JPH11319068A

JPH11319068A - 人工皮膚用基材およびその製法

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Publication number: JPH11319068A
Application number: JP10129048A
Authority: JP
Inventors: Takamitsu Kuroyanagi; 能光黒柳; Akihisa Sugiyama; 章寿杉山; Hiroaki Yanagawa; 博昭柳川
Original assignee: Menicon Co Ltd
Current assignee: Menicon Co Ltd
Priority date: 1998-05-12
Filing date: 1998-05-12
Publication date: 1999-11-24

Abstract

(57)【要約】【課題】効率よく強度が付与された支持体と細胞外基
質成分から作製されたスポンジからなる人工皮膚用基材
を提供すること。【解決手段】支持体と細胞外基質成分から作製された
スポンジからなる人工皮膚用基材、およびその製法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は支持体と細胞外基質
成分から作製されたスポンジからなる人工皮膚用基材お
よびその製法に関する。さらに詳しくは培養皮膚用基材
または創傷被覆材として用いられる前記基材およびその
製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アテロコラーゲンなどの細胞外基質を用
いて作製したスポンジ状マトリックスを培養皮膚の基材
として皮膚欠損創へ適用するなど（黒柳能光、熱傷、
「細胞組み込み型人工皮膚」第２３巻、第１号、１９９
７年３月、９〜２７頁参照）、細胞外基質からなる培養
皮膚用基材および創傷被覆材が従来から使用されてい
る。しかしながら、前記基材は脆弱で強度が低いため、
ピンセットなどで前記基材をつまむと自重で落下した
り、創面に適用する際に欠損するなど扱いづらく、また
従来行なわれている移植皮膚片の固定で使用するステー
プル（ホッチキス）で前記基材を止めるとくずれるた
め、前記基材を創面に固定することはできず、非常に使
いにくいものであった。また、前記基材の上にガーゼま
たは被覆材をそえて皮膚欠損創面まで運び適用する試み
がなされているが、前記のガーゼや被覆材はそえている
だけなので、適用した基材は創面に固定されず、ずれて
しまうなどの問題があった。

【０００３】また、とくに前記基材を培養皮膚用基材と
して用いたときには、細胞培養の際に用いた血清を適用
前に除く洗浄操作、凍結保存後に解凍して適用する際に
は凍結保存液を除く洗浄操作などを行なう必要がある
が、基材が脆弱であるが故に破損することが多かった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らはこのよう
な状況に鑑み、前記問題点を改善すべく鋭意研究を重ね
た結果、支持体と細胞外基質成分から作製されたスポン
ジを組み合せることにより、強度が付与され取扱いやす
くなった基材が提供されることを見出し、本発明を完成
するに至った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は支持
体と細胞外基質成分から作製されたスポンジからなる人
工皮膚用基材（請求項１）に関する。

【０００６】また、本発明は支持体と細胞外基質成分か
ら作製されたスポンジを組み合せることからなる請求項
１記載の基材の製法（請求項６）に関する。

【０００７】前記基材は、好ましくは、支持体と前記ス
ポンジが組み合された請求項１記載の基材（請求項
２）、細胞外基質がコラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン
酸またはそれらの混合物である請求項１記載の基材（請
求項３）、支持体が合成高分子製または天然高分子製の
編物または織布、または不織布である請求項１記載の基
材（請求項４）および培養皮膚用基材または創傷被覆材
である請求項１記載の基材（請求項５）である。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明における「細胞外基質成
分」とは、主に動植物からの分離・精製手法によりえら
れるものであって、かつ生体内で消化（分解・吸収）さ
れるものを意味し、具体的にはコラーゲン、ゼラチン、
ヒアルロン酸、ポリグリコール酸、コンドロイチン硫
酸、アルギン酸、アガロースおよびそれらの混合物など
を含む。また創傷被覆材および培養皮膚用基材では創傷
面周辺の線維芽細胞の活性化を促し、創傷治癒を促進す
ることからコラーゲンが好ましい。とくに培養皮膚用基
材では、さらに容易に細胞を接着させるためにコラーゲ
ンまたはコラーゲンとゼラチン混合物が好ましい。表皮
細胞、線維芽細胞の移動を促進するばあいには、ヒアル
ロン酸またはヒアルロン酸をコラーゲンおよび／または
コラーゲンとゼラチン混合物に混合することが好まし
い。前記混合物の組成と混合比は用途により適宜選択し
うる。

