[go: up one dir, main page]

JPH11160316A - 乾式イムノアッセイ分析要素およびそれを使用したアッセイ方法 - Google Patents

乾式イムノアッセイ分析要素およびそれを使用したアッセイ方法

Info

Publication number
JPH11160316A
JPH11160316A JP10269858A JP26985898A JPH11160316A JP H11160316 A JPH11160316 A JP H11160316A JP 10269858 A JP10269858 A JP 10269858A JP 26985898 A JP26985898 A JP 26985898A JP H11160316 A JPH11160316 A JP H11160316A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
layer
receptor
ligand
labeled
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP10269858A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4243372B2 (ja
Inventor
Margaret Elizabeth Logan
エリザベス ロガン マーガレット
Janet Fyles
ファイレス ジャネット
Stephen Hasselberg
ハッセルバーグ スティーブン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ortho Clinical Diagnostics Inc
Original Assignee
Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ortho Clinical Diagnostics Inc filed Critical Ortho Clinical Diagnostics Inc
Publication of JPH11160316A publication Critical patent/JPH11160316A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4243372B2 publication Critical patent/JP4243372B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C395/00—Compounds containing tellurium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/963—Methods of stopping an enzyme reaction or stabilizing the test materials
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/969—Multiple layering of reactants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/97—Test strip or test slide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Solid State Image Pick-Up Elements (AREA)

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】リガンドをアッセイするための乾式イムノアッ
セイ分析。 【解決手段】(a) 酵素標識リガンドまたは酵素標識レセ
プターを含んで成る標識層；(b) 展開層；(c) リガンド
のための固定化レセプターを一定濃度で含んで成るレセ
プター層；(d) テルル化ジアリールを含んで成るグラビ
ア層、を担持している支持体を含んで成る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は乾式塗膜要素および
イムノアッセイにおけるそれの使用に関する。より詳し
くは、本発明は乾式塗膜要素における標識免疫反応体の
安定性の向上に関する。
【０００２】
【従来の技術】自然免疫反応を利用するイムノアッセイ
は、臨床化学分野において分析技法として幅広く使用さ
れている。反応の特異性故に、イムノアッセイは生物学
的流体中に極低濃度で存在する生物学的分析物（analyt
e ）を定量するのに特に有利である。このような分析物
としては、例えば、抗原、抗体、治療薬、麻酔薬、酵
素、ホルモン、タンパク質、等が挙げられる。
【０００３】アッセイの標的物質である分析物を本明細
書では「リガンド」と称する。リガンドを特異的に認識
し且つ該リガンドと反応して複合体を形成する化合物を
本明細書では「レセプター」と称する。このレセプター
とリガンドは接合体ペア（conjugate pair）を形成す
る。このペアのいずれのメンバーもレセプターまたはリ
ガンドとして機能することができる。
【０００４】競合アッセイの場合、標識された免疫応答
性誘導体をはじめとする標識分析物およびそのような分
析物の類似体が前記アッセイの典型成分であり、一方、
サンドイッチアッセイの場合には、分析物のための標識
レセプターが典型的に使われる。本明細書ではこれらを
それぞれ標識リガンドおよび標識レセプターと称する。
【０００５】競合結合イムノアッセイでは、標識リガン
ドが一定量の適当なレセプターとの反応を目当てにした
未標識リガンドとの競合状態に置かれる。結合した標識
リガンドまたは未結合の（すなわち遊離の）標識リガン
ドのいずれかの測定シグナルから、リガンドの未知濃度
を決定することができる。反応は以下のように進行す
る。 リガンド ＋ 標識リガンド ＋ レセプター−基質
＜＝＞ リガンド−レセプター−基質 ＋ 標識リガンド−レセ
プター−基質。
【０００６】サンドイッチイムノアッセイまたはイムノ
メトリックアッセイとして知られている別のイムノアッ
セイ形式では、別々のエピトープ部位においてリガンド
に結合する２種以上のレセプター分子とリガンドとを接
触させる。典型的には一方のレセプターが適当に標識さ
れており、そして他方が固体支持体上に固定化されてい
かまたは固定化することができる。リガンドの量は、リ
ガンドと２種のレセプター間で結合した複合体の量に正
比例する。これは以下のように説明される。 基質−レセプター1 ＋ リガンド ＋ レセプター2
−標識 ＜＝＞ 基質−レセプター1 −リガンド−レセプター2 −標識
【０００７】常用の標識としては放射性標識、酵素、発
色団、蛍光団、安定なラジカル並びに酵素補因子、阻害
剤およびアロステリックエフェクターが挙げられる。
【０００８】イムノアッセイ分析要素は米国特許第4,51
7,288 号及び同第4,258,001 号明細書からも周知であ
る。一般に、このような要素は、粒状層に固定化された
レセプター（例えば、リガンドに対する抗体）を含む。
さらに、該要素は通常、結合した種または未結合の種と
の相互作用を通して、試料中のリガンド濃度に相関させ
ることのできるシグナルを生成する試薬系を含有する。
使用する際には、試料を酵素標識リガンドと混合し、そ
して要素へ適用すればよい。一定時間の後、標識リガン
ドのための基質を含有する溶液を粒状層に適用する。酵
素標識によって基質との反応が触媒されて最終的にシグ
ナル（例えば色）の生成を引き起こす反応生成物を形成
させる。この色の反射濃度は試料中のリガンド濃度に相
関させることができる。他の既知の常用標識、例えば放
射性標識、発色団、蛍光団、安定なラジカル並びに酵素
補因子、酵素阻害剤及びアロステリック酵素エフェクタ
ーについても同様のシグナル生成系が知られている。
【０００９】多層イムノアッセイ要素は、上述したイム
ノアッセイ原理を利用して液体試料中の分析物を測定す
る乾燥塗膜要素である。競合アッセイ要素では、発色
（または別のシグナル生成）の速度が存在する分析物の
量に反比例し、サンドイッチアッセイ要素では、発色
（または別のシグナル生成）の速度が存在する分析物の
量に正比例する。さらに、発色（または別のシグナル生
成）速度は、固定化レセプターに結合した酵素標識分析
物（例えば薬物）または酵素標識レセプターの活性にも
正比例する。イムノアッセイが安定な検定を維持するた
めには、特定の検定期間中はいずれのスライドにおいて
も全く酵素活性（測定速度）が失われてはならない。
【００１０】イムノアッセイ要素は、必要な時に１要素
を取り出すことができる50個の独立した要素を含むプラ
スチック製「カートリッジ」として顧客に供給される場
合が多い。これらの要素は、カートリッジ中の下側49個
の要素の上面が全てその上の要素によってカバーされる
ように次々に上に積み重ねられる。しかしながら、この
積層品の最上部の要素にはこのようなカバーがないた
め、その要素の表面は他の49の要素が受けないような環
境因子に晒される。例えば、製造中にカートリッジを取
り扱っている時やカートリッジが臨床分析装置の要素供
給部の中にある時には、最上部（または第一）の要素が
残りの要素よりも多く空気流や光に暴露される。
【００１１】使用前の保存中には、カートリッジそれ自
体はホイルで内張りしたシールバッグの中に保存され
る。しかしながら、最上部要素はまだ他の49の要素より
もシールバッグ内の残留空気や湿気に多く暴露される。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】共通の試験液をカート
リッジ中の要素と反応させた時、最上部（または第一）
要素で観測される発色の速度が、同じ試験液を同一カー
トリッジ中の最上部要素の下側にある要素に適用した時
に観測される発色の速度よりも常に低くなることがわか
った。この現象は「第一スライドの偏り（first slide
bias）」と呼ばれる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】第一スライドの発色の速
度が遅いという問題を処理する１つの方法は、Daniel他
による米国特許第5,516,645 号明細書に記載されるよう
なバナジウムイオンの使用を伴う。本出願人は、「第一
スライドの偏り」を減らすための１または複数のテルル
化ジアリール（ＤＡＴまたはＤＡＴｓ）の使用を開発し
た。第一スライドの偏りを防ぐためのテルル化ジアリー
ルの使用は、サンドイッチアッセイと競合イムノアッセ
イの両方に使用することができる。
【００１４】本発明の一つの面によれば、リガンドをア
ッセイするための乾式イムノアッセイ分析要素であっ
て、 (a) 酵素標識リガンドまたは酵素標識レセプターを含ん
で成る標識層； (b) 展開層； (c) 前記リガンドのための固定化レセプターを一定濃度
で含んで成るレセプター層；および (d) テルル化ジアリールを含んで成るグラビア層 を担持しているる支持体を含んで成る、乾式イムノアッ
セイ分析要素が提供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】一態様では、前記レセプターは0.
1 〜５μm の範囲の直径を有するポリマービーズに共有
結合で結合される。好ましい態様では、酵素標識リガン
ドとテルル化ジアリールが同じグラビア層（または帯
域）に存在し、前記グラビア層（または帯域）は液体試
料との最初の接触を提供する展開層の表面に隣接してい
るかまたはそれと連続している。
【００１６】上述した要素は第一スライドの偏り、すな
わちカートリッジ中の最上部要素の発色速度が同一カー
トリッジ中の他の要素の発色速度に比較して差異がある
こと、を減少させる。更に、カートリッジ中の全ての要
素がより長期間の安定性および貯蔵性を示す。本発明の
実施例は、テルル化ジアリール（ＤＡＴ）化合物がこれ
らの利点を提供することを確証する。
【００１７】加えて、このＤＡＴ化合物は、一般に酵素
組成物、特にペルオキシダーゼ、特には西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）、および治療薬、乱用薬物、ス
テロイド等のような小型分子と酵素（好ましくはＨＲ
Ｐ）との接合体を安定化する上でも有用である。別の態
様は、酵素が標識として用いられる、酵素（好ましくは
ＨＲＰ）と大型分子（例えばタンパク質、炭水化物な
ど）との接合体である。例えば、該化合物は、本発明の
乾式要素においてだけでなく溶液アッセイにおいても使
用することができる。
【００１８】本発明の別の態様は、水性試料中に含まれ
る免疫学的反応性リガンドのアッセイ方法であって、 (1) 乾式イムノアッセイ分析要素であって、 (a) 酵素標識リガンドまたは酵素標識レセプターを含ん
で成る標識層； (b) 展開層； (c) 前記リガンドのための固定化レセプターを一定濃度
で含んで成るレセプター層；および (d) テルル化ジアリールを含んで成るグラビア層 を担持している支持体を含んで成る乾式イムノアッセイ
分析要素を用意し、(2) 前記要素の展開層の限定領域を
前記試料と接触させ、それにより(i) 固定化リガンド−
レセプター複合体、(ii)固定化酵素標識リガンド−レセ
プター複合体、または(iii) (i) と(ii)の混合物、また
は固定化レセプター−リガンド−標識レセプター複合体
を形成させ、(3) 前記限定領域を前記酵素標識のための
基質溶液と接触させ、それによりシグナルの生成を触媒
し、そして(4) 前記シグナルを検出することにより前記
リガンドの濃度を測定することを含んで成る方法を提供
する。
【００１９】上記方法では、酵素標識レセプターまたは
酵素標識リガンドが、固定化酵素標識リガンドまたは固
定化酵素標識レセプターから分離される。このような分
離は、当該技術分野で知られている任意の手段、例え
ば、過酸化水素溶液などの基質溶液を添加することによ
って行うことができる。
【００２０】本発明の要素の１または複数の層は各々１
または複数の帯域を含むことができる。要素の連続層は
それらの間にはっきりした境界を有してもよく、光学お
よび／または電子鏡検法によると、それらは該要素の別
個の且つ独立した層として見えてもよく、あるいは層の
混合が起こって層間の境界がぼやけるかまたは不明瞭で
ある接触した帯域または領域を有してもよい。そのよう
な場合、別個の層は光学および／または電子鏡検法によ
り見えることもあるし見えないこともある。帯域の形成
は部分的であっても実質的に完全（または完全）であっ
てもよい。部分的帯域形成の場合、別々に付着させた１
もしくは複数の連続層の中に１または複数の帯域を含む
ように、付着層の一部だけが浸透して、別々に付着させ
た連続層に浸透しそれと混合することができる（両層が
相互に互いに浸透してもよいが、どの場合でも、両層の
一部を含んで成る帯域が形成し、そして両者が記載のよ
うな帯域形成をもたらすので、個別のおよび相互の層浸
透が共に期待される）。
【００２１】他方、別々に付着させた層の大部分または
全部が、それが光学および／または電子鏡検法により該
要素の連続層から別個のまたは離れた層として見えるこ
とがないように実質的にもしくは完全に１または複数の
連続層の内部に含まれるようにして、１または複数の連
続層に浸透し混合して１または複数の連続層の中に１ま
たは複数の帯域を形成してもよい。部分もしくは完全な
帯域が故意に形成されてもよくまたはやむを得ず形成し
てもよい。故意に形成される場合、層の中の帯域は、実
施者が１または複数の特定の成分を１または複数の層の
中に混和させるか、含有せしめるか、または層の中の帯
域の中に混入させることができる任意の方法で提供する
ことができる。例えば、ポリマーまたは他のマトリック
ス中に１または複数の特定成分を封入し、次いで該マト
リックスを１または複数の層の中に混和させることがで
きる。
【００２２】あるいは、本発明の別の態様は、２つの隣
接した層と連続している特定成分Ａ（または複数成分）
を含んで成る１つの層を、該成分が２つの連続層のうち
の１つの中に可溶であるように調製してもよいことに関
する。最初の接触の間またはその後に、該成分が可溶で
ある連続層の中に完全なまたは部分的帯域が形成され
る。連続層の中のこの帯域は、従って、特定成分Ａを含
んで成る。この帯域の形成は上記に記載したように部分
的であっても全体的（完全）であってもよい。帯域形成
の程度は、層を用意するのに使われる溶剤、乾燥前の層
の接触時間、温度などといった、塗布技術の熟練者に周
知であるような条件の調整により調節することができ
る。標識層、レセプター層、グラビア層および／または
他の層という用語を用いて定義される乾式イムノアッセ
イ要素は、該要素の標識層、レセプター層、グラビア層
および／または別の層が別々の異なる層を形成するか、
あるいは指摘の層の付着中または付着後に１もしくは複
数の連続層の中に１もしくは複数の部分的または完全な
帯域を形成することができる全ての態様を包含するとい
うことを理解すべきである。
【００２３】グラビア層は、別の層、例えば展開層の表
面上に付着された１または複数の成分を含んで成る薄層
である。「グラビア層」という用語は薄層を意味し、こ
こで「薄」とは、その層が接触している１または複数の
連続層に相対して厚さが薄いことを表すために使われる
相対的用語である。この用語は、グラビア塗布法がテル
ル化ジアリール（および／または別の成分）を含んで成
る薄層を塗布するのに好ましい手法であるので、便宜上
の用語である。この用語の使用は、どんな形でも制限す
る意図のものではない。上記に明記したような薄層の塗
布、付着または別のやり方の据え付けを可能にする任意
の手段が「グラビア層」の用語の範囲内に含まれると見
なされる。本発明の要素の展開層の上に直接塗布された
グラビア層は、展開層上の別個のまたは分離した層とし
て見えないかもしれない。グラビア層はそれとの初期接
触を経験する展開層（または別の層）の表面の上に、上
と内部に、またはすぐ下に、薄い連続帯域を形成すると
予想される。どんな場合でも、液体試料をグラビア層お
よび／または帯域を含んで成る展開層と接触させると、
