含む方法により検出される、請求項８の方法。２２．ＤＮＡプローブが少なくとも１のリガンドで標識される、請求項９の方法。２３．ＤＮＡプローブがビオチニル化されかつ固相がストレプトアビジンで被覆されている、請求項２１の方法。２４．抗ハイブリッド抗体又は抗ハイブリッド抗体断片が固相に固定化されている請求項２１の方法であって、該抗体又は抗体断片が二本鎖ハイブリッドの一成分に特異的に結合する方法。２５．プローブが二本鎖ＤＮＡである請求項２１の方法であって、該プローブを塩基で処理して、ハイブリダイゼーション工程の前に一本鎖ＤＮＡを形成する追加の工程を含む方法。２６．生体試料中の核酸を増幅するためのキットであって： − 中央プロモーター部分と標的領域中の非近接配列に相同性の２領域とを有するプロモーター−プライマー； − 刈り込み剤； − 核酸ポリメラーゼ； − ＲＮＡポリメラーゼ；及び − 該生体試料の安定化のための試料輸送媒体；を含むキット。２７．生体試料中の核酸を増幅するためのキットであって： − ５'プロモーター部分と３'プライマー部分とを有するプロモーター−プライマーであって、前記プライマー部分が前記標的領域の３'部分に相補的な配列を含み、前記プロモーター−プライマーが少なくとも１の修飾ヌクレオチド又はホスホジエステル結合を更に含むプロモーター−プライマー； − 刈り込み剤； − 核酸ポリメラーゼ； − ＲＮＡポリメラーゼ；及び − 該生体試料の安定化のための試料輸送媒体；を含むキット。２８．請求項２６又は２７の成分を含む生体試料中の核酸を増幅及び検出するためのキットであって： − 二本鎖核酸ハイブリッドの形成のための標的ＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ検出プローブ； − 該処理されたプローブを希釈しそして中和するための中和用プローブ希釈剤； − コーティングで被覆された固相であって、そのコーティングに該プローブと該標的核酸配列とのハイブリダイゼーションにより形成されるハイブリッドが結合することになる固相；及び − 該プローブと該標的核酸配列とのハイブリダイゼーションにより形成されるハイブリッドを検出するための手段：を更に含むキット。２９．固相がストレプトアビジンで被覆されかつプローブがビオチニル化されている、請求項２８のキット。３０．固相が抗ハイブリッド抗体又は抗ハイブリッド抗体断片で被覆されている請求項２８のキットであって、該抗体又は抗体断片が二本鎖ハイブリッドの一成分に特異的に結合するキット。３１．ハイブリダイズしなかったプローブを排除するための手段がＤＮアーゼである、請求項２８のキット。３２．検出手段が抗ハイブリッド抗体又は抗ハイブリッド抗体断片である請求項２８のキットであって、該抗体又は抗体断片が二本鎖ハイブリッドの一成分に特異的に結合しかつ検出可能であるキット。