JPH11500119A

JPH11500119A - Inhibition of angiogenesis using interleukin 12

Info

Publication number: JPH11500119A
Application number: JP8524631A
Authority: JP
Inventors: フォークマン，モーゼス・ユダ; トゥルーイット，ゲーリー・アーサー; フースト，エミーレ・ユーヘネ
Original assignee: エフ・ホフマン−ラロシュアーゲー; ザ・チルドレンズ・メディカル・センター・コーポレーション
Priority date: 1995-02-16
Filing date: 1996-02-07
Publication date: 1999-01-06
Also published as: WO1996025171A1; BR9607427A; TR199700801T1; FI973356L; AU4788396A; MX9706188A; FI973356A7; CA2212370A1; EP0809511A1; FI973356A0

Abstract

(57)【要約】インターロイキン１２を含有する、糖尿病性網膜症及び黄斑変性の治療において重要な、望ましからぬ、もしくは制御されない脈管形成が介在する疾患の治療用医薬。 (57) [Summary] A medicament for the treatment of undesired or uncontrolled angiogenesis-mediated diseases important in the treatment of diabetic retinopathy and macular degeneration, comprising interleukin 12.

Description

【発明の詳細な説明】インターロイキン１２を用いる脈管形成の阻害本発明は、好ましからぬ脈管形成が介在する疾患の予防に関するものである。より詳細には、本発明は、好ましからぬ脈管形成を予防するための医薬、特に脈管形成依存的又は脈管形成と関連する疾患の治療用医薬の製造のためのインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の使用に関するものである。かつてナチュラルキラー細胞刺激因子（Kobayashi M.ら、J．Exp．Med．170: 827-845，1989)、及び細胞毒性リンパ球成熟因子（Stern A.S.ら、Proc．Natl． Acad．Sci．USA 87: 6808-6812，1990）と称されていたインターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、幾つかのネズミ腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍及び抗転移活性を有する（Brunda M.J．ら、J．Exp．Med．178: 1223-1230，1993; Nastala C .L．ら、J．Immunol 153: 1697-1706，1994)。ＩＬ−１２がその抗腫瘍効果を発揮するメカニズムは完全には理解されていないが、ＩＬ−１２がナチュラルキラー及びＴ細胞に対して、インビトロにて種々の生物学的活性を誘導することが示されている（Manetti R.ら、J．Exp．Med．179: 1273-1283，1994; Wu C.Y.ら、 J．Immunol．151: 1938-1949，1993; Tripp C.S.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 90:3725-3729、1993; Seder R.A.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90: 10188 -10192，1993; Bloom E.T.ら、J．Immunol．152: 4242-4254，1994; Cesano A．ら、J．Immunol．151: 2943-2957，1993; Chan S.H．ら、J．Immunol．148: 92- 98，1992）。ＩＬ−１２による細胞毒性Ｔリンパ球の活性化は、その抗腫瘍活性において決定的であると考えられている(Brunda M.J．ら、J．Exp．Med．178: 1 223-1230，1993)。ＩＬ−１２の抗腫瘍効果は、両者共にＴ−細胞欠損である重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）及びヌードマウス、並びにＣＤ８^*−欠損正常マウス（ＣＤ８^* −depleted euthymic mice）においても部分的に維持される(Brunda M.J.ら、J ．Exp．Med．178: 1223-1230，1993;O'Toole M.ら、J．Immunol．150: 294A，19 93)。これらの結果は、ＩＬ−１２が、ネズミ腫瘍に対してインビボにおいて強力な抗腫瘍及び抗転移効果を有することを証明し、また皮下腫瘍に対する抗腫瘍効果の介在においてＣＤ８⁺Ｔ細胞が重要な役割を果していることを証明している。本発明は、望ましからぬ脈管形成の阻害に有効な医薬の調製のためのインターロイキン１２の使用を提供する。ＩＬ−１２は、インビボにおいて広域スペクトラムの腫瘍の成長を阻害することが観察されているが、インビトロにおいては腫瘍細胞に対して直接的効果は示さない。更に、Ｔ細胞欠損マウスにおいては、ＩＬ−１２の抗腫瘍活性は、完全には消失しておらず、ＩＬ−１２が、抗脈管形成性を有することが示唆されている。ＩＬ−１２は、新生血管形成の強い阻害を誘導する。この効果は、免疫系の特定の細胞型によって介在されるものではない。インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）は、ＩＬ−１２の抗脈管形成効果の化学伝達物質として重要な役割を果しているものと考えられる。ＩＬ−１２の抗脈管形成性についての驚くべき認識は、他の新生血管形成阻害剤との併用投与を含む治療プロトコールを適切にデザインするのに、その中核となる。したがって、本発明は、望ましからぬ、もしくは制御されない脈管形成が介在する疾患の治療、特には好ましからぬ、もしくは制御されない脈管形成が介在する疾患が、新生血管形成、特に網膜／脈絡膜の新生血管形成である疾患の治療のための医薬製造のためのインターロイキン１２の使用を提供する。網膜／脈絡膜の新生血管形成が、糖尿病性網膜症と関連しているか、又は網膜／脈絡膜の新生血管形成が、黄斑変性と関連している場合の上記の用途を提供することが、本発明の別の目的である。望ましからぬ、もしくは制御されない脈管形成が介在する疾患が、角膜新生血管形成である場合の、制御されない脈管形成が介在する疾患の治療用医薬の製造のためのインターロイキン１２の使用を提供することが、本発明の別の目的である。糖尿病性網膜症の治療及び黄斑変性の治療用医薬の製造のためのインターロイキン１２の使用を提供することが、本発明の更に別の目的である。更に本発明は、疾患が、固形腫瘍もしくは血液由来の腫瘍及びそれらの転移に由来する場合の望ましからぬ、もしくは制御されない脈管形成が介在する疾患の治療用医薬の製造のためのインターロイキン１２の使用を含む。糖尿病と関連するか否かに関わらず、増殖性硝子体網膜症の全ての形態の治療用医薬の調製のためのインターロイキン１２の使用を提供することも本発明のまた別の目的である。上記の医薬は、１種以上の付加的な脈管形成阻害剤を含んでいてもよい。また、インターロイキン１２及び上記疾患の治療のためのインターロイキン１２の使用も、本発明の一部である。更に、本発明は、上記疾患の治療用の１種以上の付加的脈管形成阻害剤と組み合わせた、インターロイキン１２、又はインターロイキン１２の使用を含む。図面の簡単な記載図１：ｂＦＧＦ−誘導マウス角膜新生血管形成に対する組換えネズミＩＬ−１２の効果。これらの写真は、基礎線維芽細胞成長因子ペレット（Ｐ）移植後５日目の、ビヒクル（対照）又はＩＬ−１２処置Ｃ５７ＢＬ／６及びＳＣＩＤマウスの角膜を表す。対照の角膜には顕著な新たな血管が存在するが、一方ＩＬ−１２処置後においては、脈管応答はほとんど見られない。（ＳＣＩＤマウスは、それらの虹彩が色素沈着低下であるため、角膜を通して見ることができる虹彩脈管を本来有する。したがって、ＩＬ−１２処置パネルにおいて見られる脈管は、虹彩平面内にあり、基礎線維芽細胞成長因子ペレットにより誘導された角膜脈管ではないことに留意。）図２：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける基礎線維芽細胞成長因子ペレットの移植後５日目の脈管形成応答。処置は、下記の通り、ビヒクル（２１個の角膜）、ＩＬ−１２（３０個の角膜）又はＩＬ−１２のモノマー混合物（１０個の角膜）からなる。脈管長（mm）及び時計時数(number ofclock hours)は、平均±ＳＥＭによって示す。図３：ＩＬ−１２誘導のマウス角膜新生血管形成阻害に対するＩＦＮ−γ−抗体の効果。雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、下記の通りラットＸＭＧ１．２ＩＦＮ −γ抗体又はラットＩｇＧのいずれかの１回の腹腔内注射により処置した。新生血管形成の脈管長及び時計時を５日目に測定した。この実験は、別個に２回反復し、同様な結果を得た。データは、少なくとも１３個の角膜の平均±ＳＥＭとして示す。図４：基礎線維芽細胞成長因子−誘導のマウス角膜新生血管形成に対するＩＦＮ−γ処置の効果。雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ペレット移植の日に開始したＩＦＮ−γの腹腔内ボラス注射、又はペレット移植前３日に開始したＩＦＮの継続的注入のいずれかにより処置した。脈管長及び時計時は、基礎線維芽細胞成長因子ペレットの移植後５日に測定し、各群１０個の角膜の平均±ＳＥＭで示す。図５：ルイス肺がんの成長に対するＩＬ−１２及びＡＧＭ−１４７０の効果。雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにルイス肺がんを０日目に接種し、食塩水、ＩＬ−１２又はＡＧＭ−１４７０による処置を、腫瘍が測定可能となった後に開始した。処置のプロトコール及び測定方法は、後述する。結果は、各群４頭の動物を用いた１回の実験を示す。図６：ルイス肺がんの自然発生肺表面転移に対するＩＬ−１２及びＡＧＭ−１４７０の効果。処置プロトコール及び計数方法は後述する。結果は、各群４頭の動物を用いた１回の実験を示す。脈管形成は、直径数ミリメートルを超えて拡大する腫瘍及び転移において重要なものである（Folkman J.，N．Engl．J．Med．285: 182-186，1971)。腫瘍及び転移における新たな血管の発達を阻止するための戦略は、このような腫瘍の成長の抑制に有効であった（Millauer B．ら、Nature 367:576-579，1994; Kim K.J. ら、Nature 362: 841-844，1993)。ＩＬ−１２が、抗脈管形成性を有するか否かを決定するために、ＩＬ−１２を基礎線維芽細胞成長因子−誘導マウス角膜新生血管形成のモデルにおいて評価した。結果は、ＩＬ−１２が、インビボにおいて強力な脈管形成阻害剤であり、またこの効果が、ＩＦＮ−γにより介在されることを示している。脈管形成は、組織又は器官における新たな血管の形成である。正常な生理学的条件下では、ヒト又は動物は、極めて特殊な限られた場合にのみ脈管形成を起こす。例えば、脈管形成は、通常は創傷の治癒、胎児又は胚の成長、並びに黄体、子宮内膜及び胎盤の形成において観察される。脈管形成の制御は、脈管形成刺激物質及び阻害物質による高度に調節されたシステムである。脈管形成の制御は、ある種の疾患状態において変化することが認められており、多くの場合では、疾患と関連する病理学的損傷は、制御されない脈管形成と関連している。制御された、及び制御されない脈管形成の両者共に、同様な様式で進行すると考えられている。基底膜で囲まれた内皮細胞及び血管周囲細胞が、毛細血管を形成する。脈管形成は、内皮細胞及び白血球により放出される酵素による基底膜の侵食と共に開始される。次いで血管の内腔に並ぶ内皮細胞が、基底膜を通して突出する。脈管形成刺激物質は、内皮細胞が、侵食された基底膜を通して遊走するのを誘導する。遊走細胞はもとの血管から“芽（sprout）”を形成し、ここで内皮細胞が有糸分裂し、増殖する。内皮の芽は、互いに一緒になって毛細管ループを形成し、新たな血管が形成される。疾患状態においては、脈管形成の阻害により、新たな微小脈管系の侵入により生じる損傷を防ぐことができよう。持続的な脈管形成は、多様な疾患状態、腫瘍の成長（原発腫瘍及び転移状態の両者）、及び内皮細胞の異常成長において起こり、これらの状態において見られる病理学的損傷を支持する。制御されない脈管形成が原因で生じる多様な病理学的状態は、脈管形成依存性又は脈管形成関連疾患として群別されてきた。脈管形成過程の調節に向けられた治療法は、これらの疾患の消失又は緩和をもたらすことができよう。脈管形成が介在する疾患の一例は、眼の新脈管疾患である。この疾患は、網膜又は角膜などの目の構造中への新たな血管の侵入を特徴とする。これは失明の最も一般的な原因であり、約２０種の眼疾患に関与している。年齢と関連する黄斑変性においては、関連する視覚障害は、網膜色素上皮の下の線維脈管組織の増殖に伴うブルッホ膜の欠損を通しての脈絡膜毛細管の成長により引き起こされる。脈管形成性損傷は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障及び水晶体後線維増殖にも関連する。角膜新生血管形成に関連する他の疾患としては、これらに限定されるものではないが、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ過装着、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン病、アクネしゅさ、フィレクテヌロシス(phylectenulosis) 、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学的火傷、細菌性漬瘍、真菌性漬瘍、単純ヘルペス感染、帯状ヘルペス感染、原虫感染、カポジ肉腫、モーレン漬瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角質溶解、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティブンスジョンソン病、ペリフィゴイド(periphigoid)放射状角膜切開、及び角膜移植片拒絶が挙げられる。網膜／脈絡膜の新生血管形成と関連する疾患としては、これらに限定されるものではないが、糖尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、類肉腫、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頚動脈閉塞疾患、慢性ブドウ膜炎／ビトリティス（vitritis）、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性紅斑性狼瘡、未熟児網膜症、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎又は脈絡膜炎を生じる感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、光学窩、シュタルガルト病、パルスプラニティス(pars planitis)、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷、及びレイザー後の合併症が挙げられる。その他の疾患としては、これらに限定されるものではないが、ルベオーシス（角部の新生血管形成）と関連する疾患、及び増殖性硝子体網膜症の全ての形態を含む線維脈管又は線維組織の異常増殖に起因する疾患が挙げられる。脈管形成が関与すると考えられる他の疾患は、慢性関節リウマチである。関節の滑膜のライニング中の血管が、脈管形成を起こす。新たな脈管網の形成に加えて、内皮細胞は、パンヌスの成長及び軟骨破壊を導く因子及び反応性酸素種を放出する。脈管形成に関与する該因子は、慢性関節リウマチの慢性的炎症状態に対して、活発に寄与し、これを維持すると考えられる。脈管形成と関連する因子は、変形性関節炎においても役割を果していると考えられる。脈管形成と関連する因子による軟骨細胞の活性化は、関節の破壊に寄与する。後の段階において脈管形成因子は、新たな骨の形成を促進する。骨破壊を予防する治療法は、疾患の進行を止め、関節炎を患う患者に緩解をもたらす。慢性炎症も、病理学的脈管形成に関与すると考えられる。潰瘍性大腸炎及びクローン病などの疾患状態は、炎症組織中への新たな血管の内部的成長を伴う組織学的変化を示す。南アメリカにて発見された細菌感染症であるバルトネラ症は、脈管内皮細胞の増殖を特徴とする慢性状態を生じうる。脈管形成と関連する他の病理学的役割は、アテローム性動脈硬化症において認められている。血管の内腔に形成されるプラークは、脈管形成刺激活性を有することが示されている。幼年時に最も頻発する脈管形成疾患の一つは、血管腫である。ほとんどの場合には腫瘍は良性であって、何らかの影響を及ぼさずに後退する。より重篤な場合には、腫瘍は大きい海綿状の浸潤性形態に発達し、臨床的合併症を起こす。血管腫の全身性形態である血管腫症は、高い死亡率を示す。現在使用されている治療法では治療することのできない治療抵抗性の血管腫も存在する。脈管形成は、オスラー−ウェーバー−ランデュ病又は遺伝性出血性毛細管拡張症などの遺伝性疾患において見い出される損傷の原因でもある。これは、血管又はリンパ管の多数の小血管腫、腫瘍を特徴とする遺伝性疾患である。該血管腫は、皮膚及び粘膜に認められ、しばしば鼻出血（鼻血）又は消化管出血を伴い、また場合により肺又は肝の動静脈フィステルを伴う。脈管形成は、固形がん形成及び転移状態において顕著である。脈管形成因子は、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、及び骨肉腫などの幾つかの固形がんと関連して見い出されている。腫瘍は、栄養を与え、かつ細胞老廃物を除くための血液の供給無しには広がることができない。脈管形成が重要である腫瘍としては、固形腫瘍並びに、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫などの良性腫瘍が挙げられる。脈管形成の予防により、これらの腫瘍の成長及び腫瘍の存在により生じる動物への傷害をくい止めることができる。脈管形成は、白血病、つまり白血球細胞の無制限な増殖が起こり、一般には貧血、血液凝固傷害、並びにリンパ節、肝臓及び脾臓の肥大を伴う、骨髄の種々の急性又は慢性新生物形成疾患などの血液由来腫瘍と関連している。