JPH11326323A

JPH11326323A - 赤芽球の分類計数方法

Info

Publication number: JPH11326323A
Application number: JP10019399A
Authority: JP
Inventors: Hauwen Berend; ハウウェンベレンド; Shen Won Fu; シェンウォンフー−; Tomohisa Tsuji; 智悠辻; Takashi Sakata; 孝坂田; Yukio Hamaguchi; 行雄浜口
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1998-04-09
Filing date: 1999-04-07
Publication date: 1999-11-26
Anticipated expiration: 2019-04-07
Also published as: JP2009080122A; JP4566299B2; JP4567082B2

Abstract

(57)【要約】【課題】経時変化を伴った血液学的試料においても、
精度よく、かつ安易、安価に赤芽球の測定を行うことが
できる方法を提供すること。【解決手段】 (i) 血液学的試料に、白血球に特異的に
結合する蛍光標識抗体を添加して白血球を蛍光染色し、
(ii)通常細胞膜を透過しない核酸蛍光色素の細胞膜透過
性を赤芽球のみ亢進させ、(iii) 赤芽球の核を染色し、
(iv) 次いで、得られた試料をフローサイトメータに供
して個々の細胞の少なくとも２つの蛍光信号を測定し、
(v) これら蛍光強度差から赤芽球を分類計数することか
らなる赤芽球の分類計数方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、赤芽球の分類計数
方法に関し、より詳細には、フローサイトメトリを用い
た赤芽球の分類計数方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】臨床検
査の分野において、赤芽球を分類計数することは、疾患
の診断及び疾患の経過の観察を行う上で極めて有用な情
報を得ることができるため、有利である。つまり、赤芽
球は有核赤血球ともよばれ、通常骨髄中に存在し、新生
児を除いて、末梢血液中には存在しないため、末梢血液
中に赤芽球が出現すれば、その患者は急性骨髄性白血
病、溶血性貧血、鉄欠乏性貧血、悪性貧血、その他の非
血液学的／腫瘍学的障害等の疾患である可能性を示して
いる。よって、赤芽球の分類計数を行うことは、これら
の疾患の診断及びこれらの疾患の経過の観察に非常に有
用である。

【０００３】従来、赤芽球の分類計数を行うには、血液
の塗抹標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡で
観察しながら分類計数するのが一般的であった。しか
し、このような方法では、観察のための煩雑な前処理が
必要となるとともに、精度の良い結果を得るためには観
察技師のかなりの熟練が必要となる。

【０００４】一方、近年、フローサイトメータの原理を
応用した種々の全自動白血球分類計数装置が提供されて
おり、このような装置を利用した血液成分の分析方法が
提案されている。

【０００５】例えば、特開平４−２６８４５３号公報に
は、酸性低張処理を行うとともに、赤芽球の核を染色す
る蛍光色素で染色し、フローサイトメータで散乱光と蛍
光とを検出し、赤芽球を分類計数する方法が記載されて
いる。

【０００６】また、特開平５−３４２５１号公報には、
酸性低張処理後、蛍光色素であるアストラゾンイエロー
３Ｇとニュートラルレッドとを含む４種類の色素で染色
し、フローサイトメータで赤蛍光と緑蛍光とを測定し
て、赤芽球を測定する方法が記載されている。

【０００７】さらに、特表平８−５０７１４７号公報に
は、特定量の非第４アンモニウム塩、脂肪族アルデヒ
ド、非リン酸塩緩衝液と、特定のｐＨ、特定の浸透圧を
有する試薬と、エチジウムホモダイマーのような核染料
とを用いて、フローサイトメータで前方散乱光又は蛍光
−側方散乱光を測定し、有核赤血球を測定する方法が記
載されている。

【０００８】また、米国特許第５５５９０３７号には、
赤血球と赤芽球との細胞膜を溶解し、白血球は染色しな
いが赤芽球を染色できる生体核染料で染色し、フローサ
イトメータで２つの角度の散乱光と蛍光とを測定して赤
芽球を計数する方法が記載されている。しかし、これら
の方法では、採血後の血液学的試料の経時変化により、
赤芽球のみならず、白血球の細胞膜も損傷されやすくな
るため、赤芽球の染色の際に白血球の一部が色素により
染色されてしまい、例えば、散乱光と蛍光とによる検出
では赤芽球及び白血球の出現位置が重なって、赤芽球を
正確に測定することができないという問題がある。特
に、リンパ球系細胞が傷害された場合には、傷害された
リンパ球と赤芽球とを明瞭に弁別することはさらに困難
であり、赤芽球の出現を正確に把握することができない
という問題がある。