【０００９】前記の分離・精製手法としては、当業者が
通常用いる、動植物組織から酵素処理して抽出するなど
の手法があげられる。

【００１０】本発明における「細胞外基質成分から作製
されたスポンジ」とは、前記細胞外基質成分から作製
し、スポンジ状の多孔構造を有するものであればどんな
ものでもよい。培養皮膚用基材としては、細胞ができる
だけ均一にスポンジ全体に浸透し、接着できるようにす
るためには、空孔の径が１０〜５００μｍであることが
好ましく、３０〜３００μｍ程度であることがより好ま
しい。

【００１１】創傷被覆材としては、創面からの浸出液を
充分に吸収し留置できる空孔を有することが望ましく、
そのためには、空孔の径が１０μｍ〜３ｍｍであること
が好ましく、５０〜１０００μｍ程度であることがより
好ましい。空孔の径が３ｍｍを超えると基材が脆弱とな
り、基材の分解も急速に起こりうるので、強度と分解速
度との関係で空孔の大きさを調整する。

【００１２】前記スポンジの作製方法としては、たとえ
ば、前記細胞外基質成分を適当な溶媒（たとえば水）に
溶解し、ゲル化したのちに凍結乾燥し、要すれば架橋を
行なう方法、適当な溶媒（たとえば水）に架橋剤を加
え、成型したのちに、洗浄乾燥する方法などがあげられ
る。

【００１３】以下に細胞外基質成分から作製されたスポ
ンジがコラーゲンスポンジであるばあいについて、作製
手順を具体的に説明する。

【００１４】コラーゲンスポンジは、酸可溶性コラーゲ
ンを用いるばあい、酸性に調製したコラーゲン溶液をホ
モジナイザーを用いてホモジナイズすることにより充分
に気泡を含ませたものを容器に流し込み、アンモニアガ
ス雰囲気中に静置してゲル化させたのち凍結乾燥を行な
い、ついで紫外線照射または架橋剤によって分子間架橋
を導入することにより作製することができる。

【００１５】前記コラーゲン溶液は、ウシ真皮などから
えられたコラーゲンから調製して、ｐＨを好ましくは２
〜４に調整し、濃度が０．２〜３ｗ／ｖ％、好ましくは
０．５〜２ｗ／ｖ％とすることによりえられる。ゲル化
はアンモニアなどのガス雰囲気下で必要に応じて数分〜
２時間程度行ない、水洗し、こののち、凍結乾燥を行な
う。

【００１６】架橋に用いる紫外線（ＵＶ）の主波長は２
５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００
〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ²、好ましくは１０００
〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ²の線量を照射するとよ
い。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、
グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジル
エーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、
グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレン
ジイソシアネートなどがあげられる。

【００１７】前記スポンジの厚さは、用途により適宜選
択すればよいが、熱傷などによる皮膚欠損に適用するば
あいには、表皮層および真皮層に至る欠損創を被覆する
必要があるため、好ましくは０．５〜３ｍｍ、より好ま
しくは１〜２ｍｍ、深い褥瘡に適用するばあいには好ま
しくは１〜３０ｍｍである。