展開層自体の多孔性のため、液体試料は展開層の成分、
ビーズなどと直接接触して、試料の展開と計量（これら
の用語は当業界で既知である）を可能にするだろう。よ
って、グラビア層および／または帯域を有する要素を液
体試料と接触させるということは、展開層の展開、計量
および他の機能が妨げられない時、展開層を液体試料と
接触させるという言葉で簡単に説明することができる。
【００２４】下記に記載するＴｅ５は、本出願人らの前
の出願において教示されている一般式Ａｒ1 −Ｔｅ−Ａ
ｒ2 を有する多数の種のうちの１種を表す。更に、本発
明者らは、テルル化ジアリール、特に下式で示されるＴ
ｅ５：
【００２５】
【化７】
【００２６】が、カルバマゼピン（ＣＲＢＭ）競合イム
ノレートアッセイのイムノアッセイ要素のグラビア層中
に１mMの最終再水和（rewet ）濃度で混和されると第一
スライドの偏りを著しく減少させることを発見した。第
一スライドの偏りの有意な減少は１年の期間に渡り観察
された。実際、第一スライドは非第一スライド対照から
区別できない。同レベルのＴｅ５を、ビーズ展開層上に
塗布されたグラビア層ではなくむしろビーズ展開層に直
接塗布すると、それは第一スライドの偏りの発生を予防
するのに不十分である。また、カルバマゼピン（ＣＲＢ
Ｍ）、フェノバルビタール（ＰＨＢＲ）、フェニトイン
（ＰＨＴＹ）およびジゴキシン（ＤＧＸＮ）の測定用に
設計された乾式イムノアッセイ要素のグラビア層中への
0.25〜0.50mM （要素の再水和時）のＴｅ５の混和が、
６か月および９か月の凍結保存後に第一スライドの偏り
を有意に減少させることもわかった。
【００２７】本発明は、一般に、展開層上に付着された
グラビア層に塗布されたテルル化ジアリール化合物を含
んで成る、改良型乾式イムノアッセイ要素に向けられ
る。しかしながら、グラビア層は別の層の上に付着され
ていてもよい。別の面では、本発明は、前記改良型乾式
塗膜要素を使ったイムノアッセイの実施方法に関する。
【００２８】本発明の要素は、標識リガンドまたは標識
レセプター、展開層（または帯域）、レセプター層（ま
たは帯域）およびグラビア層（または帯域）を含んで成
る。これらの帯域および層は前に定義した通りである。
各種の帯域が一つの塗布層に存在してもよいし、また別
々の塗布層に存在してもよい。例えば、展開帯域とレセ
プター帯域が単一層にあってもよく、或いはそれらが別
々の層にあってもよい。別々の層は、支持体上に任意の
順序で配置することができる。また、支持体上に直接レ
セプター層があり、そのレセプター層のすぐ上に展開層
があり、そして展開層の上に標識リガンドまたは標識レ
セプター帯域があるように、別々の層を配置させること
ができる。レセプター帯域が完全に別々の層を形成する
場合、その層は後述のタイプのバインダーも含むだろ
う。本発明の要素はグラビア層のような追加の層を含む
ことができる。このような層はいずれも当該技術分野で
周知の塗布技法によって塗布することができる。
【００２９】テルル化ジアリールである代表的化合物は
下式：Ａｒ1 −Ｔｅ−Ａｒ2を有する。テルル化ジアリ
ールは、後述するヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣ
Ｇ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）イムノアッセ
イ要素のような、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識免疫
反応体を含んで成るイムノアッセイ要素に含められる
と、第一スライドの偏りを有意に減少させる。これらの
化合物のサブセットを、第一スライドの偏りを防止する
能力について化合物を評価するために設計されたモデル
系において試験すると、ＨＲＰ活性を保持することも証
明された。有用なジオルガノテルル化物としては、Ａｒ
1 およびＡｒ2 が同一もしくは異なるアリール基または
同一もしくは異なるヘテロアリール基（下記に定義され
る）である物質が挙げられる。
【００３０】
【化８】
【００３１】上式中、ＸはＯ，Ｓ，ＳｅまたはＴｅであ
り；Ｒ11，Ｒ12，Ｒ13，Ｒ21，Ｒ22，Ｒ23，Ｒ31，
Ｒ32，Ｒ33，Ｒ41，Ｒ42およびＲ43は同一であるかまた
は異なり且つ水素、炭素原子数１〜５のアルキル、Ｏ
Ｈ、ＯＲ1 、ＳＨ、ＮＨ2 、ＮＨＲ1 、ＮＲ1 2、ＮＲ1
Ｒ2 、ＣＯ2 Ｈおよびその塩、ＣＯ2 Ｒ1 、ＳＯ3 Ｈお
よびその塩、ＰＯ3 Ｈ2 およびその塩並びにＳＲ1から
成る群より各々選ばれ、ここでＲ1 とＲ2 は異なり且つ
１個または数個の親水基を担持することがある炭素原子
数１〜14の炭素鎖を有するアルキル、フェニルまたは置
換フェニルから成る群より各々選ばれ；Ｒ14，Ｒ15，Ｒ
24およびＲ25は同一であるかまたは異なり且つ水素、炭
素原子数１〜５のアルキル、炭素原子数１〜５のアルコ
キシ、ＣＯ2 Ｈおよびその塩、ＣＯ2 Ｒ1 （Ｒ1 は上記
した通り）、ＳＯ3 Ｈおよびその塩、ＰＯ3 Ｈ2 および
その塩から成る群より各々選ばれる。
【００３２】上記において、「アルキル」は、メチル、
エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、 sec−
ブチル、tert−ブチル、アミル、イソアミルまたはネオ
ペンチルのような基を意味する。「炭素原子数１〜５の
炭素鎖」は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ｎ−ブチル、 sec−ブチル、tert−ブチル、アミ
ル、イソアミルまたはネオペンチルのような直鎖状また
は分枝状の炭素鎖を意味する。「炭素原子数１〜14の炭
素鎖」には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ｎ−ブチル、 sec−ブチル、tert−ブチル、アミ
ル、イソアミル、ネオペンチル、ヘキシル、オクチル、
デシル、テトラデシル等が含まれるが、これらに限定さ
れない。
【００３３】「親水基」とは、スルホン酸、ホスホン
酸、カルボン酸、ヒドロキシル基およびアミノ基のよう
な基を意味する。これらの化合物の幾つかはいずれかの
酸または塩基と塩を形成することができる。ナトリウ
ム、カリウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネ
シウム塩、塩酸、臭化水素酸、リン酸および硫酸との
塩、並びにシュウ酸、フマル酸、酒石酸、マロン酸、酢
酸、クエン酸およびコハク酸のような有機酸との塩が好
ましい。
【００３４】好ましいＤＡＴは、水溶性を付与する基、
例えば、限定するものではないが、ヒドロキシル基、ア
ミンおよびその塩並びにカルボン酸およびその塩を含有
する置換基を芳香環上に有するものである。特に、単独
でまたはバナジル化合物と共同してＨＲＰ活性を保存す
る水溶性ＤＡＴ化合物は以下のものである（Ｔｅ１−Ｔ
ｅ５）：
【００３５】
【化９】
【００３６】展開層に用いられる他の材料については、
例えば米国特許第4,258,001 号明細書に開示されている
乾式分析要素の製造技術において周知である。このよう
な層は、布や紙などから製造されたマクロ多孔質層を包
含する。好ましい粒状層はビーズ展開層（ＢＳＬ）であ
る。この層は、希釈したまたは未希釈の検査試料（例え
ば１〜200 μＬ）を収容する本発明の要素において使用
するのに適した多孔性を有するように容易に構築するこ
とができる。展開層は等方性多孔質であることが好まし
く、この特性は帯域を含んで成る粒子間の連続空間によ
って造られる。「等方性多孔質」とは、展開層が適用さ
れた液体をあらゆる方向で層全体に均一に展開させるこ
とを意味する。
【００３７】ビーズ展開層をはじめとする有用な展開層
が米国特許第4,670,381 号、同第4,258,001 号および同
第4,430,436 号明細書に記載されている。特に有用な展
開層は、米国特許第4,258,001 号明細書に記載されてい
る有機ポリマー粒子とその粒子のための高分子接着剤と
から形成された粒状構造を有する展開層である。展開層
に有用な有機ポリマー粒子は、一般に直径約10〜40μｍ
の範囲内またはこれより小さい粒度を有する熱安定性の
球形ビーズである。
【００３８】これらの粒子は、必要な特性を有する、天
然ポリマーと合成ポリマーの両方を含む多種多様な有機
ポリマーから構成され得る。しかしながら、上記特許明
細書に記載されている１または複数の付加ポリマーから
構成されることが好ましい。
【００３９】レセプター層が別個の層である場合には、
それは支持体上に、または支持体の上の試薬層もしくは
下塗層の上に、調製され且つ塗布される。レセプター
は、レセプター上の表面の反応性基（求核性遊離アミノ
基やスルフヒドリル基）を介してポリマー粒子に共有結
合で取り付けられる。
【００４０】レセプターを小さなポリマービーズに結合
させる一般的手法として、特定のレセプターを一般に既
知の反応によってビーズに共有結合で取り付ける方法が
ある。多くの側基、例えば、ハロアルキル、２−置換活
性エチルスルホニルおよびビニルスルホニルを使って、
レセプターをビーズに直接結合させることができる。一
般に、水性緩衝液（pHは一般に約５〜約10である）中
で、約0.1 〜約40重量％のポリマー粒子濃度、好ましく
は約0.1 〜約10重量％のポリマー粒子濃度でビーズとレ
セプターの混合が行われる。レセプターの量は、ポリマ
ーに対する比率で約 0.1：1000〜約１：10、好ましくは
約１：100 〜約１：10である。混合は約５〜約50℃、好
ましくは約５〜約40℃の範囲の温度において約0.5 〜約
48時間実施される。任意の適当な緩衝液が使用可能であ
る。
【００４１】場合により、リガンドを共有結合させるた
めに外面上の反応性側基を修飾または活性化する必要が
ある。例えば、カルボキシル基は、1992年７月22日発行
の欧州特許第308235号公報や米国特許第5,155,166 号明
細書に記載されている既知のカルボジイミドまたはカル
バモイロニウム化学を使って活性化する必要がある。
【００４２】しかしながら、カルボキシル基を含む単分
散ポリマービーズへのレセプターの結合は二段階で行わ
れる。第一段階は、該粒子の水性懸濁液をカルボジイミ
ドまたはカルバモイロニウム化合物と接触させて、カル
ボキシル基の代わりに中間反応性基を有する反応性中間
体ポリマー粒子を生成させることを含む。この段階は、
所望のｐＨを提供するために適当な酸または緩衝剤を用
いて適当なｐＨにおいて実施される。一般に、ｐＨは６
未満であるが、反応が進行できる限りこれは重要でな
い。おそらく、ｐＨは約3.5 〜約７であろう。粒子表面
上のカルボキシル基に対するカルボジイミドまたはカル
バモイロニウム化合物のモル比は約10：１〜500 ：１で
ある。
【００４３】この方法の第二段階では、第一段階で形成
された反応性中間体を反応性アミン基またはスルフヒド
リル基含有のレセプターと接触させる。これにより粒子
とレセプターとの間に共有結合が形成される。レセプタ
ー対ポリマー粒子の重量比は、一般に約１：1000〜約
１：１、好ましくは約１：100 〜約１：10である。
【００４４】別の場合として、外面上のエポキシ基を加
水分解して、免疫学的種の中のアミン基に対するカップ
リング剤として作用できる臭化シアンと反応することが
できるジオール化合物を形成させることができる。アル
デヒドをアミンと直接反応せしめてシッフ塩基を生成さ
せ、続いてこのシッフ塩基を還元して共有結合を形成さ
せてもよい。別法として、アルデヒドを酸化して酸に
し、そしてカルボキシル基について上述した化学を使っ
てアミド結合を形成させることもできる。
【００４５】レセプターが、ポリマー上の反応性基と反
応するか、またはポリマーが反応性カルボキシル基を有
する場合にはポリマー粒子上のカルボキシル基とカルボ
ジイミドもしくはカルバモイロニウム化合物との反応に
よって生成した中間体と反応するであろう、反応性アミ
ンまたはスルフヒドリル基をそれぞれ含有する限り、い
ずれの反応性アミンまたはスルフヒドリル含有のレセプ
ターでも単分散ポリマービーズに結合させることができ
る。
【００４６】レセプター上のアミンまたはスルフヒドリ
ル基と直接に反応しやすい反応性基を有する小さなポリ
マービーズは、必要ならば適当な緩衝液中で、レセプタ
ーと単に混合することにより反応させることができる。
【００４７】レセプター用のビーズを中から選ぶことが
できるポリマーとしては次のものが挙げられる：ポリ
（ｍ−＆ｐ−クロロメチルスチレン）、ポリ（スチレン
−コ−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−コ−２−ヒドロ
キシエチルアクリレート）〔モル比67：30：３〕、ポリ
（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロエチルスルホニルメチ
ルスチレン）〔モル比95.5：4.5 〕、ポリ｛スチレン−
コ−Ｎ−〔ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチ
ル）フェニル〕アクリルアミド｝〔モル比99.3：0.7
〕、ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−コ−メタ
クリル酸）〔モル比95：５、98：２および99.8：0.2
〕、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロエチルスル
ホニルメチルスチレン−コ−メタクリル酸）〔モル比9
3.5：4.5 ：2 〕、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ＆ｐ
−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニル〕ア
クリルアミド−コ−メタクリル酸｝〔モル比97.3：0.7
：2 〕、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロメチル
スチレン）〔モル比70：30〕、ポリ〔スチレン−コ−３
−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕〔モル比
97.6：2.4〕、ポリ（スチレン−コ−ビニルベンジルク
ロリド−コ−アクリル酸）〔モル比85：10：５〕、ポリ
（スチレン−コ−アクリル酸）〔モル比99：１〕、ポリ
（スチレン−コ−メタクリル酸）〔モル比90：10〕、ポ
リ（スチレン−コ−アクリル酸−コ−ｍ＆ｐ−ジビニル
ベンゼン）〔モル比89：10：１〕、ポリ（スチレン−コ
−２−カルボキシエチルアクリレート）〔モル比90：1
0〕、ポリ（メチルメタクリレート−コ−アクリル酸）
〔モル比70：30〕、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−ビニ
ルベンズアルデヒド）〔モル比95：５〕、およびポリ
（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−ビニルベンズアルデヒド−コ
−メタクリル酸）〔モル比93：５：２〕。
【００４８】要素の各層は適当な支持体の上に担持され
る。レセプター層は支持体上に塗布されるが、支持体と
レセプター層との間にゼラチン／緩衝剤層のような中間
介在層が存在してもよい。支持体は、寸法安定性がよ
く、好ましくは非多孔質で約200 〜約900 nmの波長の電
磁線を透過する透明な（すなわち、電磁線透過性）材料
であればいずれの適当な材料であってもよい。意図する
検出様式（反射、透過、発光または蛍光分光法）と適合
するように、特定の要素について支持体を選定する必要
がある。有用な支持体材料としてはポリスチレン、ポリ
エステル〔例えばポリ（エチレンテレフタレート）〕、
ポリカーボネート、セルロースエステル（例えば酢酸セ
ルロース）等が挙げられる。
【００４９】レセプター層のためのポリマーバインダー
は、カナダ国特許第1,240,445 号明細書に総括的に記載
されており、本明細書では参考としてこれを特別に援用
する。有用なポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミドのようなＮ−アルキル置換アクリルアミドの重合体
を約30〜97重量％含むポリマーである。他の有用なＮ−
アルキル置換アクリルアミドとして、Ｎ−ｎ−ブチルア
クリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドおよび
Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドが挙げられる。これら
のバインダーの有用性を例証するために、実施例におい
てポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−メタク
リル酸−コ−Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドが
用いられる。
【００５０】このポリマーバインダーは、１分子当たり
少なくとも２個の付加重合性基を有する１または複数の
重合架橋用モノマーを約３〜25重量％更に含んで成る。
これらの架橋用モノマーは当該技術分野では一般に周知
である。好適な架橋用モノマーは、Ｎ−アルキル置換ア
クリルアミドとの重合を促進するためにアクリルアミド
基またはメタクリルアミド基を含有する。
【００５１】有用な架橋用モノマーの例として、次のも
のが挙げられる：Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミ
ド；Ｎ，Ｎ′−メチレンビスメタクリルアミド；エチレ
ンジメタクリレート；２，２−ジメチル−１，３−プロ
ピレンジアクリレート；ジビニルベンゼン；モノ〔２，
３−ビス（メタクリロイルオキシ）プロピルホスフェー
ト；Ｎ，Ｎ′−ビス（メタクリロイル）尿素；トリアリ
ルシアヌレート；アリルアクリレート；アリルメタクリ
レート；Ｎ−アリルメタクリルアミド；４，４′−イソ
プロピリデンジフェニレンジアクリレート；１，３−ブ