【０００９】しかも、近年、医療経費の削減や医療機関
の効率化のために、各医療機関で患者から採血した血液
試料をある専門機関に集め、そこで集中的に検査するこ
とが行われるようになってきており、そのような場合に
は、採血から測定まで１日、あるいはそれ以上を要する
ものも稀ではない。

【００１０】さらに、一部のリンパ芽球出現検体又は化
学療法などによって、白血球系細胞の細胞膜が溶血剤に
よる障害を受けやすくなった検体では、経時変化してい
ない場合でも、正確に赤芽球を分類計数することは困難
である。

【００１１】また、特公平８−１４３４号公報には、チ
アゾールオレンジを試料に添加した後、２種の蛍光標識
抗体である抗ＣＤ４５及び抗ＣＤ７１を添加し、フロー
サイトメータで少なくとも３種の蛍光チャネル及び少な
くとも２種の光散乱チャネルで信号を検出して、有核赤
血球等を同定する方法が記載されている。この方法によ
れば、特定の抗体と色素とを組み合わせることによっ
て、有核赤血球を測定することができる。しかし、この
方法では、２種の抗体と１種の蛍光色素を使用するた
め、測定試薬が非常に高価になるという問題があるた
め、安価に赤芽球を分析することが求められている。

【００１２】さらに、特開平２−７３１５７号公報に
は、２種の蛍光核酸染料と蛍光標識モノクロナール抗体
とを用い、フローサイトメータで少なくとも３種の蛍光
チャネル及び少なくとも２種の光散乱チャネルで信号を
検出して有核赤血球を含む種々の細胞を分析する方法が
記載されている。しかし、この方法では、赤芽球を白血
球と区別するために、蛍光標識モノクロナール抗体で染
色し、側方散乱光を測定しているが、血小板、デブリス
と赤芽球とを区別する方法が記載されていないため、正
確に赤芽球を計数することはできない。

【００１３】また、日本特許第２６２０８１０号には、
赤血球を溶解し、蛍光標識モノクロナール抗体を加え、
固定剤を添加し、さらにＤＮＡに優先的に結合する核酸
染料を添加し、フローサイトメータで蛍光と散乱光とを
検出する方法が記載されている。しかし、この方法によ
れば、まずサンプル中の赤血球を溶解する処理を行うた
め、その直後には遠心洗浄操作を行わなければならず、
絶対計数は困難となる。また、この操作は煩雑であるた
め、測定技師の熟練度により測定結果に顕著な差が生じ
るという問題もある。

【００１４】以上のように、採血後長時間を経過した血
液学的試料においても、精度よく、かつ安易、安価に赤
芽球の測定を行い、さらに赤芽球を成熟度に応じて分類
計数することができる方法が要求されている。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、(i) 血
液学的試料に、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体
を添加して白血球を蛍光染色し、(ii)前記蛍光標識抗体
における蛍光と区別可能な蛍光スペクトルを有し、かつ
通常細胞膜を透過しない核酸蛍光色素の細胞膜透過性を
赤芽球のみ亢進させ、(iii) 赤芽球の核を核酸蛍光色素
で蛍光染色し、(iv)次いで、得られた試料をフローサイ
トメータに供して個々の細胞の少なくとも２つの蛍光信
号を測定し、(v) これら蛍光強度差から赤芽球を分類計
数することからなる赤芽球の分類計数方法が提供され
る。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明において、工程(i) で用い
る血液学的試料とは、末梢血液、骨髄液、リンパ組織、
尿、アフェレーシス等で採取した試料など、白血球及び
赤芽球を含む体液試料を意味する。