脈管形成は、白血病様の腫瘍を起こす、骨髄における異常において役割を果していると考えられる。脈管形成は、腫瘍転移の二つの段階において重要である。脈管形成刺激が重要である第一の段階は、腫瘍細胞が血流に入り込み、体内を循環することを可能とする腫瘍の血管新生にある。腫瘍細胞が最初の部位を離れ、第二の転移部位に着床すると、新たな腫瘍が成長し、かつ拡大することができるようになる前に、脈管形成が起こらなければならない。したがって、脈管形成の予防により、原発部位における新生物成長もおそらく含めて、腫瘍の転移を予防することができるであろう。腫瘍の維持及び転移における脈管形成の役割に関する知識により、乳がんの予後の指標がもたらされた。原発腫瘍に見い出される血管新生の量は、浸潤性乳がんにおける最も激しい脈管形成領域における、微小血管密度を計数することにより測定される。高レベルの微小血管密度は、腫瘍再発と相関することが認められた。治療手段による脈管形成の制御により、腫瘍の再発をくい止めることができるであろう。脈管形成は、生殖及び創傷の治癒などの正常な生理学的過程にも関与する。脈管形成は排卵において、また受精後の胞胚の着床において重要な過程である。脈管形成の阻害は、無月経の誘発、排卵の阻止又は胞胚の着床の予防のために使用することができよう。創傷の治癒においては、過剰修復又は線維増殖は、外科的処置の有害な副作用であり、脈管形成によって引き起こされるか又は悪化されうる。癒着は、外科的にしばしば起こる問題であり、小腸閉塞などの問題を引き起こす。脈管形成を予防するために数種の化合物が使用されてきた。Taylorらは、脈管形成の阻害のためにプロラミンを使用した。Taylorら、Nature 297: 307(1982) 参照。プロラミンは、その毒性のため、治療薬として実際に使用することは制限されている。Folkman らは、脈管形成を調節するためのヘパリンとステロイドの使用を開示している。Folkman ら、Science 221: 719(1983)及び米国特許第5,00 1,116 号及び4,994,443 号参照。糖質及び鉱質コルチコイド活性を欠くテトラヒドロコルチゾールなどのステロイドは、脈管形成を阻害することが認められた。ウシ硝子体液由来の４KDa 糖タンパク質及び軟骨誘導因子などの、動物内因性の他の因子が、脈管形成阻害に使用されてきた。インターフェロンなどの細胞因子は、脈管形成を阻害する。例えば、インターフェロンα又はヒトインターフェロンβは、ヒト新形成細胞によって刺激されたマウス真皮において腫瘍誘導脈管形成を阻害することが示されている。インターフェロンβは、同種異系脾細胞によって誘導される脈管形成の強力な阻害剤である。Sidkyら、Cancer Research 4 7: 5155-5161(1987)参照。ヒト組換えαインターフェロン（アルファ／Ａ）は、脈管形成により誘導される疾患である肺血管腫症の治療において有効に使用されたことが報告されている。White ら、N．Engl．J．Med．320: 1197-1200，1971 参照。本発明によると、ヒト及び非ヒトの両者を含む動物における望ましからぬ脈管形成の阻害に有効な組成物及び方法が提供される。これらの組成物は、非経口投与を含む各種経路により容易に投与され、安全な投与量において投与することができ、また内部部位において脈管形成阻害をもたらす。本発明は、脈管形成を阻害するために充分な投与量のインターロイキン１２を含有する組成物を投与することによる、望ましからぬ、もしくは制御されない脈管形成が介在する哺乳動物疾患の治療方法を提供する。本発明は、黄斑変性などのある種の眼新生血管疾患の治療に特に有用である。本発明の一部として意図する組成物は、好ましくは患者に非経口的に投与し、これにより疾患の進行をくい止めることができる。本発明を使用して治療することのできる他の疾患は、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、及び水晶体後線維増殖である。インターロイキン１２は、例えばヨーロッパ特許出願第433827号、国際特許出願WO9005147 及びWO9205256 号、Kobayashi M.ら、J．Exp．Med．170: 827-845 ，1989 及びStern A.S.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87: 6808-6812，1990 に記述されているように、この分野で既知の方法により調製され得る。インターロイキン１２は、既知の通常の化学的合成法、組換え法又は天然資源からの精製によって製造されうる。“インターロイキン１２”なる用語は、精製されたタンパク質、及び／又は、組換え体のタンパク質と類似するポリペプチドをも包含するが、修飾は、自然に行われたものでも、あるいは故意に操作されたものでもよい。本発明は、脈管形成の阻害が、ＩＬ−１２の新たな生物学的活性であることの証拠を提供するものである。この新生血管形成の阻害は、最適抗腫瘍効果をも生じるＩＬ−１２の濃度(Brunda M.J．ら、J．Exp．Med．178: 1223-1230，1993) において起こった。ＩＬ−１２は、種特異的であって、これは、ＩＬ−１２をニワトリ漿尿膜アッセイにおいて使用した場合に脈管形成阻害がないことと一致する。したがって、マウス角膜新生血管形成モデルが、ＩＬ−１２の抗脈管形成性の評価に選択されるアッセイ法である。このモデルを、異なった免疫的背景を有する種のマウスにおいて使用したところ、免疫系の個々の細胞型（ナチュラルキラー又はＴ細胞）は、ＩＬ−１２の抗脈管形成効果の伝達物質としては認められなかった。この研究において使用されたマウス角膜新生血管形成アッセイは、脈管形成の基礎線維芽細胞成長因子−誘導モデルである。したがって、ＩＬ−１２は、基礎線維芽細胞成長因子−誘導脈管形成を特異的に阻害すると論じられよう。しかしながら、ＩＬ−１２は、基礎線維芽細胞成長因子ペレットを、脈管内皮成長因子を含むペレット（１６０ｎｇ／ペレット）に置換した場合にも同様の阻害効果を示した。ＩＬ−１２による処置により、マウスの血流中においてＩＦＮ−γの持続的上昇が誘発された（Gately M.K．ら、Int．Immunol．6: 157-167,1994）。ＩＦＮ −γ抗体の投与により、新生血管形成のＩＬ−１２に誘導される阻害が妨げられた。更に、ＩＦＮ−γのボラス注射又は連続注入のいずれによる処置によっても、新生血管形成の阻害が得られた。これらの知見は、ＩＦＮ−γが、ＩＬ−１２の抗脈管形成活性の必要かつ充分な伝達物質であることを示唆している。ＩＬ− １２の抗腫瘍活性においてＩＦＮ−γが重要な役割を果していることを支持しているのは、正常マウスのＩＦＮ−γ−抗体による処置が、ＩＬ−１２の抗腫瘍効果の低下をもたらすという観察結果である（Nastala C.L.ら、J．Immunol．153: 1697-1706，199)。ＩＦＮ−γは、ネズミ腫瘍モデルにおいて使用されているが（Brunda M.J．ら、Int．J．Cancer 40: 807-810，1987）、抗がん剤としてのＩＦＮ−γの臨床的使用はあまり成功しているとはいえない。ＩＦＮ−γの薬理動態が、この薬剤の臨床試験においては残念な結果しか得られないことの原因である。静脈内ボラス投与後、ＩＦＮ−γは比較的短い半減期（時間）を示し(Rutenfranz I．ら、J．Interferon Res．8: 573-580，1988)、皮内注射では、この薬剤の検出可能な血清中濃度は得られない（Cross S.E.ら、J ．Interferon Res．45: 606-609，1993）。ボラス注射と比較して、ＩＦＮ−γ の連続腹腔内注入により、脈管形成の阻害が増強されたとの観察により、２種の投与法間での薬理動態の差異が示唆された。しかしながら、基礎線維芽細胞成長因子ペレットの移植前の付加的な３日前のＩＦＮ−γの連続投与が、実験結果に有利な効果をもたらすことを除外することはできない。ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１２処置動物から得た血清のいずれも、インビトロにおける内皮細胞増殖に対して顕著な効果を有したことから、現在においてはＩＦＮ−γが、血管に対してどのように効果を発揮するのかは明確ではない。抗脈管形成剤としてのＩＦＮ−γに関する文献は、論争的であって、主にインビトロでの観察に基づいている（Sato N．ら、J．Invest．Dermatol．95: 85S-89S，1990 ; Saegusa Y.ら、J．Cell．Physiol．142: 488-495，1990; Friesel R.ら、J．C ell．Biol．104:689-696，1987; Saiki I．ら、Int．J．Cancer 51: 641-645，1 992;Kobayashi S.ら、Immunopharmacol．27: 23-30，1994）。ＩＦＮ−γは、多くの遺伝子の制御に関与していることから（Sen G.C.ら、J．Biol．Chem．267: 5017-5020，1992)、ＩＦＮ−γの下流側の作用が、抗脈管形成効果に関与していると考えることは妥当であろう。ルイス肺がんを有するマウスを用いた実験では、ＩＬ−１２と脈管形成阻害剤ＡＧＭ−１４７０の両者の単一薬剤としての強力な抗腫瘍活性が確認された（Br unda M.J．ら、J.Exp.Med．178: 1223-1230，1993; Ingber D．ら、Nature 348: 555-557，1990)。ＩＬ−１２及びＡＧＭ−１４７０の同時処置が、ルイス肺がんモデルに対して相加的効果を有するという観察は、これらの薬剤が異なった経路を介して内皮細胞に作用することを示唆している。抗脈管形成剤を組み合わせることにより、悪性腫瘍の治療に対するこの方法の可能性が高められよう。本発明は、ＩＬ−１２が、インビボにおける強力な脈管形成阻害剤であることを明らかに証明し、その効果はＩＦＮ−γの継続的放出を誘導することにより介在されるものと考えられる。本発明に関連して、ＩＬ−１２の医薬的に許容されうる処方化は、当業者に既知の処方法を用いて行うことができる。これらの処方物は、標準的経路により投与することができる。一般的には、処方物は、非経口的（例えば、静脈内、皮下、又は筋肉内）に投与することができるが、局所、経皮、経口、又は直腸経路も考慮される。更に、本処方物は、ＩＬ−１２の持続的放出を可能とする生分解性ポリマーに配合することもでき、該ポリマーは、例えば腫瘍部位などの薬剤の放出を必要とする近辺に埋設する。生分解性ポリマー及びその使用は、例えばBrem ら、J．Neurosurg．74:441-446(1991)に記述されている。ＩＬ−１２の投与量は、治療される症状、特定の化合物、並びにヒト又は動物の体重及び症状、ＩＬ− １２の投与経路などの他の臨床的因子によって異なる。本発明は、ヒト及び脊椎動物の両者への適応を持つものと理解される。ヒトに対する非経口投与については、およそ０．１〜２０mg/kg の間で週に１〜５回、好ましくはおよそ０．５〜１０mg/kg の間で週に１〜３回、最も好ましくはおよそ１〜１０mg/kg の間で週に１〜３回の投与量で一般的には充分である。本処方物は、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、気管内、及び硬膜外を含む）投与に適したものを含む。本処方物は、好都合には、単位投与剤型で提供することができ、通常の医薬技術にて調製することができる。そのような技術は、ＩＬ−１２を医薬的担体又は賦形剤と組み合わせる工程を含む。一般的に、本処方物は、ＩＬ−１２を、液体担体と、均一かつ緊密に配合することによって調製する。非経口投与に好適な処方物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び目的とする患者の血液と処方物とを等張とする溶質を含んでいることのできる水性及び非水性の滅菌注射液、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含んでいることのできる水性及び非水性の滅菌懸濁剤が挙げられる。本処方物は、例えば、密封アンプルもしくはバイアルなどの単一投与又は複数投与用容器に提供することができ、また使用直前に注射用の例えば水などの滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥条件にて保存することもできる。好ましい単位投与剤型処方物は、上述のように１日投与量又は単位、１日当たりの副投与量を含むもの、あるいは投与成分の適当な分画を含むものである。本発明により治療することのできる角膜新生血管形成と関連する疾患としては、これらに限定されるものではないが、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、及び水晶体後線維増殖、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ過装着、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン病、アクネしゅさ、フィレクテヌロシス(phylectenul osis)、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学的火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状ヘルペス感染、原虫感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角質溶解、外傷、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発動脈炎、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティブンスジョンソン病、ペリフィゴイド(periphigoid)放射状角膜切開、及び角膜移植片拒絶が挙げられる。本発明により治療することのできる網膜／脈絡膜の新生血管形成と関連する疾患としては、これらに限定されるものではないが、糖尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、類肉腫、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頚動脈閉塞疾患、慢性ブドウ膜炎／ビトリティス（vitritis）、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性紅斑性狼瘡、未熟児網膜症、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎又は脈絡膜炎を生じる感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、光学窩、シュタルガルト病、パルスプラニティス(pars pl anitis)、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷、及びレイザー後の合併症が挙げられる。その他の疾患としては、これらに限定されるものではないが、ルベオーシス（角部の新生血管形成）と関連する疾患、及び糖尿病と関連するか否かに関わらず、増殖性硝子体網膜症の全ての形態を含む線維脈管又は線維組織の異常増殖に起因する疾患が挙げられる。本発明により治療することのできる別の疾患は、慢性関節リウマチである。関節の滑膜のライニング中の血管が、脈管形成を起こすと考えられる。新たな脈管網の形成に加えて、内皮細胞は、パンヌスの成長及び軟骨破壊を導く因子及び反応性酸素種を放出する。脈管形成に関与する該因子は、慢性関節リウマチの慢性的炎症状態に対して、活発に寄与し、これを維持すると考えられる。本発明により治療することのできる別の疾患は、血管腫、オスラー−ウェーバー−ランデュ病、又は遺伝性出血性毛細管拡張症、固形もしくは血液由来の腫瘍並びに後天性免疫不全症候群である。マウスにおける基礎線維芽細胞成長因子−誘導角膜新生血管形成のモデルを、インビボにおける脈管形成に対するＩＬ−１２の効果を評価するために使用した。異なる系統のマウスに、１日当たり１mgのＩＬ−１２を５日間連続して腹腔内投与した。新生血管形成の程度を、基礎線維芽細胞成長因子含有ペレットに対する応答においての新生血管形成の脈管の長さ、及び角膜時計時数(number of corneal clock hours)を用いて測定した。ＩＬ−１２及び脈管形成阻害剤ＡＧＭ−１４７０の抗腫瘍活性を、ルイス肺がんを有するマウスにて評価した。インビトロでの増殖研究は、ウシ毛細血管内皮細胞、マウス膵内皮細胞、及びマウス血管内皮腫細胞系にて行った。免疫適格Ｃ５７ＢＬ／６マウス、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス及びナチュラルキラー細胞欠損ベージュマウスにおいて、角膜新生血管形成は、ＩＬ−１２処置の結果としてほぼ完全に阻害された。この脈管形成に対する強力な阻害は、ＩＦＮ−γ中和抗体の投与によって予防された。更に、腹腔内にボラス注射、あるいは腹腔内に埋設した浸透圧ポンプによる連続的注入により投与したＩＦＮ−γは、ＩＬ−１２による治療の間に観察される抗脈管形成効果を再現した。ＩＬ−１２及びＡＧＭ−１４７０による治療は、ルイス肺がんを有するマウスにおいて相加的抗腫瘍効果を有し、作用の異なった抗脈管形成メカニズムが示唆された。本発明を以下の実施例によって更に説明するが、これらは発明の範囲に何らかの制限を与えるものと解されるべきものではない。反対に、手段は、この記述を読んで当業者に示唆される、種々の他の実施態様、変法及び均等な方法に対しても、本発明の精神及び／又は添付の請求の範囲から逸脱することなく、及ぶものと明確に理解されるべきである。実施例１．材料組換えネズミＩＬ−１２（ＩＬ−１２）、組換えネズミインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、及びラットＩｇＧ１ＸＭＧ１．２ＩＦＮ−γブロック抗体は、Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ のものである。ＡＧＭ−１４７０（ＴＮＰ−４７０）及び基礎線維芽細胞成長因子は、日本、大阪の武田薬品工業から入手した。他の材料はSigma，St Louis，Moから購入した。ＩＬ−１２のモノマー混合物は、ＩＬ−２１をジチオスレイトール（１０mM）及びヨードアセトアミド（５０mM）にて還元することにより調製した。その後、該混合物を、還元剤除去のために３時間透析した（分子量カットオフ値6-8,000D 、Spectra/Por 透析膜、Houston，Tx)。混合物中にモノマーが存在するかどうか及びダイマーが存在しないかどうかを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。２．細胞及び培養条件ウシ毛細血管内皮細胞、マウス膵島内皮細胞の一次培養物及びマウス血管内皮腫症細胞系をこの研究に使用した。