JPH11500618A

JPH11500618A - Ｄｎａ分子、その製造及び遺伝子治療における使用

Info

Publication number: JPH11500618A
Application number: JP8525455A
Authority: JP
Inventors: カムロン，ベアトリス; クルゼ，ジヨエル; ダルケ，アンヌ−マリー; シエルマン，ダニエル; ウイル，ピエール
Original assignee: ローヌ−プーラン・ロレ・エス・アー
Priority date: 1995-02-23
Filing date: 1996-02-21
Publication date: 1999-01-19
Also published as: FR2731014B1; HUP9801216A3; ZA961484B; US6143530A; CA2211427C; SK114397A3; CA2211427A1; EP0815214B1; IL117214A0; KR19980702406A; MX9706109A; AU709111B2; US6492164B1; ATE366806T1; HUP9801216A2; AU4882296A; CZ266897A3; DE69637156T2; BR9607273A; FI973467L

Abstract

(57)【要約】本発明は、環状形態であり、実質的に１種以上の有用遺伝子を含むことを特徴とする二本鎖ＤＮＡ分子に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ分子、その製造及び遺伝子治療における使用遺伝子治療は患部細胞又は器官に遺伝情報を導入することにより欠陥又は異常を治療する方法である。この情報は器官から抽出した細胞にインビトロ導入後に生物に再導入してもよいし、標的組織に直接インビボ導入してもよい。ＤＮＡは高分子量負電荷分子であるため、天然にはリン脂質細胞膜を通過し難い。そこで、遺伝子導入を可能にするために種々のベクターが使用されており、ウイルスベクターと、天然又は合成の化学及び／又は生化学ベクターに分けられる。ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等）は特に膜通過には非常に有効であるが、病原性、組換え、複製、免疫原性等のいくつかの危険がある。化学及び／又は生化学ベクターはこれらの危険を避けることができる（詳細についてはＢｅｈｒ，１９９３，ＣｏｔｔｅｎとＷａｇｎｅｒ，１９９３参照）。このようなベクターの１例は、ＤＮＡと共に沈殿を形成することにより作用するカチオン（リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン等）であり、このような沈殿は細胞により「貧食」されると考えられる。ＤＮＡを取り込み、形質膜と融合するリポソームでもよい。合成遺伝子導入ベクターは一般にＤＮＡと結合して表面に正電荷をもつ粒子を形成するカチオン脂質又はポリマーである。これらの粒子は細胞膜の負電荷と相互作用した後、細胞膜を通過することができる。このようなベクターの例としては、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ，Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））又はＮ−［１−（２，３− ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ，Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））を挙げることができる。ＤＮＡを濃縮し、リガンドと結合したポリカチオン部分から構成されるキメラタンパク質も開発されており、前記リガンドは膜レセプターに結合してエンドサイトーシスにより細胞内に複合体を運搬する。このように、導入した遺伝子のインビボ生体利用性を改善するために組織又は所定の細胞集団を「ターゲティング」することが理論的には可能である。しかし、化学及び／又は生化学ベクター又は裸のＤＮＡを使用すると、薬理学的純度のＤＮＡが多量に産生される可能性がある。実際に、これらの遺伝子治療技術では医薬は同一ＤＮＡにより構成されるので、ヒト治療用に適した性質をもつ適量のＤＮＡを製造できることが不可欠である。遺伝子治療で現在使用されているプラスミドは、（ｉ）複製起点と、（ｉｉ）抗生物質（カナマイシン、アンピシリン等）耐性遺伝子等のマーカー遺伝子と、（ｉｉｉ）その発現に必要な配列（エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化配列等）をもつ１種以上のトランスジーンをもつ。しかし、（Ｎａｂｅｌら，１９９２に記載されているようなメラノーマの治療等の臨床試験レベル又は実験レベルで）遺伝子治療に現在使用されているこれらのプラスミドは、特に生体内伝播に関連するいくつかの欠点がある。例えば、この伝播の結果、生体中に存在するコンピテント細菌はこのプラスミドを低頻度でしか受容できない。そのため、インビボ遺伝子治療でＤＮＡが患者の生体内で伝播してこの患者に感染する細菌又は共生フロラの細菌と接触する可能性は一層高くなる。プラスミドの受容細菌が大腸菌等の腸内細菌である場合には、このプラスミドは複製することができる。その結果、治療遺伝子の伝播が生じる。遺伝子治療で使用される治療遺伝子が例えばリンホカイン、成長因子、抗腫瘍遺伝子、又は宿主に欠損しているためにその遺伝子欠陥を治療することが可能な機能をもつタンパク質をコードし得る限り、これらの遺伝子の一部の伝播は（例えば病原細菌がヒト成長因子の遺伝子を獲得するような場合に）予測不能な気掛かりな結果を生じる恐れがある。更に、非ウイルス遺伝子治療で使用されているプラスミドは抗生物質（アンピシリン、カナマイシン等）耐性マーカーももつ。従って、プラスミドの耐性遺伝子を選択する抗生物質と同一ファミリーの抗生物質を使用する全抗生剤療法は該当プラスミドを選択することになるので、このようなプラスミドを獲得する細菌は明らかに優先的に選択される。因に、アンピシリンは世界で最も広く使用されている抗生物質ファミリーであるβ−ラクタムに属する。従って、治療遺伝子と耐性遺伝子の伝播を最大限に制限するように努めることが必要である。更に、プラスミドがプラスミドのベクター部分に対応する遺伝子（複製に必要な機能、耐性遺伝子）をもつ場合には、これらの遺伝子がトランスフェクトした細胞で発現される危険もある。実際に、プラスミド上の宿主の発現シグナルに起因する除去不能な転写バックグラウンドが存在する。外来タンパク質は潜在的に免疫原性であり、従って、トランスフェクトした細胞の免疫系により攻撃されるので、その発現は所定数の遺伝子治療で全く有害である。従って、治療用に適した遺伝子純度をもつ医薬ＤＮＡ分子を入手できることが特に重要である。これらのＤＮＡ分子を医薬用途に適した量で製造可能な方法を実現できることも特に重要である。本発明はこれらの問題を解決する。実際に、本発明は遺伝子治療で利用可能であり、非常に改善された遺伝子純度と高い生体利用性をもつＤＮＡ分子に関する。本発明はこれらの分子の製造及び精製に特に有効な方法にも関する。本発明は特に、遺伝子治療で利用可能であり、任意の非治療領域を実質的に欠失するＤＮＡ分子の開発にある。本発明によるＤＮＡ分子は環状構造で小サイズの超らせん状であることからミニサークルとも呼ばれ、多数の利点がある。本発明によるＤＮＡ分子はまず第１に、（１）治療遺伝子の無制御な過剰発現を誘導し得る複製及び伝播（dissemination）、（２）耐性遺伝子の伝播及び発現、（３）プラスミドの非治療部分に存在する潜在的に免疫原性及び／又は炎症性の遺伝子の発現等のプラスミドの伝播に結びつけられる危険を回避できる。本発明によるＤＮＡ分子に含まれる遺伝情報は（複製起点や、抗生物質耐性遺伝子等を含まず）実際に治療遺伝子とその発現調節シグナルに実質的に限られる。これらの分子（従ってこれらの分子に含まれる遺伝情報）が微生物移入され、安定に維持される可能性はほぼゼロである。更に、本発明によるＤＮＡ分子はサイズが小さいため、潜在的に良好なインビボ生体利用性をもつ。特に、改善された細胞侵入および細胞分布の能力をもつ。因に、組織内の拡散係数は分子量に反比例すると認められている（Ｊａｉｎ，１９８７）。また、細胞レベルでは高分子量分子は細胞膜を透過しにくい。更に、高分子量はプラスミドの発現に不可欠な核への移動にも適さず、核膜孔は核拡散に寸法制限を加える（Ｌａｎｄｆｏｒｄら，１９８６）。本発明によるプラスミドは非治療部分（特に複製起点と耐性遺伝子）を欠失するため、ＤＮＡ分子のサイズを低減することもできる。例えば複製起点と耐性マーカー（ベクター部分）が３ｋｂ、トランスジーンとその発現に必要な配列が３ｋｂとするならば、この低減は２分の１と予想することができる。（ｉ）分子量と（ｉｉ）負電荷のこの低下により、本発明の分子は改善された拡散能と組織、細胞及び核生体利用性をもつ。従って、本発明の第１の目的は、環状であり、本質的に１種以上の有用遺伝子を含むことを特徴とする２本鎖ＤＮＡ分子にある。上述のように、本発明の分子は非治療領域、特に複製起点及び／又はマーカー遺伝子を実質的に欠失する。更に、本発明の分子は超らせん状であるという利点がある。本発明は、これらの治療用ＤＮＡ分子の製造に特に有効な方法、構築物及び特定細胞宿主の開発にもある。より詳細には、本発明による方法は部位特異的組換えによりプラスミド又は染色体から切り出すことにより上記治療用ＤＮＡ分子を製造することを特徴とする。本発明による方法は、プラスミドの予備精製段階が不要であり、非常に特異的であり、特別に有効であり、ＤＮＡ生産量が低下せず、非常に高い遺伝子純度と高い生体利用性の治療用分子が直接得られるという点で特に有利である。この方法は実際に、主に有用遺伝子と、発現が所望される細胞、組織、臓器、器官又は完全生物で前記遺伝子の発現を可能にする調節配列を含む環状ＤＮＡ分子（ミニサークル）を生成する。更に、その後、これらの分子を慣用技術により精製してもよい。部位特異的組換えは、配列間の部位特異的組換えを引き起こす種々の系により実施することができる。より好ましくは、本発明の方法における部位特異的組換えは、一般にリコンビナーゼと呼ばれる特定タンパク質の存在下で相互に組換え可能な２種の特定配列により得られる。このため、本発明によるＤＮＡ分子は一般にこの部位特異的組換えにより生じる配列も含む。本発明の範囲内で使用される組換えを可能にする配列は一般に５〜１００塩基対、より好ましくは５０塩基対未満を含む。部位特異的組換えはインビボ（即ち宿主細胞内）で実施してもインビトロ（即ちプラスミド調製物上）で実施してもよい。この点で、本発明は上記治療用ＤＮＡ分子の製造に適した特定遺伝子構築物も提供する。これらの遺伝子構築物即ち本発明による組換えＤＮＡは特に、順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列によってフランキングされた１種以上の有用遺伝子を含む。順方向位置とは、２つの配列が本発明による組換えＤＮＡ内で同一の５’−３’極性に従うことを意味する。本発明の遺伝子構築物は主に上記要素から構成される２本鎖ＤＮＡフラグメント（カセット）であり得る。これらのカセットはこれらの要素をそのゲノムに組み込んだ細胞宿主の構築に利用できる（図１）。本発明の遺伝子構築物はプラスミドでもよく、即ち所与の宿主細胞で複製することができ、順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列によってフランキングされた１種以上の有用遺伝子を含む任意の直鎖又は環状ＤＮＡ分子でもよい。これらのプラスミドはより具体的には、ベクター（例えばクローニング及び／又は発現ベクター）、ファージ、ウイルス等であり得る。本発明のこれらのプラスミドは、プラスミドの複製とその後のミニサークルの切り出しによってミニサークルを製造する目的で任意のコンピテント細胞宿主を形質転換させるために利用することができる（図２）。この点で、本発明の別の目的は順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列によってフランキングされた１種以上の目的遺伝子を含む組換えＤＮＡにある。本発明による組換えＤＮＡは好ましくは少なくともａ）複製起点及び場合によりマーカー遺伝子と、ｂ）順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列と、ｃ）前記配列ｂ）の間に配置された１種以上の有用遺伝子と、を含むプラスミドである。本発明による遺伝子構築物に存在する特定組換え系は、種々の起源のものでよい。特に、使用する特定配列及びリコンビナーゼは、種々の構造クラスに属するものを利用でき、特にバクテリオファージλのインテグラーゼのファミリー又はトランスポゾンＴｎ３のリゾルベースのファミリーに属するものを利用できる。バクテリオファージλのインテグラーゼのファミリーに属するリコンビナーゼのうちでは、特にファージλ（Ｌａｎｄｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９７（１９７７）１１４７）、Ｐ２２及びΦ８０（Ｌｅｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１９８５）４４６８）のインテグラーゼ、ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＨＰ１（Ｈａｕｓｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１９９２）６８５９）、ファージＰ１のインテグラーゼＣｒｅ、プラスミドｐＳＡＭ２のインテグラーゼ（ＥＰ３５０３４１）、又はプラスミド２μのリコンビナーゼＦＬＰを挙げることができる。