【００１７】また、白血球に特異的に結合する蛍光標識
抗体における抗体とは、抗CD45抗体などが挙げられ、一
般に市販されているものを使用することができる。

【００１８】上記抗体を蛍光標識抗体とするための蛍光
標識化合物としては、フィコエリスリン（phycoerythri
n)、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein
isothiocyanate：ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（al
lophycocyanin)、テキサスレッド（Texas Red)、ＣＹ
５、ペリジニンクロロフィルコンプレックス（peridini
n chlorophyll complex)及びそれらのフィコエリスリン
結合体などによる標識化合物が挙げられる。これら蛍光
標識化合物は、後述する核酸蛍光色素とは異なる蛍光ス
ペクトルを有していることが好ましい。なかでも、フィ
コエリスリン、フルオレセインイソチオシアネートが好
ましい。

【００１９】血液学的試料と蛍光標識抗体との混合比
は、用いる血液学的試料の状態、蛍光標識抗体の種類等
により適宜調整することができるが、例えば、１０：１
〜２：１程度の容量比があげられる。この際の反応温
度、反応時間は、適宜調整することができるが、例え
ば、室温で１５〜３０分間、アイスバスで３０〜４５分
間程度が好ましい。

【００２０】本発明の工程(ii)では、通常細胞膜を透過
しない核酸蛍光色素の細胞膜透過性を、赤芽球のみ亢進
させる。

【００２１】核酸蛍光色素としては、例えば、プロピジ
ウムアイオダイド、Ｎ−メチル−４−（１−ピレン）ビ
ニル−プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイ
ド、TOTO-1、TOTO-3、YOYO-1、YOYO-3、BOBO-1、BOBO-
3、エチジウムホモダイマー−１（EthD-1）、エチジウ
ムホモダイマー−２（EthD-2）、POPO-1、POPO-3、BO-P
RO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1等が挙げられる。なかでも、
プロピジウムアイオダイドが好ましい。これら核酸蛍光
色素は、上述したように、工程(ii)における白血球に特
異的に結合する蛍光標識抗体の蛍光標識化合物とは異な
る蛍光スペクトルを有していることが好ましい。核酸蛍
光色素の終濃度は、０．００３〜２００ｍｇ／Ｌ程度、
好ましくは０．０３〜７０ｍｇ／Ｌ程度、より好ましく
は０．３〜３５ｍｇ／Ｌである。ここで、終濃度とは、
フローサイトメータに供される血液学的試料、蛍光標識
抗体及び核酸蛍光色素の混合物中の濃度、あるいは、後
述するような他の試薬を用いる場合においても、フロー
サイトメータに供される混合物中の濃度を意味する。

【００２２】上記核酸蛍光色素の細胞膜透過性を、赤芽
球のみ亢進させる方法としては、例えば、得られた血
液学的試料（少なくとも赤芽球及び白血球を含有する）
に、ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤からなる低浸透圧
の第１液を添加、混合し、における血液学的試料及
び第１液を中和し、溶液ｐＨを染色に適したｐＨにする
ための緩衝剤と白血球の形態を保持する浸透圧に調整す
るための浸透圧調整剤とからなる第２液を添加、混合す
る方法が挙げられる。

【００２３】工程における第１液は、赤血球を有効に
溶血させるために、ｐＨが酸性域、例えば、２．０〜
５．０程度、より好ましくは２．５〜４．０程度、さら
に好ましくは、３．０〜３．５程度に保持されたもので
ある。ｐＨが低すぎる場合には、赤血球のみならず、白
血球、赤芽球及び白血球に特異的に結合する蛍光標識抗
体にも過度の傷害を与え、一方、ｐＨが高すぎる場合に
は、赤血球を断片化する作用が明らかに妨げられるた
め、好ましくない。

【００２４】上記ｐＨを保持するための緩衝剤として
は、酸解離定数ｐＫａが３．０±２．０程度の緩衝剤が
挙げられる。具体的には、例えば、リンゴ酸、コハク
酸、クエン酸、リン酸、グッドの緩衝剤等が挙げられ
る。緩衝剤の濃度は、第１液をｐＨ２．０〜５．０程度
に維持するのに必要な濃度であれば特に限定されるもの
ではなく、例えば、５〜５０ｍＭ／Ｌが挙げられる。