チレンジアクリレート；１，４−シクロヘキシレンジメ
チレンジメタクリレート；２，２′−オキシジエチレン
ジメタクリレート；ジビニルオキシメタン；エチレンジ
アクリレート；エチリデンジアクリレート；プロピリデ
ンジメタクリレート；１，６−ジアクリルアミドヘキサ
ン；１，６−ヘキサメチレンジアクリレート；１，６−
ヘキサメチレンジメタクリレート；フェニルエチレンジ
メタクリレート；テトラメチレンジメタクリレート；
２，２，２−トリクロロエチリデンジメタクリレート；
エチレンビス（オキシエチレン）ジアクリレート；エチ
レンビス（オキシエチレン）ジメタクリレート；エチリ
ジントリメタクリレート；プロピリジントリアクリレー
ト；ビニルアリルオキシアセテート；１−ビニルオキシ
−２−アリルオキシエタン；２−クロトノイルオキシエ
チルメタクリレート；ジアリルフタレート；および２−
（５−フェニル−２，４−ペンタジエノイルオキシ）エ
チルメタクリレート。
【００５２】これらのポリマーバインダーは、重合した
親水性モノマーを０〜60重量％含むこともできる。５〜
35重量％の量も有用である。親水性モノマーはカナダ国
特許第1,240,445 号明細書に開示されている。具体的に
は、このようなモノマーはヒドロキシ、ピロリドン、ア
ミン、アミド、カルボキシ、スルホ、カルボン酸塩、ス
ルホン酸塩および硫酸塩の基の中から選ばれた１または
複数の基を有する。一般に、上記塩の基の対イオンはア
ルカリ金属またはアンモニウムである。有用な親水性モ
ノマーはアクリル酸およびメタクリル酸並びにそれらの
塩、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン
酸ナトリウム、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２
−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシプ
ロピルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリ
レートおよびグリセリルメタクリレートである。
【００５３】更に、先に列挙したバインダーは、押出ホ
ッパー塗布工程中の剪断減粘性により達成される非常に
低いバインダー粘性のため、レセプター層の均一塗膜を
形成できるようにする。列挙したバインダーを使うと、
均一塗膜の形成直後にバインダーの粘性が実質的に増加
し、バインダーの乾燥や湿式輸送の間中、安定性と均一
性が維持される「セット層」が得られるという、更なる
利点が得られる。
【００５４】レセプターはまた、8000〜400,000 の範囲
の分子量を有するポリ（ビニルアルコール）、ウシ血清
アルブミン、アラビアゴムおよびＮ−ビニルピロリドン
のホモポリマー；並びにアクリルアミド、メタクリルア
ミド、Ｎ−アルキル置換アクリルアミド、Ｎ−アルキル
置換メタクリルアミド、１−ビニルイミダゾール、２−
アルキル置換−１−ビニルイミダゾール、２−ヒドロキ
シアルキル置換−１−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニル
ピロリドン、ヒドロキシアルキルアクリレート、ヒドロ
キシアルキルメタクリレート、アクリル酸およびメタク
リル酸から成る群より選ばれた二種以上のモノマーを有
する水溶性ビニル付加コポリマー（ここで前記コポリマ
ー中のアルキルおよびヒドロキシアルキルはメチル、エ
チル、プロピルおよびヘキシルのように１〜６個の炭素
原子を含有する）から成る群より選ばれたポリマーバイ
ンダー中に分散させることもできる。
【００５５】本発明の要素は、１または複数の追加の
層、例えば、電子移動剤のような別の必要な添加剤を含
有する、別個のまたは合体させたゼラチン／緩衝剤層お
よび試薬／展開層を含むことができる。
【００５６】該要素のゼラチン／緩衝剤層または試薬層
または展開層は、１もしくは複数の合成または天然バイ
ンダー材料、例えば、ゼラチンまたは別の天然コロイ
ド、ホモポリマーおよびコポリマー、例えばポリ（アク
リルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−
イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド
−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）および類似のコポ
リマー中に分散された１または複数の試薬を含んで成る
指示（検知）組成物を含むことができる。この指示組成
物はレセプター層に分散されてもよい。
【００５７】その他の任意の層、例えば、下塗層、輻射
線遮断層、等を所望であれば含めることもできる。要素
の全ての層は互いに流体接触状態にあり、すなわち、流
体並びに該流体中の試薬と複合体形成してない反応生成
物は、隣接層の重ね合わされた領域間を透過することが
できる。
【００５８】本発明の要素の層は、界面活性剤、増粘
剤、緩衝剤、硬化剤、酸化防止剤、カプラー溶剤および
その他当該技術分野で周知の物質をはじめとする、望ま
しいが任意である種々様々な別の成分を含有することが
できる。これら成分の量の選択も当該分野の技術者の技
術範囲内である。
【００５９】本発明の要素を使用して、生物学的流体
（例えば、全血、血清、血漿、尿、脊髄液、ヒトまたは
動物組織の懸濁液、排泄物、唾液、リンパ液など）のよ
うな液体中の低濃度の免疫学的反応性リガンドを測定す
ることができる。これらのリガンドは約10-15 モル程度
の低濃度で、最も一般的には約10-11 〜約10-4モルの濃
で測定することができる。
【００６０】このように定量的または定性的に測定する
ことができるリガンドとしては、治療薬（例えばフェノ
バルビタール、ジゴキシン、ジギトキシン、テオフィリ
ン、ゲンタマイシン、キニジン、フェニトイン、プロパ
ノロール、カルバマゼピン、トブラマイシン、リドカイ
ン、プロカインアミド等）、天然または合成ステロイド
（例えばコルチゾール、アルドステロン、テストステロ
ン、プロゲステロン、エストリオール等）、ホルモン
（例えば甲状腺ホルモン、ペプチドホルモン、インスリ
ン等）、タンパク質（例えばアルブミン、ＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、フェリチン、血液凝固因子、Ｃ反応性タンパク質、
イソ酵素、ｈＣＧ、アポリポタンパク質等）、抗原、抗
体（モノクローナル抗体を含む）、レセプターと自然に
反応するその他の種が挙げられる。本発明は、ジゴキシ
ン、フェニトイン、カルバマゼピン、テオフィリンまた
はフェノバルビタールのような治療薬、チロキシンまた
はトリヨードチロニンのようなホルモン、並びにｈＣＧ
またはＣ反応性タンパク質のような分析物の測定に特に
有用である。分析はリガンドに結合して標識リガンドを
形成することができる任意の酵素標識を使用して実施す
ることができる。グルコースオキシダーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）、アルカリホスファターゼおよびガラクトシダーゼ
のような酵素が好ましい標識である。
【００６１】特定の標識に適した基質を決めることは臨
床化学分野における当業者の技術範囲内である。基質
は、酵素標識によって直接に作用を受ける物質である
か、或いは該標識の酵素反応を含む一連の反応に関与す
る物質であることができる。例えば、酵素標識がペルオ
キシダーゼである場合、その基質は過酸化水素と適当な
還元剤である。一例としてグルコースオキシダーゼを使
用する時、その基質であるグルコースは、約0.01モル／
ｍ2 、好ましくは約0.001 〜約0.1 モル／ｍ2 となるよ
うに通常は試薬層内に存在するかまたは基質溶液として
添加される。当業者であれば、アッセイに使用する酵素
標識の量に対して特定の基質の量を調整する方法を知っ
ているだろう。
【００６２】試薬層は、酵素標識により触媒される反応
の結果として検出可能な種を提供する１または複数の試
薬を含んで成る指示組成物を含有することができる。こ
の検出可能な種は、発色性のもの、放射性のもの、蛍光
性のもの、または化学発光性のものであることができ
る。当該目的上、酵素標識リガンド類似体と基質との酵
素反応の結果として比色法により検出可能な種を提供す
る比色用指示組成物を使って本発明を説明する。
【００６３】この指示組成物は、酵素反応によって検出
可能な色素を生成する単一化合物であるか、或いは色素
を生成する試薬の組合せであることができる。例えば、
基質としてグルコースを使用し且つ酵素標識としてグル
コースオキシダーゼを使用する場合、比色用指示組成物
は、反応して色素を生成する被酸化性化合物とカプラー
を含むことができる。あるいは、該組成物は、ロイコ色
素とペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼが
グルコースをグルコン酸に転化する時に生じる過酸化水
素の生成の結果として検出可能な色素を生成する別の適
当な過酸化性化合物を含むことができる。有用なロイコ
色素は当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第
4,089,747 号（1978年５月16日、Bruschi に対して発
行）および米国特許第4,670,385 号（1987年６月２日、
Babb他に対して発行）明細書に記載されているものが挙
げられる。比色用指示組成物の特定量およびそれの種々
の成分については当業者であれば適宜選定することがで
きる。
【００６４】標識リガンドは、既知の出発物質と手順を
用いて調製するか、または商業的に入手することができ
る。一般に、リガンドは標識（例えば酵素成分）に共有
結合を通して結合される。
【００６５】イムノアッセイ法は手動であっても自動化
されてもよい。一般に、液体中のリガンドの量は、供給
ロール、チップパケットまたはその他の供給源から本発
明の要素を取り出し、そして該要素の展開層の限定領域
を該液体の試料（例えば１〜200 μＬ）と物理的に接触
させることにより測定される。接触させられる限定領域
の面積は一般に約150 mm2 以下である。
【００６６】リガンドの量は、複合体形成したリガンド
類似体を直接検出するための、または酵素標識と基質と
の酵素反応の結果として形成される検出可能な種を検出
するための、適当な装置に要素を通過させることによっ
て測定される。例えば、一般に知られている手順を用い
て適当な分光光度分析装置を使ってこれらの種を検出す
ることができる。酵素反応においては、得られた生成物
は、例えば検査試料と接触せしめた限定領域中の反射密
度または透過密度の変化率を測定することによって分析
される。測定される領域の直径は約３〜約５mmである。
液体試料中のリガンドの量は、競合アッセイの場合は限
定領域において測定された標識の量に反比例し、サンド
イッチアッセイの場合には正比例する。通常、標識の測
定は基質溶液を適用した後に行われる。
【００６７】１．テルル化ジアリールの合成 ＤＡＴを調製するには多くの合成経路がある。特定の化
合物に対して採用される合成経路は芳香環上の置換基に
大きく依存する。既知の合成経路の幾つかを下記の例で
説明する。他のＤＡＴの合成へのこれらの方法および文
献に記載の別法の推定は当業者に容易に明らかであろ
う。
【００６８】調製１：４，４′−ジ（２−ヒドロキシエ
トキシ）−１，１′−テルロビスベンゼン（Te１） (a) 〔２−（４−ブロモフェノキシ）エトキシ〕（１，
１−ジメチルエチル）ジメチルシラン（１ａ）の調製 150 mLの乾燥ジメチルホルムアミド中の〔２−（４−ブ
ロモフェノキシ）エタノール（10.0 g, 46ミリモル）の
溶液（30mL）にｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（8.
34 g, 55ミリモル）とイミダゾール（7.82 g, 115 ミリ
モル）を加えた。これらの物質を反応フラスコ中へ洗い
移すために追加のジメチルホルムアミド（20mL）を使用
した。得られた溶液をニューマン管を用いて室温で一晩
攪拌した。それを水（200 mL）の中に注ぎ、エーテル
（３×75mL）で抽出した。合わせた抽出液を0.5 N HCl
(200 mL)、飽和NaHCO3 (200 mL) 、水（４×150 mL）お
よび飽和NaCl（200 mL）で洗浄し、MgSO4 上で乾燥し、
そして濾過した。溶媒をロータリーエバポレーター上で
減圧留去して粗生成物（16.5 g；＞100 ％）を得た。 1H
-NMR (CDCl3)：δ 7.34 (2H, d, J=8.9), 6.78 (2H, d,
J=8.9), 4.00-3.93 (4H, m), 0.89 (9H, s), 0.08 (6
H, s)。13C-NMR (CDCl3) ：δ 158.1, 132.2, 116.4, 1
12.8. 69.6, 61.9, 25.9, 18.4 。FDMS (m/e) 330（Ｍ
+ ，79Br）。この粗生成物を精製せずに100 ％として使
用した。
【００６９】(b) ４，４′−ジ（２−ヒドロキシエトキ
シ）−１，１′−テルロビスベンゼン（Te１）の調製 500 mLの三口フラスコをアルゴン雰囲気下に置き、そこ
に冷却器と滴下漏斗を取り付けた。マグネシウム屑（0.
89 g, 37ミリモル）を添加した。臭化物１ａ（12.3 g,
37ミリモル, 100 ％として使用）を乾燥テトラヒドロフ
ラン（ＴＨＦ）（100 mL）中に取り、そして滴下漏斗に
移した。この臭化物溶液約10mL、１，２−ジブロモエタ
ンおよびヨウ素を使ってグリニャール反応を開始させ
た。残りの臭化物溶液を加え、反応液を一晩還流させた
後は、Mgはまったく残存していなかった。加熱マントル
を30分間取り外し、次いでテルル顆粒（4.74 g, 37ミリ
モル）を加え、そして反応液を再び加熱して７時間還流
させた後は、ほぼ全てのテルルが消費されていた。反応
液を室温まで冷却し、次いで激しく攪拌しながら10％水
性NH4Cl (300 mL)中に注ぎ、15分間攪拌した。沈澱した
Ｔｅをセライト（商標）珪藻土を通して濾過することに
より分離し、濾過ケークをエーテルで洗浄した。その濾
液を分液漏斗に移し、エーテルで３回（200 mL, 100 m
L, 100 mL）抽出した。合わせた抽出液を水と飽和NaCl
で洗浄し、MgSO4 上で乾燥し、そして濾過した。溶媒を
減圧留去して赤色油状物として粗生成物（12.4 g）を得
た。それを銅粉末（2.5 g ）と共にトルエン（50mL）中
に取り、ニューマン管を使って2.5時間加熱して還流さ
せると、その時には色が赤から灰色に変わていた。反応
液を室温まで冷却し、セライト珪藻土を通して濾過し、
エーテルで洗浄し、濃縮して琥珀色油状物（12.4 g）を
得た。1H-NMRにより分析すると、それは所望の生成物
と、失活したグリニャール試薬と、残留トルエンとの混
合物であった。この混合物をフッ化カリウム（5.025, 8
6 ミリモル）と共にメタノール（50mL）とＴＨＦ（20m
L）中に取り、そして24時間還流させた。メタノールの
大部分を減圧留去し、残渣をエーテル／酢酸エチルと水
の間に分配させた。水性相を酢酸エチルで更に２回抽出
し、そして一緒にした抽出液を水と飽和NaClで洗浄し、
Na2SO4上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧留去して褐色
固体として粗生成物（8 g ）を得た。エーテル粉砕によ
り白色固体を与え、それを濾過により単離し、エーテル
で洗浄し、風乾して、粗生成物（1.74 g）を得た。それ
をジクロロメタンを用いてフラッシュシリカゲル（20m
L）上に吸着させた。200 mLのフラッシュシリカゲル上
で、ジクロロメタンに続いて95：5 ジクロロメタン：メ
タノールを使って溶離させるフラッシュクロマトグラフ
ィーを注意深く行い（生成物は対応する少量のビアリー
ル化合物の直前に溶出する）、エーテルで粉砕し、そし
て濾過すると、白色固体（1.2 g ）として純物質が得ら
れた。粗生成物のエーテル粉砕で得られたエーテル濾液
を上記と同様なクロマトグラフィーにかけた。エーテル
粉砕とエタノールからの再結晶により、追加の純粋なTe
１（0.2 g ）が得られた。総収量：1.4 g, 19 ％。1H-N
MR (DMSO-d6)：δ 7.52 (4H, d, J=8.5), 6.80 (4H, d,
J=8.5), 4.82 (2H, t, J=5.5), 3.91 (4H, t, J=5.0),
3.65 (4H, app q, J=5.1)。13C-NMR (DMSO-d6) ：δ 1
59.2, 139.8, 116.5, 104.5, 69.9, 59.9 。FDMS (m/e)
404 (Ｍ+ , 130Te ）。
【００７０】調製２：Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（フェニ
ルテルロ）ベンゼンメタンアミン塩酸塩（Te２） (a) Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（フェニルテルロ）ベンゼ
ンメタンアミン（２ａ）の調製 室温でアルゴン雰囲気下においた丸底フラスコに入った
乾燥エーテル（50mL）中のＮ，Ｎ−ジメチルベンゼンメ
タンアミン（2.70 g, 0.020 モル）の溶液に、シリンジ
を使ってn-BuLi（2.5 M, 10 mL, 0.025 モル）を滴下添
加した。反応混合物を室温で５時間攪拌した後、乾燥テ
トラヒドロフラン中のフェニルテルレニルブロミドの溶
液（0.5 Ｍ）をシリンジにより滴下添加した。38 mL
(0.019モル) を添加した後、反応混合物がフェニルテル
レニルブロミドに特徴的なオレンジ色に変わったので、
添加を停止した。その反応混合物をエーテル（100 mL）
上に注ぎ、得られた溶液を飽和NaCl（１×100 mL, ２×
50mL）で洗浄し、MgSO4 上で乾燥し、そして濃縮した。
残渣をアセトン（100 mL）に溶かし、ヨウ素（5.08 g.
