JPH11322602A - 転写因子ＮＦκＢ活性化阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】新たな転写因子ＮＦκＢ活性化阻害剤、アポト
ーシス賦活剤、さらには炎症または自己免疫疾患治療剤
が要望されている。 【解決手段】本発明は熱帯植物エルヴァタミア・ミクロ
フィラから単離されたコノフィリンまたはその薬理学上
許容される塩を有効成分とするＮＦκＢ活性化阻害剤、
アポトーシス賦活剤、抗癌剤の効果増強剤、炎症または
自己免疫疾患治療剤に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はｒａｓ癌遺伝子機能
抑制作用のある物質（ＩＩＩ−１２１Ｃ）として知られ
コノフィリンの新規用途に関するもので、コノフィリン
を有効成分とする転写因子ヌクレアー・ファクター・カ
ッパーＢ（ＮＦκＢ）活性化の阻害剤、アポトーシス賦
活剤、制癌剤の効果増強剤及び炎症または自己免疫疾患
の治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＮＦκＢの刺激で転写される遺伝子とし
て、インターロイキン１，２，３，６，８，１２、腫瘍
壊死因子（ＴＮＦ−α）、リンホトキシン−α、インタ
ーフェロン-βなどのサイトカイン類、顆粒球コロニー
刺激因子、単球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒
球・単球マクロファージコロニー刺激因子、インターロ
イキン２などのサイトカイン受容体類、補体因子Ｂ、Ｃ
３、Ｃ４、α１酸糖タンパクなどのストレス蛋白類、Ｉ
ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンなどの白血
球接着分子類、主要組織適合複合体クラスＩ、 ＩＩ、
Ｔ細胞受容体α、同β、β２ミクログロブリンなどの免
疫調節分子等が知られている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
Ｔｏｄａｙ、１９巻、８０頁、１９９８年）。炎症や自
己免疫疾患などではＮＦκＢが活性化され上述の遺伝子
群が活発に転写、発現されている（Ａｎｎ． Ｒｅ
ｖ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２巻、１４１頁、１９９４
年）。最近、古くから用いられてきたグルココルチコイ
ドやサリチル酸などの抗炎症剤に転写因子ＮＦκＢを阻
害する作用があることがわかってきた（臨床免疫、２９
巻、１４８頁、１９９７年）。既存のアドリアマイシン
やシスプラチンなどの抗癌剤は培養細胞ではアポトーシ
スを誘導するが（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３巻，１
８４５頁，１９９３年およびＥｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅ
ｓ．、２１１巻、２３２１頁、１９９４年）、固形癌細
胞の中には抗癌剤によりアポトーシスを起こしにくいも
のが多い（臨床医、２１巻、４２頁、１９９５年）。一
方、コノフィリンはタイ産植物エルヴァタミア・ミクロ
フィラ（Ｅｒｖａｔａｍｉａ ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌ
ａ Ｋｅｒｒ）の葉から単離された化合物で、ｒａｓ癌
遺伝子機能抑制作用のある物質（ＩＩＩ−１２１Ｃ）と
して知られ、癌細胞の形態を正常化し、その増殖を阻害
する効果を有することから、抗癌剤への適用が報告され
ている（特開平７−２３３０７１号公報およびＡｎｔｉ
ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４巻、２４１３
頁、１９９４年）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】癌は羅患人数の多い病
気であり、多くは外科的療法には限界があり、化学療法
においてはいずれも著効を示す薬剤のないのが現状であ
る。多くの細胞はアポトーシスを誘導することができる
刺激に対して防御機構を持ち、これらの刺激に対して抵
抗性を示す。ＴＮＦなどの抗腫瘍サイトカイン、放射線
照射、ダウノマイシンなどの化学療法によるアポトーシ
スの刺激に対して、細胞はＮＦκＢを活性化して細胞死
から守っている。 中でも固形癌細胞はこのようなしく
みを使い、抗癌剤によりアポトーシスを起こしにくいも
のが多い。そこでＮＦκＢの活性を阻害すれば固形癌細
胞に対しても既存の抗癌剤がより有効になる。ＮＦκＢ
転写の阻害はＮＦκＢの活性化により下方制御されてい
るアポトーシスを増強すると考えられ、その有用な阻害
物質の開発が要望されている。また、これまで用いられ
てきた抗炎症剤、自己免疫疾患治療剤は、特に慢性疾患
に対して、安全性や抜本的な効果に問題がある。また、
特異性に問題が残り、現在までに知られている阻害物質
には見られない新しい作用機序を有する薬剤の開発が望
まれる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】癌細胞、特に固形癌細胞
においてはＮＦκＢの活性化により、抗癌剤などのアポ
トーシスの刺激に対して防御をしている。従って、ＮＦ
κＢの活性化を阻害することにより、抗癌剤の効果を高
め、癌細胞を細胞死（アポトーシス）に導くことができ
る。アポトーシスを誘導する抗癌剤に対し、ＮＦκＢの
活性化により抵抗性を獲得した耐性癌等に対しても、Ｎ
ＦκＢ活性化阻害剤を投与することにより、抗癌剤の効
果を高め、耐性癌細胞等を細胞死（アポトーシス）に導
くことができる。