【００２５】また、この緩衝液の浸透圧は、低浸透圧で
あることが必要であり、例えば、１００ｍＯｓｍ／ｋｇ
・Ｈ₂Ｏ程度以下の浸透圧が挙げられ、より好ましくは
１０〜６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ₂Ｏ程度である。このよ
うな浸透圧に調整するために使用する浸透圧調整剤の種
類は特に限定されないが、例えばアルカリ金属塩類、糖
類等があげられる。具体的には、塩化ナトリウム、しょ
糖等を０．１ｇ／Ｌ〜２．０ｇ／Ｌ程度の濃度で使用す
ることができる。ただし、上述の緩衝剤のみで、上記浸
透圧が補償される場合は、浸透圧調整剤を使用しなくて
もよい。

【００２６】血液学的試料と第１液との反応時間は、赤
血球の溶血を完了するのに十分な時間が必要であり、例
えば５秒〜１２０秒間程度、好ましくは１０秒〜６０秒
間程度、さらに好ましくは２０〜４０秒間程度である。
血液学的試料と第１液との混合比は特に限定されない
が、フローサイトメータでの測定を考慮すると、１：５
〜１：２００程度の容量比が好ましい。

【００２７】工程における第２液は、血液学的試料と
第１液との混合液を中和し、溶液ｐＨを染色に適したｐ
Ｈにするための緩衝剤と白血球の形態を保持する浸透圧
に調整するための浸透圧調整剤とからなる。

【００２８】第１液の酸を中和し、染色に適した第２液
のｐＨは、例えば、５．０〜１１．０程度であり、好ま
しくは、７．５〜１０．０程度である。このｐＨに保持
するために用いられる緩衝剤の種類は特に限定されない
が、ｐＫａが９．０±２．０付近にある緩衝剤が好まし
い。具体的には、リン酸、ＨＥＰＥＳ、トリシン等が挙
げられる。緩衝剤の濃度は、第２液をｐＨ５．０〜１
１．０程度に維持するのに必要な濃度であれば特に限定
されないが、通常５〜１００ｍＭ／Ｌ程度が挙げられ
る。

【００２９】白血球の形態を保持するのに好適な浸透圧
の範囲は、例えば３００〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ
₂Ｏ程度、より好ましくは４００〜６００ｍＯｓｍ／ｋ
ｇ・Ｈ₂Ｏ程度である。このような浸透圧に調整するた
めに使用する浸透圧調整剤の種類は特に限定されない
が、アルカリ金属塩類、糖類等があげられる。具体的に
は、塩化ナトリウム、しょ糖等を１０．０ｇ／Ｌ〜２
０．０ｇ／Ｌ程度の濃度で使用することができる。

【００３０】第１液と第２液との混合比は、先に使用し
た第１液のｐＨ、量、第１液の浸透圧調整剤の濃度、第
２液のｐＨ、第２液の浸透圧調整剤の濃度等により適宜
調整することができる。たとえば、第１液のｐＨが３．
０、浸透圧が１６ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ₂Ｏ程度、第２液
のｐＨが７．５、浸透圧が４００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ₂
Ｏ程度の場合、第１液と第２液との混合比は、１：１〜
１：５程度が好ましい。

【００３１】なお、本発明の工程(ii)において、血液学
的試料の白血球の形態を保持するためには、第１液及び
第２液を混合した後の浸透圧が１００〜５００ｍＯｓｍ
／ｋｇ・Ｈ₂Ｏの範囲内にあることが好ましく、より好
ましくは２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ₂Ｏの範囲
である。第１液及び第２液を混合した後の浸透圧がこの
範囲を外れる場合には、第２液に、さらに浸透圧補償剤
を含むことが好ましい。浸透圧補償剤の種類は、特に限
定されないが、アルカリ金属又は糖類等、通常、生物学
的細胞を生理的浸透圧に保つための物質が好ましい。

【００３２】本発明の工程(iii) では、赤芽球の核を染
色する。赤芽球の核を染色するとは、上記工程で処理さ
れた血液学的試料を、核酸蛍光色素で染色する工程であ
る。具体的には、予め第１液又は第２液に、核酸蛍光色
素を添加しておき、核酸蛍光色素を含有する第１液又は
第２液を、血液学的試料と混合する方法が挙げられる。
また、核酸蛍光色素を含む溶液を調製しておき、この溶
液を添加してもよい。なかでも、核酸蛍光色素は第１液
に予め添加しておくことが好ましい。この際の赤芽球の
核の染色に要する時間は、血液学的試料とすべての試薬
を混合した後、１〜１２０分間程度であり、好ましくは
３〜３０分間程度、より好ましくは５〜１０分間程度で
ある。