0.020 モル）を加えた。得られた溶液を冷却して生成物
を沈澱させた。黄色結晶を濾過して集め、冷アセトンで
洗浄し、乾燥して、２ａのヨウ素付加物（5.95g, 50
％、融点178-179 ℃）を得た。このヨウ素付加物（5.93
g, 0.010 モル）をジメチルホルムアミド（100 mL）に
溶かした。水（100 mL）に溶かした亜硫酸水素ナトリウ
ム（5.2 g, 0.05 モル）の溶液をゆっくり添加し、反応
混合物を室温で１時間攪拌すると、その間に反応混合物
は無色になった。反応混合物を水（500 mL）の上に注
ぎ、次いでエーテル（２×50mL）で洗浄した。水性層を
10％NaOHで塩基性にし、該アミンをエーテル（３×100
mL）中に抽出した。合わせた抽出液を飽和NaClで洗浄
し、MgSO4 上で乾燥し、濃縮した。残渣をメタノールか
ら再結晶すると、白色固体（融点51〜54℃）として純粋
な生成物（3.14 g, 93％）が得られた。1H-NMR (CDC
l3)：δ 7.88 (2H, d, J=6.9), 7.35 (1H, t, J=7.3),
7.26 (2H, t, J=7.3), 7.17 (1H, d, J=7.7), 7.10-7.0
4 (2H, m), 6.94-6.89(1H, m), 3.53 (2H, s), 2.25 (6
H, s) 。
【００７１】(b) Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（フェニルテ
ルロ）ベンゼンメタンアミン塩酸塩（Te２）の調製 水浴中に入れたエーテル（50mL）中の２−（Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアミノメチル）−１−フェニルテルロベンゼン
（1.02 g, 3.0 ミリモル）のスラリーに、塩化水素／エ
ーテル溶液（3.15 mL, 1.0 M, 3.15ミリモル）をシリン
ジにより滴下添加した。濃厚なスラリーをイソプロパノ
ール（20mL）で希釈した後、濾過した。白色固体をエー
テルで洗浄し、風乾すると、生成物（1.13 g, 95％）が
得られた。 1H-NMR (CDCl3)：δ 2.6 (1H, br s), 8.13
(1H, d, J=7.5), 7.80 (1H, d, J=7.7), 7.52-7.48 (3
H, m), 7.26-7.17 (4H, m), 4.44 (2H, d, J=5.8), 2.6
8 (6H, d, J=4.5) 。C15H18ClNTe についての元素分
析，計算値：Ｃ，48.00 ；Ｈ，4.83；Ｎ, 3.73。実測
値：Ｃ，47.97 ；Ｈ，4.87；Ｎ，3.65。
【００７２】調製３：Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（２
−ヒドロキシエチル）−４，４′−テルロビスベンゼン
アミン（Te３） (a) Ｎ，Ｎ−ビス〔２−〔〔（１，１−ジメチルエチ
ル）ジメチルシリル〕オキシ〕エチル〕ベンゼンアミン
（３ａ）の調製 下記の物質を使って１ａについて用いたのと同様の手順
を使用した：２，２′−（フェニルイミノ）ジエタノー
ル（9.0 g, 50 ミリモル）、ｔ−ブチルジメチルシリル
クロリド（18.1 g, 0.12モル）、イミダゾール（17.0
g, 0.25モル）およびジメチルホルムアミド（50mL）。
反応混合物を便宜上一晩攪拌した。１ａと同様に後処理
すると、淡色油状物として３ａが得られた（21.6 g, ＞
100 ％）。 1H-NMR (CDCl3)：δ 7.21 (2H, d, J=8.4),
6.68 (3H, 重複するd,t), 3.77 (4H, d, J=6.6), 3.52
(4H, d, J=6.6), 0.92 (18H, s), 0.06 (12H, s)。13C-
NMR(CDCl3) ：δ 147.8, 129.2, 115.7, 111.4, 60.3,
53.5, 25.9, 18.3, -5.3 。FDMS (m/e) 409 (Ｍ+ ) 。
この油状物を精製せずに100 ％として使用した。
【００７３】(b) Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ〔２−
〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキ
シ〕エチル〕−４，４′−テルロビスベンゼンアミン
（３ｂ）の調製 オーブン乾燥しアルゴン雰囲気下に置いた500 mLの三口
フラスコに塩化テルル（IV）（5.93 g, 22ミリモル）を
入れた。乾燥エーテル（100 mL）をシリンジで加えると
薄黄色のスラリーが生じ、フラスコを水浴中に置いた。
乾燥エーテル（50mL）中の３ａ（18 g, 44ミリモル）の
溶液をアルゴン雰囲気下で調製し、その溶液を激しく攪
拌しながらカニューレにより反応混合物に移した。最初
に非常に濃厚な黄色沈澱が形成するが、それはアニリン
溶液の添加を続けていくうちに薄まった。添加終了後、
緑がかった黄色のスラリーを一晩攪拌した。反応混合物
を濾過し、濾液を減圧下で蒸発させた。生じた黄緑色の
油状物をジクロロメタン（200 mL）中に取り、水（200
mL）中のメタ亜硫酸水素ナトリウム（8.36 g, 44ミリモ
ル）の溶液を攪拌下で添加した。得られた二相混合物を
室温で30分間攪拌した後、セライト珪藻土を通して濾過
した。固体のNaHCO3を添加してpH 9にし、次いで反応混
合物を分液漏斗に移した。ジクロロメタン層を分離し、
水層を追加のジクロロメタンで抽出した。合わせた抽出
液を水／飽和NaCl（200 mL／50mL）に続いて飽和NaClで
洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、濾過し、そして溶媒を減圧
留去した。得られた赤色油状物（21.4 g）をトルエン
（80mL）中に取り、そして銅粉末（4 g ）を添加した。
反応混合物をニューマン管を使って加熱して一晩還流さ
せた。得られた灰色の反応混合物を室温に冷却し、セラ
イト珪藻土を通して濾過し、そして溶媒を減圧留去せし
めた。生じた琥珀色油状物（18ｇ）を３：１のシクロヘ
キサン：ジクロロメタンを使ったフラッシュクロマトグ
ラフィーにより２回精製して、回収した出発物質から生
成物を分離すると、黄色オイルとして純粋な３ｂが得ら
れた（5.0 ｇ，理論量の48％）。1H-NMR (CDCl3)：δ
7.54 (4H, d,J=8.6), 6.53 (4H, d, J=8.5), 3.72 (4H,
t, J=6.4), 3.47 (4H, t, J=6.5), 0.88 (18H, s), 0.
03 (12H, s) 。13C-NMR (CDCl3) ：δ 147.6, 139.7, 1
12.7,98.2, 60.2, 53.4, 25.9, 18.3, -5.3。FDMS (m/
e) 946（Ｍ+ , 130Te ）。
【００７４】(c) Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（２−ヒ
ドロキシエチル）−４，４′−テルロビスベンゼンアミ
ン（Te３）の調製 シリルエーテル３ｂ（2.7 g, 2.86 ミリモル）とフッ化
カリウム（0.66 g, 11.4ミリモル）とメタノール（20m
L）の不均一混合物を加熱して20時間還流させた。白色
スラリーを氷浴中で冷却し、次いで生成物を濾過により
単離し、冷メタノールで洗浄し、そして風乾した（0.80
g, 57％）。分析試料用に少量をメタノールから再結晶
した（融点 169-170℃）。1H-NMR (DMSO-d6)：δ 7.54
(4H, d, J=8.6), 6.53 (4H, d, J=8.5), 3.45 (4H, app
q, J=5.7), 3.33 (4H, t, J=5.9)。13C-NMR (DMSO-d6)
：δ 148.1, 139.8, 113.1, 97.6, 58.4, 53.5。IR (K
Br)：3350, 1585, 1495, 1350 cm -1。FDMS (m/e) 490
（Ｍ+ , 130Te ）。C20H28N2O4Teについての元素分析，
計算値：Ｃ，49.22 ；Ｈ，5.78；Ｎ，5.74。実測値：
Ｃ，48.78 ；Ｈ，5.72；Ｎ，5.66。
【００７５】調製４：２，２′−〔テルロビス（４，１
−フェニレンオキシ）〕ビス酢酸二ナトリウム塩（Te
４） (a) ４−（ブロモフェノキシ）（１，１−ジメチルエチ
ル）ジメチルシラン（４ａ）の調製 乾燥ジメチルホルムアミド（450 mL）中のｐ−ブロモフ
ェノール（104 g, 0.6モル）の溶液に、ｔ−ブチルジメ
チルシリルクロリド（108 g, 0.72 モル）とイミダゾー
ル（102 g, 1.5モル）を添加した。得られた淡黄色溶液
をニューマン管を使って室温で３時間攪拌した。それを
水（1.2 L ）中に注ぎ入れ、エーテル（900 mL, 300 m
L, 300 mL）で３回抽出した。合わせた抽出液を水（150
mL）で４回、1 N HCl (300 mL)、飽和NaHCO3 (300 mL)
および飽和NaCl (300 mL) で１回ずつ洗浄し、MgSO4
上で乾燥し、そして濾過した。溶媒をロータリーエバポ
レーターと次に真空ポンプを使って減圧留去すると、加
水分解した出発物質からのシラノールと６：１の比で、
粗生成物（183 g ；＞100 ％）が得られた。1H-NMR (CD
Cl3)：δ 7.31 (2H, d, J=8.7), 6.71 (2H, d, J=8.7),
0.97 (9H, s), 0.18(6H, s) 。これを精製せずに100
％として使用した。
【００７６】(b) ４，４′−ジ（ｔ−ブチルジメチルシ
リルオキシ）−１，１′−テルロビスベンゼン（４ｂ）
の調製 オーブン乾燥した後にアルゴン雰囲気下に置いた２Ｌの
三口フラスコに、頭上攪拌器と滴下漏斗を取り付けた。
マグネシウム屑（15.2 g, 0.66モル）を添加した。臭化
物４ａ（17.2 g, 0.6 モル、100 ％として使用）を乾燥
ＴＨＦ（600 mL）中に取り、滴下漏斗に移した。臭化物
溶液約25 mL と結晶ヨウ素数粒を用いてグリニャール反
応を開始した。反応液が還流し続けるような速度で残り
の臭化物溶液を添加した。添加終了後、反応混合物を更
に30分間還流させると、その時点でわずかな量のＭｇだ
けが残った。反応液を水浴中で若干冷却し、次いでテル
ル顆粒（76.8 g, 0.6 モル）を加え、反応液を再び加熱
して2.5 時間還流させると、その時にはほとんど全ての
Ｔｅが消費されていた。反応液を室温まで冷却し、次い
で素早く攪拌しながら10％水性NH4Cl (2 L) 上に注ぎ入
れ、30分間攪拌した。沈澱したＴｅをセライト珪藻土を
通して濾過することにより分離し、濾過ケークをエーテ
ルで洗浄した。濾液を分液漏斗に移し、エーテルで３回
（1200 mL, 300 mL, 300 mL ）抽出した。合わせた抽出
液を水と飽和NaClで洗浄し、MgSO4 上で乾燥し、セライ
ト珪藻土を通して濾過して、処理中に沈澱したＴｅとMg
SO4 の両方を除去した。溶媒を減圧留去して赤色油状物
として粗生成物（194 g ）を得た。それを銅粉（38ｇ）
と共にトルエン（900 mL）中に取り出し、ニューマン管
を使って2.5 時間加熱還流せしめると、その間に色が赤
から灰色に変化した。反応混合物を室温に冷却し、セラ
イト珪藻土を通して濾過し、濃縮して琥珀色油状物（18
1 g ）を得た。1H-NMRにより分析すると、それは所望の
生成物と失活したグリニャール試薬と残留トルエンの混
合物であり、４ｂを0.23モル含有すると算出された。４
ｂのヨウ素付加物を経由して精製を行った。粗生成物を
アセトン (0.6 L)に取り、激しく攪拌しながらヨウ素
（58 g, 0.23モル）を分割して添加した。15分後、非常
に濃厚な沈澱が生じた。エタノール (1.2 L)を加え、濾
過と風乾により、橙色固体と暗真珠色の結晶性固体を単
離した。濾液を再濾過して第二の収穫物を得た。合わせ
た収量は206 g であり、ＮＭＲによるとそれは純粋であ
り、唯一の汚染物は残留エタノールであった。1H-NMR
(CDCl3)：δ 7.95 (4H, d, J=8.7), 6.86 (4H, d, J=8.
7), 0.98 (18H, s), 0.25 (12H, s) 。13C-NMR (CDCl3)
：δ 158.6, 138.4, 121.9, 25.5, 18.2, -4.3。
【００７７】このヨウ素付加物をジオキサン（500 m
L）、ジクロロメタン（500 mL）および５％水性NaHSO3
(1.1 L)中に取り、生じた二相系を激しく攪拌した。１
時間後、下（有機）層はまだ赤色であり、還元が不完全
であることを示していた。黄色水性層の大部分をデカン
トして保存し、そして有機層を減圧下で蒸発させた。そ
の残渣にジオキサン（200 mL）、ジクロロメタン（200
mL）および５％水性NaHSO3（400 mL）を加え、混合物を
更に１時間攪拌した。それを減圧下で蒸発させて有機溶
媒を部分的に除去し、残った水性ジオキサンを分液漏斗
に移してエーテルで３回抽出した。一緒にした抽出液を
水、飽和NaHCO3および飽和NaClで洗浄し、MgSO4 上で乾
燥し、そして濾過した。先にデカントしておいた水性層
についても同様に処理し、両者を一緒にした。溶媒を減
圧留去すると、琥珀色油状物として純粋な４ｂ（97.3
g, 60％）が得られた。1H-NMR (CDCl3)：δ 7.54 (4H,
d, J=8.4), 6.80 (4H, d, J=8.4), 0.96 (18H, s), 0.1
7 (12H, s) 。13C-NMR (CDCl3)：δ 155.8, 139.6, 12
1.5, 105.2, 25.7, 18.2, -4.4 。FDMS (m/e) 544
（Ｍ+, 130Te ）。
【００７８】(c) ４，４′−テルロビスフェノール（４
ｃ）の調製 シリルエーテル４ｂ（54.2 g, 0.1 モル）を500 mLの丸
底フラスコの中のメタノール（200 mL）中に取った。フ
ッ化カリウム（11.6 g, 0.2 モル）を添加し、反応混合
物をアルゴン下で1.5 時間加熱して還流させた。反応混
合物を室温に冷却した後、追加のメタノール（20mL）を
使って移し替えを容易にすることにより、激しく攪拌し
ている水（1.2 L)の中に反応混合物を注ぎ入れた。10％
NaOH（約40mL）でpH 14 に調整し、反応混合物をセライ
ト珪藻土を通して濾過した。濾液を分液漏斗に移してジ
クロロメタンで２回洗浄した。水性層を氷浴中に置いた
２Ｌのアーレンマイヤーフラスコに移し、そして25％水
性酢酸を加えてpH 6にすると、クリーム色の沈澱が生成
した。その生成物を濾過により単離し、水で洗浄し、風
乾して粗生成物（29ｇ）を得た。エーテルを用いてそれ
をフラッシュシリカゲル（150 mL）に吸着させた。１Ｌ
のフラッシュシリカゲル上で、ジクロロメタンに続いて
１：４の酢酸エチル：ジクロロメタンを用いて溶離させ
る真空クロマトグラフィーは、純粋な生成物を与えた。
ジクロメタンでの粉砕により、２部分の収穫物において
黄色固体（24 g, 76％）として純粋な４ｃが得られた。
1H-NMR(CDCl3 、５滴のDMSO）：δ 8.77 (2H, s), 7.29
(4H, d, J=8.4), 6.47 (4H,d, J=8.4) 。
【００７９】(d) ４，４′−ジ（エトキシカルボニルメ
トキシ）−１，１′−テルロビスベンゼン（４ｄ）の調
製 頭部攪拌器と滴下漏斗を取り付けたオーブン乾燥済の25
0 mLの三口フラスコをアルゴン雰囲気下に置き、そこに
水素化ナトリウム（60％, 1.76 g, 44ミリモル）を加え
た。それをシクロヘキサンで３回洗浄し、次いで乾燥済
（分子篩で）ジメチルホルムアミド（60mL）を加えた。
フラスコを水浴中に置き、そして乾燥ジメチルホルムア
ミド（15mL）中のビスフェノール４ｃ（6.28 g, 20ミリ
モル）の溶液を滴下漏斗から滴下添加した（激しいＨ2
発生）。生じたスラリーを油浴中で85℃に20分間加熱し
た（更にＨ2 発生）。スラリーを室温まで冷却し、そし
て乾燥ジメチルホルムアミド（5mL ）中のブロモ酢酸エ
チル（6.68 g, 40ミリモル）の溶液を滴下漏斗から滴下
添加すると、その間に沈澱がなくなった。反応混合物を
45分間攪拌した後、激しく攪拌されている水（320 mL）
の中に注いだ。得られた淡褐色沈澱を濾過により単離
し、水で洗浄した。それを水（50mL）とジクロロメタン
（80mL）との間に分配させた。水性相をジクロロメタン
で更に２回抽出し、合わせた抽出液を水、次に飽和NaCl
で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧留
去し、得られた固体をエタノール（50mL）から再結晶
し、冷却し、濾過した。白色固体として生成物が得られ
た（5.3 g, 55 ％、融点88.5〜89℃）。1H-NMR (CDC
l3)：δ 7.60 (4H, d, J=8.5), 6.75 (4H, d, J=8.5),
4.58 (4H, s), 4.25 (4H, q, J=7.1), 1.28 (6H, t, J=
7.1) 。IR (KBr)：1765, 1720,1580, 1480 cm -1。FDMS
(m/e) 488（Ｍ+ , 130Te)。C20H22O6Teについての元素
分析，計算値：Ｃ, 49.43 ；Ｈ, 4.56。実測値：Ｃ, 4
9.36 ；Ｈ, 4.55。
【００８０】(e) ４，４′−ジ（カルボキシメトキシ）
−１，１′−テルロビスベンゼン二ナトリウム塩（Te
４）の調製 ジエステル４ｄ（39.2 g, 81ミリモル）をメタノール
（400 mL）中に取り出し、10％水性NaOH（47 mL, 170ミ
リモル）を加えた。非常に濃厚なスラリーが得られた。
反応混合物を１時間加熱して還流させた。得られたスラ
リーを氷浴中で冷却した。固体を濾過により単離し、エ
タノール洗浄し、風乾し、そして乳鉢と乳棒で磨砕する
と、淡いクリーム色の固体（37.6 g, 98％）としてTe４
が得られた。1H-NMR (DMSO-d6,５滴のD2O)：δ 7.46 (4
H, d, J=8.4), 6.66 (4H, d, J=8.5), 4.06 (4H, s) 。
13C-NMR (D2O) ：δ 176.6, 158.0, 139.8, 115.9, 10
4.8,66.5。IR (KBr)：3540, 3430, 1595, 1490, 1415,
1230 cm -1。C16H12Na2O6Te1.5 H2O についての元素分
析，計算値：Ｃ, 38.37 ；Ｈ, 3.02。実測値：Ｃ, 38.3
3 ；Ｈ, 3.05。
【００８１】調製５．Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（カ
ルボキシメチル）−４，４′−テルロビスベンゼンアミ
ン四ナトリウム塩（Te５） (a) Ｎ−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−Ｎ−フ
ェニルグリシンのエチルエステル（５ａ）の調製 ニューマン管を取り付けたフラスコ内で、アニリン（9.