１００U/mlのペニシリン、１００mg/ml のストレプトマイシン、２mMのＬ−グルタミン（“全培地”）及び１０％ウシ血清（ GIBCO BRL，Grand Island，NY.）を添加したダルベッコ変法イーグル最少必須培地（ＤＭＥＭ）において、１０％ＣＯ₂雰囲気下で単層培養を行った。ウシ毛細血管内皮細胞を、４ng/mlの基礎線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の存在下で培養を維持し、一方で、マウス膵島内皮細胞を、６ng/ml の基礎線維芽細胞成長因子及び１０％ＮＵＳＥＲＵＭIV培養補給剤(Becton Dickinson Labware，Bedford ，MA)の存在下で成長させた。ウシ及びマウス内皮細胞を含む実験は、１０及び１５継代の間に行った。３．マウス雄性Ｃ５７ＢＬ／６、ＳＣＩＤ（Ｃ５７ＢＬ／６／ＳＣＩＤ／ｓｚｊ）及びベージュ（Ｃ５７ＢＬ／６／ｂｇｊ）マウスは、Jackson Laboratories，Ba r Harbor，MEから購入した。ヌードマウス（ＮＣＲＮｕ／ｓｅｄ、Swiss whit e background）は、Massachusetts General Hospital，Boston，MAから入手した。全ての動物研究は、６−８週令の雄性マウスにて行った。４．インビトロアッセイ内皮細胞増殖に対する効果を評価するために、ウシ毛細血管内皮細胞、マウス膵島内皮細胞及び血管内皮腫症細胞を、２４ウエルのプレート中、１０，０００〜１２，５００細胞／ウエルの密度で培養した。２４時間後、細胞を１ng/ml の基礎線維芽細胞成長因子及び５％ウシ血清を補充した完全培地中で培養し、試験化合物を加えた。７２時間後、細胞をトリプシン処理により回収し、クールター計数器で計数した。５．インビボアッセイインビボにおけるＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの脈管形成に対する効果を研究するために、既述のマウス角膜脈管形成アッセイの変法を使用した（Polakowski I .J．ら、Am．J．Pathol．143: 507-517，1993; Muthukkaruppan V.ら、Science 205: 1416-1418，1979）。略述すると、両眼の角膜に、縁の１mm以内に広がるマイクロポケットを作成し、基礎線維芽細胞成長因子（〜８０ng）、スクラルフェート及びハイドロンを含むペレットを両眼に埋設した。最大脈管長及び新生血管形成の時計時数として測定した脈管の反応を、毎日評価した。本研究で示されたデータは、基礎線維芽細胞成長因子ペレットの移植後５日目に得たもので、これは最大脈管形成反応の日であることが認められた。この実験において、食塩水又はＩＦＮ−γのいずれかを連続的に注入するように設計した浸透圧ポンプ（Alzet 2002，Alza Corporation，Palo Alto，CA)を、腹腔内に埋設した。マウスには、基礎線維芽細胞成長因子ペレットの移植前に３日間、開腹手術からの回復期間が与えられた。実験終了後、残るポンプの体積を検査して、それが適当に機能し、適当に注入を行ったかどうかを確認した。ＩＬ−１２処置マウスの血清を、ＩＬ−１２の連日投与の５日目の注射から２４時間後に、心臓穿刺により得た。６．腫瘍実験雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０⁶個のルイス肺がん細胞を接種した。腫瘍体積が７５mm³に達した後に、食塩水、ＩＬ−１２、ＡＧＭ−１４７０又はＩＬ− １２プラスＡＧＭ−１４７０のいずれかによる処置を開始した。ＩＬ−１２は、１mg／日の投与量をもって、５日間連続して腹腔内投与した。２日間の休息の後に、このサイクルを反復した。ＡＧＭ−１４７０は、１日おきに、３０mg/kg の投与量で皮下投与した。垂直直径のキャリパによる連続測定を行って、式：最長径×最短径²×０．５２を使用して腫瘍体積（mm³）を算出した。接種から３週間後に腫瘍及び肺を切除して、重量を測定した。肺表面転移は、解剖顕微鏡下で計数した。７．統計学的解析群間の差異の統計学的有意性をスチューデントの２−tailed ｔ−検定を適用して計算した。結果は、平均±標準平均誤差として表した。８．マウス角膜新生血管形成に対するＩＬ−１２の効果雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＩＬ−１２（ペレット移植の日から開始して、５日間連続で、１日当たり、０．１mlのビヒクル中の１mgを腹腔内投与）又はビヒクル（リン酸緩衝食塩水中の１％同系マウス血清）のいずれかにより処置した。処置中に、明らかな毒性を観察することはなかった。ＩＬ−１２にて処置したＣ５７ＢＬ／６マウスは、基礎線維芽細胞成長因子ペレットに対する反応において、角膜新生血管形成をほとんど有さなかったが、一方、ビヒクルで処置したマウスは、ペレット移植後５日以内にペレットに達する血管を有していた（ｐ＜０．０００１；図１及び２）。結果は、別々の３回の実験から得た。ＩＬ−１２をモノマー混合物に還元し、マウスを１日当たり、この混合物１mgにて、５日間腹腔内投与により処置したところ、血管形成に対するインビボ阻害効果は失われていた（図２）。免疫系のいずれの細胞が、脈管形成に対するＩＬ−１２の阻害効果に介在するものであるかを調査するために、マウス角膜新生血管形成アッセイを、異常免疫系を有するマウスの系統において使用した。我々は、最初にＴ細胞欠損ＳＣＩＤマウスを使用した。ＩＬ−１２は、ＳＣＩＤマウスにおいては、脈管形成の阻害を維持していた（ビヒクル及びＩＬ−１２処置マウスに対して、それぞれ脈管長：０．９８±０．０６mm対０．２２±０．０２mm（ｐ＝０．０００２）、及び時計時：４．６±０．４時間対３±０．３時間（ｐ＝０．０１１））。阻害の程度は、正常Ｃ５７ＢＬ／６において観測されたものと似ていた。阻害の同様なパターンが、ナチュラルキラー細胞欠損ベージュマウスをＩＬ−１２にて処置した場合に観察された（ビヒクル又はＩＬ−１２処置マウスに対して、それぞれ脈管長：０．７±０．０５mm対新たな脈管無し（ｐ＜０．０００１）、及び時計時：３．６±０．３時間対新たな脈管無し（ｐ＜０．０００１））。ヌードマウスは、自然発生的な角膜新生血管形成を有し、これが、基礎線維芽細胞成長因子−誘導新血管の発達を隠すことが認められた。しかしながら、脈管形成のある程度の阻害を示唆する知見は、ＩＬ−１２処置動物においてはペレット中に成長する毛細血管がなく、その一方で、ビヒクル処置マウスでは、ペレット中に血管が明らかに成長していたというものである。９．インビトロにおける内皮細胞増殖に対するＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの効果ＩＬ−１２（０．００１〜１００ng/ml の範囲）は、ウシ又はマウス内皮細胞もしくは血管内皮腫細胞のいずれの増殖に対しても効果を示さなかった。ＩＬ− １２により５日間処置を受けた後のＣ５７ＢＬ／６、ＳＣＩＤ又はヌードマウスから得たいずれの血清も、いずれの型の内皮細胞の増殖に対しても阻害効果を持たなかった。ＩＦＮ−γ（０．０００１〜２００ng/ml の範囲）は、マウス膵島内皮細胞の増殖に対して、最小の効果（対照細胞数に比べて１６％の阻害）しか示さず、ウシ毛細血管内皮細胞の増殖に対しては効果を示さなかった。１０．インビボにおけるＩＬ−１２活性の伝達物質としてのＩＦＮ−γの役割Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＩＦＮ−γ−抗体の単回投与による処置（ペレット移植の日の、ＩＬ−１２の第１回の注射の２時間前に、１mg／マウスを腹腔内投与）は、ＩＬ−１２の抗脈管形成性を完全に打ち消した（ｐ＜０．０００１）。ラットＩｇＧの対照投与（ペレット移植の日に、１mg／マウスを腹腔内投与）は、ＩＬ−１２による新生血管形成の阻害に影響を与えなかった（図３）。ＩＦＮ−γによる処置が、ＩＬ−１２で見られたように同様な脈管形成阻害を生ずるか否かを調査するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＩＦＮ−γを毎日腹腔内注射することにより処置した（２５０，０００U/日、５日間連続）。これらのマウスでは、有意な脈管長の阻害（ｐ＝０．０００７）が観察された（図４）が、明らかな毒性は観察されなかった。ＩＦＮ−γを一定濃度に維持するために、浸透圧ミニポンプを腹腔内に移植し、これが、ＩＦＮ−γを、実験期間中、１３０，０００U/日の最終投与量になるように放出した。基礎線維芽細胞成長因子ペレットを、ポンプ移植から７２時間後に移植した。食塩水を負荷したポンプを移植しても、対照動物における新たな脈管の発達に対する影響は認められなかった。これらの動物において、新生血管形成の程度は、ポンプを移植されなかった対照動物に匹敵するものであった。しかしながら、ＩＦＮ−γを含むポンプを移植した動物では、角膜における新脈管の成長が完全に阻害された（図４；対照と対比して、脈管長についてｐ＝０．０００２、及び時計時についてｐ＝０．０００４）。対照マウス及びＩＦＮ−γ処置マウスの両者共に、開腹術後の回復期間に体重が減少した。ペレットの移植後、対照マウスでは体重が増加したが、一方、ＩＦＮ−処置マウスは、安定した体重を示し、かつ傾眠的であった。１１．ルイス肺がんに対するＩＬ−１２及びＡＧＭ−１４７０による処置の効果ＩＬ−１２又はＡＧＭ−１４７０のいずれかによる処置は、食塩水にて処置された対照動物に比べて、ルイス肺がんを接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける原発腫瘍の成長及び自然肺転移の阻害に有効であった。ルイス肺がんを有するマウスを、ＩＬ−１２及びＡＧＭ−１４７０により同時処置したところ、ＩＬ− １２又はＡＧＭ−１４７０の単一薬剤による処置を受けた動物で見られるものより、原発腫瘍体積（図５）は小さく、自然肺転移（図６）も少なかった。いずれの群においても、処置中に明らかな毒性は観察されなかった。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Inhibition of angiogenesis using interleukin 12 The present invention relates to the prevention of diseases mediated by unwanted angiogenesis. More particularly, the present invention relates to a medicament for preventing unwanted angiogenesis, An interface for the manufacture of a medicament for the treatment of angiogenesis-dependent or angiogenesis-related diseases It relates to the use of Leukin 12 (IL-12). Once natural killer cell stimulating factor (Kobayashi M. et al., J. Exp. Med. 170: 827-845, 1989), and cytotoxic lymphocyte maturation factor (Stern A.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6808-6812, 1990). IL-12) has potent anti-tumor and anti-metastatic activity in several murine tumor models (Brunda M.J. et al., J. Exp. Med. 178: 1223-1230, 1993; Nastala C) .L. J. et al. Immunol 153: 1697-1706, 1994). IL-12 exerts its antitumor effect The mechanism of volatility is not fully understood, but IL-12 is a natural killer. Induces various biological activities in vitro against T-cells and T cells (Manetti R. et al., J. Exp. Med. 179: 1273-1283, 1994; Wu C.Y. et al. J. Immunol. 151: 1938-1949, 1993; Tripp C.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 90: 3725-3729, 1993; Seder R.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10188 -10192, 1993; Bloom E.T. et al. Immunol. 152: 4242-4254, 1994; Cesano A. J. et al. Immunol. 151: 2943-2957, 1993; Chan S.H. J. et al. Immunol. 148: 92- 98, 1992). Activation of cytotoxic T lymphocytes by IL-12 indicates its antitumor activity (Brunda M.J. et al., J. Exp. Med. 178: 1). 223-1230, 1993). The antitumor effects of IL-12 are both severe in T-cell deficiency. Complex immunity Deficient (SCID) and nude mice, and CD8^*-Deficient normal mice (CD8^* -Depleted euthymic mice) (Brunda M.J. et al., J. . Exp. Med. 178: 1223-1230, 1993; O'Toole M. et al. Immunol. 150: 294A, 19 93). These results indicate that IL-12 is potent against murine tumors in vivo. Has a strong anti-tumor and anti-metastatic effect, and has anti-tumor activity against subcutaneous tumors CD8 in mediating effects⁺Proves that T cells play an important role You. The present invention relates to an interface for the preparation of a medicament effective for inhibiting unwanted angiogenesis. Provides use of Leukin 12. IL-12 has a broad spectrum in vivo Although it has been observed to inhibit the growth of ram tumors, It has no direct effect on tumor cells. Furthermore, in T cell deficient mice, I The antitumor activity of L-12 was not completely abolished, and IL-12 showed anti-angiogenic It is suggested to have a property. IL-12 induces strong inhibition of neovascularization Lead. This effect is not mediated by any particular cell type of the immune system. Interferon gamma (IFN-γ) is a chemistry of the anti-angiogenic effect of IL-12. It is thought to play an important role as a transmitter. Anti-vascular of IL-12 Surprising recognition of formability involves co-administration with other neovascularization inhibitors It is at the core of properly designing treatment protocols. Thus, the present invention is directed to the mediation of unwanted or uncontrolled angiogenesis. Treatment of illnesses, particularly those mediated by unwanted or uncontrolled angiogenesis For treating neovascularization, particularly retinal / choroidal neovascularization. The use of interleukin 12 for the manufacture of a medicament for the production of Retina / choroid Neovascularization is associated with diabetic retinopathy or retinal / choroid neogenesis Where angiogenesis is associated with macular degeneration It is another object of the present invention to provide the above uses in such cases. Undesired or uncontrolled angiogenesis-mediated diseases include corneal neovascularization Manufacture of a medicament for the treatment of a disease mediated by uncontrolled angiogenesis in the case of angiogenesis It is another object of