【００３３】本発明の工程(iv)において使用するフロー
サイトメータは、特に限定されるものではなく、一般に
市販されているものを用いることができる。このような
フローサイトメータにより、個々の細胞の少なくとも２
つの蛍光信号を測定する。この際の蛍光信号は、使用す
る蛍光標識抗体の標識化合物、核酸蛍光色素の種類によ
り異なるが、例えば、赤蛍光と緑蛍光との組み合わせ、
赤蛍光と橙蛍光の組み合わせ、橙蛍光と緑蛍光との組み
合わせ等が挙げられる。なかでも、赤蛍光と緑蛍光との
組み合わせが好ましい。

【００３４】本発明の工程(v) においては、赤芽球は上
述した少なくとも２つの蛍光信号の強度差に基づいて、
分類計数することができる。例えば、２つの蛍光信号を
測定した場合には、２軸をそれぞれ白血球に特異的に結
合する蛍光標識抗体に基づく蛍光及び核酸蛍光色素に基
づく蛍光とし、２次元分布（たとえば、スキャッタグラ
ム）を得ることが好ましい。この２次元分布から白血球
及び赤芽球の分布領域を設定し、それぞれの領域の細胞
数を計数し、赤芽球の細胞数を白血球の細胞数で除算す
ることにより、白血球に対する赤芽球の比率を求めるこ
とができる。

【００３５】また、薬剤投与の影響等で白血球膜が過度
に傷害され、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体に
基づく蛍光（実施例では緑蛍光）及び核酸蛍光色素に基
づく蛍光（実施例では赤蛍光）を２軸とする２次元分布
上で、赤芽球の弁別が明瞭でないときは、工程(iv)にお
いて、さらに、（ａ）同時に散乱光信号を測定し、散乱
光信号（たとえば、側方散乱光、前方散乱光、好ましく
は側方散乱光）と蛍光標識抗体に基づく蛍光信号とをそ
れぞれ２軸とする２次元分布を得て、その分布から白血
球集団を特定し（図６）、（ｂ）核酸蛍光色素と蛍光標
識抗体に基づく蛍光とをそれぞれ２軸とする２次元分布
上で、対応する白血球集団の分布領域を特定し（図
７）、（ｃ）（ｂ）の２次元分布上で白血球集団と赤芽
球集団との境界（Ａ）を設定することにより、赤芽球を
より精度よく弁別することができる。

【００３６】さらに、工程(ii)において、核酸蛍光色素
を０．００３ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの濃度範囲にした
場合、核酸蛍光色素に基づく蛍光の強度差によって、少
なくとも２つの異なる成熟度の赤芽球に分類することが
可能である。核酸蛍光色素の濃度は、より好ましくは
０．０３ｍｇ／Ｌ〜３ｍｇ／Ｌの範囲である。

【００３７】この場合には、工程(v)において、核酸蛍
光色素に基づく蛍光の強度差から、成熟度の異なる赤芽
球を分類計数することができる。つまり、２次元分布か
ら赤芽球の分布領域を設定し、さらに核酸蛍光色素に基
づく蛍光の強度差によって赤芽球の領域内に各成熟段階
の赤芽球の領域を設定することにより、それぞれの領域
の細胞数を計数することができる。さらに、各成熟段階
の赤芽球の細胞数を全赤芽球数で除算することにより、
全赤芽球に対する各成熟度段階の赤芽球の比率をも求め
ることができる。

【００３８】赤芽球を成熟段階に応じて分類するとは、
たとえば、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、
正染性赤芽球等を少なくとも２つの赤芽球グループに分
類計数することをいう。

【００３９】

【実施例】以下に本発明の赤芽球の分類計数方法の実施
例を具体的に説明する。実施例１まず、以下の組成の試薬を調製した。蛍光標識抗体・ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体第１液（ｐＨ３．０、浸透圧：１６ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ₂Ｏ）・緩衝剤クエン酸一水和物２．１０ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム０．５６ｇ／Ｌ・核酸蛍光色素プロピジウムアイオダイド１００ｍｇ／Ｌ・精製水第２液（ｐＨ７．５、浸透圧：４２０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ₂Ｏ）・緩衝剤リン酸一ナトリウム二水和物０．９５ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム６．２４ｇ／Ｌ・浸透圧調整剤塩化ナトリウム１０．２ｇ／Ｌ・精製水