【００１８】前記スポンジの形状および大きさは適宜選
択すればよいが薄板状、板状、棒状、紡錘状、両側凸レ
ンズ状、球状などがあげられる。

【００１９】本発明における「支持体」とは、生体内で
消化されない（非吸収性）構造物を意味し、たとえば、
ナイロン、ポリエステルまたはシリコンなどの合成高分
子、絹、木綿または麻などの天然高分子からできている
編物または織布、または不織布などが包含されるが、好
ましくは前記編物または織布である。前記編物または織
布とは、当該人工皮膚用基材の強度を増して、基材が消
化される状態においても組織と癒着しにくい程度の目を
持つ編物または織布を意味するが、前記基準を満たす編
物または織布、または不織布であれば、本発明に用いる
ことができる。このことから、メッシュの大きさとして
は、３ ¹/₂〜４００メッシュでよい。好ましくは、細胞
を通過させ難い２００〜４００メッシュ、さらに好まし
くは、体液を通過、蒸散させ難く創面に体液を温存させ
うる閉鎖包帯法（オクルーシブ）の状態に近い２５０〜
４００メッシュである。前記メッシュとは、Ｔｙｌｅｒ
（テイラー）により定義されたものを意味する。

【００２０】前記不織布とは短繊維とからみ合わせ、層
化させた布状物を意味し、たとえば、和紙のような形態
のものをいう。

【００２１】前記支持体の厚みは、用途により適宜選択
すればよいが、充分に基材を支持する強度を与え、取扱
いやすくするためには、好ましくは０．０１〜１ｍｍで
ある。

【００２２】本発明の基材とは、支持体と細胞外基質成
分から作製されたスポンジ（状物質）からなるものを意
味する。前記スポンジと前記支持体との組み合せの形態
は、好ましくは前記支持体の少なくとも片面で前記スポ
ンジが接触している形態であり、適用した際支持体が動
かず、皮膚欠損創面へのせ、その上にガーゼをのせてと
めたばあい、上方（前記創面からより遠方）のスポンジ
がクッションのような役割を果すので、より好ましくは
前記支持体の両面に前記スポンジが接触している形態
（サンドイッチ状の形態）である（図１および２参
照）。本発明の基材の形状および大きさは、適用するも
のにしたがい適宜選択すればよい。

【００２３】本発明の基材の作製方法としては、前記の
ように調製した細胞外基質成分溶液上に支持体をのせ、
要すればさらにその上に前記溶液を加えたのち、ゲル化
し、凍結乾燥を行ない、要すれば架橋を行なう方法など
をあげることができる。

【００２４】本発明にしたがった前記基材の製法は、好
ましくは、細胞外基質成分からなる液体を支持体と前記
支持体の少なくとも片面で接触させて凍結乾燥すること
によって支持体と細胞外基質成分から作製されたスポン
ジを組み合わせることからなり、より好ましくは、細胞
外基質成分溶液上に支持体をのせてゲル化および凍結乾
燥を行なうことによって支持体と細胞外基質成分から作
製されたスポンジを組み合わせることからなり、とくに
好ましくは、細胞外基質成分溶液上に支持体をのせ、そ
の上に前記溶液を加えたのちに、ゲル化および凍結乾燥
を行なうことによって支持体と細胞外基質成分から作製
されたスポンジを組み合わせることからなる。前記細胞
外基質成分溶液とは、細胞外基質成分と、前記細胞外基
質成分を溶解する溶媒からなり、好ましくは、細胞外基
質成分水溶液を意味する。