【０００５】また 炎症や自己免疫疾患などではＮＦκ
Ｂが活性化されＮＦκＢの刺激で転写される上述の遺伝
子群が活発に転写、発現されている。そのなかでＮＦκ
Ｂの活性化を阻害することにより、これらの遺伝子の転
写を阻害すれば炎症や自己免疫疾患が抑えられる。そこ
で本発明者らは種々検討の結果、コノフィリンがＮＦκ
Ｂの活性化を阻害すること見出し、本発明を完成した。
コノフィリンはＮＦκＢの活性化を阻害するので、ＮＦ
κＢの活性化阻害剤、アポトーシス賦活剤 抗炎症剤、
自己免疫疾患治療剤等として有用である。

【０００６】すなわち、本発明は次の（１）〜（９）に
関するものである。 （１）化学式１

【化２】 で表されるコノフィリンまたはその薬理上許容される塩
を有効成分とする転写因子ＮＦκＢ活性化阻害剤。

【０００７】（２）１項記載の化学式１で表されたコノ
フィリンまたはその薬理学上許容される塩を有効成分と
するアポトーシス賦活剤。 （３）アポトーシス誘導剤と併用する２項記載のアポト
ーシス賦活剤。

【０００８】（４）アポトーシス誘導剤が制癌剤であ
る、３項記載のアポトーシス賦活剤。 （５）制癌剤がダウノマイシン、アドリアマイシン、エ
トポシド、ＴＨＰ−アドリアマイシン、シスプラチンで
ある４項記載のアポトーシス賦活剤。

【０００９】（６）１項記載の化学式１で表されるコノ
フィリンまたはその薬理学上許容される塩を有効成分と
する制癌剤の効果増強剤。 （７）１項記載の化学式１で表されるコノフィリンまた
はその薬理学上許容される塩を有効成分とする耐性癌に
対する制癌剤の効果増強剤。 （８）耐性癌が転写因子ＮＦκＢ活性化によるものであ
る請求項７の制癌剤の効果増強剤。 （９）１項記載の化学式１で表されるコノフィリンまた
はその薬理学上許容される塩を有効成分とする炎症また
は自己免疫疾患の治療剤、に関するものである。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明化合物の化学式１で表され
るコノフィリンは熱帯植物エルヴァタミア・ミクロフィ
ラから抽出された物質であり、特開平７−２３３０７１
号公報（物質ＩＩＩ−１２１Ｃ）に記載の方法で製造し
て得られる。また、本発明においてはコノフィリンは薬
理学上許容される塩として用いても良い。塩としては酸
又は塩基いずれでも薬理学上許容される塩を形成するも
のであれば特に限定はないが、通常は酸（無機酸又は有
機酸）との塩が挙げられ、具体的には塩酸塩、硫酸塩、
リン酸塩などが挙げられる。