【００４０】まず、抗凝固剤処理した末梢血液に患者の
血液５０μＬを加え、血液学的試料を調製した。なお、
この際に用いた末梢血液及び患者の血液は採取後８時間
経過したものであった。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体１
０μＬを、得られた血液学的試料に加え、室温で約１５
分間インキュベーションした。

【００４１】その後、第１液を５００μＬ加え、室温で
約３０秒間インキュベーションし、さらに第２液を１０
００μＬ加え、室温で約５分間インキュベーションし、
得られた血液学的試料に含有されている個々の細胞につ
いて、光源として４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザを
装備したフローサイトメータで、５３０ｎｍ（緑）、６
５０ｎｍ（赤）の波長の蛍光を測定した。

【００４２】図１に緑蛍光強度と赤蛍光強度とを座標軸
とする個々の細胞の分布を描いたスキャッタグラムを示
す。図１では、白血球、赤蛍光染色白血球、赤芽球、ゴ
ーストの４集団が認められた。解析は、図２に示したよ
うに、白血球及び赤蛍光染色白血球をウィンドウ（Ｗ
１）によって囲み、白血球のみの数を計数し、全白血球
数を計数した。

【００４３】次に、すべての赤芽球をウィンドウ（Ｗ
２）によって囲み、赤芽球のみの数を計数し、全赤芽球
数を計数した。全赤芽球数を、上記で求めた全白血球で
除算することにより、白血球に対する赤芽球の比率を求
めた。

【００４４】また、実施例１とは別に、実施例１と同様
の血液学的試料を用いて、用手法（メイグリュンワルド
−ギムザ染色、１０００カウント）により赤芽球を分類
計数した。図３に、本実施例のフローサイトメータで測
定した赤芽球数と、用手法で測定した赤芽球数との相関
図を示す。

【００４５】図３から、相関係数Ｒは０．９９１とな
り、実施例１の方法が赤芽球の分類計数について非常に
精度が高いことが確認された。

【００４６】実施例２実施例１と同様の方法により、末梢血液（採血後８時間
後、２４時間後、４８時間後、血液は室温保存）及び２
人の患者の血液を用い、白血球及び赤芽球の測定を行っ
た。その結果を図４（ａ）〜（ｃ）及び５（ａ）〜
（ｃ）にそれぞれ示す。

【００４７】また、各検体について、実施例１と同様の
方法によって全白血球に対する全赤芽球の比率を求め
た。その結果を表１に示す。

【表１】

【００４８】図４（ａ）〜（ｃ）、図５（ａ）〜（ｃ）
及び表１から明らかなように、本実施例の方法によれ
ば、時間の経過にかかわらず、ほぼ同様の測定結果が得
られることが確認された。

【００４９】実施例３まず、以下の組成の試薬を調製した。蛍光標識抗体・ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体第１液（ｐＨ３．０、浸透圧：１６ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ₂Ｏ）・緩衝剤クエン酸一水和物２．１０ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム０．５６ｇ／Ｌ・核酸蛍光色素プロピジウムアイオダイド１ｍｇ／Ｌ・精製水第２液（ｐＨ７．５、浸透圧：４２０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ₂Ｏ）・緩衝剤リン酸一ナトリウム二水和物０．９５ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム６．２４ｇ／Ｌ・浸透圧調整剤塩化ナトリウム１０．２ｇ／Ｌ・精製水

【００５０】まず、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体１０μ
Ｌに、抗凝固剤処理した末梢血液に赤芽球が出現した患
者の血液５０μＬを加え、室温で約１５分間インキュベ
ーションした。その後、第１液を５００μＬ加え、室温
で約３０秒間インキュベーションし、さらに第２液を１
０００μＬ加え、室温で約５分間インキュベーション
し、得られた血液学的試料に含有されている個々の細胞
について、光源として４８８ｎｍのアルゴンイオンレー
ザを装備したフローサイトメータで、５３０ｎｍ
（緑）、６５０ｎｍ（赤）の波長の蛍光を測定した。