the present invention to provide the use of interleukin 12 for You. Interloy for the treatment of diabetic retinopathy and for the manufacture of a medicament for the treatment of macular degeneration It is yet another object of the present invention to provide for the use of the kin 12. Furthermore, the present invention relates to a method for treating a solid tumor or a blood-derived tumor and metastases thereof. Of undesired or uncontrolled angiogenesis-mediated disease when derived from Including the use of interleukin 12 for the manufacture of a therapeutic medicament. Treatment of all forms of proliferative vitreoretinopathy, whether or not associated with diabetes It is also an object of the present invention to provide the use of interleukin 12 for the preparation of a medicament. For another purpose. The medicament may include one or more additional angiogenesis inhibitors. Interleukin 12 and interleukin 1 for the treatment of the above diseases The use of 2 is also part of the present invention. Further, the present invention provides one or more of the above-mentioned treatments for treating the above diseases. Interleukin 12, or interleukin 12, in combination with the above additional angiogenesis inhibitor -Including the use of Leukin 12.Brief description of drawings Figure 1: Recombinant murine IL-1 on bFGF-induced mouse corneal neovascularization. 2 effects. These photographs are 5 days after implantation of basal fibroblast growth factor pellet (P). Ocular, vehicle (control) or IL-12 treated C57 The corneas of BL / 6 and SCID mice are represented. Significant new blood vessels in control cornea Present, while little vascular response is seen after IL-12 treatment . (SCID mice pass through the cornea because their iris is hypopigmented. It has inherently visible iris vessels. Therefore, the IL-12 treatment panel Are located in the iris plane and are located in the basal fibroblast growth factor pellet. Note that it is not a more induced corneal vessel. ) Figure 2: Implantation of basal fibroblast growth factor pellet in C57BL / 6 mice Angiogenic response 5 days later. Treatments were as follows: vehicle (21 corneas), I L-12 (30 corneas) or a monomer mixture of IL-12 (10 corneas) Become. Vessel length (mm) and number of clock hours are average ± SEM Therefore, it is shown. FIG. 3: IFN-γ-antibody against IL-12-induced inhibition of mouse corneal neovascularization Body effect. Male C57BL / 6 mice were ligated with rat XMG1. 2 IFN Treated with a single intraperitoneal injection of either -γ antibody or rat IgG. Newborn Vessel length and clock time of angiogenesis were measured on day 5. This experiment was repeated twice separately And obtained similar results. Data are the mean ± SEM of at least 13 corneas. Shown. Figure 4: IF on basal fibroblast growth factor-induced mouse corneal neovascularization. Effect of N-γ treatment. Male C57BL / 6 mice were started on the day of pellet implantation Intraperitoneal bolus injection of IFN-γ or IFN transfusion started 3 days before pellet implantation Treated by any of the subsequent infusions. Vascular length and clock time, basal fibroblast growth Measured 5 days after transplantation of the factor pellet, and shown as the mean ± SEM of 10 corneas in each group. Figure 5: IL-12 and AGM-1470 on Lewis lung cancer growth effect. Male C57BL / 6 mice were inoculated with Lewis lung carcinoma on day 0, saline, I Initiation of treatment with L-12 or AGM-1470 after tumor is measurable did. The treatment protocol and measurement method will be described later. The results were 4 animals per group 1 shows one experiment using. Figure 6: IL-12 and AGM-1 for spontaneous lung surface metastasis of Lewis lung cancer 470 effects. The treatment protocol and counting method will be described later. The results are 4 One experiment with animals is shown. Angiogenesis is important in tumors and metastases that extend beyond a few millimeters in diameter (Folkman J. , N .; Engl. J. Med. 285: 182-186, 1971). Tumor and Strategies to prevent the development of new blood vessels in metastases are important for such tumor growth (Millauer B.). Et al., Nature 367: 576-579, 1994; Kim K. J. Et al., Nature 362: 841-844, 1993). Whether IL-12 has anti-angiogenic properties To determine IL-12, use basal fibroblast growth factor-induced mouse corneal neoplasia It was evaluated in a model of angiogenesis. The results show that IL-12 It is a potent angiogenesis inhibitor and its effects are mediated by IFN-γ. Are shown. Angiogenesis is the formation of new blood vessels in a tissue or organ. Normal physiological Under conditions, humans or animals can only undergo angiogenesis in very specific and limited cases. You. For example, angiogenesis is usually associated with wound healing, fetal or embryo growth, and corpus luteum, Observed in endometrium and placenta formation. Angiogenesis control involves angiogenesis stimulation It is a highly regulated system of substances and inhibitors. Control of angiogenesis It has been shown to change in certain disease states, and in many cases The pathological damage associated with the disease is associated with uncontrolled angiogenesis. When both controlled and uncontrolled angiogenesis progress in a similar manner It is considered. Endothelial cells and perivascular cells surrounded by basement membrane form capillaries To achieve. Angiogenesis is caused by the release of endothelial cells and leukocytes by enzymes released from the basement membrane. Started with erosion. Next, endothelial cells lining the lumen of the blood vessel protrude through the basement Put out. Angiogenic stimulants cause endothelial cells to migrate through the eroded basement membrane Inducing The migrating cells form “sprouts” from the original blood vessels, where Skin cells undergo mitosis and proliferate. Endothelial buds, capillary loop together And new blood vessels are formed. In disease states, inhibition of angiogenesis This would prevent damage caused by the invasion of new microvasculature. Sustained angiogenesis can be linked to various disease states, tumor growth (primary tumors and metastatic states). Both), and occurs in abnormal growth of endothelial cells and is found in these conditions Support pathological damage. Diverse Pathology Caused by Uncontrolled Angiogenesis Strategic conditions have been grouped as angiogenesis-dependent or angiogenesis-related diseases. Vascular form Therapies directed at modulating the developmental process may result in elimination or alleviation of these diseases. I can do it. An example of a disease mediated by angiogenesis is ocular neovascular disease. The disease affects the retina Or it is characterized by the invasion of new blood vessels into the structure of the eye, such as the cornea. This is the most blinding Is also a common cause and is involved in about 20 eye diseases. Age related macular In degeneration, the associated visual impairment is the proliferation of fibrovascular tissue below the retinal pigment epithelium Caused by choroid capillary growth through Bruch's membrane defects associated with Angiogenic damage includes diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, corneal graft rejection, angiogenesis It is also associated with glaucoma and post-lens fibrosis. Other diseases associated with corneal neovascularization Patients include, but are not limited to, epidemic keratoconjunctivitis, vitamin A deficiency Disease, contact lens overwear, atopic keratitis, upper limbal keratitis, pterygium dry angle Meningitis, Sjogren's disease, acne rosacea, phylectenulosis , Syphilis, mycobacterial infection, lipid degeneration, chemical burn, bacterial ulcer, fungal pickle Ulcer, herpes simplex infection, herpes zoster infection, protozoal infection, Kaposi's sarcoma, Mohren's pickle Ulcer, terien margin degeneration, limbic keratolysis, rheumatoid arthritis, systemic lupus, multiple activation Phlebitis, trauma, Wegener's sarcoidosis, scleritis, Stevens-Johnson disease , Periphigoid radial keratotomy, and corneal graft rejection It is. Diseases associated with retinal / choroidal neovascularization include, but are not limited to: But not diabetic retinopathy, macular degeneration, sickle cell anemia, sarcoma, syphilis, bullet Fibrous pseudoxanthoma, Paget's disease, venous occlusion, arterial