本発明によるＤＮＡ分子がバクテリオファージλのインテグラーゼのファミリーの部位特異系を介して組換えにより製造される場合には、本発明によるＤＮＡ分子は一般に、対応するバクテリオファージ又はプラスミドの２つの結合配列ａｔｔ間の組換えにより生じる配列も含む。トランスポゾンＴｎ３のファミリーに属するリコンビナーゼのうちでは、特にトランスポゾンＴｎ３もしくはトランスポゾンＴｎ２１及びＴｎ５２２のリゾルベース（Ｓｔａｒｋら，１９９２）、バクテリオファージｍｕのインベルターゼＧｉｎ又はプラスミドのリゾルベース、例えばＲＰ４のｐａｒフラグメントのリゾルベース（Ａｂｅｒｔら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２（１９９４）１３１）を挙げることができる。本発明によるＤＮＡ分子がトランスポゾンＴｎ３のファミリーの部位特異系を介して組換えにより製造される場合には、本発明によるＤＮＡ分子は一般に、該当するトランスポゾンのリゾルベースの２つの認識配列間の組換えにより生じる配列も含む。特定態様によると、本発明の遺伝子構築物において、部位特異的組換えを可能にする配列はバクテリオファージから誘導される。より好ましくは、このような配列はバクテリオファージの結合配列（ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列）又は誘導配列である。これらの配列は、インテグラーゼと呼ばれるリコンビナーゼの存在下で相互に特異的に組換え可能である。誘導配列なる用語は、バクテリオファージの結合配列の改変により得られ、適当なリコンビナーゼの存在下で特異的組換え能力を維持する配列を意味する。そのような配列は、例えば、該結合配列の短縮フラグメントでもよいし、逆に他の配列（制限部位等）を付加して伸長したフラグメントでもよい。更には、突然変異、特に点突然変異により得られる変異体でもよい。本発明によると、バクテリオファージ又はプラスミドのａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列とは、該バクテリオファージ又はプラスミドに特異的な組換え系の配列のことであり、即ちａｔｔＰ配列は前記ファージ又はプラスミドに存在する配列であり、ａｔｔＢは対応する染色体配列である。好ましい例として、特にファージλ、Ｐ２２、Φ８０、Ｐ１、ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＨＰ１又はプラスミドｐＳＡＭ２もしくは２ μの結合配列を挙げることができる。これらの配列は配列番号１、２、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及び１４の配列の全部又は一部から選択すると有利である。これらの配列は特に、これらのファージの結合配列の中心相同領域を含む。この点で、本発明による好ましいプラスミドは、（ａ）細菌複製起点及び場合によりマーカー遺伝子と、（ｂ）ファージλ、Ｐ２２、Φ８０、ＨＰ１、Ｐ１又はプラスミドｐＳＡＭ２もしくは２μから選択されるバクテリオファージのａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列又は誘導配列と、（ｃ）前記配列ｂ）の間に配置された１種以上の有用遺伝子を含む。特に好ましい態様によると、λファージの結合配列（ａｔｔＰ及びａｔｔＢ）を含む。これらの配列をもつプラスミドは特にプラスミドｐＸＬ２６４８、ｐＸＬ２６４９又はｐＸＬ２６５０である。これらのプラスミドをインビボ又はインビトロでλファージのインテグラーゼの存在下におくと、配列が相互に組換えられ、切り出しにより、主に要素（ｃ）即ち治療部分を含む本発明によるミニサークルがインビボ又はインビトロで生成される（図２）。更に本発明の特定態様によると、部位特異的組換えを可能にする配列はファージＰ１のｌｏｘＰ領域から誘導される。この領域は、Ｃｒｅと呼ばれるタンパク質の存在下で相互に特異的に組換え可能な２つの逆方向反復配列から主に構成される（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０（１９７１）４６７）。従って、特定変形例によると本発明は、（ａ）細菌複製起点及び場合によりマーカー遺伝子と、（ｂ）バクテリオファージＰ１の逆方向反復配列（ｌｏｘＰ領域）と、（ｃ）前記配列ｂ）の間に配置された１種以上の有用遺伝子を含むプラスミドに関する。別の特定態様によると、本発明の遺伝子構築物において、部位特異的組換えを可能にする配列はトランスポゾンから誘導される。より好ましくは、このような配列はトランスポゾンのリゾルベースの認識配列又は誘導配列である。好ましい例としては、トランスポゾンＴｎ３、Ｔｎ２１及びＴｎ５２２の認識配列を特に挙げることができる。好ましい例としては、配列番号１５の配列又はその誘導体を挙げることができる（Ｓｈｅｒｒａｔ，Ｐ．１６３−１８４，ＭｏｂｉｌｅＤＮＡ，Ｄ．ＢｅｒｇとＭ．Ｈｏｗｅ編，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．１９８９も参照のこと）。特に有利な別の変形例によると、本発明のプラスミドはマルチマーの分解配列も含む。このような配列は、好ましくはプラスミドＲＫ２のｍｒｓ（マルチマー分解系）配列である。より好ましくは、本発明は、（ａ）細菌複製起点及び場合によりマーカー遺伝子と、（ｂ）ファージλ、Ｐ２２、Φ８０、ＨＰ１、Ｐ１又はプラスミドｐＳＡＭ２もしくは２μから選択されるバクテリオファージの順方向ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列又は誘導配列と、（ｃ）前記配列ｂ）の間に配置された１種以上の有用遺伝子及びプラスミドＲＫ２のｍｒｓ配列を含むプラスミドに関する。この態様は特に有利である。因にプラスミドｐＸＬ２６４９又はｐＸＬ２６５０をインビボでバクテリオファージのインテグラーゼの存在下におくと、配列が組換えられ、ミニサークルとミニプラスミドのみならず、ミニサークル又はミニプラスミドのマルチマー又はトポロジー形態も生成される。ミニサークルの生産を増加し、その精製を容易にするためには、これらの形態の濃度を低下できることが特に有利である。プラスミドのマルチマー形態は当業者に公知である。例えばＣｏｌＥ１のｃｅｒフラグメント（Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９８４Ｃｅｌｌ３６ｐ１０９７）又はＲＫ２の遺伝子座ｐａｒのｍｒｓ部位（Ｌ．Ｅｂｅｒｔ１９９４Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２ｐ１３１）はプラスミドのマルチマーの分解が可能であり、プラスミドの安定性の増加を助長する。但し、ｃｅｒ部位での分解には大腸菌のゲノムによりコードされる４種のタンパク質が必要であるが（Ｃｏｌｌｏｍｓら，１９９０Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２ｐ６９７３）、ｍｒｓ部位での分解にはＲＫ２の遺伝子座ｐａｒにマッピングされる遺伝子ｐａｒＡをコードするタンパク質ＰａｒＡしか必要としない。このため、ｐａｒＡとｍｒｓ配列を含む遺伝子座ｐａｒの全部又は一部を利用すれば有利であると思われる。例えば、ｍｒｓ配列をλファージのａｔｔＢ及びａｔｔＰ配列間に配置すると、遺伝子ｐａｒＡをその固有のプロモーター又は誘導プロモーターからトランス又はシス発現させることができる。この点で、本発明の特定プラスミドは、（ａ）細菌複製起点及び場合によりマーカー遺伝子と、（ｂ）ファージλ、Ｐ２２、Φ８０、ＨＰ１、Ｐ１又はプラスミドｐＳＡＭ２もしくは２μから選択されるバクテリオファージの順方向ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列又は誘導配列と、（ｃ）前記配列ｂ）の間に配置された１種以上の有用遺伝子及びプラスミドＲＫ２のｍｒｓ配列と、（ｄ）プラスミドＲＫ２の遺伝子ｐａｒＡを含む。このようなプラスミドの１例は特に実施例に記載するプラスミドｐＸＬ２９６０である。このようなプラスミドを利用して固有のモノマー形態のミニサークルを生産することができる。別の有利な変形例によると、本発明のプラスミドは異なるファミリーの２組の部位特異的組換え配列を含む。このような配列は、第１組のインテグラーゼ依存性配列と、第２組のｐａｒＡ依存性配列が有利である。２組の配列を使用すると、最初の部位特異的組換えが不完全である場合にミニサークルの生産収率を増加することができる。因にプラスミドｐＸＬ２６５０又はｐＸＬ２９６０をインビボでバクテリオファージのインテグラーゼの存在下におくと、配列が組換えられ、ミニプラスミドとミニサークルが生産されるが、この反応は完全ではない（初期プラスミドの５〜１０％が残存し得る）。 λファージのａｔｔ配列の各々の近傍にＲＫ２のｍｒｓ配列を導入すると、ミニサークルの生産を増加することができる。例えばλファージのインテグラーゼの誘導とＩｎｔ依存性組換え後、非組換え分子はＲＫ２のタンパク質ＰａｒＡの調節下にｍｒｓ部位で組換え可能になる。他方、タンパク質ＰａｒＡの誘導とＰａｒＡ依存性組換え後に非組換え分子はλファージのインテグラーゼの調節下にａｔｔ部位で組換え可能になる。従って、このような構築物はミニサークルとごく少量の非組換え分子を生産することができる。ａｔｔ配列とｍｒｓ配列は共に順方向であり、ｉｎｔ及びｐａｒＡ遺伝子は同一誘導プロモーター又は２つの誘導プロモーターから同時又は順次誘導され得る。λファージの順方向結合配列ａｔｔＢ及びａｔｔＰとＲＫ２の２つの順方向ｍｒｓ配列を使用するのが好ましい。上述のように、本発明の別の態様は部位特異的組換えによりプラスミド又は染色体から切り出すことにより上記治療用ＤＮＡ分子を製造する方法にある。従って、本発明の別の目的は上記のような組換えＤＮＡを含む宿主細胞培養物を、部位特異的組換えを誘導することが可能なリコンビナーゼと接触させることを特徴とする、上記ＤＮＡ分子（ミニサークル）の製造方法にある。前記リコンビナーゼの遺伝子を含むプラスミド又はファージをトランスフェクト又は感染させるか、あるいは宿主細胞中に存在する前記リコンビナーゼをコードする遺伝子の発現を誘導することにより接触させるとより好ましい。後述するように、この遺伝子はゲノムに組み込まれた形態で宿主細胞中に存在してもよいし、複製プラスミド又は本発明のプラスミド上の非治療部分に存在してもよい。インビボ部位特異的組換えにより本発明によるミニサークルを生産できるようにするには、使用するリコンビナーゼを所定の時点で細胞又は培地に導入又は誘導しなければならない。このためには種々の方法を利用することができる。第１の方法によると、調節下にその発現を可能にする形態でリコンビナーゼの遺伝子を含む宿主細胞を使用する。前記遺伝子は特にプロモーターもしくは誘導プロモーター系の制御下におくか、又は感熱系に導入する。特に、増殖期は潜伏しており、適当な温度で誘導される温度感受性ファージに遺伝子を導入する（例えば溶原λファージＸｉｓ^--ｃＩ８５７）。リコンビナーゼの遺伝子の発現カセットはプラスミド、ファージ又は本発明のプラスミドの非治療領域に担持させることができる。前記カセットは宿主細胞のゲノムに組み込んでもよいし、複製形態のままでもよい。別の方法によると、増殖期後に細胞培養物にトランスフェクト又は感染させるために使用するプラスミド又はファージに遺伝子の発現カセットを担持させる。この場合には、遺伝子を調節下に発現可能な形態にする必要はない。特に、任意の構成プロモーターを使用することができる。リコンビナーゼとの接触は、タンパク質と共に直接インキュベートすることにより、プラスミド調製物上でインビボ実施することもできる。本発明の範囲内では、リコンビナーゼの遺伝子を調節下に発現させることが可能な宿主細胞を使用するのが好ましい。この態様は、リコンビナーゼが誘導後に宿主細胞により直接供給されるので特に有利である。実際に、部位特異的インビボ組換えとその結果として本発明のミニサークルの切り出しを誘導するためには、所望の時点で培養細胞をリコンビナーゼの遺伝子の発現条件（温度感受性遺伝子の許容温度、調節プロモーターのインデューサーの付加等）下におくだけで十分である。更に、リコンビナーゼの遺伝子を導入するためにトランスフェクション又は感染が必要な場合には必ずしもそうでないとしても、この切り出しは全培養細胞がリコンビナーゼを発現するので特に高い効率で実施される。第１の態様によると、本発明の方法はプラスミドから部位特異的組換えにより治療用ＤＮＡ分子を切り出すことを特徴とする。この態様は上記プラスミドを利用して選択した宿主でまず最初に複製を行った後、第２段階で部位特異的組換えにより前記プラスミドの非治療部分（特に複製起点と耐性遺伝子）を切り出して本発明の環状ＤＮＡ分子を生成する。この方法を実施するためには、種々の型のプラスミドを利用することができ、特にベクター、ファージ又はウイルスを利用できる。複製ベクターを利用するのが好ましい。