3 g, 0.1モル）、ブロモ酢酸エチル（36.7 g, 0.22モ
ル）および２，６−ルチジン（23.5 g, 0.22モル）をア
セトニトリル（200 mL）中で１日還流させた。ＴＬＣ
（ジクロロメタン）によると反応は完全であった。反応
混合物を室温に冷却し、エーテル（200 mL）で希釈し
た。沈澱したルチジン塩酸塩を濾過により除去し、その
濾液を減圧下で蒸発させた。残渣をエーテルと水の間に
分配させ、水層をエーテルで更に２回抽出した。合わせ
た抽出液を1N HCl、飽和NaHCO3および飽和NaClで洗浄
し、MgSO4上で乾燥し、そして減圧下で蒸発させ、暗色
液体として粗製の５ａを得た。これをジクロロメタン中
に取り、シリカゲルを通して濾過して脱色して、淡色油
状物として生成物（23.2 g, 88％）を得た。1H-NMR (CD
Cl3)：δ 7.21 (2H, t, J=7.9), 6.77 (1H, t, J=7.3),
6.61 (2H, d, J=8.4), 4.20 (4H, q, J=7.2), 4.13(4
H, s), 1.26 (6H, t, J=7.1)。
【００８２】(b) Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（エトキ
シカルボニルメチル）−４，４′−テルロビスベンゼン
アミン（５ｂ）の調製 オーブン乾燥し、滴下漏斗を取り付けそしてアルゴン雰
囲気下に置いた500 mLの三口フラスコに、塩化テルル
（IV）（11.9 g, 44ミリモル）を添加した。乾燥エーテ
ル（200 mL）をシリンジにより添加すると、薄い黄色ス
ラリーが得られ、フラスコを氷浴中に置いた。乾燥エー
テル（50mL）中の５ａ（23.2 g, 89ミリモル）の溶液を
アルゴン雰囲気下で調製し、その溶液をカニューレによ
り滴下漏斗に移した。それを激しく攪拌しながら反応混
合物に滴下添加した。すぐに濃厚なスラッジが生じ、攪
拌棒が停止した。残りの添加は反応混合物を手動で且つ
渦動攪拌しながら実施した。反応混合物を攪拌せずに一
晩静置しておき、次いでスラッジ全部が塊状固体に変わ
るまで音波処理した。反応混合物を濾過し、濾過ケーク
をエーテルで洗浄した。その濾過ケークをジクロロメタ
ン（200 mL）中に取り、水（200 mL）中のメタ亜硫酸水
素ナトリウム（17.0 g, 89ミリモル）の溶液を攪拌しな
がら添加した。得られた二相混合物を室温で30分間攪拌
した。固体NaHCO3を添加してpH 7に調整し、反応混合物
をセライト珪藻土を通して濾過した。濾液を分液漏斗に
移し、ジクロロメタン層を分離し、水層を追加のジクロ
ロメタンで抽出した。一緒にした抽出液を水と飽和NaCl
で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、次いで溶媒を減圧
留去した。得られた赤色油状物（17.9 g）をトルエン
（100 mL）中に取り、そこに銅粉（９ｇ）を添加した。
反応混合物をニューマン管を使って２時間加熱還流させ
た。生じた灰色の反応混合物を室温に冷却し、セライト
珪藻土を通して濾過し、そして溶媒を減圧留去した。粗
生成物（18 g, 琥珀色油状物）を、ジクロロメタンに続
いて98:2のジクロロメタン：メタノールを用いたフラッ
シュクロマトグラフィーにより２回精製して、回収され
た出発物質から生成物を分離すると、淡い橙色の粘稠油
状物（7.36 g, 理論量の50％）として純粋な５ｂが得ら
れた。1H-NMR (CDCl3)：δ 7.52 (4H, d, J=8.6), 6.43
(4H, d,J=8.7), 4.19 (8H, q, J=7.1), 4.08 (8H, s),
1.25 (12H, t, J=7.1)。13C-NMR (CDCl3) ：δ 170.7,
147.6, 139.5, 113.6, 101.3, 61.2, 53.3, 14.2。IR
(塩プレート法) ：1730, 1580, 1490, 1180 cm -1。FDM
S (m/e) 658 (Ｍ+ , 130Te ）。
【００８３】(c) Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（カルボ
キシメチル）−４，４′−テルロビスベンゼンアミン四
ナトリウム塩（Te５）の調製 ジエステル５ｂ（4.35 g, 6.63ミリモル）をメタノール
（60mL）中に取り、10％水性NaOH（7.4 mL, 26.5ミリモ
ル）を添加した。反応混合物を加熱して１時間還流させ
た。得られたスラリーを氷浴中で冷却した後、濾過し
た。固体を冷メタノールで洗浄し、風乾すると、淡いク
リーム色の固体（3.81 g, 91％）としてＴｅ５が得られ
た。1H-NMR (D2O)：δ 7.56 (4H, d, J=8.6), 6.38 (4
H, d, J=8.6), 3.83 (8H, s) 。13C-NMR (D2O) ：δ 17
9.4, 148.7, 139.6, 113.0, 98.3, 55.5 。IR (KBr)：3
250 (br), 1575, 1405, 1210 cm-1。 C20H16Na4N2O8Te
・3 H2O についての元素分析，計算値：Ｃ, 35.02 ；
Ｈ, 3.23；Ｎ, 4.08。実測値：Ｃ, 34.82 ；Ｈ, 3.03；
Ｎ, 4.04。
【００８４】
【実施例】下記の実施例は本発明の例示であって排他で
はない。実施例１ 下記の塗膜を細長く切ってスライドとして取り付けた。
スライドを入れたカートリッジを卓上にのせ、実験室の
照明をつけたまま16〜20時間置いておくことにより準備
した。卓上インキュベーションの翌日に、原型の自動乾
燥塗膜イムノアッセイ分析装置を用いてスライドを試験
した。10,000ｍIU／mLのｈＣＧを含有するヒト血清基質
溶液11μL を各スライド上に適用した。次いで各スライ
ドを37℃で５分間インキュベートし、その後、Na2HPO4
(10 mM, pH 6.8) 、４′−ヒドロキシアセトアニリド
（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（0.1
％）、H2O2（8 mM）およびジエチレントリアミン五酢酸
（DTPA）（10mM）を含有する洗浄液12μL を各スライド
に適用した。この洗浄液は、未結合の西洋ワサビペルオ
キシダーゼ標識リガンドまたはレセプターを読取り領域
から洗い流し（除去し）、且つＨＲＰが触媒する色素生
成反応を開始させる働きをする。洗浄液を加えた後、各
スライドを37℃での第二のインキュベーションにかけ、
その間に、670 nmの波長において３秒間隔で反射濃度の
読みを行った。反射濃度の読みから、各塗膜より調製し
たスライドについての色素生成速度（発色速度）を算出
した。
【００８５】血清試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
（ｈＣＧ) のアッセイ用に、次の粗製の乾燥塗膜をポリ
（エチレンテレフタレート）支持体の上に製作した。全
ての塗膜構造に用いる用語は表１にまとめて記載してあ
る。
【００８６】塗膜１ 層 材料 乾燥塗布量(g/m2) ビーズ展開層 TES 緩衝剤，pH 7 0.219 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 ジメドン 0.45 接着剤ポリマー 2.58 ポリマービーズ 130.0 BSA 1.0 グリセロール 2.0 マンニトール 1.0 標識 34e-6 レセプター層 TES 緩衝剤，pH 7.0 0.10 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.8 ロイコ色素 0.2 抗体ビーズ 0.1 TETRONIC T908 0.02 OLIN 10G 0.01 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤，pH 7.0 4.580 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 BSVME 0.15
【００８７】塗膜２ 層 材料 乾燥塗布量(g/m2) ビーズ展開層 TES 緩衝剤，pH 7.0 0.219 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 ジメドン 0.45 接着剤ポリマー 2.58 ポリマービーズ 130 BSA 1.0 グリセロール 2 マンニトール 1.0 標識 34e-6 VOSO4 0.04 レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.1 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.8 ロイコ色素 0.2 抗体ビーズ 0.1 TETRONIC T908 0.02 OLIN 10G 0.01 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤, pH 7.0 4.58 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.02 BSVME 0.15
【００８８】塗膜３ 層 材料 乾燥塗布量(g/m2) ビーズ展開層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.219 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 ジメドン 0.45 接着剤ポリマー 2.58 ポリマービーズ 130.0 BSA 1.0 マンニトール 1.0 標識 34e-6 Te１ 0.04 レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.1 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.8 ロイコ色素 0.2 抗体ビーズ 0.1 TETRONIC T908 0.02 OLIN 10G 0.01 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤, pH 7.0 4.58 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.02 BSVME 0.15
【００８９】塗膜４ 層 材料 乾燥塗布量(g/m2) ビーズ展開層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.219 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 ジメドン 0.45 接着剤ポリマー 2.58 ポリマービーズ 130 BSA 1.0 グリセロール 2.0 マンニトール 1.0 標識 34e-6 Te３ 0.012 レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.1 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.8 ロイコ色素 0.2 抗体ビーズ 0.1 TETRONIC T908 0.02 OLIN 10G 0.01 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤, pH 7.0 4.58 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.02 BSVME 0.15
【００９０】塗膜５ 層 材料 乾燥塗布量(g/m2) ビーズ展開層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.219 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 ジメドン 0.45 接着剤ポリマー 2.58 ポリマービーズ 130 BSA 1.0 グリセロール 2.0 マンニトール 1.0 標識 34e-6 VOSO4 0.04 Te１ 0.04 レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.10 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.8 ロイコ色素 0.2 抗体ビーズ 0.1 TETRONIC T908 0.02 OLIN 10G 0.01 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝液, pH 7.0 4.58 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.02 BSVME 0.15
【００９１】塗膜６ 層 材料 乾燥塗布量(g/m2) ビーズ展開層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.219 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 ジメドン 0.45 接着剤ポリマー 2.58 ポリマービーズ 130 BSA 1.0 グリセロール 2 マンニトール 1.0 標識 34e-6 VOSO4 0.04 Te３ 0.012 レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.1 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.8 ロイコ色素 0.2 抗体ビーズ 0.1 TETRONIC T908 0.02 OLIN 10G 0.01 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤, pH 7.0 4.58 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.02 BSVME 0.15
【００９２】塗膜１〜６のカートリッジスライドの比較 最上部スライド 非最上部スライド 最上部スライド塗膜 の速度（n=3) の速度(n=15) の速度低下％ １ 0.186 Dt/分 0.231 Dt/分 -19.48％ ２ 0.316 Dt/分 0.317 Dt/分 -0.32 ％ ３ 0.305 Dt/分 0.318 Dt/分 -4.09 ％ ４ 0.202 Dt/分 0.211 Dt/分 -4.27 ％ ５ 0.292 Dt/分 0.295 Dt/分 -1.02 ％ ６ 0.211 Dt/分 0.212 Dt/分 -0.47 ％
【００９３】このカートリッジスライドの比較は、塗膜
中にVOSO4 またはＤＡＴ化合物のいずれも含まれていな
いと、カートリッジ中の第一スライドの速度低下率が大
きいことを明確に示している。この第一スライドにおけ
る発色速度の低下は、検査を行う試料について不正確な
分析物濃度予測を引き起こすことになる。VOSO4 （塗膜
２）、ＤＡＴ化合物（塗膜３および４）またはVOSO4 と
ＤＡＴ化合物の組合せ（塗膜５および６）を包含させる
と、最上部スライドにおいて保持される速度パーセント
が著しく改良される。
【００９４】実施例２ 調査したＤＡＴ化合物の効果をさらに区別化するため、
各塗膜からのスライドを卓上に直接表を上にして置き、
カートリッジに保持されたスライドと同じ条件に暴露し
た（蛍光灯をつけたまま室温で16〜20時間のインキュベ
ーション）。インキュベーション期間後、上述したもの
と同じ材料およびプロトコールを使用した原型自動乾燥
塗膜イムノアッセイ分析装置上でスライドを試験した。
予想される結果は、スライドの環境因子（光、空気な
ど）に対する暴露が増加したことによる発色速度のより
大幅な低下である。環境への暴露が増加したことによる
影響を観察する方法として、卓上スライドの発色速度と
各条件についてのカートリッジ内スライド（最上部スラ
イドを除く）の発色速度とを比較した。上記のように処
理したスライドの結果は以下の通りであった。
【００９５】塗膜１〜６のカートリッジスライドの比較 卓上 カートリッジ 卓上 スライド スライド スライド塗膜 の速度（n=10) の速度(n=15) の速度低下％ １ 0.161 Dt/分 0.231 Dt/分 -30.3％ ２ 0.288 Dt/分 0.317 Dt/分 -9.15％ ３ 0.293 Dt/分 0.318 Dt/分 -7.86％ ４ 0.179 Dt/分 0.211 Dt/分 -15.17 ％ ５ 0.291 Dt/分 0.295 Dt/分 -1.36％ ６ 0.198 Dt/分 0.212 Dt/分 -6.6 ％
【００９６】この卓上スライド試験は、VOSO4 （塗膜
２）、ＤＡＴ化合物（塗膜３および４）またはVOSO4 と
ＤＡＴ化合物の組合せ（塗膜５および６）を塗膜に含め
ると、環境への暴露による速度低下に対する保護を提供
することを示している。この試験はまた、同じ塗膜中に
VOSO4 とTe１を混在させると（塗膜５）協同作用が生じ
ることも示している。この結果、いずれかの化合物を単
独で含めた時（塗膜２と３）よりも速度低下％が小さ
い。ＤＡＴ化合物であるTe１〜Te５を、ＨＲＰ活性の低
下を強調するようにデザインしたモデル系において評価
した。この系において、ＤＡＴ化合物Te１，Te４および
Te５は、次の実施例に示す通り、単独でまたはバナジル
塩と協同してＨＲＰ活性を保護した。
【００９７】実施例３〜５ ポリ（エチレンテレフタレート）支持体上に下記組成の
分析要素を調製した。 層 材料 乾燥塗布量(g/m2) ビーズ展開層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.219 接着剤ポリマー 2.58 ポリマービーズ（20〜40mM） 130.0 レセプター層 ポリマーバインダーＩ 0.60 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.10 TX-100 0.02 ゲル ゼラチン 10.0 TES 緩衝剤, pH 7.0 4.58 TX-100 0.020 BVSME 0.150
【００９８】この分析要素を使用して、下記のプロトコ
ールでＨＲＰ安定性を測定した。様々な量の本発明のテ
ルル化ジアリール化合物の１つと約３×10-8ＭのＨＲＰ
を含有する10 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.0の10
μＬ試料を、上記の塗布要素の別々の１cm2 片の上に各
々スポットした（各化合物についておよび各濃度におい
て４試料）。これらの要素を乾燥し、そして暗い引き出
しの中に入れた。30分後と24時間後（すなわち、翌日）
に、要素を引き出しから再び取り出して、各要素を試験
管に入った10 mM リン酸ナトリウム緩衝剤、0.15 M塩化
ナトリウム、0.1 ％ウシ血清アルブミンの溶液（pH 7.