occlusion, carotid artery occlusion, Uveitis / vitritis, mycobacterial infection, Lyme disease, Systemic lupus erythematosus, prematurity retinopathy, Eales disease, Behcet's disease, retinitis or pulse Infections causing choroiditis, putative ocular histoplasmosis, best disease, myopia, optical fossa, Targart's disease, pulse planitis, chronic retinal detachment, hyperviscosity Syndrome, toxoplasmosis, trauma, and complications after razor. That Other disorders include, but are not limited to, rubeosis (corneal A line that includes all forms of disease associated with neovascularization) and proliferative vitreoretinopathy Diseases caused by abnormal growth of vascular or fibrous tissue can be mentioned. Angiogenesis is involved Another disease that may be considered is rheumatoid arthritis. Synovial lining of joints The blood vessels inside cause angiogenesis. In addition to forming new vascular networks, endothelial cells It releases factors and reactive oxygen species that lead to growth and cartilage destruction of nunus. For angiogenesis The factors involved actively contribute to the chronic inflammatory state of rheumatoid arthritis. It is believed that this will be maintained. Angiogenic factors may play a role in osteoarthritis Can be Activation of chondrocytes by factors associated with angiogenesis contributes to joint destruction I do. At a later stage, angiogenic factors promote new bone formation. Bone destruction Preventive treatment stops the progression of the disease and results in remission in patients with arthritis. Pride Sexual inflammation is also thought to be involved in pathological angiogenesis. Ulcerative colitis and claw Disease states, such as Parkinson's disease, are histological with the ingrowth of new blood vessels into Indicates a change. Bartonellosis, a bacterial infection found in South America, is a vascular A chronic condition characterized by proliferation of endothelial cells can result. Other pathologies associated with angiogenesis Biological role has been recognized in atherosclerosis. Shaped into the lumen of a blood vessel The resulting plaque has been shown to have angiogenic stimulatory activity. One of the most frequent angiogenic diseases in childhood is hemangiomas. In most cases The tumor is benign and regresses without any effect. More serious In some cases, the tumor develops into a large spongy invasive form, causing clinical complications. Blood vessels Hemangiomatosis, a systemic form of tumor, exhibits high mortality. Currently used treatment There are also refractory hemangiomas that cannot be treated by law. Angiogenesis is Hereditary diseases such as Slur-Weber-Lundue disease or hereditary hemorrhagic telangiectasia It is also the cause of the damage found in patients. This is because a large number of blood vessels or lymph vessels Is a hereditary disease characterized by small hemangiomas and tumors. The hemangioma affects the skin and mucous membranes And often with epistaxis (nosebleeds) or gastrointestinal bleeding, and Is accompanied by hepatic arteriovenous fistula. Angiogenesis is prominent in solid tumor formation and metastatic states. Angiogenic factors , Rhabdomyosarcoma, retinoblastoma, Ewing sarcoma, neuroblastoma, osteosarcoma, etc. Have been found in connection with several solid cancers. The tumor is Can spread without a blood supply to nourish and remove cellular waste Absent. Tumors where angiogenesis is important include solid tumors, acoustic neuromas, Examples include benign tumors such as fibroids, trachoma and purulent granulomas. Prognosis of angiogenesis Prevention prevents the growth of these tumors and damage to animals caused by the presence of the tumors. You can stop it. Angiogenesis occurs in leukemia, an unlimited proliferation of white blood cells, which is generally poor. Various types of bone marrow with blood, blood clotting injury and hypertrophy of lymph nodes, liver and spleen It is associated with blood-borne tumors, such as acute or chronic neoplastic diseases. Angiogenesis is Possibly plays a role in abnormalities in bone marrow causing leukemia-like tumors It is. Angiogenesis is important in two stages of tumor metastasis. Angiogenic stimulation is important The first step is to allow tumor cells to enter the bloodstream and circulate through the body. In the neovascularization of tumors. Tumor cells leave the first site and land on the second metastatic site When bedded, the pulse is reached before new tumors can grow and spread. Tube formation must occur. Therefore, by preventing angiogenesis, Tumor metastasis, possibly including neoplastic growth in the There will be. Knowledge of the role of angiogenesis in tumor maintenance and metastasis Prognostic indicators were provided. The amount of angiogenesis found in the primary tumor is Microvessel density in the areas of most severe angiogenesis in primary breast cancer And is measured by High levels of microvessel density have been shown to correlate with tumor recurrence Was called. Controlling angiogenesis through therapeutic measures to stop tumor recurrence Will be able to. Angiogenesis is also involved in normal physiological processes such as reproduction and wound healing. pulse Tube formation is important in ovulation and in implantation of the blastula after fertilization. It is about. Inhibition of angiogenesis can induce amenorrhea, prevent ovulation or prevent implantation of blastula Could be used for In wound healing, over-repair or fibrosis Proliferation is a deleterious side effect of surgical procedures, caused by angiogenesis or Can be exacerbated. Adhesions are a frequent surgical problem, such as small bowel obstruction Cause problems. Several compounds have been used to prevent angiogenesis. Taylor et al. Prolamin was used to inhibit formation. Taylor et al., Nature 297: 307 (1982). reference. Prolamin is limited in practical use as a therapeutic because of its toxicity Have been. Folkman and colleagues use heparin and steroids to regulate angiogenesis. Disclose use. Folkman et al., Science 221: 719 (1983) and U.S. Pat. See Nos. 1,116 and 4,994,443. Tetrahi lacking carbohydrate and mineralocorticoid activity Steroids such as drocortisol have been found to inhibit angiogenesis. Endogenous animals such as 4KDa glycoprotein and cartilage inducing factor from bovine vitreous humor Other factors have been used to inhibit angiogenesis. Cellular factors such as interferon Offspring inhibit angiogenesis. For example, interferon α or human interferon Ron beta is a tumor-inducing vasculature in the mouse dermis stimulated by human neoplastic cells It has been shown to inhibit formation. Interferon beta is present in allogeneic splenocytes It is thus a potent inhibitor of induced angiogenesis. Sidky et al., Cancer Research 4 7: 5155-5161 (1987). Human recombinant α-interferon (alpha / A) Effectively used in the treatment of pulmonary hemangiomatosis, a disease induced by angiogenesis Has been reported. White et al. Engl. J. Med. 320: 1197-1200, 1971 reference. According to the present invention, unwanted vasculature in animals, including both humans and non-humans Compositions and methods are provided that are effective in inhibiting formation. These compositions Is easily administered by various routes, including parenteral administration, and is administered in a safe dosage. And can result in angiogenesis inhibition at internal sites. The present invention Composition containing Interleukin-12 in a dose sufficient to inhibit angiogenesis Undesired or uncontrolled angiogenesis by administering substance A method for treating a mammalian disease. The invention is particularly useful for treating certain ocular neovascular diseases such as macular degeneration. Compositions contemplated as part of the present invention are preferably administered parenterally to a patient, and This can halt the progress of the disease. Treating using the present invention Other diseases that can be affected are diabetic retinopathy, neovascular glaucoma, and post-lens fibroplasia It is. Interleukin 12 is described, for example, in European Patent Application No. 433827, No.WO9005147 and WO9205256, Kobayashi M. J. et al. Exp. Med. 170: 827-845 1989 and Stern A. S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6808-6812, 1990 Can be prepared by methods known in