本発明の方法は、上記のようなプラスミドで宿主細胞を形質転換させた後、適量のプラスミドが得られるように形質転換細胞を培養する予備段階を含むと有利である。その後、上記条件下でリコンビナーゼと接触させることにより、部位特異的組換えによる切り出しを行う（図２）。上述のように、この態様では部位特異的組換えはインビボ（即ち宿主細胞内）でもインビトロ（即ちプラスミド調製物上）でも実施できる。従って、好ましい態様によると、本発明のＤＮＡ分子は特に複製起点とマーカー遺伝子をもつ非治療部分を部位特異的組換えにより切り出すことにより、複製ベクターから得られる。別の態様によると、本発明の方法は部位特異的組換えにより細胞宿主のゲノムからＤＮＡ分子を切り出すことを特徴とする。この態様はより詳細には、組換えを可能にする配列によってフランキングされた有用遺伝子を含むカセットの１個以上のコピーをそのゲノムに挿入した細胞宿主の構築にある（図１）。宿主細胞のゲノムに本発明のカセットを挿入するためには種々の技術を利用することができる。特に、組み込みベクターを利用することにより、ゲノムの複数の異なる場所に挿入できる。この点では、ミニＭｕ系や例えばＴｎ１０の誘導体等の欠損トランスポゾン等の種々の転位系を使用することができる（Ｋｌｅｃｋｎｅｒら，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２０４（１９９１）１３９；ＧｒｏｉｓｍａｎＥ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２０４（１９９１）１８０）。１種以上の有用遺伝子にフランキングする２つの順方向組換え配列を含むカセットを細菌ゲノムに組み込むことが可能な相同組換えにより挿入を実施することもできる。この方法は細胞１個当たりできるだけ多数のコピーが得られるように所望回数反復することができる。別の方法としては、カセットの１コピーから最大限の数に増加するように、Ｌａｂａｒｒｅら（ＬａｂａｒｒｅＪ．，Ｏ．Ｒｅｙｅｓ，Ｇｕｙｏｎｖａｒｃｈ及びＧ．Ｌｅｂｌｏｎ．１９９３．Ｇｅｎｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｔｔｈｅｇｄｈＡｌｏｃｕｓｏｆＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：１００１− １０７）に記載されているような組換えを利用するインビボ増幅系を使用してもよい。好ましい方法の１例はミニＭｕの使用である。このためには、耐性マーカーと、転位に必要なシス機能と、有用遺伝子にフランキングする２つの順方向組換え配列を含むカセットを含むミニＭｕの誘導体を構築する。ゲノムあたり複数のコピーを選択できる耐性マーカー（例えばカナマイシン）を使用することにより、これらのミニＭｕをゲノムの複数の場所に配置すると有利である（ＧｒｏｉｓｍａｎＥ．前出）。上述のように、問題の宿主細胞は順方向組換え配列によってフランキングされたフラグメントの切り出しを誘導する特定部位リコンビナーゼも誘導的に発現できる。切り出し後、ミニサークルを慣用技術により精製してもよい。本発明の方法のこの態様は、単一型のプラスミド分子として本発明のミニサークルを生産できるので特に有利である。細胞は実際に、プラスミドから生産する場合のように他のエピソームプラスミドを全く含まない（図１及び２）。本発明の別の目的は、上記のような組換えＤＮＡの１個以上のコピーをそのゲノムに挿入した改変宿主細胞でもある。本発明は更に、上記のようなプラスミドを含む任意の組換え細胞にも関する。これらの細胞は、所与の細胞にＤＮＡを導入することが可能な当業者に公知の任意の技術により得られる。このような技術としては特に、形質転換、エレクトロポレーション、接合、プロトプラスト融合又は当業者に公知の他の任意の技術が挙げられる。形質転換については、種々のプロトコールが従来技術に記載されている。特に、細胞の形質転換はＩｔｏら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３（１９８３）１６３−１６８）に記載の技術に従って酢酸リチウムとポリエチレングリコールの存在下又はＤｕｒｒｅｎｓら（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１８（１９９０）７）の技術に従ってエチレングリコールとジメチルスルホキシドの存在下で完全細胞を処理することにより実施できる。ヨーロッパ特許出願第ＥＰ３６１９９１号にも代替プロトコールが記載されている。エレクトロポレーションについては、ＢｅｃｋｅｒとＧｕａｒｅｎｔｔｅ（ｉｎ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶｏｌ１９４（１９９１）１８２）に従って実施することができる。本発明による方法は任意の型の細胞宿主で実施することができる。特に、細菌又は真核細胞（酵母、動物細胞、植物細胞）等を利用できる。細菌のうちでより好ましいものとして、大腸菌、枯草菌、ストレプトミセス、シュードモナス（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｒｈｉｚｏｎｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ又はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ等を挙げることができる。細菌のうちでは大腸菌を使用するのが好ましい。酵母のうちでは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ等を挙げることができる。哺乳動物細胞のうちではＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等を挙げることができる。本発明によるプラスミドは、使用する宿主に応じてその複製を可能とするように当業者により適応される。特に、複製起点とマーカー遺伝子は選択する宿主細胞に応じて選択される。マーカー遺伝子は特に抗生物質（アンピシリン、カナマイシン、ゲネチシン、ハイグロマイシン等）に対して耐性の遺伝子でもよいし、細胞が欠損する機能（例えば染色体で欠失しているか不活性にされている遺伝子）を細胞に与え、プラスミド上でこの機能を回復する任意の遺伝子でもよい。特定態様では、本発明の方法はミニサークルの付加的精製段階を含む。この点では、ミニサークルはプラスミドＤＮＡと同様に超らせん状であるので、プラスミドＤＮＡの慣用精製技術により精製することができる。これらの技術としては特に、臭化エチジウムの存在下の塩化セシウム密度勾配上の精製や、アニオン交換カラムの使用が挙げられる（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）。更に、非治療部分（特に複製起点と選択マーカー）に対応するプラスミドＤＮＡが非常に多量に存在すると予想される場合には、プラスミドを消化し且つミニサークルを消化しない１種以上の制限酵素を精製後又は前に使用することも可能であり、こうすると、臭化エチジウムの存在下の塩化セシウム密度勾配等のように直鎖ＤＮＡから超らせんＤＮＡを分離する技術によって分離することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）。更に、本発明は改善されたミニサークルの精製方法にも関する。この方法は、１段階で非常に高純度のミニサークルが高収率で得られる。この改善方法は、ミニサークル上に存在する２本鎖配列と特異的リガンドの相互作用に基づく。リガンドは種々のものを利用でき、特にタンパク種、化学種又は核酸種を利用できる。核酸型リガンドが好ましく、特に場合により化学的に修飾され、本発明のＤＮＡ分子上に存在する特定配列とハイブリダイゼーションにより三重螺旋を形成することが可能なオリゴヌクレオチドが好ましい。実際に、所定のオリゴヌクレオチドは２本鎖ＤＮＡ配列と特異的に三重螺旋を形成できることが立証されている（Ｈｅｌｅｎｅら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０４９（１９９０）９９；参考資料として本明細書の一部とする仏国特許出願第ＦＲ９４１５１６２号も参照）。従って、特に有利な変形例では、本発明のＤＮＡ分子はリガンドと特異的に相互作用することが可能な配列も含む（図３）。このような配列は、ハイブリダイゼーションにより特定オリゴヌクレオチドと三重螺旋を形成することが可能な配列が好ましい。この配列は有用遺伝子の機能に影響しないので、本発明のＤＮＡ分子の任意の部位に配置することができる。この配列は本発明の遺伝子構築物（プラスミド、カセット）の有用遺伝子を含む部分にも存在する（特にプラスミドｐＸＬ２６５０参照）。本発明のＤＮＡ分子上に存在するこの特定配列は５〜３０塩基対を含むことが好ましい。本発明による方法を実施するために使用されるオリゴヌクレオチドは下記塩基を含み得る。 −２本鎖ＤＮＡのダブレットＡ．Ｔとトリプレットを形成することが可能なチミジン（Ｔ）（Ｒａｊａｇｏｐａｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ２８（１９８９）７８５９）； −２本鎖ＤＮＡのダブレットＡ．Ｔとトリプレットを形成することが可能なアデニン（Ａ）； −２本鎖ＤＮＡのダブレットＧ．Ｃとトリプレットを形成することが可能なグアニン（Ｇ）； −２本鎖ＤＮＡのダブレットＧ．Ｃとトリプレットを形成することが可能なプロトン化シトシン（Ｃ＋）（Ｒａｊａｇｏｐａｌら、前出）。好ましくは、使用するオリゴヌクレオチドはシトシンを含むホモピリミジン配列を含み、ＤＮＡ分子上に存在する特定配列はホモプリン−ホモピリミジン配列である。シトシンの存在により、シトシンがプロトン化されている場合には酸性ｐＨで安定な三重螺旋が得られ、シトシンが中和されている場合にはアルカリ性ｐＨで不安定な三重螺旋が得られる。ハイブリダイゼーションにより三重螺旋を形成できるようにするためには、オリゴヌクレオチドと本発明のＤＮＡ分子上に存在する特定配列が相補的であることが重要である。この点で、最良の収率と最良の選択性を得るために、本発明の方法では完全に相補的なオリゴヌクレオチドと特定配列を使用する。特に、オリゴヌクレオチドポリ−ＣＴＴと特定配列ポリ−ＧＡＡを使用できる。例えば、塩基ＧＡＧＧが三重螺旋を形成せずにオリゴヌクレオチドを結合アームから分離することができる配列ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ（配列番号５）のオリゴヌクレオチドを挙げることができる。当然のことながら、親和性をさほど低下させない程度であれば多少のミスマッチは許容できる。使用するオリゴヌクレオチドは天然種（修飾されていない天然塩基から構成）でもよいし、化学的に修飾してもよい。特に、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに対する耐性もしくは保護又は特定配列に対する親和性を増加できるように所定の化学的修飾を含むと有利である。例えば、骨格構造の修飾（例えばメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート等）によりオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより耐性にすることができる。オリゴヌクレオチドと特定配列の間の相互作用及び／又は親和性を改善することを特に目的とした別の型の修飾も考えられる。特に、本発明で完全に有利な修飾はオリゴヌクレオチドのシトシンのメチル化である。こうしてメチル化されたオリゴヌクレオチドは中性ｐＨで特定配列と安定な三重螺旋を形成する特筆すべき性質をもつ。従って、従来技術のオリゴヌクレオチドよりも高いｐＨ、即ちプラスミドＤＮＡの分解の危険が少ないｐＨで操作することができる。本発明の方法で使用するオリゴヌクレオチドの長さは少なくとも３、好ましくは５〜３０塩基である。１０塩基を越える長さのオリゴヌクレオチドを使用すると有利である。長さは所望の相互作用の選択性及び安定性に応じて当業者が適宜適応できる。本発明によるオリゴヌクレオチドは任意の公知方法により合成することができる。特に、核酸合成により製造することができる。当業者に公知の他の任意の方法も当然使用できる。本発明の方法を実施するためには、特異的リガンド（タンパク質、核酸等）を支持体にグラフトしてもよいししなくてもよい。このためには種々の型の支持体を使用することができ、例えば特に、カラムに予めパッケージングするかもしくはしない機能性クロマトグラフィー支持体、機能性プラスチック表面又は磁性もしくは非磁性の機能性ラテックスビーズが挙げられる。クロマトグラフィー支持体が好ましい。例えば、使用可能なクロマトグラフィー支持体はアガロース、アクリルアミド又はデキストラン及びそれらの誘導体（例えばＳｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ等）、ポリ（スチレンジビニルベンゼン）等のポリマー、又はグラフトするかしないシリカである。クロマトグラフィーカラムは拡散又は潅流方式で使用することができる。支持体に共有結合できるようにリガンドは一般に機能性である。オリゴヌクレオチドについては、例えばチオール、アミン又はカルボキシル末端基で５’又は３’位を修飾し得る。