【００５１】図８に緑蛍光強度と赤蛍光強度とを座標軸
とする個々の細胞の分布を描いたスキャッタグラムを示
す。図８では、白血球、赤蛍光染色白血球、成熟赤芽
球、未成熟赤芽球１、未成熟赤芽球２、ゴーストの６集
団が認められた。解析は、図９に示したように、白血球
及び赤蛍光染色白血球をウィンドウ（Ｗ１）によって囲
み、白血球のみの数を計数し、全白血球数を計数した。
次に、すべての赤芽球をウィンドウ（Ｗ２）によって囲
み、赤芽球のみの数を計数し、全赤芽球数を計数した。

【００５２】さらに、ウィンドウ（Ｗ２）中の赤芽球を
ステージＩ、II、IIIとしてそれぞれウィンドウ（Ｗ
３）、ウィンドウ（Ｗ４）及びウィンドウ（Ｗ５）によ
って囲み、それぞれの数を計数した。得られた各ウィン
ドウの赤芽球数を、全赤芽球数で除算することにより、
全赤芽球に対する各ステージにおける赤芽球の比率を求
めた。

【００５３】また、実施例３とは別に、実施例３と同様
の血液学的試料を用いて用手法（メイグリュンワルド−
ギムザ染色）により、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染
性赤芽球、正染性赤芽球の赤芽球に分類計数した。

【００５４】表２に、実施例３のフローサイトメータで
測定した結果と、用手法で測定した結果を示す。なお、
表２においては、ステージＩ、II及びIIIは、それぞれ
図８における未成熟赤芽球２、未成熟赤芽球１及び成熟
赤芽球に対応する。

【表２】

【００５５】表２から、本方法と用手法との結果がほぼ
一致しており、実施例３の方法が赤芽球の分類計数につ
いて非常に精度が高いことが確認された。

【００５６】実施例４実施例３と同様の方法により、末梢血液（採血後８時間
後、血液は室温保存）及び２４人の血液疾患患者の血液
を用い、赤芽球の測定を行った。また、実施例４とは別
に、実施例４と同様の血液学的試料を用いて用手法（メ
イグリュンワルド−ギムザ染色）により、赤芽球の測定
を行った。

【００５７】図１０及び図１１に、本実施例のフローサ
イトメータで測定した赤芽球数と、用手法で測定したス
テージII及びステージIIIにおける赤芽球数との相関図
を示す。図１０及び図１１から、実施例４の方法が赤芽
球の各ステージにおける分類計数について非常に精度が
高いことが確認された。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の赤芽球の分類計数方法により測定され
たスキャッタグラムである。