【００１１】本発明において、コノフィリンまたはその
薬理学上許容される塩を転写因子ＮＦκＢ活性化阻害
剤、アポトーシス賦活剤、炎症または自己免疫疾患治療
剤として用いるには、固形剤、軟膏、液剤等の剤形にし
て経口剤または非経口剤として投与される。非経口剤と
しては特に限定されない。例えば、座剤、経皮吸収剤、
及び静脈注射剤等が挙げ得られる。コノフィリンまたは
その薬理学上許容される塩を含む製剤は一般的には、上
記有効成分の効果を発揮する量を適当な医薬用の担体そ
の他の補助剤と組み合わせて常法により製剤化すること
により得ることができる。ここでいう「効果を発揮する
量」（以下有効量と言う）とは目的とする薬理活性を発
揮する量のことである。好ましくは副作用が少なく目的
とする薬理活性を発揮する量が好ましい。個々の場合に
おける正確な投与量は、多くの因子、例えば投与方法、
投与される患者の個体差、化合物を投与するときの状態
などによっても変わる。

【００１２】通常、上記有効量の投与量は、成人１日当
たり１〜１０００ｍｇ、好ましくは２〜７００ｍｇ、程
度である。アポトーシス誘導剤と併用する場合は、アポ
トーシス誘導剤たとえば制癌剤を成人１日当たり１〜１
０００ｍｇ、好ましくは２〜６００ｍｇ程度、コノフィ
リンまたはその薬理学上許容される塩を成人１日当たり
１〜８００ｍｇ、好ましくは２〜５００ｍｇ程度投与す
るのが好ましい。

【００１３】本発明に係わる有効成分とともに一般的に
用いられる医薬用の担体その他の補助剤は個体状でも液
体状でもよく、普通投与経路を考慮して選ばれる。例え
ば個体の担体としては、乳糖、蔗糖、ゼラチン、寒天な
どが挙げられ、液体の担体としては、水、シロップ、ピ
ーナッツ油、オリーブ油などが挙げられる。そのほかに
も、当該分野の熟練者にとって公知の適当な担体を用い
てもよい。本発明に係わる有効成分は担体と組み合わせ
て、種々の許容しうる剤形、例えば錠剤、注射剤、カプ
セル剤、座剤、液剤、エマルジョン剤、パウダー剤など
の形にしてもよい。

【００１４】本発明の治療薬の製剤中におけるコノフィ
リンまたはその薬理学的に許容される塩の含量は、製剤
の形態等により広範囲に変えることが可能であるが、一
般的には０．０１〜１００％（重量）好ましくは０．１
〜７０％（重量）であり、製剤中の残りは通常医薬用の
担体その他の補助剤からなる。本発明において、アポト
ーシス誘導剤と併用するとき、アポトーシス誘導剤の効
果が高められ、抵抗性の癌細胞などもアポトーシスへ誘
導することが出来る。併用の仕方は特に限定されない
が、一般的にはコノフィリンまたはその薬理学上許容さ
れる塩を先に投与し、数分ないし十数時間後に、アポト
ーシス誘導剤を投与するのが好ましい。

【００１５】

【実施例】以下に本発明化合物コノフィリンの作用につ
いて実施例に基づいて説明する。なお本実施例中で使用
している略号の意味は下記の通り。 ＡＴＰ ：アデノシン５’−三燐酸 ＤＥＡＥ ：ジエチルアミノエチル ＤＴＴ ：ジチオトレイトール ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン４酢酸 ＩκＢ ：ＮＦκＢ阻害蛋白 ＮＰ−４０ ：ノニルフェノキシポリエトキシエタノール ＰＭＳＦ ：フェニルメタンスルホニルフロリド ＰＶＤＦ ：ポリビニリデンフロリド ＴＮＦ ：腫瘍懐死因子 ＴＮＥ緩衝液：トリス塩酸・ＮＰ−４０・ＥＤＴＡ緩衝液