特に、チオール、アミン又はカルボキシル基を付加すると、例えばジスルフィド、マレイミド、アミン、カルボキシル、エステル、エポキシド、臭化シアン又はアルデヒド基をもつ支持体にオリゴヌクレオチドを結合することが可能になる。これらの結合は、オリゴヌクレオチドと支持体の間にジスルフィド、チオエステル、エステル、アミド又はアミン結合を設定することにより形成される。例えば二官能性結合試薬等の当業者の公知の他の任意の方法も使用できる。更に、結合したオリゴヌクレオチドの活性を改善するためには、「アーム」により結合すると有利である。アームを使用すると、実際に本発明のＤＮＡ分子との相互作用条件を改善できるように支持体から選択された距離にオリゴヌクレオチドを結合できる。アームはハイブリダイゼーションを妨げないヌクレオチド塩基から構成すると有利である。例えばアームはプリン塩基を含み得る。１例として、アームは配列ＧＡＧＧを含み得る。本発明によるＤＮＡ分子は生物、組織又は所与の細胞に遺伝子を導入するために任意のワクチン接種又は遺伝子及び細胞治療用途で使用することができる。特に、患者に接種する目的で直接インビボ投与に使用してもよいし、インビトロ又はエクスビボ細胞改変に使用してもよい。この点で、本発明による分子はそのまま（裸のＤＮＡ形態）で使用してもよいし、種々の合成又は天然の化学及び／又は生化学ベクターと組み合わせてもよい。このようなベクターとしては、ＤＮＡと沈殿を形成することにより作用するカチオン（リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン等）を特に挙げることができ、この沈殿は細胞によって「貧食」されると考えられる。ＤＮＡ分子を組み込み、形質膜と融合するリポソームでもよい。遺伝子導入用合成ベクターは一般に、ＤＮＡと結合してこれと共に表面に正電荷をもつ粒子を形成するカチオン脂質又はポリマーである。これらの粒子は細胞膜の負電荷と相互作用した後、これを通過することが可能である。このようなベクターの例としてはＤＯＧＳ（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））又はＤＯＴＭＡ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））を挙げることができる。ＤＮＡを濃縮し、リガンドと結合したポリカチオン部分から構成されるキメラタンパク質も開発されており、前記リガンドは膜レセプターに結合してエンドサイトーシスにより細胞内に複合体を運搬する。本発明によるＤＮＡ分子はボンバードメント、エレクトロポレーション等の物理的トランスフェクション技術により遺伝子を細胞に導入するためにも使用できる。更に、治療に使用する前に、本発明の分子を場合により例えば酵素切断により直鎖化してもよい。この点で、本発明の別の目的は少なくとも上記のようなＤＮＡ分子を含む任意の医薬組成物に関する。この分子は裸でもよいし、化学及び／又は生化学トランスフェクションベクターに結合してもよい。本発明による医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮等の経路で投与するように調合することができる。注射可能又は塗布形態でＤＮＡ分子を使用するのが好ましい。特に治療部位のレベルに直接注射するように注射可能な調合物に医薬的に許容可能な任意キャリヤーと混合することができる。キャリヤーとしては、特に滅菌等張溶液、又は場合に応じて滅菌水もしくは生理食塩水を加えると注射可能な溶液とすることができる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物が挙げられる。特にグルコース又は塩化ナトリウムを含む希釈されたＴｒｉｓ又はＰＢＳ緩衝液が挙げられる。患者の患部領域に核酸を直接注射すると、患部組織のレベルに治療効果を集中できるので有利である。核酸の使用量は種々のパラメーター、特に遺伝子、ベクター、使用する投与方法、該当疾病又は所望の治療期間に応じて適応できる。本発明のＤＮＡ分子は１種以上の有用遺伝子、即ち標的細胞中で転写して、好ましくは翻訳されると、治療、ワクチン、農学的又は獣医学的に有用な産物を産生する１種以上の核酸（ｃＤＮＡ，ｇＤＮＡ，合成又は半合成ＤＮＡ等）を含み得る。治療用有用遺伝子としては、より特定的には酵素をコードする遺伝子、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（例えばインターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等）（ＦＲ９２／０３１２０）、成長因子、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子（例えばＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５等）、アポリポタンパク質（例えばＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等）（ＦＲ９３／０５１２５）、ジストロフィン又はミニジストロフィン（ＦＲ９１／１１９４７）、腫瘍抑制遺伝子（例えばｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ等）（ＦＲ９３／０４７４５）、因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ等の凝血関連因子をコードする遺伝子、自殺遺伝子（例えばチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ等）、更には天然又は人工免疫グロブリン（Ｆａｂ、ＳｃＦｖ等）、リガンドＲＮＡ（ＷＯ９１／１９８１３）の全部又は一部等を挙げることができる。治療遺伝子は標的細胞で発現されると遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡの転写を制御することが可能なアンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列は、例えばヨーロッパ特許第ＥＰ１４０３０８号に記載の技術に従って標的細胞で細胞ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡに転写し、そのタンパク質への翻訳を阻止することができる。有用遺伝子はワクチン接種用遺伝子でもよく、即ちワクチン製造の目的でヒト又は動物で免疫応答を生じることが可能な抗原ペプチドをコードする遺伝子でもよい。このような遺伝子としては特に、エプスタイン−バールウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＥＰ１８５５７３）、偽狂犬病ウイルスの特異抗原ペプチド、又は腫瘍特異抗原ペプチド（ＥＰ２５９２１２）が挙げられる。一般に、本発明のプラスミド及び分子において治療、ワクチン、農学又は獣医学用有用遺伝子は更に、標的細胞又は生物（即ち哺乳動物）において機能する転写プロモーター領域と、３’未満に位置し、転写終結シグナル及びポリアデニル化部位を表す領域も含む（発現カセット）。プロモーター領域としては、該当細胞又は生物で機能し得るときに着目遺伝子の発現に天然に関与するプロモーター領域が挙げられる。別の起源の領域でもよい（他のタンパク質の発現に関与する領域でもよいし、合成領域でもよい）。特に、真核又はウイルス遺伝子のプロモーター配列を挙げることができる。例えば、標的細胞のゲノムに由来するプロモーター配列を挙げることができる。真核プロモーターとしては、ある遺伝子の転写を特異的又は非特異的、誘導又は非誘導的に強弱いずれかで刺激又は抑制する任意のプラスミド又は誘導配列を使用することができる。特に、ユビキチンプロモーター（ＨＰＲＴ、ＰＧＫ、α−アクチン、チューブリン等の遺伝子のプロモーター）、中間フィラメントのプロモーター（ＧＦＡＰ、デスミン、ビメンチン、ニューロフィラメント、ケラチン等の遺伝子のプロモーター）、治療遺伝子プロモーター（例えばＭＤＲ、ＣＦＴＲ、ＶＩＩＩ因子、ＡｐｏＡＩ等の遺伝子のプロモーター）、組織特異的プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、脂肪酸結合性腸タンパク質、平滑筋細胞のαアクチン等の遺伝子のプロモーター）、又は刺激応答プロモーター（ステロイドホルモンレセプター、レチノイン酸レセプター等）を挙げることができる。更に、ウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列、例えばアデノウイルスのＥ１Ａ及びＭＬＰ遺伝子のプロモーター、ＣＭＶの初期プロモーター又はＲＳＶのＬＴＲのプロモーター等でもよい。更に、活性化配列、調節配列又は組織特異的もしくは過半数発現を可能にする配列の付加によってこれらのプロモーター領域を改変してもよい。更に、有用遺伝子は標的細胞の分泌経路に合成物を導くシグナル配列を含んでいてもよい。このシグナル配列は合成物の天然シグナル配列でもよいし、他の任意の機能シグナル配列又は人工シグナル配列でもよい。有用遺伝子に応じて、本発明のＤＮＡ分子は遺伝病（ジストロフィー、嚢胞性線維症等）、神経変性病（アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ等）、癌、凝血障害又はリポタンパク異常血症に結び付けられる疾病、ウイルス感染に結び付けられる疾病（肝炎、ＡＩＤＳ等）等を含む多数の疾病の治療もしくは予防、又は農学及び獣医学等の分野で使用できる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単なる例示であってこれによって発明を制限するものではない。図面の説明図１：ゲノムに組み込んだカセットからのミニサークルの生産。図２：プラスミドからのミニサークルの生産。図３：リガンドに特異的な配列を含むミニサークルの生産。図４：ｐＸＬ２６４９の構築。Ｏｒｉ：複製起点；Ｋａｎ：カナマイシン耐性を付与するマーカー遺伝子；Ａｍｐ ^r：アンピシリン耐性を付与するマーカー遺伝子；ｇａｌＫ：大腸菌のガラクトシダーゼ遺伝子；Ｐｌａｃ：ラクトースオペロンのプロモーター。図５：プラスミドｐＸＬ２６５０、プラスミドｐＸＬ２６５０から生産されるミニサークル及び対照ＰＧＬ２（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ）をマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３にトランスフェクション後に得られるルシフェラーゼ活性。トランスフェクションは、各ウェル当たりＤＮＡ０．５ｍｇ、各ウェル当たり細胞５００００個の条件下で実施した。使用したリポフェクタントはＲＰＲ１１５３３５である。リポフェクタント／ＤＮＡ電荷比の関数としてタンパク質１μ ｇ当たりのＲＬＵとして結果を報告する。図６：プラスミドｐＸＬ２７９３の構築。このプラスミドは組換え後にホモプリン−ホモピリミジン合成配列とｐＸＬ２７２７のルシフェラーゼカセットを含むミニサークルを生じる。図７：レーン１は三重螺旋カラム精製後に溶出したフラクションのＳａｌＩ消化物に対応する。レーン２は三重螺旋カラム精製後に溶出したフラクションのＸｍｎＩ消化物に対応する。レーン３は三重螺旋カラム精製後に溶出したフラクションの非消化物に対応する。レーン４はプラスミドｐＸＬ２７９３の非誘導非消化物に対応する。レーン５及び６は夫々直鎖状ＤＮＡ及び超らせんＤＮＡのサイズマーカーに対応する。図８：プラスミドｐＸＬ２７７６の構築の模式図。図９：プラスミドｐＸＬ２７７７及びｐＸＬ２９６０の構築の模式図。図１０：大腸菌バクテリオファージ１のインテグラーゼがプラスミドｐＸＬ２７７７及びｐＸＬ２９６０に及ぼす作用。Ｍ：直鎖状ＤＮＡ又は超らせんＤＮＡの１ｋｂ分子量マーカー。Ｎ．Ｉ．：非誘導。Ｉ：誘導。Ｎ．Ｄ．：非消化。図１１：プラスミドｐＸＬ２７７７及びｐＸＬ２９６０における大腸菌でのバクテリオファージｌのインテグラーゼの組換えの動力学。２’：２分。Ｏ／Ｎ：１４時間。Ｍ：直鎖状ＤＮＡ又は超らせんＤＮＡの１ｋｂ分子量マーカー。Ｎ．Ｉ．：非誘導。Ｉ：誘導。Ｎ．Ｄ．：非消化。一般クローニング及び分子生物学技術臭化エチジウム−塩化セシウム勾配によるプラスミドＤＮＡの遠心分離、制限酵素消化、ゲル電気泳動、アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの電気溶離、大腸菌での形質転換、核酸沈降等のような慣用分子生物学法は文献に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９，Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７）。核酸配列は既に報告されているプロトコール（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７）に従って鎖終止法により決定した。制限酵素はＮｅｗ−ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）又はＡｍｅｒｓｈａｍＬｔｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から入手した。連結にあたっては、ＤＮＡフラグメントを０．