【図２】図１の模式図である。

【図３】本発明の方法と用手法とで測定された赤芽球数
の相関関係を示す図である。

【図４】本発明の赤芽球の分類計数方法により、赤芽球
測定の経時変化を示すスキャッタグタムである。

【図５】本発明の赤芽球の分類計数方法により、赤芽球
測定の経時変化を示す別のサンプルによるスキャッタグ
ラムである。

【図６】本発明の赤芽球の分類計数方法に散乱光信号を
組み合わせた場合のスキャッタグラムである。

【図７】図６におけるＧｈｏ＋ＮＲＢＣをさらに赤芽球
とゴーストに弁別した場合のスキャッタグラムである。

【図８】本発明の赤芽球の分類計数方法により、緑蛍光
強度と赤蛍光強度とを座標軸とする個々の細胞の分布を
示すスキャッタグラムである。

【図９】図１の模式図である。

【図１０】本発明の方法と用手法とで測定されたステー
ジIIの赤芽球数の相関関係を示す図である。

【図１１】本発明の方法と用手法とで測定されたステー
ジIIIの赤芽球数の相関関係を示す図である。

【符号の説明】

ＷＢＣ全白血球ＮＲＢＣ赤芽球ｌｅｕ白血球ＧｈｏゴーストＬｙリンパ球Ｍｏ単球Ｇｒａｎ顆粒球

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者辻智悠神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号シスメックス株式会社内 (72)発明者坂田孝神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号シスメックス株式会社内 (72)発明者浜口行雄神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号シスメックス株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】(i) 血液学的試料に、白血球に特異的に結
合する蛍光標識抗体を添加して白血球を蛍光染色し、 (ii)前記蛍光標識抗体における蛍光と区別可能な蛍光ス
ペクトルを有し、かつ通常細胞膜を透過しない核酸蛍光
色素の細胞膜透過性を赤芽球のみ亢進させ、 (iii) 赤芽球の核を核酸蛍光色素で蛍光染色し、 (iv)次いで、得られた試料をフローサイトメータに供し
て個々の細胞の少なくとも２つの蛍光信号を測定し、 (v) これら蛍光強度差から赤芽球を分類計数することか
らなる赤芽球の分類計数方法。
【請求項２】工程(i) における白血球に特異的に結合す
る蛍光標識抗体が、白血球表面に発現している抗原を認
識し、その抗原に結合する蛍光標識抗体である請求項１
記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項３】工程(i) の蛍光標識抗体の蛍光標識化合物
が、フィコエリスリン、フルオレセインイソチオシアネ
ート、アロフィコシアニン、テキサスレッド、ＣＹ５、
ペリジニンクロロフィルコンプレックス及びそれらのフ
ィコエリスリン結合体からなる群から選択される少なく
とも１種の化合物である請求項１〜４のいずれかに記載
の赤芽球の分類計数方法。
【請求項４】工程(ii)において、通常細胞膜を透過し
ない核酸蛍光色素の細胞膜透過性を赤芽球のみ亢進させ
る工程が、工程(i)で得られた血液学的試料に、ｐＨを酸性域に
保つための緩衝剤からなる低浸透圧の第１液を添加、混
合し、前記血液学的試料を含有する第１液を中和し、溶液ｐ
Ｈを染色に適したｐＨにするための緩衝剤と白血球の形
態を保持する浸透圧に調整するための浸透圧調整剤とか
らなる第２液を添加、混合することからなる請求項１記
載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項５】工程(iii) の赤芽球の核を染色する工程
が、核酸蛍光色素と混合する工程である請求項１〜４の
いずれかに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項６】工程(ii)の核酸蛍光色素が、プロピジウム
アイオダイド、Ｎ−メチル−４−（１−ピレン）ビニル
−プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、
TOTO-1、TOTO-3、YOYO-1、YOYO-3、BOBO-1、BOBO-3、エ
チジウムホモダイマー−１（EthD-1）、エチジウムホモ
ダイマー−２（EthD-2）、POPO-1、POPO-3、BO-PRO-1、
YO-PRO-1、TO-PRO-1からなる群から選択される少なくと
も１種類の色素である請求項１〜５のいずれかに記載の
赤芽球の分類計数方法。
【請求項７】測定された個々の細胞の蛍光信号から、白
血球に特異的に結合する蛍光標識抗体に基づく蛍光及び
核酸蛍光色素に基づく蛍光をそれぞれ２軸として２次元
分布を得ることからなる請求項１〜６のいずれかに記載
の赤芽球の分類計数方法。
【請求項８】２次元分布から赤芽球の分布領域を設定
し、その領域の細胞数を計数する請求項１〜７のいずれ
かに記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項９】２次元分布から白血球及び赤芽球の分布領
域を設定し、それぞれの領域の細胞数を計数し、赤芽球
細胞数を白血球細胞数で除算することにより白血球に対
する赤芽球の比率を求める請求項１〜７のいずれかに記
載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１０】核酸蛍光色素を、０．００３ｍｇ／Ｌ〜
１０ｍｇ／Ｌの濃度範囲で使用して赤芽球を成熟度に応
じて染色し、赤芽球の成熟度に対応した少なくとも２つ
の領域に分類することからなる請求項５に記載の赤芽球
の分類計数方法。
【請求項１１】（１）測定された個々の細胞の蛍光信号
から、白血球に特異的に結合する蛍光標識抗体に基づく
蛍光及び核酸蛍光色素に基づく蛍光をそれぞれ２軸とし
て２次元分布を得、（２）２次元分布において、核酸蛍
光色素に基づく蛍光の強度差で、赤芽球を少なくとも２
つに分類する領域を設定し、各領域の細胞数を計数する
ことによって、成熟度の異なる赤芽球を分類することか
らなる請求項１０に記載の赤芽球の分類計数方法。
【請求項１２】２次元分布において、全赤芽球及び少な
くとも２つの成熟度の異なる赤芽球の各領域の細胞数を
計数し、２つの成熟度の異なる赤芽球の細胞数を全赤芽
球数でそれぞれ除算することにより全赤芽球に対する成
熟度の異なる赤芽球の各比率を求める請求項１１に記載
の赤芽球の分類計数方法。