【００２５】本発明の基材は人工皮膚以外のいかなる用
途にも用いられうるが、人工皮膚用、好ましくは培養皮
膚用基材または創傷被覆材として用いられる。

【００２６】以下に本発明を実施例をあげてさらに詳細
に説明するが、本発明はもとよりこの実施例に限定され
るものではない。

【００２７】

【実施例】比較例１コラーゲンスポンジの作製（従来技術）１ｇの粉末コラーゲン（（株）高研製）をｐＨ３の塩酸
酸性水溶液１００ｍｌに溶解した。えられたコラーゲン
溶液６０ｍｌをホモジナイザー（（株）日本精機製作所
製）で１分間ホモジナイズして充分に気泡を含ませたの
ち、１９ｃｍ×１０ｃｍ、高さ２．５ｃｍのポリスチレ
ン製の容器（商品名：スチロール角型ケースＮＯ．１
５、（株）サンプラテック製）に入れ、水平を維持して
アンモニアガスの雰囲気下にて中和し（２５℃、１２０
分）ゲル化させた。えられたコラーゲンゲルを約−８０
℃で凍結したのち、真空凍結乾燥機（ラブコンコ社製）
に移して−３０℃より段階的に室温まで昇温し、３０時
間かけて凍結乾燥しコラーゲンスポンジをえた。えられ
たコラーゲンスポンジに紫外線（３６００ｍＷ／ｃｍ²
ＵＶ、１５分）を表裏に照射して架橋した。えられた架
橋コラーゲンスポンジの形状は約１８×９．５×０．１
８ｃｍであった。

【００２８】また、ダルベッコ変法イーグル最小必須培
地（ギブコ社製）溶液５０ｍｌを前記架橋コラーゲンス
ポンジに加えたばあいの前記スポンジの引裂き強度は、
約０．２ニュートン／ｍｍであり、取扱いはガーゼを添
えて扱わなければならず非常に脆弱で取扱いが困難であ
った。なお、引裂き強度はインストロン万能材料試験機
（モデル４３０１、インストロン社製）を用いて、２×
３ｃｍの長方形試験片の短辺中央にて長辺に平行に２ｃ
ｍの長さの切り込みを入れ、この両端を引張ることで求
めた。

【００２９】実施例１コラーゲンスポンジと支持体からなる基材の作製１ｇの粉末コラーゲン（（株）高研製）をｐＨ３の塩酸
酸性水溶液１００ｍｌに溶解した。えられたコラーゲン
溶液の６０ｍｌをホモジナイザー（（株）日本精機製作
所製）で１分間ホモジナイズして充分に気泡を含ませた
のち、このコラーゲン溶液の３０ｍｌを１９ｃｍ×１０
ｃｍ、高さ２．５ｃｍのポリスチレン製の容器（商品
名：スチロール角型ケースＮＯ．１５、（株）サンプラ
テック製）に入れ、水平を維持し、前記容器と同形状の
３００メッシュのナイロン製織布を前記コラーゲン溶液
の上に静かにのせた。さらに残りのコラーゲン溶液３０
ｍｌを前記ナイロン製織布の上に静かに注入した。コラ
ーゲン溶液＋ナイロン製織布＋コラーゲン溶液が入った
容器の水平を保ち、アンモニアガスの雰囲気下で中和し
（２５℃、１２０分）ゲル化させた。えられたコラーゲ
ンゲルについて比較例１と同様に凍結乾燥を行ない、コ
ラーゲンスポンジをえた。えられたコラーゲンスポンジ
に紫外線（３６００ｍＷ／ｃｍ² ＵＶ、１５分）を表裏
に照射し架橋してえられた架橋コラーゲンスポンジの形
状は約１８×９．５×０．１９ｃｍであった（図３
（ａ）〜（ｄ）および図４（ａ）〜（ｄ）参照）。

【００３０】また、ダルベッコ変法イーグル最小必須培
地（ギブコ製）溶液５０ｍｌを前記架橋コラーゲンスポ
ンジに加えたばあいの前記スポンジは引裂き強度試験が
困難なほどの強度を有しており、ガーゼなどを添えるこ
となく、そのまま困難なく取扱うことができた。なお、
引裂き強度試験は比較例１と同様に行なった。