0）１mLの中に浸漬することによりＨＲＰを抽出した。
試験管を１分間渦動攪拌した後〔ポリ（エチレンテレフ
タレート）支持体から分析要素成分を分離させる〕、得
られた懸濁液を遠心分離し、溶液を取り出した。100 μ
L アリコートを分光光度計のキュベットに入れ、そして
そこに試薬溶液を添加して50 mM リン酸カリウム緩衝剤
（pH 7.0）、 5 mM ４′−ヒドロキシアセトアニリド、
0.625 ％ Triton X-100 界面活性剤、0.005 ％４，５−
ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒド
ロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ色
素および0.85 mM 過酸化水素の最終溶液１mLを提供する
ことにより、溶液中の活性ＨＲＰの量を測定した。アッ
セイ温度は30℃であった。青色が生じ、その発色速度を
655 nmにおいて分光光度測定した。この発色速度は、抽
出液中の活性酵素の量に正比例した。
【００９９】各試料について24時間目に抽出された活性
を30分目に抽出された活性で割ることにより計算した
「活性比」としてデータを表わした。活性比１は、酵素
が24時間に渡って添加剤により完全に保護されたことを
示す。実験間でデータのばらつきが多少観察されたが、
これは恐らく環境湿度と環境温度が日ごとに異なるため
に生じたのだろう。これは、ＨＲＰがどの位速く塗膜上
で乾燥定着（dry down）するかに影響を与え、引いては
酵素の見かけ安定性に影響を与える可能性がある。従っ
て、データは実施例３〜５の実施例内では比較可能であ
るが、いずれか２つの実施例間で比較することはできな
い。
【０１００】実施例３ １mMでのTe１，Te２，Te３およびTe４の効果を、単独で
または１mM VOSO4の存在下で比較した（図１）。化合物
Te１とTe４は、モデル乾燥定着方式において添加剤を含
まないものに比較してＨＲＰ活性を保護した。化合物Te
２とTe３は、この方式において有効な安定剤でなかっ
た。VOSO4 とTe１かTe4 の両者が含まれる場合には、い
ずれか一方が単独で存在する場合よりも多くのＨＲＰ活
性が保持された。実施例４ ＨＲＰを安定化するTe１およびTe４の能力に対する濃度
の効果を示す（図２）。ＨＲＰ溶液において、1 mM, 0.
1 mMまたは0.01 mM Te１および10 mM,１mMまたは0.1 mM
Te４の濃度を使用した。その上、緩衝剤のみを含有す
るＨＲＰ溶液または１mM VOSO4を含有するＨＲＰ溶液を
スポットした。Te１とTe４の両方とも、活性低下は試薬
濃度に依存した。10 mM Te４の存在下では、24時間のイ
ンキュベーション後でもＨＲＰ活性が十分に保護され
た。
【０１０１】実施例５ この実施例は、抗ＣＲＰ−ＨＲＰ酵素接合体（2.85×10
-8Ｍ）の安定性に対するTe４およびTe５の効果を示す。
スポット液には、緩衝液のみ、1 mM, 2 mM, 4mMまたは
8 mM Te４；または1 mMもしくは 8 mM Te５が存在し
た。Te４またはTe５のいずれも接合型ＨＲＰの活性を保
護し、この保護は濃度依存性であった（図３）。実施例６ 下記塗膜構造７〜10に示されるように塗膜７〜10を調製
し、スライドとして取り付け、約21℃（70°Ｆ）／33％
ＲＨで２日間に渡りコンディショニングし、そして凍結
させた。
【０１０２】塗膜７ 血清試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）アッセイ用
の下記組成の乾燥塗膜をポリ（エチレンテレフタレー
ト）支持体上に調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.219 ジメドン 0.450 CaCl2 1.0 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 グリセロール 2 ウシ血清アルブミン 0.5 マゼンタ色素 0.0538 接着剤ポリマー 2.538 ポリマービーズ 130 レセプター層 TES 緩衝剤 0.1 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.8 ロイコ色素 0.2 ＰＣビーズ 0.3 抗ＣＲＰ抗体 0.05 抗ＣＲＰ抗体−ＨＲＰ接合体 0.0005 TETRONIC T908 0.02 OLIN 10G 0.01 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤, pH 7.0 4.580 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 BSVME 0.15
【０１０３】塗膜８ 血清試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）アッセイ用
の下記組成の乾燥塗膜をポリ（エチレンテレフタレー
ト）支持体上に調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.219 ジメドン 0.450 CaCl2 1.0 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 グリセロール 2 ウシ血清アルブミン 0.5 マゼンタ色素 0.0538 接着剤ポリマー 2.538 ポリマービーズ 130 Te１ 0.08 レセプター層 TES 緩衝剤 0.1 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.8 ロイコ色素 0.2 ＰＣビーズ 0.3 抗ＣＲＰ抗体 0.05 抗ＣＲＰ抗体−ＨＲＰ接合体 0.0005 TETRONIC T908 0.02 OLIN 10G 0.01 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤, pH 7.0 4.580 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 BSVME 0.15
【０１０４】塗膜９ 血清試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）アッセイ用
の下記組成の乾燥塗膜をポリ（エチレンテレフタレー
ト）支持体の上に調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.219 ジメドン 0.450 CaCl2 1.0 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 グリセロール 2 ウシ血清アルブミン 0.5 マゼンタ色素 0.0538 接着剤ポリマー 2.538 ポリマービーズ 130 Te２ 0.075 レセプター層 TES 緩衝剤 0.1 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.8 ロイコ色素 0.2 ＰＣビーズ 0.3 抗ＣＲＰ抗体 0.05 抗ＣＲＰ抗体−ＨＲＰ接合体 0.0005 Tetronic T908 0.02 Olin 10G 0.01 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 pH 7.0 4.580 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 BSVME 0.15
【０１０５】塗膜10 血清試料中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）アッセイ用
の下記組成の乾燥塗膜をポリ（エチレンテレフタレー
ト）支持体上に調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.219 ジメドン 0.450 CaCl2 1.0 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 グリセロール 2 ウシ血清アルブミン 0.5 マゼンタ色素 0.0538 接着剤ポリマー 2.538 ポリマービーズ 130 VOSO4 0.04 レセプター層 TES 緩衝剤 0.1 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.8 ロイコ色素 0.2 ＰＣビーズ 0.3 抗ＣＲＰ抗体 0.05 抗ＣＲＰ抗体−ＨＲＰ接合体 0.0005 Tetronic T908 0.02 Olin 10G 0.01 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 pH 7.0 4.580 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 BSVME 0.15
【０１０６】カートリッジを解凍してE250分析装置に装
填した。各スライドに、約20 mg/L のＣＲＰを含有する
ヒト血清試料11μL を適用した。次いで各スライドを37
℃で５分間インキュベートした後、Na2HPO4 (10 mM, pH
6.8) 、４′−ヒドロキシアセトアニリド（5 mM）、ヘ
キサデシルピリジニウムクロリド（0.1 ％）、H2O2（8
mM）およびDTPA (10μM)を含む洗浄液12μL を各スライ
ドに適用して、未結合の抗体−ＨＲＰ接合体を読取り領
域から洗い流し、ＨＲＰが触媒する色素生成反応を開始
させた。37℃での2.5 分間のインキュベーション後、67
0 nmにおける反射濃度を測定し、それを検量線によって
ＣＲＰ濃度に変換した。
【０１０７】最上部スライドの推定濃度を、その下の６
枚のスライドの平均推定濃度と比較した。この方法での
幾つかの実験の結果を下記に示す。 偏り＝最上部スライドの推定値−スライド２〜７の平均
推定値
【０１０８】 実験１ 実験２ 実験３塗膜 剤 １カート ２カートの平均 １カート ７ 無 -29.9 -27.5 -34.3 ８ Te１ -6.0 -6.1 -7.2 ９ Te２ -23.2 -19.3 -21.8 10 VOSO4 -13.3 -16.2 -20.6
【０１０９】これらの結果は、どの保護剤も存在しない
場合、最上部スライドはその下のスライドよりも実質的
に小さい推定値を有することを示す。Te１，Te２または
VOSO 4 のいずれかの添加は、最上部スライドとその下の
スライドとの間の偏りを減少させる。Te１により最大の
改善が得られる。
【０１１０】実施例７ 塗膜７〜10を細く切り、スライドとして取り付け、約21
℃（70°Ｆ）／33％ＲＨで２日間コンディショニング
し、そして冷凍した。カートリッジを解凍した。各カー
トリッジの最上部スライドを取り出し、カートリッジを
約21℃（70°Ｆ）／33％ＲＨで３日間インキュベートし
た。これらのスライドを、実施例６に記載した通りに、
約20 mg/L のＣＲＰを含有するヒト血清を用いて試験し
た。約21℃（70°Ｆ）／33％ＲＨに３日間暴露した最上
部スライドの推定値を、スライド２〜７の平均推定値と
比較した。その結果を以下に示す。 偏り＝最上部スライドの推定値−スライド２〜７の平均
推定値
【０１１１】塗膜 剤 ２カートの平均 ７ 無 -26.4 ８ Te１ -4.5 ９ Te２ -8.2 10 VOSO4 -5.6
【０１１２】これらの結果は、新たに暴露された最上部
スライドが３日間に渡り変化し、保護剤の不在下ではそ
の下のスライドよりも実質的に低い推定値を生じること
を示す。テルル化ジアリールTe１およびTe２並びにVOSO
4 はスライドを保護し、同一カートリッジ内の下部スラ
イドと比較した偏りを小さくする。同様に、Te１が最大
の改良を示す。
【０１１３】実施例８ 塗膜７〜10を細く切り、スライドとして取り付け、約21
℃（70°Ｆ）／33％ＲＨで２日間コンディショニング
し、そして冷凍した。カートリッジを解凍し、そして約
21℃（70°Ｆ）／33％ＲＨで７日間インキュベートし
た。インキュベート後のカートリッジと解凍したてのカ
ートリッジを、実施例６に記載した通りに、約10〜30 m
g/L の範囲のＣＲＰを含有する３つのヒト血清試料を使
って分析した。インキュベート後のスライドの推定値
を、解凍したてのスライドの推定値と比較した。３つの
液体試料について、解凍したてのスライドに対するイン
キュベート後のスライドの平均偏りを測定し、これを以
下に示す。
【０１１４】塗膜 剤 平均偏り ７ 無 -7.8 ８ Te１ 0.8 ９ Te２ -2.62 10 VOSO4 -0.26
【０１１５】これらの結果は、保護剤の不在下では、約
21℃（70°Ｆ）／33％ＲＨに７日間暴露したスライド
は、解凍したてのスライドに対して偏りを生じることを
示している。Te１もしくはTe２またはVOSO4 のいずれか
の存在下では、この暴露から生じる偏りが実質的に減少
する。
【０１１６】下記の例は、ＤＡＴをグラビア層に塗布し
た時に、ＤＡＴを使用しなかった時または別の層に塗布
した時に比べて、優れた意外な結果が得られたことを証
明する。
【０１１７】実施例９ Te５を次の方法でＣＲＢＭアッセイにおいて評価した。
塗膜１（Te５無し） 下記に示す組成および層構造を有する、血清試料中のカ
ルバマゼピン（ＣＲＢＭ）アッセイ用の乾燥塗膜を調製
した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS 0.0045 BSA 0.000215 A-100 0.00108 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.00995 マゼンタ色素 0.05380 TX-100 0.0043 カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ＣＲＢＭ−ＨＲＰ標識 0.000012 ビーズ展開層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.219 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.220 ジメドン 0.450 接着剤ポリマー 2.583 ポリマービーズ 130.00 BSA 1.00 グリセロール 2.00 マンニトール 1.00 硫酸バナジル（＝オキシ硫酸バナジウム）二水和物 0.04 レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.10 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.50 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.02 Olin 10G 0.01 抗体ビーズ 0.20 ゲル ゼラチン 10.00 TES 緩衝剤, pH 7.0 4.580 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.02 BVSME 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１１８】実施例10 塗膜２ 下記に示す組成および層構造を有し、１mMの最終再水和
濃度で展開層に塗布されたTe５を含んで成る、カルバマ
ゼピン（ＣＲＢＭ）アッセイ用の乾燥塗膜を調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS 0.0045 BSA 0.000215 A-100 0.00108 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.00995 マゼンタ色素 0.05380 TX-100 0.0043 カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ＣＲＢＭ−ＨＲＰ標識 0.000012 ビーズ展開層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.219 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.220 ジメドン 0.450 接着剤ポリマー 2.583 ポリマービーズ 130.00 BSA 1.00 グリセロール 2.00 マンニトール 1.00 硫酸バナジル二水和物 0.04 Te５ 0.0632 レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.10 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.50 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.02 Olin 10G 0.01 抗体ビーズ 0.20 ゲル ゼラチン 10.00 TES 緩衝剤, pH 7.0 4.580 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.02 BVSME 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１１９】実施例11 塗膜３、1 mM Te5（グラビア層） 下記に示す組成および層構造を有し、１mMの最終再水和
濃度でグラビア層に塗布されたTe５を含んで成る、カル
バマゼピン（ＣＲＢＭ）アッセイ用の乾燥塗膜を調製し
た。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS 0.0045 BSA 0.000215 A-100 0.00108 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.00995 マゼンタ色素 0.05380 TX-100 0.0043 カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ＣＲＢＭ−ＨＲＰ標識 0.000012 Te５ 0.0632 ビーズ展開層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.219 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.220 ジメドン 0.450 接着剤ポリマー 2.583 ポリマービーズ 130.00 BSA 1.00 グリセロール 2.00 マンニトール 1.00 硫酸バナジル二水和物 0.04 レセプター層 TES 緩衝剤, pH 7.0 0.10 TX-100 0.02 ポリマーバインダー 0.50 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.02 Olin 10G 0.01 抗体ビーズ 0.20 ゲル ゼラチン 10.00 TES 緩衝剤, pH 7.0 4.580 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.02 BVSME 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１２０】実施例12 塗膜１〜３を細く切り、スライドとして取り付けた。こ
のスライドを含むカートリッジを塗布後２週間目に速度
応答について試験し、次いでフリーザー中−18℃で１年
間保存した。フリーザー保存の１年後、カートリッジを
速度応答と第一バイアスの偏りについて試験した。VITR
OS E250 ANALYZER上でスライドを試験した。8.8 μg/mL
のＣＲＢＭを含むヒト血清基質溶液11μL を３つのカー
トリッジからの第一（最上部）スライドと、同じカート
リッジからの２〜７番目のスライドにも適用した。各ス
ライドを37℃で５分間インキュベートした後、Na2HPO4
(10 mM, pH 6.8) 、４′−ヒドロキシアセトアニリド
（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（0.1
％）、H2O2（8 mM）およびDTPA (10μM)を含む洗浄液12
μL を各スライドに適用した。この洗浄液は未結合の薬
剤−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識を読取り領域から
洗い流し（または除去し）、ＨＲＰが触媒する色素生成
反応を開始させる働きをする。洗浄液の添加後、各スラ
イドを37℃で再びインキュベートし、その間に３秒間隔
で2.5 分間に渡り670 nmの波長で反射濃度の読みを行っ
た。その反射率測定値をClapper-William 変換を使って
透過率（Dt）に変換し、そして色素生成速度（発色速
度）を計算した。その結果を下記に示す。
【０１２１】 最上部スライド 非最上部スライド 最上部スライド塗膜 カートリッジ の速度 (n=1) の速度 (n=6) の速度低下％ １ １ 0.05199 Dt／分 0.05682 Dt／分 8.50 １ ２ 0.05243 Dt／分 0.05738 Dt／分 8.63 １ ３ 0.05183 Dt／分 0.05687 Dt／分 8.86 ２ １ 0.05500 Dt／分 0.05975 Dt／分 7.95 ２ ２ 0.05406 Dt／分 0.05973 Dt／分 9.49 ２ ３ 0.05470 Dt／分 0.05924 Dt／分 7.66 ３ １ 0.05968 Dt／分 0.05927 Dt／分 -0.69 ３ ２ 0.05918 Dt／分 0.05894 Dt／分 -0.41 ３ ３ 0.06020 Dt／分 0.05948 Dt／分 -1.21
【０１２２】塗膜比較実験は、Te５が塗膜に存在しない
かまたは１mMの再水和濃度でビーズ展開層中に置かれた
時に、カートリッジ中の第一スライドに大きな速度低下
が起こったことを明らかに示す。この第一スライドにお
ける色素生成の速度低下は、試験しようとする試料につ
いて正しくない分析物濃度推定値を与えるだろう。１mM
の再水和濃度でのグラビア層へのTe５の包含は、フリー
ザー保存１年後に第一スライドに保持される速度パーセ
ントに著しい改善をもたらす。
【０１２３】実施例13 フェノバルビタール乾燥塗膜要素のグラビア層中におい
てTe５を評価した。塗膜４（Te５なし） 下記に示す組成および層構造を有する、ＰＨＢＲアッセ
イ用の乾燥塗膜を調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS緩衝剤 0.0045 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.01 マゼンタ色素 0.16 水酸化ナトリウム，１Ｎ (17 g/kgバッチ) BSA 0.00022 A-100 0.00108 TX-100 0.00430 硫酸，２Ｎ 5.3 g/kg バッチ カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ＰＨＢＲ−ＨＲＰ標識 0.00001 ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.22 水酸化ナトリウム，10Ｎ 0.58 ジメドン 0.50 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 硫酸バナジル二水和物 0.040 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 ウシ血清アルブミン 1.0 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.02 Olin 10G 0.25 ポリマービーズ 130 接着剤ポリマー 2.6 レセプター層 TES 緩衝剤 0.10 水酸化ナトリウム，１Ｎ 0.12 TX-100 0.020 ポリマーバインダー 0.80 抗体ビーズ 0.20 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 4.6 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.020 水酸化ナトリウム，10Ｎ 1.18 架橋剤 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１２４】実施例14 塗膜５（グラビア層中0.25 mM Te５） 下記に示す組成および層構造を有し、0.25 mM の最終再
水和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成
る、ＰＨＢＲアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。 層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS緩衝剤 0.0045 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.010 マゼンタ色素 0.16 水酸化ナトリウム，１Ｎ (17 g/kgバッチ) BSA 0.00022 A-100 0.00108 TX-100 0.00430 硫酸，２Ｎ 5.3 g/kg バッチ カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ＰＨＢＲ−ＨＲＰ標識 0.000010 Te５ 0.016 ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.22 水酸化ナトリウム，10Ｎ 0.58 ジメドン 0.50 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 硫酸バナジル二水和物 0.040 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 ウシ血清アルブミン 1.0 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.02 Olin 10G 0.25 ポリマービーズ 130 接着剤ポリマー 2.6 レセプター層 TES 緩衝剤 0.10 水酸化ナトリウム，１Ｎ 0.12 TX-100 0.020 ポリマーバインダー 0.80 抗体ビーズ 0.20 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 4.6 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.020 水酸化ナトリウム，10Ｎ 1.18 架橋剤 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１２５】実施例15 塗膜６（グラビア層中 0.5 mM Te５） 下記に示す組成および層構造を有し、0.5 mMの最終再水
和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成る、
ＰＨＢＲアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS緩衝剤 0.0045 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.010 マゼンタ色素 0.16 水酸化ナトリウム，１Ｎ (17 g/kgバッチ) BSA 0.00022 A-100 0.00108 TX-100 0.00430 硫酸，２Ｎ 5.3 g/kg バッチ カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ＰＨＢＲ−ＨＲＰ標識 0.000010 Te５ 0.032 ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.22 水酸化ナトリウム，10Ｎ 0.58 ジメドン 0.50 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 硫酸バナジル二水和物 0.040 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 ウシ血清アルブミン 1.0 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.02 Olin 10G 0.25 ポリマービーズ 130 接着剤ポリマー 2.6 レセプター層 TES 緩衝剤 0.10 水酸化ナトリウム，１Ｎ 0.12 TX-100 0.020 ポリマーバインダー 0.80 抗体ビーズ 0.20 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 4.6 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.020 水酸化ナトリウム，10Ｎ 1.18 架橋剤 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１２６】実施例16 比較実験２ 塗膜４〜６を細く切り、スライドとして取り付けた。こ