７％アガロースゲル又は８％アクリルアミドゲル上でサイズに従って分離し、電気泳動後に電気溶離により精製し、フェノール抽出し、エタノール沈殿後、ファージＴ４（Ｂｉｏｌａｂｓ）のＤＮＡリガーゼの存在下、緩衝液５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１０ｍＭＭｇＣｌ₂，１０ｍＭＤＴＴ，２ｍＭＡＴＰ中でインキュベートする。オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成器Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８６００を製造業者の指示に従って使用し、シアノエチル基によりｂ位置で保護したホスホアミダイト誘導体を用いるホスホアミダイト化学（Ｓｉｎｈａら，１９８４，Ｇｉｌｅｓ１９８５）を使用することにより合成する。連結したＤＮＡを使用して、コンピテントにした株即ち大腸菌ＭＣ１０６０［（ＬａｃＩＯＰＺＹＡ）Ｘ７４，ｇａｌＵ，ｇａｌＫ，ｓｔｒＡ ^r，ｈｓｄＲ］（Ｃａｓａｄａｂａｎら，１９８３）；ＨＢ１０１［ｈｓｄＳ２０，ｓｕｐＥ４４，ｒｅｃＡ１３，ａｒａ−１４，ｐｒｏＡ２，ｌａｃＹ１，ｇａｌＫ２，ｒｐｓＬ２０，ｘｙｌ−５，ｍｔｌ−１，λ^-，Ｆ−］（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）及びＤＨ５α［ｅｎｄＡ１，ｈｓｄＲ１７，ｓｕｐＥ４４，ｔｈｉ−１，ｒｅｃＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｒｅｌＡ，λ^-，Φ８０，ｄｌａｃＺΔＭ１５］をプラスミドについて形質転換する。細菌学的部分にはＬＢ及び２ＸＴＹ培地を使用する（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）。プラスミドＤＮＡはアルカリ溶解法（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）により精製する。使用した用語及び略語の定義組換えＤＮＡ：天然には結合しないＤＮＡ配列を同一微生物の内部に結合するか又はＤＮＡフラグメントを特異的に突然変異誘発することが可能な技術の総称。ＡＴＰ：アデノシン５’−三リン酸ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン・ＰＢＳ：１０ｍＭリン酸緩衝液，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４。ｄＮＴＰ：２’‐デオキシリボヌクレオシド５’‐三リン酸。ＤＴＴ：ジチオトレイトールｋｂ：キロベースｂｐ：塩基対。実施例１：バクテリオファージの反復順方向ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列をもつプラスミドの構築プラスミドｐＮＨ１６ａはａｔｔＰ配列をもつλバクテリオファージのフラグメントを既に含んでいるので、出発材料として使用した（ＨａｓａｎとＳｚｙｂａｌｓｋｉ，１９８７）。このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化した。ａｔｔＢ配列（Ｌａｎｄｙ，１９８９）を含むオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドは下記配列をもつ。これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズしてａｔｔＢ配列を再構成した後、ｐＮＨ１６ａ（ＨａｓａｎとＳｚｙｂａｌｓｋｉ，１９８７）の４．２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントのＥｃｏＲＩ部位に連結した。ＤＨ５αの形質転換後、組換えクローンを保存した。こうして構築したプラスミドをｐＸＬ２６４８と命名した（図４参照）。このプラスミドは順方向にバクテリオファージのａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列を含む。バクテリオファージのインテグラーゼ（Ｉｎｔタンパク質）の作用下で２つのａｔｔ部位間に含まれる配列の切り出しが行われるはずである。この結果、外部に配置されたプラスミドの複製起点と耐性マーカーから２つのａｔｔ配列間に挿入された配列が分離される。実施例２：大腸菌におけるミニサークルのインビボ生産カナマイシン耐性カセットをプラスミドｐＸＬ２６４８のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした（図４）。このカセットはプラスミドｐＵＣ４ＫＩＸＸ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ．）に由来する。このために、プラスミドｐＵＣ４ＫＩＸＸ１０ｇをＥｃｏＲＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、カナマイシン耐性マーカーを含む１．６ｋｂフラグメントを電気溶離により精製した後、ＥｃｏＲＩにより直鎖化したプラスミドｐＸＬ２６４８に連結した。大腸菌ＤＨ５αに形質転換してカナマイシン耐性の選択後に組換えクローンを選択した。１つのクローンで所期制限プロフィルが観察され、このクローンをｐＸＬ２６４９（図４）と命名した。このプラスミドを形質転換により２種の大腸菌株、即ちＤ１２１０［ｈｓｄＳ２０，ｓｕｐＥ４４，ｒｅｃＡ１３，ａｒａ−１４，ｐｒｏＡ２，ｌａｃＹ１，ｇａｌＫ２，ｒｐｓＬ２０，ｘｙｌ−５，ｍｔｌ−１，λ^-，Ｆ−，ｌａｃＩｑ］（Ｓａｄｌｅｒら，１９８０）と、ファージｘｉｓ ^-（Ｘｉｓ^-Ｋｉｌ^-）ｃＩ８５７（Ｐｏｄｊａｓｋａら，１９８５）により溶原化したＤＨ１２１０に対応するＤ１２１０ＨＰに導入した。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を加えた２ＸＴＹ培地上で３０℃で形質転換株を選択した。選択培地で再単離後、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬ培地５ｍｌに株を接種した。撹拌（５ｃｍの回転振幅）下に３０℃で１６時間インキュベーション後に培養物を同一培地１００ｍｌで１／１００倍に希釈した。これらの培養物を０．３のＯＤ₆₁₀に達するまで同一条件下でインキュベートした。この時点で培養物の２分の１を取り出した後、４２℃で１０分間インキュベートしてファージの溶菌サイクルを誘導し、従って、インテグラーゼの発現を誘導した。このインキュベーション後、培養物を３０℃に戻した後、これらの条件下で１時間インキュベートした。次に、培養を停止し、プラスミドＤＮＡのミニ調製を行った。条件に関係なく、プラスミドｐＸＬ２６４９の非消化プラスミドＤＮＡのアガロースゲル電気泳動プロフィルは、Ｄ１２１０株でも熱誘導しなかったＤ１２１０ＨＰ株でも変わらなかった。他方、４２℃で１０分間インキュベートした後に３０℃で１時間培養したＤ１２１０ＨＰでは、予想通りプラスミドは最早存在せず、より迅速に移動し且つＥｃｏＲＩ部位を含む低分子量分子と、単一のＢｇｌＩ部位を含むより高分子量の分子との２種の環状ＤＮＡ分子が認められる。従って、２つのａｔｔ配列間に存在する配列が確かに切り出され、全複製起点を欠失するミニサークルが生成されている。複製起点をもたないこの超らせん環状ＤＮＡをミニサークルと呼ぶ。この呼称は実際に分子の環状特徴を十分考慮したものである。出発プラスミドｐＸＬ２６４９は存在するが、ａｔｔによってフランキングされた配列が切り出されたプラスミドの約１０％である。ミニサークルはプラスミドＤＮＡと同様に超らせん状であるので、ミニサークルをその後、慣用プラスミドＤＮＡ精製技術により精製してもよい。これらの技術は、臭化エチジウムの存在下での塩化セシウム密度勾配精製や、アニオン交換カラムの使用を含む（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）。更に、複製起点と選択マーカーに対応するプラスミドＤＮＡがかなり多量に存在すると予想される場合には、プラスミドを消化し且つミニサークルを消化しない１種以上の制限酵素を精製後に使用してもよく、こうすると、臭化エチジウムの存在下の塩化セシウム密度勾配等のように直鎖状ＤＮＡから超らせんＤＮＡを分離する技術により分離することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）。実施例３：ルシフェラーゼ発現カセットを含むミニサークルの生産これらのミニサークルのインビボ使用を試験するために、その発現に必要な配列をもつリポーター遺伝子をプラスミドｐＸＬ２６４９にクローニングした（実施例２参照）。このような遺伝子は、より特定的には対照ｐＧＬ２（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ．）に由来する３１５０ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩカセットである。このカセットはＳＶ４０の初期プロモーターと、ＳＶ４０の初期プロモーターのエンハンサーと、Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ遺伝子と、ＳＶ４０に由来するポリアデニル化部位を含む。３１５０ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＢａｍＨＩで消化したｐＸＬ２６４９のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、カナマイシン耐性カセットを対照ｐＧＬ２のルシフェラーゼ発現カセットによって置換した。こうして構築したプラスミドをｐＸＬ２６５０と命名した。このプラスミドではａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位がルシフェラーゼ発現カセットにフランキングしている。部位特異的組換えにより、ルシフェラーゼの発現に必要な配列とルシフェラーゼ遺伝子のみを切り出すことができる。これは実施例２に記載したと全く同様に実施することができる。プラスミドｐＸＬ２６５０のようなミニサークルは、インビボ又はインビトロトランスフェクション実験で後で使用することができる。アンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）を補充した２ＸＴＹ培地でＤ１２１０ＨＰｐＸＬ２６５０株１リットルを３０℃で培養した。ＯＤ₆₁₀が０．３になったら４２℃で２０分間、次いで３０℃で２０分間培養した。透明溶菌体技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）後に臭化エチジウムを補充した塩化セシウム密度勾配で精製し（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）、次いで臭化エチジウムをイソプロパノールで抽出して透析することにより、エピソームＤＮＡを調製した。このＤＮＡはミニサークルを含むことが判明した。この調製物１００μｇをＰｓｔＩで消化した後、臭化エチジウムを補充した塩化セシウム密度勾配で水解物を精製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）。調製物をＡｌｗＮＩとＸｍｎＩで同時に消化しても同一結果が得られる。超らせん形態を回収し、臭化エチジウムの除去（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）後、複製起点と全マーカー遺伝子を欠失するミニサークル以外の何物でもないことが判明した。このミニサークル調製物はインビトロ及びインビボトランスフェクション実験に使用することができる。実施例４：ミニサークルによる哺乳動物細胞、より特定的にはヒト細胞のインビトロトランスフェクション実施例３に記載したようなＰｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼの遺伝子を含むミニサークルＤＮＡ、即ちプラスミドｐＸＬ２６５０から生成したミニサークルに対応するＤＮＡを１５０ｍＭＮａＣｌで希釈し、トランスフェクタントと混合する。ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ，Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）等の種々の市販トランスフェクタントを種々の正負電荷比で使用することができる。１例として、３以上の電荷比でトランスフェクタント剤を使用した。混合物をボルテックスし、周囲温度で１０分間放置し、ウシ胎児血清を含まない培地で希釈した後、培養ウェル当たりＤＮＡ２μｇの割合で細胞に加える。使用する細胞はヒト結腸腺癌に由来するＣａｃｏ−２であり、記載のプロトコール（Ｗｉｌｓら，１９９４）に従って培養し、実験前日に細胞５０，０００個／ウェルの割合で４８ウェル培養プレートに接種する。３７ ℃で２時間後、１０％ｖ／ｖウシ胎児血清を加え、細胞を５％ＣＯ₂の存在下で３７℃で２４時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、記載のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａキット等）によりルシフェラーゼ活性を測定する。