the art. Inter Leukin 12 can be obtained by known conventional chemical synthesis methods, recombinant methods or purification from natural resources. It can be manufactured by The term "interleukin 12" refers to purified Includes polypeptides similar to protein and / or recombinant proteins However, the modifications can be natural or intentionally manipulated. No. The present invention recognizes that inhibition of angiogenesis is a novel biological activity of IL-12. It provides evidence. This inhibition of neovascularization also produces optimal antitumor effects. Concentration of IL-12 (Brunda M. J. J. et al. Exp. Med. 178: 1223-1230, 1993) Happened in. IL-12 is species-specific, which makes IL-12 Used in the chicken chorioallantoic membrane assay In the absence of angiogenesis. Therefore, mouse corneal neovascularization The adult model is the assay of choice for assessing the anti-angiogenic properties of IL-12. Using this model in mice of different species with different immunological backgrounds Individual cell types of the immune system (natural killers or T cells) It was not recognized as a mediator of the angiogenic effect. The mouse corneal neovascularization assay used in this study was an angiogenesis assay. Basal fibroblast growth factor-induced model. Therefore, IL-12 is It will be argued that it specifically inhibits fibroblast growth factor-induced angiogenesis. However IL-12, on the other hand, converts basal fibroblast growth factor pellets into vascular endothelial growth factor. A similar inhibitory effect is obtained when the pellet is replaced with a pellet containing (160 ng / pellet). Indicated. Treatment with IL-12 resulted in a sustained increase in IFN-γ in the bloodstream of mice. The ascent was triggered (Gately M. K. Et al., Int. Immunol. 6: 157-167, 1994). IFN -Γ antibody administration prevents IL-12-induced inhibition of neovascularization Was. Furthermore, treatment by either bolus injection or continuous infusion of IFN-γ Inhibition of neovascularization was obtained. These findings indicate that IFN-γ is IL-12 It is a necessary and sufficient mediator of the anti-angiogenic activity of E. coli. IL- In support of the important role of IFN-γ in the antitumor activity of Twelve In fact, the treatment of normal mice with IFN-γ-antibodies has a significant (Nastala C. L. J. et al. Immunol. 153: 1697-1706, 199). IFN-γ has been used in murine tumor models, (Brunda M. J. Et al., Int. J. Cancer 40: 807-810, 1987), I as an anticancer agent Clinical use of FN-γ has not been very successful. The pharmacokinetics of IFN-γ has shown disappointing results in clinical trials of this drug It is the cause of not being. After intravenous bolus administration, IFN-γ has a relatively short half-life ( Time) (Rutenfranz I. J. et al. Interferon Res. 8: 573-580, 1988), leather Intravenous injection does not provide detectable serum concentrations of this drug (Cross S. E. J . Interferon Res. 45: 606-609, 1993). IFN-γ compared to bolus injection Observation of enhanced angiogenesis inhibition by continuous intraperitoneal injection of The difference in pharmacokinetics between the administration methods was suggested. However, basal fibroblast growth Continuous administration of IFN-γ three additional days before transplantation of factor pellets It cannot be ruled out that it has a beneficial effect. Serum from either IFN-γ or IL-12 treated animals was in vitro. Has a significant effect on endothelial cell proliferation in It is not clear how N-γ exerts effects on blood vessels. Anti-vascular The literature on IFN-γ as a forming agent is controversial and mainly in vitro. (Sato N. et al.). J. et al. Invest. Dermatol. 95: 85S-89S, 1990 ; Saegusa Y. J. et al. Cell. Physiol. 142: 488-495, 1990; Friesel R. J. et al. C ell. Biol. 104: 689-696, 1987; Saiki I. Et al., Int. J. Cancer 51: 641-645, 1 992; Kobayashi S. Et al., Immunopharmacol. 27: 23-30, 1994). IFN-γ Involved in the regulation of many genes (Sen G. C. J. et al. Biol. Chem. 267: 5017-5020, 1992), the downstream action of IFN-γ is involved in the anti-angiogenic effect. That would be reasonable. In experiments using mice with Lewis lung cancer, IL-12 and an angiogenesis inhibitor Strong antitumor activity of both AGM-1470 as single agents was confirmed (Br unda M. J. J. Exp. Med. 178: 1223-1230, 1993; Ingber D. Et al., Nature 348: 555-557, 1990). Simultaneous IL-12 and AGM-1470 The observation that treatment has an additive effect on the Lewis lung cancer model suggests that Suggest that these drugs act on endothelial cells via different pathways. Anti-vascular By combining plasticizers, the potential of this method for the treatment of malignant tumors Let's be enhanced. The present invention is based on the finding that IL-12 has potent angiogenesis inhibition in vivo. , An effect that induces a continuous release of IFN-γ It is thought that they are interposed. In the context of the present invention, pharmaceutically acceptable formulations of IL-12 are known to those of skill in the art. This can be done using known methods. These formulations are administered by standard routes. Can be given. In general, formulations are parenteral (eg, intravenous, subcutaneous) Or intramuscular), but also topical, transdermal, oral, or rectal routes Be considered. In addition, the formulation is biodegradable allowing for sustained release of IL-12 It can also be incorporated into a polymer, which releases the drug, for example, at the site of a tumor. It is buried in the vicinity where it needs to go out. Biodegradable polymers and their use are, for example, Brem J. et al. Neurosurg. 74: 441-446 (1991). The dose of IL-12 is , The condition to be treated, the specific compound, and the weight and condition of the human or animal, IL- It depends on other clinical factors such as the 12 routes of administration. The present invention relates to humans and spine It is understood to have adaptation to both animals. Parenteral administration to humans Is approximately 0. 1 to 20 mg / kg 1 to 5 times a week, preferably about 0,1 mg / kg. 5- Between 10 mg / kg and 1 to 3 times a week, most preferably between about 1 and 10 mg / kg One to three doses are generally sufficient. The formulation is parenteral (including subcutaneous, intramuscular, intravenous, intradermal, intratracheal, and epidural). V) Including those suitable for administration. The formulation is conveniently administered in unit dose It can be provided in a dosage form and can be prepared by ordinary pharmaceutical techniques. That's it Such techniques include the step of combining the IL-12 with a pharmaceutical carrier or excipient. one In general, the formulation involves uniformly and intimately formulating the IL-12 with the liquid carrier. Prepared by Formulations suitable for parenteral administration include antioxidants, buffers, Contain solutes that make the blood of the intended patient and the formulation isotonic with fungicides Aqueous and non-aqueous sterile injectable solutions, including suspending agents and thickening agents And aqueous and non-aqueous sterile suspensions. The formulation, for example, Provide in single or multidose containers, such as sealed ampules or vials. It is necessary only to add a sterile liquid carrier for injection, for example water, immediately before use. It can also be stored under required freeze-drying conditions. Preferred unit dosage formulations are daily doses or units, daily, as indicated above. Or an appropriate fraction of the components to be administered. Diseases associated with corneal neovascularization that can be treated according to the present invention include: , But not limited to, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, corneal transfer Plant rejection, neovascular glaucoma, and post-lens fibrosis, epidemic keratoconjunctivitis, vitamins A deficiency, contact lens overwear, atopic keratitis, upper limb keratitis, pterygium Keratitis sicca, Sjogren's disease, acne rosacea, phylectenulosis syphilis), syphilis, mycobacterial infection, lipid degeneration, chemical burns, bacterial ulcers, true Fungal ulcer, herpes simplex infection, herpes zoster infection, protozoan infection, Kaposi's sarcoma, Len ulcer, terien margin degeneration, marginal keratolysis, trauma, rheumatoid arthritis, systemic