【００１６】実施例１ コノフィリンによるＮＦκＢ活
性化阻害作用 コノフィリンのＮＦκＢ活性化に対する阻害効果の試験
として、ジャーカット細胞にＴＮＦ−αを添加し、ＮＦ
κＢを活性化させる実験系を用いた。ＮＦκＢの活性は
ルシフェラーゼ遺伝子の上流にＮＦκＢ結合配列をつな
げたレポーター遺伝子を利用した。図１に示すようにコ
ノフィリンは０．０１〜０．３μｇ／ｍｌの濃度でＴＮ
Ｆ−αによるＮＦκＢの活性化を強く阻害した。

【００１７】（方法）１×１０⁶細胞のジャーカット細
胞に、０．５μｇのｐ（κＢ）３−ＩＮＦ−ｌｕｃ（下
記参考文献１参照）をＤＥＡＥ−デキストラン法にて形
質導入した。コノフィリンは６時間前処理し、２０ｎｇ
／ｍｌのＴＮＦ−α（シグマ社製）で刺激し、６時間後
に細胞を捕集した。次に、培養液を除去し、５０μｌの
溶解緩衝液（２５ｍＭトリス−リン酸、ｐＨ７．８、２
ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭの１，２−ジアミノシクロヘキサ
ン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、１０％グリセロ
ール、１％トライトンＸ−１００で可溶化した。ルシフ
ェラーゼ活性は１０μｌの抽出物を１００μｌの発光基
質溶液（２０ｍＭトリシン、１．０７ｍＭ（ＭｇＣＯ
３）４Ｍｇ（ＯＨ）２・５Ｈ２Ｏ、２．６７ｍＭ 硫酸
マグネシウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ３３．３ｍＭ
ＤＴＴ、２７０μＭ コエンザイムＡ、４７０μＭ ル
シフェリン、５３０μＭ ＡＴＰ）に加え、発光量はル
ミマートＬＢ９５０（商品名：Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）
で測定することによって、検出した。なお、数値はβ−
ガラクトースアッセイにより補正した。 参考文献１ Ｇｅｎｈｏｎｇ Ｃｈｅｎｇ，Ｄａｖｉｄ Ｂａｌｔｉ
ｍｏｒｅ； ＴＡＮＫ，ａ ｃｏ−ｉｎｄｕｃｅｒ ｗ
ｉｔｈ ＴＲＡＦ２ ｏｆ ＴＮＦ ａｎｄ ＣＤ４０
Ｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＮＦκＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏ
ｎ． Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ． １０巻，９６３頁，１９
９６年

【００１８】実施例２ コノフィリンによるＩκＢのリ
ン酸化、分解阻害作用 ＮＦκＢは刺激のないとき、細胞質にあり、阻害蛋白Ｉ
κＢと結合して不活性になっている。細胞にＴＮＦ−α
などの刺激が入ると、ＩκＢはリン酸化され、次いでプ
ロテアソームにより分解され、ＮＦκＢは活性になる。
そこでＴＮＦ−αにより刺激されたジャーカット細胞で
コノフィリン添加によりＩκＢのリン酸化、分解が阻害
されたかを調べたところ、図２のようにジャーカット細
胞においてＴＮＦ−αで誘導されるＩκＢのリン酸化
（コノフィリンのない時、５分後に見える上のバンド）
および分解（コノフィリンのない時の３０分後のバンド
消失）をコノフィリンは０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの
濃度で阻害した。

【００１９】（方法）２×１０⁶細胞のジャーカット細
胞に、各濃度のコノフィリンは６時間前処理し、２０ｎ
ｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで刺激後、各々の時間に細胞を捕
集した。培養液を除去し、５０μｌのＴＮＥ緩衝液（１
０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．８、１％（ｗ／ｖ）ＮＰ
−４０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．１ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＰＭＳＦ，
１ｍＭＮａ３ＶＯ４）で可溶化した。１００μｇ蛋白質
を１０％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルで分離し、Ｐ
ＶＤＦ膜（ミリポア）に転写した。膜を抗ＩκＢαＣ−
１５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）、つづいてＨＲＰ標
識抗ウサギイムノグロブリンロバ抗体（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ社製）で反応させ、ＩκＢαの検出はＥＣＬ検出シス
テムで行った（下記参考文献２参照）。 参考文献２ Ｈｏｎｏｏ Ｓａｔａｋｅ ｅｔ．ａｌ；Ｃｕｐｒｉｃ
ｉｏｎ ｂｌｏｃｋｓＮＦκＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏ
ｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｈｅ ｓ
ｉｇｎａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ＩκＢα． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．２１６巻，５６８
頁，１９９５年