種々の種に由来する他の系（繊維芽細胞、リンパ球等）を使用してもよいし、個体から採取した細胞（繊維芽細胞、ケラチノサイト、リンパ球等）をトランスフェクション後に再注入してもよい。実施例５：ＮＩＨ３Ｔ３細胞のインビトロトランスフェクション実施例３に記載したようなＰｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼの遺伝子を含むミニサークルＤＮＡ、即ちプラスミドｐＸＬ２６５０から生成されるミニサークルに対応するＤＮＡを哺乳動物細胞にインビトロトランスフェクトし、同一発現カセットを含むｐＸＬ２６５０及び対照ＰＧＬ２（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ．）を対照として使用した。使用した細胞はマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３であり、実験前日に２４ウェル培養プレートに細胞５０，０００個／ウェルの割合で接種した。プラスミドを１５０ｍＭＮａＣｌで希釈し、リポフェクタントＲＰＲ１１５３３５と混合する。この他、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ，Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｇａ）（Ｄｅｍｅｎｅｉｘら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３５（１９９１）４８１）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）（Ｆｅｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４（１９８７）７４１３）等の他の種々の市販物質も利用できる。リポフェクタントの正電荷／ＤＮＡの負電荷の比は３以上を使用する。混合物をボルテックスし、周囲温度で１０分間放置し、ウシ胎児血清を含まない培地で希釈した後、培養ウェル当たりＤＮＡ０．５ｍｇの割合で細胞に加える。３７℃で２時間後、１０％ｖ／ｖウシ胎児血清を加え、細胞を５％ＣＯ₂の存在下で３７℃で４８時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、記載のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａキット、ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従って光度計ＬｕｍａｔＬＢ９５０１（ＥＧｅｔＧＢｅｒｔｈｏＩｄ，Ｅｖｒｙ）でルシフェラーゼ活性を測定する。上記条件に対応するトランスフェクション結果を図５に示す。結果は、ミニサークルが複製起点をもつプラスミドと同一のトランスフェクション特性をもつことを明白に示す。従って、これらのミニサークルは遺伝子治療用途で標準プラスミドと同様に使用できると考えられる。実施例６：三重螺旋相互作用を使用したミニサークルのアフィニティー精製本実施例は、精製しようとするミニサークルに存在する合成ＤＮＡ配列との間で行われる三重螺旋型相互作用により、ミニサークルを切り出したプラスミド形態を含む混合物から本発明によるミニサークルを精製する方法に関する。本実施例は、ミニサークルを切り出したプラスミド形態からミニサークルを分離するために、三重螺旋の形成による精製技術をどのように使用できるかを示すものである。６−１．合成ホモプリン−ホモピリミジン配列を含むミニサークルの生産６−１．１．プラスミドｐＸＬ２６５０へのホモプリン−ホモピリミジン配列の挿入プラスミドｐＸＬ２６５０はＰｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼの遺伝子を含むカセットの直後に単一のＢａｍＨＩ部位をもつ。この単一の部位を使用して次の２種のオリゴヌクレオチドをクローニングした。これらのオリゴヌクレオチドは一旦ハイブリダイズしてプラスミドｐＸＬ２６５０にクローニングすると、上述のようにホモプリン−ホモピリミジン配列（ＧＡＡ）₁₇を付加する。このクローニングを実施するために、まず最初にオリゴヌクレオチドを次のようにハイブリダイズした。これらの２種のオリゴヌクレオチド各１ｇを最終４０ｍｌの緩衝液５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 中で混合した。この混合物を９５℃まで加熱した後、周囲温度にして温度をゆっくりと低下させた。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド混合物１０ｎｇをＢａｍＨＩで直鎖化した２００ｎｇのプラスミドｐＸＬ２６５０と連結し、最終３０ｍｌとした。連結後、アリコートをＤＨ５で形質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬ培地に形質転換混合物をプレーティングした。２４個のクローンをＰｆｌＭＩとＢａｍＨＩで消化した。１個のクローンは５０ｂｐ増加した９５０ｂｐのＰｆｌＭＩ−ＢａｍＨＩフラグメントのサイズをもつことが判明した。このクローンを選択し、ｐＸＬ２６５１と命名した。プラスミドｐＸＬ２６５１をＷｉｚａｒｄＭｅｇａｐｒｅｐキット（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により製造業者の指示に従って精製した。６−１．２．プラスミドｐＸＬ２６４９へのホモプリン−ホモピリミジン配列の挿入ａ）ｐＸＬ２６４９のカナマイシンカセットの両側への新しい制限部位の挿入実施例２に記載したようなプラスミドｐＸＬ２６４９をＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣ４ＫＩＸＸ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）に由来するカナマイシンカセットを取り出した。このために、５ｍｇのプラスミドｐＸＬ２６４９をＥｃｏＲＩで消化した。４．２ｋｂのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離し、電気溶離により精製した。他方では、プラスミドｐＸＬ１５７１を使用した。このプラスミドはプラスミドｐＦＲ１０（Ｇｅｎｅ２５（１９８３），７１−８８）から構築し、カナマイシン遺伝子に対応するｐＵＣ４ＫＩＸＸに由来する１．６ｋｂフラグメントをＳｓｔＩに挿入した。このクローニングにより、カナマイシン遺伝子の両側に１２個の新しい制限部位を挿入することができた。５μｇのｐＸＬ１５７１をＥｃｏＲＩで消化した。カナマイシン遺伝子に対応する１．６ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離し、電気溶離により精製した。次に、ｐＸＬ２６４９の４．２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントと連結した。大腸菌ＤＨ５ａで形質転換してカナマイシン及びアンピシリン耐性の選択後に組換えクローンを選択した。１個のクローンで所期制限プロフィルが観察され、このプラスミドクローンをｐＸＬ２７９１と命名した。ｂ）プラスミドｐＸＬ２７９１からカナマイシンカセットの抽出プラスミドｐＸＬ２７９１をＳｓｔＩで消化してカナマイシンカセットを取り出した。４．２ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離し、ゲル抽出キットＪｅｔｓｏｒｂ（Ｇｅｎｏｍｅｄ）により精製した。その後、フラグメントを連結した。大腸菌ＤＨ５ａに形質転換後に組換えクローンをアンピシリン耐性について選択した。１個のクローンで所期制限プロフィルが観察された。このプラスミドクローンをｐＸＬ２７９２と命名した。このクローンは特にａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位間にＳａｌＩ及びＸｍａＩ制限部位を含む。ｃ）ホモプリン−ホモピリミジン配列とルシフェラーゼの発現を可能にするカセットをプラスミドｐＸＬ２７９２の２部位ａｔｔＰ及びａｔｔＢ間にクローニングプラスミドｐＸＬ２７２７を使用した。このプラスミドをＸｍａＩとＳａｌＩで消化すると、プロモーターｐＣＭＶ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼの遺伝子、ＳＶ４０に由来するポリアデニル化部位及びホモプリン −ホモピリミジン配列を含むフラグメントを取り出すことができる。前記ホモプリン−ホモピリミジン配列は次の２種のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及びクローニング後に得られた。ｐＸＬ２７２７上に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列をＳｅｑｕｅｎａｓｅ法Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により配列決定した。得られた結果は、プラスミドｐＸＬ２７２７上に実際に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列が、オリゴヌクレオチド６００６及び６００８の配列から予想される通り、１０個の反復（ＧＡＡ−ＣＴＴ）と１７個の非反復を含むことを示す。オリゴヌクレオチド６００８に対応する鎖で配列決定後に読み取られたプラスミドｐＸＬ２７２７上に実際に存在する配列は次の通りである。１μｇのｐＸＬ２７２７をＸｍａＩとＳａｌＩで消化した。３．７ｋｂのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離し、ゲル抽出キットＪｅｔｓｏｒｂ（Ｇｅｎｏｍｅｄ）により精製した。他方では、１．７ｍｇのｐＸＬ２７９２をＸｍａＩとＳａｌＩで消化した。４．２ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離し、ゲル抽出キットＪｅｔｓｏｒｂ（Ｇｅｎｏｍｅｄ）により精製し、ｐＸＬ２７２７の３．７ｋｂのＸｍａＩ−ＳａｌＩフラグメントと連結した。大腸菌ＤＨ５ａで形質転換及びアンピシリン耐性の選択後に組換えクローンを選択した。１個のクローンで所期制限プロフィルが観察され、このクローンをｐＸＬ２７９３と命名した。既述方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）に従って塩化セシウム密度勾配を使用してプラスミドｐＸＬ２７９３を精製した。６−２．ミニサークル上に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列との三重螺旋型相互作用を生じることが可能なカラムの調製次のようにカラムを調製した。使用したカラムはＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１ｍｌで活性化したＨｉＴｒａｐカラムであり、蠕動ポンプ（流量＜１ｍｌ／分）に連結した。使用した特定オリゴヌクレオチドは５’末端にＮＨ₂基をもつ。プラスミドｐＸＬ２６５１に使用したオリゴヌクレオチドの配列は次の通りである。プラスミドｐＸＬ２７９３に使用したオリゴヌクレオチドの配列は次の通りである（オリゴ１１６４１８）。使用した緩衝液は次の通りである。結合用緩衝液： 0.2M NaHCO₃，0.5M NaCl，pH8.3 洗浄用緩衝液：緩衝液A: 0.5M エタノールアミン，0.5M NaCl，pH8.3 緩衝液B: 0.1M 酢酸塩，0.5M NaCl，pH4 固定及び溶離用緩衝液緩衝液F: 2M NaCl，0.2M酢酸塩，pH4.5 緩衝液E: 1M Tris，HCl，pH9，0.5mM EDTA。カラムは次のように調製する。カラムを６ｍｌの１ｍＭＨＣｌで洗浄した後、結合用緩衝液（１ｍｌ中５０ｎｍｏｌ）で希釈したオリゴヌクレオチドをカラムに加えて周囲温度で３０分間放置する。カラムを結合用緩衝液３ｍｌ、次いで緩衝液Ａ６ｍｌ、次いで緩衝液Ｂ６ｍｌで洗浄する。後者２種の緩衝液はカラムに順次３回加え、こうしてオリゴヌクレオチドをＣＯＮＨ結合によりカラムに共有結合させる。カラムを４ ℃でＰＢＳ０．１％ＮａＮ₃中で保存する。６−３．ホモプリン−ホモピリミジン合成配列を含むミニサークルの三重螺旋型相互作用による精製６−３．１．プラスミドｐＸＬ２６５１の精製プラスミドｐＸＬ２６５１をＤ１２１０ＨＰ株に導入した。この組換え株［Ｄ１２１０ＨＰ（ｐＸＬ２６５１）］を実施例３に記載したように培養し、Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼの遺伝子を含むミニサークルを生成した。培養物２０ｍｌを取り出して遠心分離した。細胞残渣を１．５ｍｌの５０ｍＭグルコース、２５ｍＭＴｒｉｓ２５ＨＣｌｐＨ８、１０ｍＭＥＤＴＡにとる。２ｍｌの０．２ＭＮａＯＨ，１％ＳＤＳで溶解させ、１．５ｍｌの３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５）で中和させる。次にＤＮＡを２ −プロパノール３ｍｌで沈降させ、残渣を０．５ｍｌの０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）、０．