【００３１】試験例１実施例１と同様にしてえられた基材の一方のスポンジ上
に１０％牛胎児血清（以下、ＦＢＳ）含有ダルベッコ変
法イーグル最小必須培地（以下、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢ
Ｓ、ギブコ社製）中に懸濁した培養ウサギ線維芽細胞を
１×１０⁴細胞／ｃｍ²の密度で播種したのちＣＯ₂ ５
％、３５℃のインキュベーター中で７日間培養し、培養
真皮を作製した。培地を除去し、これを凍結保存液（１
０％グリセロール含有ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に入れ
−１５２℃の冷凍庫内で保存した。３カ月間凍結保存し
たのち、解凍して凍結保存液を除去し、ハンクス液３０
ｍｌで２回洗浄して動物実験に使用した。ウサギの背部
に直径７ｃｍの円を描き前層皮膚を切除した。切除後、
皮膚欠損創の直径は９ｃｍと広がった。この皮膚欠損創
に解凍した前記基材（同種培養真皮）を直径９ｃｍに切
って適用し創周辺をナイロン６．０縫合糸（協和時計工
業（株）製）により縫合し、その上にバイオクルーシブ
（ポリウレタンフィルム製創傷被覆材）を適用し、さら
に直径９ｃｍの滅菌パットをのせて、前記と同様に創周
辺と縫合固定し伸縮性包帯で圧迫固定した。１週間後
に、包帯交換を行ない創面を観察して、再度、新しい基
材を適用し、さらに２週間（３週目）に創面を観察し
た。

【００３２】コラーゲンスポンジ内にはナイロンメッシ
ュが組み込まれているため解凍後の洗浄操作は非常に容
易であり、また移植操作が容易であった。とくに創周辺
との縫合固定が可能であった。３週目において良好な肉
芽組織が形成され、創周辺からの表皮化も観察された。
新生組織はナイロンメッシュに食い込んでおらず容易に
創面からナイロンメッシュを除去することができた。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、支持体と細胞外基質成
分から作製されたスポンジを組み合せることにより、こ
れらからなる基材の強度が向上され取扱いやすくなった
人工皮膚用基材を提供することが可能となる。さらに、
本発明の基材のスポンジ上に細胞を播種することにより
培養皮膚が大量に生産でき、凍結保存が可能で、要時解
凍し使用できる。えられた培養皮膚は解凍後の凍結保存
液を除去するための洗浄操作性、輸送性および移植操作
性が向上されており、また創面をオクルーシブに近い状
態にできるので、創面の組織修復が促進されることにな
り、適当な時期に新生組織に悪影響を与えることなく創
面から支持体を除去することができる。本発明の基材
は、培養皮膚用基材と同様、創傷被覆材としても好適に
用いられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の基材の一実施例の説明図であって、ス
ポンジとスポンジの間に支持体がはさまった状態で支持
体とスポンジが組み合されている基材の断面図を示す図
である。

【図２】本発明の基材の別の一実施例の説明図であっ
て、支持体の片面でスポンジが接触している状態で支持
体とスポンジが組み合されている基材の断面を示す図で
ある。

【図３】本発明の基材の一作製手順（前半）を示す説明
図である。

【図４】本発明の基材の一作製手順（後半）を示す説明
図である。

【符号の説明】

１スポンジ２支持体３コラーゲン溶液４コラーゲンゲル１１コラーゲンスポンジ１２架橋コラーゲンスポンジ２１ナイロンメッシュ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】支持体と細胞外基質成分から作製された
スポンジからなる人工皮膚用基材。
【請求項２】支持体と前記スポンジが組み合された請
求項１記載の基材。
【請求項３】細胞外基質がコラーゲン、ゼラチン、ヒ
アルロン酸またはそれらの混合物である請求項１記載の
基材。
【請求項４】支持体が合成高分子製または天然高分子
製の編物または織布、または不織布である請求項１記載
の基材。
【請求項５】培養皮膚用基材または創傷被覆材である
請求項１記載の基材。
【請求項６】支持体と細胞外基質成分から作製された
スポンジを組み合せることからなる請求項１記載の基材
の製法。