のスライドを含むカートリッジをフリーザー中−18℃で
保存した。６か月および９か月間凍結保存した後、カー
トリッジを速度応答と第一バイアスの偏りについて試験
した。Vitros 250分析装置上でスライドを試験した。約
27μg/mLのフェノバルビタールを含むヒト血清基質溶液
11 μL を３つのカートリッジからの第一（最上部）ス
ライドと、同じカートリッジからの２〜７番目のスライ
ドにも適用した。各スライドを37℃で５分間インキュベ
ートした後、Na2HPO4 (10 mM, pH 6.8) 、４′−ヒドロ
キシアセトアニリド（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウ
ムクロリド（0.1 ％）、H2O2（8 mM）およびDTPA (10μ
M)を含む洗浄液 12 μL を各スライドに適用した。この
洗浄液は未結合の薬剤−西洋ワサビペルオキシダーゼ標
識を洗い流し（または除去し）、ＨＲＰが触媒する色素
生成反応を開始させる働きをする。洗浄液の添加後、各
スライドを37℃で再びインキュベートし、その間に３秒
間隔で2.5 分間に渡り670 nmの波長で反射濃度を読み取
った。その反射率測定値をClapper-Williams変換を使っ
て透過率（Dt）に変換し、そして色素生成速度（発色速
度）を計算した。この値を検量線によりフェノバルビタ
ール濃度に変換した。
【０１２７】結果を下記に示す：偏り＝最上部スライド
の推定値−２〜７番目のスライドの平均推定値。 塗膜 剤 偏り、６か月 偏り、９か月 ４ なし 3.43 3.54 ５ 0.25 Te5 2.96 3.55 ６ 0.50 Te5 1.02 1.15
【０１２８】実施例17 Te５を下記のようなフェニトイン乾燥塗膜要素のグラビ
ア層において試験した。塗膜７（Te５なし） 下記に示す組成および層構造を有する、ＰＨＹＴアッセ
イ用の薄層塗膜を調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS緩衝剤 0.0045 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.010 マゼンタ色素 0.054 水酸化ナトリウム，１Ｎ (17 g/kgバッチ) BSA 0.00022 A-100 0.00108 TX-100 0.00430 硫酸，２Ｎ 5.3 g/kg バッチ カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ＰＨＴＹ−ＨＲＰ標識 0.000013 ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.22 水酸化ナトリウム，10Ｎ 1.90 g/kgバッチ ジメドン 0.45 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 硫酸バナジル二水和物 0.040 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 ウシ血清アルブミン 1.0 Olin 10G 0.24 ポリマービーズ 130 接着剤ポリマー 2.6 レセプター層 TES 緩衝剤 0.10 硫酸，２Ｎ 1.15 g/kgバッチ TX-100 0.020 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.020 Olin 10G 0.010 ジメドン 0.050 ポリマーバインダー 0.50 抗体ビーズ 0.15 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 4.6 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.020 水酸化ナトリウム，10Ｎ 13.8 g/kgバッチ 架橋剤 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１２９】実施例18 塗膜８（グラビア層中0.25 mM Te５） 下記に示す組成および層構造を有し、0.25 mM の最終再
水和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成
る、ＰＨＹＴアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。 層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS緩衝剤 0.0045 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.010 マゼンタ色素 0.054 水酸化ナトリウム，１Ｎ (17 g/kgバッチ) BSA 0.00022 A-100 0.00108 TX-100 0.00430 硫酸，２Ｎ 5.3 g/kg バッチ カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ＰＨＴＹ−ＨＲＰ標識 0.000013 Te５ 0.016 ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.22 水酸化ナトリウム，10Ｎ 1.90 g/kgバッチ ジメドン 0.45 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 硫酸バナジル二水和物 0.040 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 ウシ血清アルブミン 1.0 Olin 10G 0.24 ポリマービーズ 130 接着剤ポリマー 2.6 レセプター層 TES 緩衝剤 0.10 硫酸，２Ｎ 1.15 g/kgバッチ TX-100 0.020 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.020 Olin 10G 0.010 ジメドン 0.050 ポリマーバインダー 0.50 抗体ビーズ 0.15 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 4.6 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.020 水酸化ナトリウム，10Ｎ 13.8 g/kgバッチ 架橋剤 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１３０】実施例19 塗膜９（グラビア層中 0.5 mM Te５） 下記に示す組成および層構造を有し、0.5 mMの最終再水
和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成る、
ＰＨＹＴアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS緩衝剤 0.0045 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.010 マゼンタ色素 0.054 水酸化ナトリウム，１Ｎ (17 g/kgバッチ) BSA 0.00022 A-100 0.00108 TX-100 0.00430 硫酸，２Ｎ 5.3 g/kg バッチ カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ＰＨＴＹ−ＨＲＰ標識 0.000013 Te５ 0.032 ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.22 水酸化ナトリウム，10Ｎ 1.90 g/kgバッチ ジメドン 0.45 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 硫酸バナジル二水和物 0.040 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 ウシ血清アルブミン 1.0 Olin 10G 0.24 ポリマービーズ 130 接着剤ポリマー 2.6 レセプター層 TES 緩衝剤 0.10 硫酸，２Ｎ 1.15 g/kgバッチ TX-100 0.020 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.020 Olin 10G 0.010 ジメドン 0.050 ポリマーバインダー 0.50 抗体ビーズ 0.15 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 4.6 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.020 水酸化ナトリウム，10Ｎ 13.8 g/kgバッチ 架橋剤 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１３１】実施例20 比較実験３ 塗膜７〜９を細く切り、スライドとして取り付けた。こ
のスライドを含むカートリッジをフリーザー中−18℃で
保存した。６か月および９か月間凍結保存した後、カー
トリッジを速度応答と第一バイアスの偏りについて試験
した。Vitros 250分析装置上でスライドを試験した。約
12.5μg/mLのフェニトインを含むヒト血清基質溶液 11
μL を３つのカートリッジからの第一（最上部）スライ
ドと、同じカートリッジからの２〜７番目のスライドに
も適用した。各スライドを37℃で５分間インキュベート
した後、Na2HPO4 (10 mM, pH 6.8) 、４′−ヒドロキシ
アセトアニリド（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウムク
ロリド（0.1 ％）、H2O2（8 mM）およびDPTA (10μM)を
含む洗浄液 12 μL を各スライドに適用した。この洗浄
液は未結合の薬剤−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識を
洗い流し（除去し）、ＨＲＰが触媒する色素生成反応を
開始させる働きをする。洗浄液の添加後、各スライドを
37℃で再びインキュベートし、その間に３秒間隔で2.5
分間に渡り670 nmの波長で反射濃度を読み取った。反射
率測定値をClapper-Williams変換を使って透過率（Dt）
に変換し、そして色素生成速度（発色速度）を計算し
た。この値を検量線によりフェニトイン濃度に変換し
た。
【０１３２】結果を下記に示す：偏り＝最上部スライド
の推定値−２〜７番目のスライドの平均推定値。 塗膜 剤 偏り、６か月 偏り、９か月 ７ なし 0.89 1.10 ８ 0.25 Te5 0.10 -0.17 ９ 0.50 Te5 0.19 -0.41
【０１３３】実施例21 Te５を下記のようなジコキシンのグラビア層において試
験した。塗膜10（Te５なし） 下記に示す組成および層構造を有する、ＤＧＸＮアッセ
イ用の乾燥塗膜を調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS緩衝剤 0.0045 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.010 マゼンタ色素 0.054 水酸化ナトリウム，１Ｎ (17 g/kgバッチ) BSA 0.00022 A-100 0.00108 TX-100 0.00430 硫酸，２Ｎ 5.3 g/kg バッチ カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ジコキシン−ＨＲＰ標識 0.0000060 ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.22 水酸化ナトリウム，10Ｎ 1.90 g/kgバッチ ジメドン 0.50 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 硫酸バナジル二水和物 0.040 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 ウシ血清アルブミン 1.0 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.020 Olin 10G 0.25 ポリマービーズ 130 接着剤ポリマー 2.6 抗体ビーズ 0.055 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 4.6 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.020 水酸化ナトリウム，10Ｎ 13.8 g/kgバッチ 架橋剤 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１３４】実施例22 塗膜11（グラビア層中0.25 mM Te５） 下記に示す組成および層構造を有し、0.25 mM の最終再
水和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成
る、ＤＧＸＮアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。 層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS緩衝剤 0.0045 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.010 マゼンタ色素 0.054 水酸化ナトリウム，１Ｎ (17 g/kgバッチ) BSA 0.00022 A-100 0.00108 TX-100 0.00430 硫酸，２Ｎ 5.3 g/kg バッチ カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ジゴキシン−ＨＲＰ標識 0.0000060 Te５ 0.016 ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.22 水酸化ナトリウム，10Ｎ 1.90 g/kgバッチ ジメドン 0.50 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 硫酸バナジル二水和物 0.040 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 ウシ血清アルブミン 1.0 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.020 Olin 10G 0.25 ポリマービーズ 130 接着剤ポリマー 2.6 抗体ビーズ 0.055 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 4.6 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.020 水酸化ナトリウム，10Ｎ 13.8 g/kgバッチ 架橋剤 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１３５】実施例23 塗膜12（グラビア層中 0.5 mM Te５） 下記に示す組成および層構造を有し、0.5 mMの最終再水
和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成る、
ＤＧＸＮアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS緩衝剤 0.0045 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.010 マゼンタ色素 0.054 水酸化ナトリウム，１Ｎ (17 g/kgバッチ) BSA 0.00022 A-100 0.00108 TX-100 0.00430 硫酸，２Ｎ 5.3 g/kg バッチ カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ジゴキシン−ＨＲＰ標識 0.0000060 Te５ 0.032 ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.22 水酸化ナトリウム，10Ｎ 1.90 g/kgバッチ ジメドン 0.50 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 硫酸バナジル二水和物 0.040 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 ウシ血清アルブミン 1.0 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.020 Olin 10G 0.25 ポリマービーズ 130 接着剤ポリマー 2.6 抗体ビーズ 0.055 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 4.6 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.020 水酸化ナトリウム，10Ｎ 13.8 g/kgバッチ 架橋剤 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１３６】実施例24 比較実験４ 塗膜10〜12を細く切り、スライドとして取り付けた。こ
のスライドを含むカートリッジをフリーザー中−18℃で
保存した。６か月および９か月間凍結保存した後、カー
トリッジを速度応答と第一バイアスの偏りについて試験
した。Vitros 250分析装置上でスライドを試験した。約
2.0 μg/mLのジゴキシンを含むヒト血清基質溶液 11 μ
L を３つのカートリッジからの第一（最上部）スライド
と、同じカートリッジからの２〜７番目のスライドにも
適用した。各スライドを37℃で５分間インキュベートし
た後、Na2HPO4 (10 mM, pH 6.8) 、４′−ヒドロキシア
セトアニリド（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウムクロ
リド（0.1 ％）、H2O2（8mM）およびDPTA (10μM)を含
む洗浄液 12 μL を各スライドに適用した。この洗浄液
は未結合の薬剤−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識を洗
い流し（除去し）、ＨＲＰが触媒する色素生成反応を開
始させる働きをする。洗浄液の添加後、各スライドを37
℃で再びインキュベートし、その間に３秒間隔で2.5 分
間に渡り670nmの波長で反射濃度を読み取った。反射率
測定値をClapper-Williams変換を使って透過率（Dt）に
変換し、そして色素生成速度（発色速度）を計算した。
この値を検量線によりジゴキシン濃度に変換した。結果
を下記に示す：偏り＝最上部スライドの推定値−２〜７
番目のスライドの平均推定値。
【０１３７】 塗膜 剤 偏り、６か月 偏り、９か月 10 なし 0.16 0.38 11 0.25 Te5 0.063 0.21 12 0.50 Te5 0.003 0.03
【０１３８】実施例25 Te５を下記の通りカルバマゼピン乾燥塗膜要素のグラビ
ア層において試験した。塗膜13（Te５なし） 下記に示す組成および層構造を有する、ＣＲＢＭアッセ
イ用の乾燥塗膜を調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS緩衝剤 0.0045 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.010 マゼンタ色素 0.16 水酸化ナトリウム，１Ｎ (17 g/kgバッチ) BSA 0.00022 A-100 0.00108 TX-100 0.0043 硫酸，２Ｎ 5.3 g/kg バッチ カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ＣＲＢＭ−ＨＲＰ標識 0.000012 ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.22 水酸化ナトリウム，10Ｎ 0.57 ジメドン 0.45 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 硫酸バナジル二水和物 0.040 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 ウシ血清アルブミン 1.0 Olin 10G 0.24 ポリマービーズ 130 接着剤ポリマー 2.6 レセプター層 TES 緩衝剤 0.10 水酸化ナトリウム，１Ｎ 0.40 g/kgバッチ TX-100 0.020 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.020 Olin 10G 0.010 ジメドン 0.050 ポリマーバインダー 0.50 抗体ビーズ 0.20 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 4.6 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.020 水酸化ナトリウム，10Ｎ 1.18 架橋剤 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１３９】実施例26 塗膜14（グラビア層中0.25 mM Te５） 下記に示す組成および層構造を有し、0.25 mM の最終再
水和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成
る、ＣＲＢＭアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。 層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS緩衝剤 0.0045 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.010 マゼンタ色素 0.16 水酸化ナトリウム，１Ｎ (17 g/kgバッチ) BSA 0.00022 A-100 0.00108 TX-100 0.0043 硫酸，２Ｎ 5.3 g/kg バッチ カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ＣＲＢＭ−ＨＲＰ標識 0.000012 Te５ 0.016 ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.22 水酸化ナトリウム，10Ｎ 0.57 ジメドン 0.45 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 硫酸バナジル二水和物 0.040 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 ウシ血清アルブミン 1.0 Olin 10G 0.24 ポリマービーズ 130 接着剤ポリマー 2.6 レセプター層 TES 緩衝剤 0.10 水酸化ナトリウム，１Ｎ 0.40 g/kgバッチ TX-100 0.020 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.020 Olin 10G 0.010 ジメドン 0.050 ポリマーバインダー 0.50 抗体ビーズ 0.20 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 4.6 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.020 水酸化ナトリウム，10Ｎ 1.18 架橋剤 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１４０】実施例17 塗膜15（グラビア層中 0.5 mM Te５） 下記に示す組成および層構造を有し、0.5 mMの最終再水
和濃度でグラビア層中に塗布されたTe５を含んで成る、
ＣＲＢＭアッセイ用の乾燥塗膜を調製した。層 材料 乾燥塗布量(g/m2) グラビア層 MOPS緩衝剤 0.0045 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.010 マゼンタ色素 0.16 水酸化ナトリウム，１Ｎ (17 g/kgバッチ) BSA 0.00022 A-100 0.00108 TX-100 0.0043 硫酸，２Ｎ 5.3 g/kg バッチ カルボキシメチル−アポＨＲＰ 0.010 ＣＲＢＭ−ＨＲＰ標識 0.000012 Te５ 0.032 ビーズ展開層 TES 緩衝剤 0.22 水酸化ナトリウム，10Ｎ 0.57 ジメドン 0.45 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.22 硫酸バナジル二水和物 0.040 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 ウシ血清アルブミン 1.0 Olin 10G 0.24 ポリマービーズ 130 接着剤ポリマー 2.6 レセプター層 TES 緩衝剤 0.10 水酸化ナトリウム，１Ｎ 0.40 g/kgバッチ TX-100 0.020 ロイコ色素 0.20 Tetronic T908 0.020 Olin 10G 0.010 ジメドン 0.050 ポリマーバインダー 0.50 抗体ビーズ 0.20 ゲル ゼラチン 10 TES 緩衝剤 4.6 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド 0.44 TX-100 0.020 水酸化ナトリウム，10Ｎ 1.18 架橋剤 0.15 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート）
【０１４１】実施例28 比較実験５ 塗膜13〜15を細く切り、スライドとして取り付けた。こ
のスライドを含むカートリッジをフリーザー中−18℃で
保存した。６か月および９か月間凍結保存した後、カー
トリッジを速度応答と第一バイアスの偏りについて試験
した。Vitros 250分析装置上でスライドを試験した。約
9.3 μg/mLのカルバマゼピンを含むヒト血清基質溶液 1
1 μL を３つのカートリッジからの第一（最上部）スラ
イドと、同じカートリッジからの２〜７番目のスライド
にも適用した。各スライドを37℃で５分間インキュベー
トした後、Na2HPO4 (10 mM, pH 6.8) 、４′−ヒドロキ
シアセトアニリド（5 mM）、ヘキサデシルピリジニウム
クロリド（0.1 ％）、H2O2（8 mM）およびDPTA (10μM)
を含む洗浄液 12 μL を各スライドに適用した。この洗
浄液は未結合の薬剤−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識
を洗い流し（除去し）、ＨＲＰが触媒する色素生成反応
を開始させる働きをする。洗浄液の添加後、各スライド
を37℃で再びインキュベートし、その間に３秒間隔で2.