１ＭＮａＣｌにとり、上述のようにミニサークルに含まれるポリＧＡＡ配列と三重螺旋型相互作用を形成することが可能なオリゴヌクレオチドカラムに加える。カラムを６ｍｌの緩衝液Ｆで予め洗浄しておき、カラムに加えた後に精製すべきミニサークルを含有する溶液を周囲温度で２時間インキュベートする。カラムを１０ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄した後、緩衝液Ｅで溶離する。こうしてミニサークルに対応する精製ＤＮＡが得られる。得られたミニサークルをアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム染色により分析すると、スーパーコイル環状ＤＮＡの単一バンドの形態である。調製物中に残存する出発プラスミドｐＸＬ２６５１は５％未満である。６−３．２．プラスミドｐＸＬ２７９３の精製７．９ｋｂのプラスミドｐＸＬ２７９３をＤ１２１０ＨＰ株に導入した。この組換え株を実施例３に記載したように培養し、Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼの遺伝子を含む４ｋｂのミニサークルと３．９ｋｂのプラスミドを生成した。培養物２００ｍｌを取り出して遠心分離した。細胞残渣をＫｉｔＷｉｚａｒｄＭｅｇａｐｒｅｐ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により製造業者の指示に従って処理した。ＤＮＡを最終容量２ｍｌの１ｍＭＴｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）にとった。このプラスミドサンプル２５０μｌを最終容量２．５ｍｌの緩衝液Ｆで希釈した。カラムは６ｍｌの緩衝液Ｆで予め洗浄しておいた。上記のように調製したミニサークルに含まれるポリＧＡＡ配列と三重螺旋型の相互作用を形成することが可能なオリゴヌクレオチドカラムに希釈サンプル全体を加えた。１０ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄後、緩衝液Ｅで溶離した。溶離したサンプルを１ｍｌフラクションずつ回収した。この方法により、ｐＸＬ２７９３から生成されるミニサークルに対応する精製ＤＮＡが得られる。カラムから溶出したＤＮＡサンプルをアガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色と酵素制限により分析した。このために、ＯＤ_260nm 滴定によりＤＮＡを含有すると判断される溶出フラクションを１ｍＭＴｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡで２４時間透析した後、イソプロパノールで沈降させ、２００ｍｌのＨ₂Ｏにとった。こうして得られたサンプル１５μｌを、ミニサークルには存在するが組換えにより生成された３．９ｋｂのプラスミドには存在しない制限部位であるＳａｌＩ、又は組換えにより生成された３．９ｋｂのプラスミドには存在するがミニサークルには存在しない制限部位であるＸｍｎＩにより消化した。得られた結果を図７に示すが、同図はミニサークルが組換えプラスミドを含まないことを立証している。実施例７：ミニサークルによる哺乳動物細胞のインビボトランスフェクション本実施例はルシフェラーゼの遺伝子をコードするミニサークルの新生ラットの脳への導入に関する。ミニサークル（３０μｇ）を滅菌１５０ｍＭＮａＣｌで濃度１μｇ／μｌに希釈する。次に２以下の正負電荷比でジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）等の合成トランスフェクタントを加える。混合物をボルテックスし、麻酔した新生ラットの大脳皮質にマイクロマニピュレーターとマイクロシリンジを用いてＤＮＡ２μｇを注入する。４８時間後に脳を取り出し、均質化し、遠心分離し、上清を使用して記載のプロトコール（例えばＰｒｏｍｅｇａキット）によりルシフェラーゼを定量する。実施例８：ミニサークル又はミニプラスミドの位相異性体の存在を低下させるためのＲＫ２の遺伝子座ｐａｒの使用本実施例は、大腸菌でのバクテリオファージｌのインテグラーゼの作用後に、ｉ）順方向ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列をもつプラスミド、ｉｉ）ミニサークル又はｉｉｉ）ミニプラスミドから誘導される位相形態の存在を立証する。本実施例は、ＲＫ２の遺伝子座ｐａｒ（Ｇｅｒｌｉｔｚら，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２，ｐ６１９４）の使用によりこれらの位相又はオリゴマー形態を分解できることも示す。実際に、この遺伝子座は特にｍｒｓ（マルチマー分解系）（Ｅｂｅｒｌら，１９９４，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２，ｐ．１３１）部位に作用するレゾルベースをコードするｐａｒＡ遺伝子を含む。８−１．プラスミドｐＸＬ２７７７及びｐＸＬ２９６０の構築プラスミドｐＸＬ２７７７及びｐＸＬ２９６０はベクターｐＸＬ２７７６から誘導され、共通してＣｏｌＥ１の最小レプリコンと、カナマイシン耐性をコードするトランスポゾンＴｎ５の遺伝子と、バクテリオファージｌの順方向ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列をもつ。これらのプラスミドはａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列間に挿入された遺伝子の点で相違し、特にｐＸＬ２７７７は（スペクチノマイシン耐性遺伝子をコードする）オメゴンカセットを含み、プラスミドｐＸＬ２９６０はＲＫ２の遺伝子座ｐａｒをもつ。８−１．１．最小ベクターｐＸＬ２６５８ベクターｐＸＬ２６５８（２．５１３ｋｂ）はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに由来するＣｏｌＥ１の最小レプリコン（ｏｒｉ）と、選択マーカーとしてカナマイシン耐性をコードするトランスポゾンＴｎ５の遺伝子（Ｋｍ）をもつ。Ｋｌｅｎｏｗの作用によりＢｓａＩ末端を平滑にした後、ｐＢＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ市販品）の１．１５ｋｂのＢｓａＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントをｐＵＣ４ＫＩＸＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ市販品）の１．２ｋｂのＳｍａＩフラグメントとクローニングし、プラスミドｐＸＬ２６４７を生成した。オリゴヌクレオチド５５４２ 5′(AGC TTC TC G AGC TGC AGG ATA TCG AAT TCG GAT CCT CTA GAG CGG CCG CGA GCT CC)3′（配列番号２０）及び５５４３ 5′(AGC TGG AGC TCG CGG CCG CTC TAG AGG ATC CG A ATT CGA TAT CCT GCA GCT CGA GA)3′（配列番号２１）を相互にハイブリダイズした後、ｐＸＬ２６４７のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、こうしてｐ２６５８を構築する。このプラスミド上には、複製起点とカナマイシン耐性をコードする遺伝子の間に多重クローニング部位ＳｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩが存在する。８−１．２．ファージｌのａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列を含むベクターｐＸＬ２７７６ベクターｐＸＬ２７７６（２．９３ｋｂ）はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに由来するＣｏｌＥ１の最小レプリコンと、カナマイシン耐性をコードする遺伝子と、バクテリオファージｌの順方向ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列をもつ（図８参照）。ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位がクローニング後に再構成されないようにセンスオリゴヌクレオチド６１９４ 5′(ACT AGT GGC CAT G CA T CC GCT CAA GTT AGT ATA AAA AAG CAG GCT TCA G)3′（配列番号２２）をアンチセンスオリゴヌクレオチド６１９５ 5′(AGC TCT GAA GCC TGC TTT TTT AT A CTA ACT TGA GCG CAT GCA TGG CCA CTA GTA GCT)3′（配列番号２３）とハイブリダイズした後にｐＸＬ２６５８のＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位間に２９ｂｐのａｔｔＢ配列（Ｍｉｚｕｕｃｈｉら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７，ｐ３２２０）を導入した。このプラスミドのａｔｔＢ配列を確認してからＳｐｅＩとＮｓｉＩで消化し、ＮｓｉＩ及びＸｂａＩ制限部位によってフランキングされるａｔｔＰ配列を導入し、こうしてプラスミドｐＸＬ２７７６を生成する。ａｔｔＰ配列は、鋳型として（実施例２に記載したような）プラスミドｐＸＬ２６４９と、センスオリゴヌクレオチド６１９０ 5′(GCG TCT AGA ACA GTA TCG TGA TGA CAG AG)3′（配列番号２４）及びアンチセンスオリゴヌクレオチド６１９１ 5′(GCC AAG CTT AGC TTT GCA CTG GA T TGC GA)3′（配列番号２５）を使用し、ハイブリダイゼーション温度を５０℃ とするサイクルを３０サイクル実施することにより、ＰＣＲ増幅により得た。ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化したＰＣＲ産物をファージＭ１３ｍｐＥＨのＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローニングした。増幅配列は、２７４８０〜２７８６３位間でＬａｍｂｄａＩＩ（Ｒ．Ｗ．Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｊ．Ｗ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｆ．Ｗ．Ｓｔａｈｌ，Ｒ．Ａ．Ｗｅｉｓｂｅｒｇ編；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８３）に記載されているａｔｔＰの配列に一致する。８−１．３．プラスミドｐＸＬ２７７７プラスミドｐＸＬ２７７７（６．９ｋｂ）はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに由来するＣｏｌＥ１の最小レプリコンと、カナマイシン耐性をコードする遺伝子と、枯草菌のレバンスクラーゼ（Ｐ．Ｇａｙら，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３，ｐ１４２４）をコードするｓａｃＢ遺伝子により分離されたバクテリオファージｌの順方向ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列と、スペクチノマイシンＳｐ及びストレプトマイシンＳｍ耐性遺伝子をコードするオメゴンＳｐ（Ｐ．Ｐｒｅｎｔｋｉら，１９８４，Ｇｅｎｅ２９，ｐ３０３）をもつ。ＥｃｏＲＶ及びＮｓｉＩクローニング末端をもつカセットｓａｃＢ−ＳｐはプラスミドｐＸＬ２７５７（ＦＲ９５／０１６３２）に由来し、ｐＸＬ２７７６のＥｃｏＲＶ及びＮｓｉＩ部位間にクローニングしてｐＸＬ２７７７を形成した。８−１．４．プラスミドｐＸＬ２９６０プラスミドｐＸＬ２９６０（７．３ｋｂ）はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに由来するＣｏｌＥ１の最小レプリコンと、カナマイシン耐性をコードする遺伝子と、ｉ）枯草菌のレバンスクラーゼ（Ｐ．Ｇａｙら，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３，ｐ１４２４）をコードするｓａｃＢ遺伝子及びｉｉ）ＲＫ２の遺伝子座ｐａｒ（Ｇｅｒｌｉｔｚら，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２，ｐ６１９４）により分離されたバクテリオファージ１の順方向ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列をもつ。ＢａｍＨＩ末端をもつカセットｐａｒはプラスミドｐＸＬ２４３３（ＰＣＴ／ＦＲ９５／０１１７８）に由来し、ｐＸＬ２７７７のＢａｍＨＩ部位間に導入してｐＸＬ２９６０を形成した。８−２．ミニサークル又はミニプラスミドの位相異性体の分解プラスミドｐＸＬ２７７７及びｐＸＬ２９６０を形質転換により大腸菌株Ｄ１２１０ＨＰに導入した。実施例２に記載した手順を次のように変更して形質転換株を選択及び分析した。６１０ｎｍにおける細胞の光学密度が１．