Lupus, polyarteritis, Wegener's sarcoidosis, scleritis, Stevens John Sons disease, periphigoid radial keratotomy, and corneal graft rejection Raise It is. Diseases associated with retinal / choroidal neovascularization that can be treated according to the present invention Patients include, but are not limited to, diabetic retinopathy, macular degeneration, Sickle cell anemia, sarcoma, syphilis, elastoid pseudoxanthoma, Paget's disease, vein closure Occlusion, arterial occlusion, carotid occlusion, chronic uveitis / vitritis, Mycobacterial infection, Lyme disease, systemic lupus erythematosus, prematurity retinopathy, eels Disease, Behcet's disease, infection causing retinitis or choroiditis, putative eye histoplasma Disease, best disease, myopia, optical fovea, Stargardt disease, pulse planitis (pars pl anitis), chronic retinal detachment, hyperviscosity syndrome, toxoplasmosis, trauma, and lay After complications. Other disorders include, but are not limited to, rubeosis ( Diseases associated with neovascularization of the horn, and whether or not diabetes Abnormal growth of fibrovascular or fibrous tissue, including all forms of proliferative vitreoretinopathy Caused by the disease. Another disease that can be treated according to the present invention is rheumatoid arthritis. Seki The blood vessels in the lining of the nodal synovium are thought to cause angiogenesis. New vessels In addition to the formation of the omentum, endothelial cells are responsible for the factors and Releases reactive oxygen species. The factors involved in angiogenesis are chronic chronic rheumatoid arthritis. It is thought to actively contribute to and maintain the inflammatory condition. Another disease that can be treated according to the present invention is hemangiomas, Osler-Weber --- Randue disease or hereditary hemorrhagic telangiectasia, solid or blood-derived tumor And acquired immunodeficiency syndrome. Model of basal fibroblast growth factor-induced corneal neovascularization in mice Is used to assess the effect of IL-12 on angiogenesis in vivo. Used. Mice of different strains received 1 mg of IL-12 per day for 5 consecutive days Administered intraperitoneally. The extent of neovascularization is determined by the basal fibroblast growth factor-containing pellet. Vascular length of neovascularization in response to and corneal clock time (number of corneal clock hours). IL-12 and angiogenesis inhibitor A The anti-tumor activity of GM-1470 was evaluated in mice with Lewis lung cancer. I In vitro proliferation studies were performed on bovine capillary endothelial cells, mouse pancreatic endothelial cells, and mouse Performed on a hemangioendothelioma cell line. Immunocompetent C57BL / 6 mice, severe combined immunity Deficient (SCID) mice and natural killer cell-deficient beige mice Corneal neovascularization was almost completely inhibited as a result of IL-12 treatment. This Potent inhibition of vasculogenesis is prevented by administration of IFN-γ neutralizing antibodies Was. In addition, a bolus injection in the abdominal cavity or an osmotic pump embedded in the abdominal cavity IFN-γ administered by continuous infusion was observed during treatment with IL-12. Anti-angiogenic effect was reproduced. Treatment with IL-12 and AGM-1470 Has additive antitumor effects in mice with Lewis lung cancer An anti-angiogenic mechanism was suggested. The present invention is further described by the following examples, which do not It should not be construed as giving any restrictions. Conversely, the means For various other embodiments, modifications, and equivalents, as read and suggested to those skilled in the art. Without departing from the spirit of the invention and / or the appended claims. And should be clearly understood.Example 1. material Recombinant murine IL-12 (IL-12), recombinant murine interfero Gamma (IFN-γ) and rat IgG1 XMG1.2 IFN-γ The antibody is from Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ. AGM-1470 (TNP-470) and basal fibroblast growth factor are available from Takeda Pharmaceutical Company, Osaka, Japan. Obtained from. Other materials were purchased from Sigma, St Louis, Mo. The monomer mixture of IL-12 was prepared by converting IL-21 to dithiothreitol (10 mM). And reduction with iodoacetamide (50 mM). afterwards, The mixture was dialyzed for 3 hours to remove the reducing agent (molecular weight cutoff 6-8,000 D , Spectra / Por dialysis membrane, Houston, Tx). Whether there are monomers in the mixture And the presence of dimers was confirmed by SDS-PAGE. 2. Cells and culture conditions Primary culture of bovine capillary endothelial cells, mouse islet endothelial cells and mouse vascular endothelium A neoplastic cell line was used for this study. 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml Treptomycin, 2 mM L-glutamine ("whole medium") and 10% bovine serum ( Dulbecco's Modified Eagle with GIBCO BRL, Grand Island, NY. 10% CO in the ground (DMEM)_TwoMonolayer culture was performed under an atmosphere. Bovine capillary Vascular endothelial cells were cultured in the presence of 4 ng / ml basal fibroblast growth factor (bFGF). While maintaining mouse nutrition, the mouse pancreatic islet endothelial cells were transferred to a 6 ng / ml basal fibroblast growth factor. And 10% NUSERUMIV culture supplement (Becton Dickinson Labware, Bedford) , MA). Experiments involving bovine and mouse endothelial cells were 10 and Performed during 15 passages. 3. mouse Male C57BL / 6, SCID (C57BL / 6 / SCID / szj) And beige (C57BL / 6 / bgj) mice were purchased from Jackson Laboratories, Ba. r Purchased from Harbor, ME. Nude mice (NCR Nu / sed, Swiss whit e background) was obtained from Massachusetts General Hospital, Boston, MA . All animal studies were performed on 6-8 week old male mice. 4. In vitro assay To assess the effect on endothelial cell proliferation, use bovine capillary endothelial cells, mice Islet endothelial cells and hemangioendothelioma cells were plated in a 24-well plate at 10,000 Cultured at a density of ~ 12,500 cells / well. After 24 hours, cells were harvested at 1 ng / ml. Culture and test in complete medium supplemented with basal fibroblast growth factor and 5% bovine serum Compound was added. After 72 hours, cells were harvested by trypsinization and cooled. It was counted with a counter. 5. In vivo assays Study the effects of IL-12 and IFN-γ on angiogenesis in vivo A modified version of the previously described mouse corneal angiogenesis assay was used for this (Polakowski I .J. Et al., Am. J. Pathol. 143: 507-517, 1993; Muthukkaruppan V. et al., Science 205: 1416-1418, 1979). Briefly, the cornea of both eyes has a mask that extends within 1 mm of the border. Create a micropocket, basal fibroblast growth factor (~ 80ng), sucralfe A pellet containing a salt and hydron was implanted in both eyes. Maximum vessel length and new blood vessels Vascular responses, measured as clock hours of formation, were evaluated daily. Shown in this study Data were obtained 5 days after implantation of basal fibroblast growth factor pellets. Was found to be the day of the maximal angiogenic response. In this experiment, a continuous infusion of either saline or IFN-γ was used. Osmotic Pumps Designed in Japan (Alzet 2002, Alza Corporation, Palo Alto, CA) was implanted intraperitoneally. Mice receive basal fibroblast growth factor pellets. Three days before transplantation, he was given a period of recovery from laparotomy. Remains after the experiment Inspect the volume of the pump to make sure it is working properly and delivering confirmed. The sera of IL-12 treated mice were injected 2 days after injection on day 5 of daily IL-12 administration. Four hours later, they were obtained by cardiac puncture. 6. Tumor experiment 10 in male C57BL / 6 mice⁶Individual Lewis lung cancer cells were inoculated. Tumor body Product is 75mm^ThreeReached, saline, IL-12, AGM-1470 or IL- Treatment with any of 12 plus AGM-1470 was started. IL-12 is It was administered intraperitoneally at a dose of 1 mg / day for 5 consecutive days. After two days of rest This cycle was repeated. AGM-1470 contains 30 mg / kg every other day. The dose was administered subcutaneously. Perform continuous measurement with a vertical diameter caliper and use the formula: longest Diameter x shortest diameter^TwoTumor volume (mm) using 0.52^Three) Was calculated. 