【００２０】実施例３ ヒト線維芽細胞腫細胞ＨＴ１０８０は抗癌剤ダウノマイ
シンや放射線でＮＦκＢが活性化され、それがアポトー
シスを阻害していることが報告されている（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２７４巻、７８４頁、１９９６年）。そこでダウ
ノマイシンと同じアンスラサイクリン系抗癌剤で、臨床
に、より多く用いられているアドリアマイシンをＨＴ１
０８０細胞に添加し、コノフィリン添加でアポトーシス
感受性が向上するかどうか調べたところ、コノフィリン
は１μｇ／ｍｌ添加することで、アドリアマイシン０.
１−１μｇ／ｍｌ処理の細胞にアポトーシスが増強され
ており、コノフィリンは顕著にアドリアマイシンのアポ
トーシス誘導能を増強した（図３）。

【００２１】（方法）ＨＴ１０８０細胞は９６ウエルの
プラスチックプレートに１×１０⁴細胞／ウエルで蒔
き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中において２
４時間培養した。コノフィリンを１μｇ／ｍｌ添加し、
１時間後にアドリアマイシンを、それぞれ０．０１μｇ
／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ
／ｍｌ加え、２４時間及び４８時間培養し、トリパンブ
ルー排出試験を行って細胞死を調べた。細胞死はアポト
ーシスであることは核をヘキスト３３２５８で染色し、
核の分断化で確認した。

【００２２】

【発明の効果】コノフィリンはＮＦκＢの活性化を阻害
し、アポトーシス賦活作用があることが示された。更
に、コノフィリンは抗癌剤たとえばアドリアマイシンで
細胞死アポトーシスを起こしにくいヒト固形癌細胞に対
し、併用することでアポトーシスを賦活することが確認
された。

【図面の簡単な説明】

【図１】 コノフィリンによるＴＮＦ−αで活性化され
たＮＦκＢの阻害作用

【図２】 コノフィリンによるＴＮＦ−αで誘導される
ＩκＢのリン酸化および分解阻害作用

【図３】 コノフィリンによるアドリアマイシン誘導ア
ポトーシスの増強作用 （Ａ）２４時間処理（Ｂ）４８時間処理を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 491/22 Ｃ０７Ｄ 491/22

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 化学式１ 【化１】 で表されるコノフィリンまたはその薬理学上許容される
   塩を有効成分とする転写因子ＮＦκＢ活性化阻害剤。
2. 【請求項２】 請求項１記載の化学式１で表されるコノ
   フィリンまたはその薬理学上許容される塩を有効成分と
   するアポトーシス賦活剤。
3. 【請求項３】 アポトーシス誘導剤と併用する請求項２
   記載のアポトーシス賦活剤。
4. 【請求項４】 アポトーシス誘導剤が制癌剤である、請
   求項３記載のアポトーシス賦活剤。
5. 【請求項５】 制癌剤がダウノマイシン、アドリアマイ
   シン、エトポシド、ＴＨＰ−アドリアマイシン、シスプ
   ラチンである、請求項４記載のアポトーシス賦活剤。
6. 【請求項６】 請求項１記載の化学式１で表されるコノ
   フィリンまたはその薬理学上許容される塩を有効成分と
   する制癌剤の効果増強剤。
7. 【請求項７】 請求項１記載の化学式１で表されるコノ
   フィリンまたはその薬理学上許容される塩を有効成分と
   する耐性癌に対する制癌剤の効果増強剤。
8. 【請求項８】 耐性癌が転写因子ＮＦκＢ活性化による
   ものである請求項７記載の制癌剤の効果増強剤。
9. 【請求項９】 請求項１記載の化学式１で表されるコノ
   フィリンまたはその薬理学上許容される塩を有効成分と
   する炎症または自己免疫疾患の治療剤。