８になったらインテグラーゼの発現を４２℃で１５分間誘導した後、３０℃で３０分間（図９参照）又は２分間〜１４時間（Ｏ／Ｎ）の可変時間（図１０参照）細胞をインキュベートする。ミニサークル（ＥｃｏＲＩ）もしくはミニプラスミド（ＢｇｌＩＩ）部分に固有の制限酵素による消化前もしくは後（図Ｙ参照）、又は大腸菌のＤＮＡトポイソメラーゼＡもしくはジャイレースの作用後に、非誘導及び誘導培養物に由来するプラスミドＤＮＡをアガロースゲル上で分析した。ｉ）分子量、ｉｉ）制限酵素による直鎖化、ｉｉｉ）トポイソメラーゼＡ（弛緩型二量体）又はジャイレース（超らんせ状二量体）の作用によるトポロジーの変化、ｉｖ）ミニサークル又はミニプラスミドに固有の内部フラグメントとの特異的ハイブリダイゼーションにより、ミニサークル又はミニプラスミドの超らせん二量体形態が明白に立証される。初期プラスミドよりも高分子量の他のトポロジー形態はミニサークル（ＥｃｏＲＩ）又はミニプラスミド（ＢｇｌＩＩ）部分に固有の制限酵素による消化後に消滅するので、初期プラスミド又はミニサークル又はミニプラスミドに由来する。これらの形態は初期プラスミドと同様にｐＸＬ２７７７よりもｐＸＬ２９６０のほうが著しく少ない（図１０）。特に、細胞を３０℃ で少なくとも３０分間インキュベートした場合、プラスミドｐＸＬ２７７７には二量体形態のミニサークルがかなり存在するが、ｐＸＬ２９６０では検出されない（図９及び１０参照）。ｐＸＬ２９６０では反応開始時（２〜１０分）に二量体のミニサークルが観察されるが、その後（３０分後）は分解される（図１０参照）。従って、遺伝子座ｐａｒは大腸菌でのバクテリオファージ１のインテグラーゼが順方向ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列を含むプラスミドに作用する結果としてオリゴマー／トポロジー形態を有意に低下させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ダルケ，アンヌ−マリーフランス国、エフ−94400・ビトリー−シユール−セーヌ、リユ・ジユル−ラゲス、 36 (72)発明者シエルマン，ダニエルフランス国、エフ−75645・パリ・セデツクス・13、リユ・ドユ・デイスク、50 (72)発明者ウイル，ピエールフランス国、エフ−75003・パリ、リユ・ドウ・モンモランシー、36

Claims

【特許請求の範囲】１．−環状で超らせん形態であり、 −哺乳動物細胞で活性な転写プロモーター及び転写ターミネーターの制御下の有用遺伝子から構成される発現カセットを含んでおり、 −複製起点を欠失しており、 −マーカー遺伝子を欠失しており、 −２つの配列間の部位特異的組換えにより生成され、発現カセットの外側に配置された領域を含む、ことを特徴とする二本鎖ＤＮＡ分子。２．リガンドと特異的に相互作用することが可能な配列を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の分子。３．リガンドと特異的に相互作用することが可能な配列が、特定オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションにより三重螺旋を形成することが可能な配列であることを特徴とする請求項２に記載の分子。４．三重螺旋を形成することが可能な配列が５〜３０塩基対を含むことを特徴とする請求項３に記載の分子。５．三重螺旋を形成することが可能な配列がホモプリン−ホモピリミジン配列であることを特徴とする請求項３又は４に記載の分子。６．２つのａｔｔ結合配列間もしくはトランスポゾンのレゾルベースの２つの認識配列間の部位特異的組換えにより生成される配列又はＲＫ２のｐａｒＡを含むことを特徴とする請求項１に記載の分子。７．マルチマーを分解することが可能なＲＫ２の遺伝子座ｐａｒに由来するｍｒｓ配列を更に含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の分子。８．有用遺伝子が治療、ワクチン、農学又は獣医学用物質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の分子。９．部位特異的組換えによりプラスミド又は染色体から切り出すことにより得られることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の分子。１０．哺乳動物細胞で活性な転写プロモーター及び転写ターミネーターの制御下の有用遺伝子から構成され、順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列によってフランキングされた発現カセットを含む組換えＤＮＡ。１１．ａ）複製起点及び場合によりマーカー遺伝子と、ｂ）順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列と、ｃ）前記配列ｂ）の間に配置され、哺乳動物細胞で活性な転写プロモーター及び転写ターミネーターの制御下の有用遺伝子から構成される発現カセットを含む複製プラスミドであることを特徴とする請求項１３に記載の組換えＤＮＡ。１２．部位特異的組換えを可能にする配列が、リコンビナーゼの存在下で特異的組換えが可能な配列であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の組換えＤＮＡ。１３．リコンビナーゼがλファージのインテグラーゼのファミリー及びトランスポゾンＴｎ３のレゾルベースのファミリーから選択されることを特徴とする請求項１２に記載の組換えＤＮＡ。１４．部位特異的組換えを可能にする配列がバクテリオファージから誘導されることを特徴とする請求項１０から１３のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ。１５．部位特異的組換えを可能にする配列がバクテリオファージの結合配列ａｔｔ又は誘導配列から構成されることを特徴とする請求項１４に記載の組換えＤＮＡ。１６．部位特異的組換えを可能にする配列がバクテリオファージλ、Ｐ２２、Φ ８０、Ｐ１、ＨＰ１又はプラスミドｐＳＡＭ２もしくは２の結合配列又は誘導配列から構成されることを特徴とする請求項１５に記載の組換えＤＮＡ。１７．部位特異的組換えを可能にする配列が配列番号１、２、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の配列の全部又は一部を含むことを特徴とする請求項１６に記載の組換えＤＮＡ。１８．（ａ）複製起点及び場合によりマーカー遺伝子と、（ｂ）順方向に配置されたファージλ、Ｐ２２、Φ８０、Ｐ１、ＨＰ１又はプラスミドｐＳＡＭ２もしくは２から選択されるバクテリオファージのａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列と、（ｃ）前記配列間に配置され、哺乳動物細胞で活性な転写プロモーター及び転写ターミネーターの制御下の有用遺伝子から構成される発現カセットを含むことを特徴とするプラスミド。１９．部位特異的組換えを可能にする配列がλバクテリオファージの結合配列から構成されることを特徴とする請求項１８に記載のプラスミド。２０．部位特異的組換えを可能にする配列がバクテリオファージＰ１から誘導されることを特徴とする請求項１４に記載の組換えＤＮＡ。２１．（ａ）細菌複製起点及び場合によりマーカー遺伝子と、（ｂ）順方向に配置されたバクテリオファージの逆方向反復配列（ｌｏｘＰ領域）と、（ｃ）前記配列（ｂ）の間に配置され、哺乳動物細胞で活性な転写プロモーター及び転写ターミネーターの制御下の有用遺伝子から構成される発現カセットを含むことを特徴とするプラスミド。２２．部位特異的組換えを可能にする配列がトランスポゾンから誘導されることを特徴とする請求項１０から１３のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ。２３．部位特異的組換えを可能にする配列がトランスポゾンＴｎ３、Ｔｎ２１もしくはＴｎ５２２のリゾルベースの認識配列又は誘導配列から構成されることを特徴とする請求項２２に記載の組換えＤＮＡ。２４．部位特異的組換えを可能にする配列が配列番号１５の配列の全部又は一部を含むことを特徴とする請求項２３に記載の組換えＤＮＡ。２５．部位特異的組換えを可能にする配列がプラスミドＲＰ４のｐａｒ領域から誘導されることを特徴とする請求項１０から１３のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ。２６．リガンドと特異的に相互作用することが可能な配列を更に含むことを特徴とする請求項１０から２５のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ。２７．（ａ）複製起点及び場合によりマーカー遺伝子と、（ｂ）順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列と、（ｃ）前記配列ｂ）の間に配置された１種以上の有用遺伝子及びリガンドと特異的に相互作用することが可能な配列を含むことを特徴とするプラスミド。２８．（ａ）複製起点及び場合によりマーカー遺伝子と、（ｂ）順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列と、（ｃ）前記配列ｂ）の間に配置された１種以上の有用遺伝子及びマルチマーを分解することが可能なＲＫ２の遺伝子座ｐａｒに由来するｍｒｓ配列を含むことを特徴とするプラスミド。２９．（ａ）複製起点及び場合によりマーカー遺伝子と、（ｂ）順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列と、（ｃ）前記配列ｂ）の間に配置された１種以上の有用遺伝子、マルチマーを分解することが可能なＲＫ２の遺伝子座ｐａｒに由来するｍｒｓ配列及びリガンドと特異的に相互作用することが可能な配列を含むことを特徴とするプラスミド。３０．（ａ）複製起点及び場合によりマーカー遺伝子と、（ｂ）順方向に配置されたインテグラーゼ依存性部位特異的組換えを可能にする２つの配列及び該２つの配列の隣に同様に順方向に配置されたレゾルベース依存性部位特異的組換えを可能にする２つの配列と、（ｃ）前記配列ｂ）の間に配置された１種以上の有用遺伝子及び場合によりリガンドと特異的に相互作用することが可能な配列を含むことを特徴とするプラスミド。３１．リガンドと特異的に相互作用することが可能な配列が請求項２から５のいずれか一項に記載の配列であることを特徴とする請求項２７、２９及び３０のいずれか一項に記載のプラスミド。３２．請求項１４、２７、２９及び３０のいずれか一項に記載のプラスミドを含む組換え細胞。３３．請求項１０に記載の組換えＤＮＡの１個以上のコピーをそのゲノムに挿入した組換え細胞。３４．細菌であることを特徴とする請求項３２又は３３に記載の組換え細胞。３５．真核細胞であることを特徴とする請求項３２又は３３に記載の組換え細胞。３６．大腸菌Ｄ１２１０ＨＰであることを特徴とする請求項３４に記載の組換え細胞。３７．請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＤＮＡ分子を含む医薬組成物。３８．請求項１０に記載の組換えＤＮＡを含む宿主細胞培養物を、部位特異的組換えをインビボ誘導することが可能なリコンビナーゼと接触させることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子の製造方法。３９．宿主細胞培養物が請求項３２に記載の細胞の培養物であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。４０．宿主細胞培養物が請求項３３に記載の細胞の培養物であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。４１．リコンビナーゼとの接触が、前記リコンビナーゼの遺伝子を含むプラスミド又はファージを培養細胞にトランスフェクト又は感染させることにより実施されることを特徴とする請求項３８から４０のいずれか一項に記載の方法。４２．リコンビナーゼとの接触が、宿主細胞中に存在する前記リコンビナーゼをコードする遺伝子の発現を誘導することにより実施されることを特徴とする請求項３８から４０のいずれか一項に記載の方法。４３．宿主細胞が温度調節下に発現されるリコンビナーゼの遺伝子をそのゲノムに組み込んでおり、その培養物を誘導温度で培養することによりリコンビナーゼと接触させることを特徴とする請求項４２に記載の方法。４４．使用する宿主細胞が前記リコンビナーゼの遺伝子を含む溶原ファージをそのゲノムに組み込んでいることを特徴とする請求項４３に記載の方法。４５．部位特異的組換えをインビトロ誘導することが可能なリコンビナーゼと請求項１１に記載のプラスミド調製物を接触させることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子の製造方法。４６．ミニサークルの付加的精製段階を含むことを特徴とする請求項３７又は４５に記載の方法。４７．ミニサークルを含有する溶液を、場合により支持体にグラフトした特異的リガンドと接触させる段階を含むことを特徴とする請求項４６に記載の方法。４８．ミニサークルを含有する溶液を、場合により支持体にグラフトし、ミニサークル中に存在する特定配列とハイブリダイゼーションにより三重螺旋を形成することが可能なオリゴヌクレオチドと接触させることを特徴とする請求項４７に記載の方法。