3 weeks after inoculation Later, tumors and lungs were excised and weighed. Lung surface metastasis was measured under a dissecting microscope. I counted. 7. Statistical analysis Student's 2-tailed t-test applied for statistical significance of differences between groups Was calculated. The results were expressed as mean ± standard error of the mean. 8. Effect of IL-12 on mouse corneal neovascularization Male C57BL / 6 mice were treated with IL-12 (starting from the day of pellet implantation, 1 mg in 0.1 ml vehicle per day for 5 consecutive days) or vehicle Treatment with either vehicle (1% syngeneic mouse serum in phosphate buffered saline) . No apparent toxicity was observed during the treatment. Treated with IL-12 C57BL / 6 mice have a basal fibroblast cell line. Little to no corneal neovascularization in response to long factor pellets However, mice treated with vehicle, on the other hand, had pellets within 5 days after pellet implantation. (P <0.0001; FIGS. 1 and 2). The results are separate Obtained from three experiments. IL-12 was reduced to the monomer mixture and mice were exposed for one day. When treated with 1 mg of this mixture by intraperitoneal administration for 5 days, angiogenesis was observed. The in vivo inhibitory effect on it was lost (FIG. 2). Any cell in the immune system mediates the inhibitory effect of IL-12 on angiogenesis Mouse corneal neovascularization assay to determine if Used in strains of mice with strains. We first developed a T-cell deficient SCID A mouse was used. IL-12 inhibits angiogenesis in SCID mice (Vessel length for vehicle and IL-12 treated mice, respectively) : 0.98 ± 0.06 mm vs. 0.22 ± 0.02 mm (p = 0.0002) and hour Timekeeping: 4.6 ± 0.4 hours vs. 3 ± 0.3 hours (p = 0.011)). Degree of inhibition Was similar to that observed in normal C57BL / 6. Similar pattern of inhibition Was treated with IL-12 in a natural killer cell-deficient beige mouse. (Vessel length versus vehicle or IL-12 treated mice, respectively) : 0.7 ± 0.05 mm vs. no new vessels (p <0.0001), and clock time: 3 . 6 ± 0.3 hours vs no new vessels (p <0.0001)). Nude mice are Has spontaneous corneal neovascularization, which is basal fibroblast growth factor-induced It was found to mask the development of new blood vessels. However, there is some inhibition of angiogenesis. Findings suggestive of harm are evidence of capillary growth in pellets in IL-12 treated animals. No blood vessels, while vehicle-treated mice show blood vessels in the pellet It was that it had grown. 9. Effect of IL-12 and IFN-γ on endothelial cell proliferation in vitro IL-12 (in the range of 0.001 to 100 ng / ml) was obtained from bovine or mouse endothelial cells. Or it had no effect on any growth of hemangioendothelioma cells. IL- C57BL / 6, SCID or nude mice after 5 days of treatment with 12 Of all types of endothelial cells had an inhibitory effect on the proliferation of all types of endothelial cells. I didn't. IFN-γ (ranging from 0.0001 to 200 ng / ml) was expressed in mouse pancreatic islet endothelial cells. Has minimal effect on proliferation (16% inhibition compared to control cell number); It had no effect on the proliferation of capillary endothelial cells. 10. Role of IFN-γ as a mediator of IL-12 activity in vivo Treatment of C57BL / 6 mice with a single dose of IFN-γ-antibody (pellet transfer) 1 mg / mouse ip 2 hours prior to the first injection of IL-12 on the day of planting ) Completely abolished the anti-angiogenic properties of IL-12 (p <0.0001). La Control IgG (1 mg / mouse administered intraperitoneally on the day of pellet implantation) It did not affect the inhibition of neovascularization by IL-12 (FIG. 3). Treatment with IFN-γ resulted in a similar inhibition of angiogenesis as seen with IL-12. C57BL / 6 mice were challenged daily with IFN-γ to determine if they occurred. Treatment was by intracavitary injection (250,000 U / day for 5 consecutive days). these In mice, significant inhibition of vascular length (p = 0.0007) was observed (FIG. 4). But obvious toxicity was observed Did not. In order to maintain a constant concentration of IFN-γ, an osmotic minipump was used intraperitoneally. , Which gave IFN-γ a final dose of 130,000 U / day for the duration of the experiment. Released to volume. Basal fibroblast growth factor pellet from pump implant Implanted 72 hours later. Implantation of saline-loaded pump does not affect control animals. No effect on new vascular development was noted. In these animals, The extent of neovascularization is comparable to control animals that did not receive the pump. Was. However, in animals implanted with a pump containing IFN-γ, Neovascular growth was completely inhibited (FIG. 4; p. = 0.0002 and p = 0.0004 for clock time). Control mice and IF Both N-γ treated mice lost weight during the recovery period after laparotomy. pellet After transplantation, the control mice gained weight while the IFN-treated mice gained weight. He showed a defined weight and was drowsy. 11. Effect of treatment with IL-12 and AGM-1470 on Lewis lung cancer Treatment with either IL-12 or AGM-1470 was treated with saline. In C57BL / 6 mice inoculated with Lewis lung carcinoma as compared to control animals Was effective in inhibiting primary tumor growth and spontaneous lung metastasis. Have Lewis lung cancer When mice were co-treated with IL-12 and AGM-1470, IL- Seen in animals treated with 12 or AGM-1470 single agent In addition, the primary tumor volume (FIG. 5) was small and spontaneous lung metastasis (FIG. 6) was small. Either No apparent toxicity was observed during treatment.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹＡＤＹＡＤＺＡＤＺＡＤＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者トゥルーイット，ゲーリー・アーサーアメリカ合衆国、ニュージャージー 07003、ブルームフィールド、ガーナー・アベニュー 109 (72)発明者フースト，エミーレ・ユーヘネオランダ国、エヌエル−3769 ベーペースーステルベルヒ、ヨンヒブルートラーン 41──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI A61K 38/00 ADU A61K 37/02 ADY ADY ADZ ADZ ADA (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES , FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD) , TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, BB, BG, BR, CA , CN, CZ, EE, FI, GE, HU, IS, JP, KP, KR, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, O, NZ, PL, RO, SG, SI, SK, TR, TT, UA, UZ, VN (72) Inventor Trueit, Gary Arthur United States, New Jersey 07003, Bloomfield, Garner Avenue 109 (72) Invention Fust, Emile Euchene, Nuel 3769, The Netherlands Beetho Ssterberg, Yonhi Brutlan 41

Claims

[Claims] 1. Pharmaceutical for the treatment of unwanted or uncontrolled angiogenesis-mediated diseases Use of interleukin 12 for the production of 2. Undesired or uncontrolled angiogenesis-mediated diseases include neovascularization The use according to claim 1, which is a formation. 3. Undesired or uncontrolled angiogenesis-mediated diseases include retinal / vascular 3. Use according to claim 2, which is choroidal neovascularization. 4. 4. The retinal / choroidal neovascularization is associated with diabetic retinopathy. Use. 5. 4. Use according to claim 3, wherein the retinal / choroidal neovascularization is associated with macular degeneration. for. 6. Undesired or uncontrolled angiogenesis-mediated diseases include corneal neoplasia The use according to claim 1, which is angiogenesis. 7. Use of interleukin 12 for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetic retinopathy. 8. Use of interleukin 12 for the manufacture of a medicament for the treatment of macular degeneration. 9. Undesired or uncontrolled angiogenesis-mediated disease is a solid tumor Or a disease derived from a blood-derived tumor and a metastatic state thereof. Use of the description. 10. Unwanted or uncontrolled angiogenesis-mediated disease The use according to claim 1, which is for vitreoretinopathy. 11. The method according to claim 1, which is used in combination with 11.1 or more other angiogenesis inhibitors. Use of Interleukin 12. 12. An in-treatment in the treatment of a disease as defined in any one of claims 1 to 11. Use of Tarleukin 12. 13. An interleuk for the treatment of a disease according to any one of claims 1 to 11. Kin 12. 14． 12. One or more updates for the treatment of a disease according to any one of claims 1 to 11. Interleukin 12 in combination with an angiogenesis inhibitor. 15. The invention as described herein.