5 分間に渡り670 nmの波長で反射濃度を読み取った。反
射率測定値をClapper-Williams変換を使って透過率（D
t）に変換し、そして色素生成速度（発色速度）を計算
した。この値を検量線によりカルバマゼピン濃度に変換
した。
【０１４２】結果を下記に示す：偏り＝最上部スライド
の推定値−２〜７番目のスライドの平均推定値。 塗膜 剤 偏り、６か月 偏り、９か月 13 なし 0.35 0.69 14 0.25 Te5 0.53 0.56 15 0.50 Te5 -0.013 0.12
【０１４３】比較実験２〜５は、グラビア層中のTe５の
存在が、Te５不在下よりも第一スライドの偏りの有意な
減少をもたらすこと、すなわち第一スライドの偏りがよ
り０に近い値であることを示す。必要なTe５の濃度は異
なり、ある場合には0.25（ＰＨＹＴ）であり、またある
場合には 0.5（ＰＨＢＲ，ＤＧＸＮ，ＣＲＢＭ）であ
る。しかしどの場合でも、グラビア層中のＴｅ５の存在
により、第一スライドの偏りを０に近い値へと減少させ
ることができる。
【０１４４】本発明は、競合イムノレートアッセイにお
いて展開層中に塗布されるのと対比して、安定剤が展開
層の上のグラビア層の中に置かれた時、より低レベルの
Te５によって第一スライドの偏りの有意な減少をもたら
す。これは、本明細書中に与えられた実施例により一般
的な現象であることがわかる。展開層中に直接塗布した
テルル化ジアリールと比較して、４種のイムノレートア
ッセイのグラビア層へのテルル化ジアリールの包含は低
レベルであっても、第一スライドの偏りを有意に減少さ
せた。用量依存性である方法ではテルル化ジアリールは
アッセイに不利な影響を及ぼし得るので（例えば、位置
合わせ色素を漂白することにより）、展開層に必要とさ
れる高濃度に対立するものとして、グラビア層中により
低濃度のテルル化ジアリールを使用することが重要な利
点を付与する。
【０１４５】本発明により、単独でまたはバナジル化合
物のような他の安定剤と協同してＨＲＰの安定性が改善
される。本発明の好ましい態様はＴｅ５とバナジル塩の
両方を含んで成る。表１ 接着剤ポリマー：ポリ（メチルアクリレート−コ−２−
アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリ
ウム−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレー
ト） 抗体ビーズ：リガンドに対する抗体が結合しているポリ
（スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロ
ピオン酸のポリマー粒子 ＰＣビーズ：ホスホリルコリンが結合しているポリ（ス
チレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオ
ン酸のポリマー粒子 BSA ：牛血清アルブミン BVSME ：ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル DTPA：ジエチレントリアミン五酢酸 標識：リガンドまたはリガンドのためのレセプターと西
洋ワサビペルオキシダーゼとの接合体 ロイコ色素：４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニ
ル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェ
ニル）イミダゾール マゼンタ色素：４，５−ジヒドロキシ−３−（６，８−
ジスルホ−２−ナフチランゾ）−２，７−ナフタレンジ
スルホン酸ナトリウム MOPS：３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸緩
衝剤 OLIN 10G：１分子当たり平均して約10グリシドール単位
を有するイソノニルフェノキシポリグリシドール界面活
性剤（販売元Olin Chemical Co. ） ポリマービーズ：平均直径20〜40μｍのポリ（ビニルト
ルエン−コ−メタクリル酸）粒子 ポリマーバインダー：ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリル
アミド−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパン
スルホン酸ナトリウム−コ−Ｎ，Ｎ′−メチレンビスア
クリルアミド） ポリマーバインダーＩ：ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート−
コ−Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド） TES ：Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２
−アミノエタンスルホン酸緩衝剤 TX-100：オクチルフェノキシポリエトキシエタノール界
面活性剤であるTriton X-100界面活性剤（販売元Union
Carbide ） TETRONIC T908 ：酸化エチレンと酸化プロピレンのブロ
ックコポリマーである非イオン性界面活性剤（販売元BA
SF Corp.）
【０１４６】本発明をその好ましい実施態様を参照しな
がら詳しく説明してきたが、本発明の精神および範囲内
で様々な変更や修正が可能であることを理解されたい。
特に、本出願人の発明を最適化するために、１もしくは
複数のテルル化ジアリールの使用、特定のテルル化ジア
リールの使用、複数の特定のテルル化ジアリールの組合
せの使用、または１もしくは複数のテルル化ジアリール
と１もしくは複数のバナジル化合物との組合せの使用を
選択できるということを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例３に記載のように、緩衝剤の
み、1 mM VOSO4、単独での1 mM各テルル化ジアリール、
または1 mM VOSO4と1 mM各テルル化ジアリールを含む種
々の溶液をスポットした時の、モデル乾燥定着方式にお
けるＨＲＰ安定性を示す棒グラフである。
【図２】図２は、実施例３に記載のように、様々な濃度
のテルル化ジアリール１および４を使ったモデル乾燥定
着方式における24時間に渡るＨＲＰ安定性を示す棒グラ
フである。
【図３】図３は、実施例５に記載のように、スポット溶
液中に混和された種々の濃度のテルル化ジアリール１お
よび４を使ったモデル乾燥定着方式における抗ＣＲＰ−
ＨＲＰ接合体の安定性を示す棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジャネット ファイレス アメリカ合衆国，ニューヨーク 14519, オンタリオ，スロカム ロード 5961 (72)発明者 スティーブン ハッセルバーグ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14580, ウェブスター，バターミルク サークル 830

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 リガンドをアッセイするための乾式イム
    ノアッセイ分析要素であって、 (a) 酵素標識リガンドまたは酵素標識レセプターを含ん
    で成る標識層； (b) 展開層； (c) 前記リガンドのための固定化レセプターを一定濃度
    で含んで成るレセプター層；および (d) テルル化ジアリールを含んで成るグラビア層 を担持している支持体を含んで成る、乾式イムノアッセ
    イ分析要素。
  2. 【請求項２】 前記テルル化ジアリール化合物が次の構
    造（Ｉ）： Ａｒ1 −Ｔｅ−Ａｒ2 （Ｉ） を含んで成り、上式中Ａｒ1 とＡｒ2 は 【化１】 から成る群より選ばれた同一もしくは異なるアリール基
    または同一もしくは異なるヘテロアリール基であり、こ
    こでＸはＯ，Ｓ，ＳｅまたはＴｅであり；Ｒ11，Ｒ12，
    Ｒ13，Ｒ21，Ｒ22，Ｒ23，Ｒ31，Ｒ32，Ｒ33，Ｒ41，Ｒ
    42およびＲ 43は同一または異なり且つ各々水素、炭素原
    子数１〜５のアルキル、ＯＨ、ＯＲ 1 、ＳＨ、ＮＨ2 、
    ＮＨＲ1 、ＮＲ1 2、ＮＲ1 Ｒ2 、ＣＯ2 Ｈおよびその
    塩、ＣＯ2 Ｒ1 、ＳＯ3 Ｈおよびその塩、ＰＯ3 Ｈ2 お
    よびその塩並びにＳＲ1 から成る群より各々選ばれ、こ
    こでＲ1 とＲ2 は異なり且つ１個または複数個の親水基
    を有することがある炭素原子数１〜14の炭素鎖を有する
    アルキル、フェニルおよび置換フェニルから成る群より
    各々選ばれ；Ｒ14，Ｒ15，Ｒ24およびＲ25は同一または
    異なり且つ水素、炭素原子数１〜５のアルキル、炭素原
    子数１〜５のアルコキシ、ＣＯ2 Ｈおよびその塩、ＣＯ
    2 Ｒ1、ＳＯ3 Ｈおよびその塩、並びにＰＯ3 Ｈ2 およ
    びその塩から成る群より各々選ばれる、請求項１に記載
    の要素。
  3. 【請求項３】 前記テルル化ジアリールが 【化２】 から成る群より選ばれる、請求項１に記載の要素。
  4. 【請求項４】 バナジル塩を更に含んで成る、請求項１
    に記載の要素。
  5. 【請求項５】 バナジル塩を更に含んで成る、請求項２
    に記載の要素。
  6. 【請求項６】 バナジル塩を更に含んで成る、請求項３
    に記載の要素。
  7. 【請求項７】 前記標識リガンドまたは標識レセプター
    中の標識がペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ誘
    導体である、請求項１に記載の要素。
  8. 【請求項８】 前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペル
    オキシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ誘導体
    である、請求項７に記載の要素。
  9. 【請求項９】 前記グラビア層が標識リガンドまたは標
    識レセプターを更に含んで成る、請求項８に記載の要
    素。
  10. 【請求項１０】 前記グラビア層が液体試料との接触を
    提供する展開層表面と連続している、請求項９に記載の
    要素。
  11. 【請求項１１】 前記テルル化ジアリールが 【化３】 から成る群より選ばれる、請求項１０に記載の要素。
  12. 【請求項１２】 バナジル塩を更に含んで成る、請求項
    １１に記載の要素。
  13. 【請求項１３】 水性液体試料中に含まれる免疫学的反
    応性リガンドのアッセイ方法であって、 (1) 乾式イムノアッセイ分析要素であって、 (a) 酵素標識リガンドまたは酵素標識レセプターを含ん
    で成る標識層； (b) 展開層； (c) 前記リガンドのための固定化レセプターを一定濃度
    で含んで成るレセプター層；および (d) テルル化ジアリールを含んで成るグラビア層 を担持している支持体を含んで成る乾式イムノアッセイ
    分析要素を用意し、 (2) 前記要素の展開層の限定領域を前記試料と接触さ
    せ、それにより(i) 固定化リガンド−レセプター複合
    体、(ii)固定化酵素標識リガンド−レセプター複合体、
    または(iii) (i) と(ii)の混合物、または固定化レセプ
    ター−リガンド−標識レセプター複合体を形成させ、 (3) 前記限定領域を前記酵素標識のための基質溶液と接
    触させ、それによりシグナルの生成を触媒し；そして (4) 前記シグナルを検出することにより前記リガンドの
    濃度を測定することを含んで成る方法。
  14. 【請求項１４】 前記テルル化ジアリール化合物が次の
    構造（Ｉ）： Ａｒ1 −Ｔｅ−Ａｒ2 （Ｉ） を含んで成り、上式中Ａｒ1 とＡｒ2 は 【化４】 から成る群より選ばれた同一もしくは異なるアリール基
    または同一もしくは異なるヘテロアリール基であり、こ
    こでＸはＯ，Ｓ，ＳｅまたはＴｅであり；Ｒ11，Ｒ12，
    Ｒ13，Ｒ21，Ｒ22，Ｒ23，Ｒ31，Ｒ32，Ｒ33，Ｒ41，Ｒ
    42およびＲ 43は同一または異なり且つ水素、炭素原子数
    １〜５のアルキル、ＯＨ、ＯＲ1 、ＳＨ、ＮＨ2 、ＮＨ
    Ｒ1 、ＮＲ1 2、ＮＲ1 Ｒ2 、ＣＯ2 Ｈおよびその塩、Ｃ
    Ｏ2Ｒ1 、ＳＯ3 Ｈおよびその塩、ＰＯ3 Ｈ2 およびそ
    の塩並びにＳＲ1 から成る群より各々選ばれ、ここでＲ
    1 およびＲ2 は異なり且つ１個または複数個の親水基を
    有することがある炭素原子数１〜14の炭素鎖を有するア
    ルキル、フェニルおよび置換フェニルから成る群より各
    々選ばれ；Ｒ14，Ｒ15，Ｒ24およびＲ25は同一または異
    なり且つ水素、炭素原子数１〜５のアルキル、炭素原子
    数１〜５のアルコキシ、ＣＯ2 Ｈおよびその塩、ＣＯ2
    Ｒ1、ＳＯ3 Ｈおよびその塩並びにＰＯ3 Ｈ2 およびそ
    の塩から成る群より各々選ばれる、請求項１３に記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】 前記テルル化ジアリールが 【化５】 から成る群より選ばれる、請求項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記要素がバナジル塩を更に含んで成
    る、請求項１３に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記要素がバナジル塩を更に含んで成
    る、請求項１４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記要素がバナジル塩を更に含んで成
    る、請求項１５に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記標識リガンドまたは標識レセプタ
    ー中の標識がペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ
    誘導体である、請求項１３に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペ
    ルオキシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ誘導
    体である、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記シグナルが比色シグナルである、
    請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記グラビア層が標識リガンドまたは
    標識レセプターを更に含んで成る、請求項２１に記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】 前記グラビア層が液体試料との接触を
    提供する展開層表面と連続している、請求項２２に記載
    の方法。
  24. 【請求項２４】 前記テルル化ジアリールが 【化６】 から成る群より選ばれる、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記要素がバナジル塩を更に含んで成
    る、請求項２４に記載の方法。
JP26985898A 1997-09-23 1998-09-24 乾式イムノアッセイ分析要素およびそれを使用したアッセイ方法 Expired - Fee Related JP4243372B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/935,965 US5928886A (en) 1995-06-07 1997-09-23 Reduction in first slide bias and improved enzyme stability by incorporation of diaryl tellurides in the gravure layer of dry-film, immunoassay elements
US08/935965 1997-09-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH11160316A true JPH11160316A (ja) 1999-06-18
JP4243372B2 JP4243372B2 (ja) 2009-03-25

Family

ID=25467986

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP26985898A Expired - Fee Related JP4243372B2 (ja) 1997-09-23 1998-09-24 乾式イムノアッセイ分析要素およびそれを使用したアッセイ方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5928886A (ja)
EP (1) EP0903583B1 (ja)
JP (1) JP4243372B2 (ja)
KR (1) KR100597818B1 (ja)
AT (1) ATE254281T1 (ja)
AU (1) AU736764B2 (ja)
CA (1) CA2247723C (ja)
DE (1) DE69819646T2 (ja)
DK (1) DK0903583T3 (ja)
ES (1) ES2210679T3 (ja)
PT (1) PT903583E (ja)
SI (1) SI0903583T1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001299386A (ja) * 2000-04-21 2001-10-30 Mitsubishi Chemicals Corp 酵素濃度の測定方法および酵素濃度の測定装置

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9926435D0 (en) * 1999-11-08 2000-01-12 Polymer Lab Ltd Method
WO2005081954A2 (en) * 2004-02-25 2005-09-09 Wyeth Inhibitors of protein tyrosine phosphatase 1b
US20050203081A1 (en) * 2004-02-25 2005-09-15 Jinbo Lee Inhibitors of protein tyrosine phosphatase 1B
US11852970B2 (en) * 2015-08-24 2023-12-26 Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. Material for lithography, production method therefor, composition for lithography, pattern formation method, compound, resin, and method for purifying the compound or the resin
CN113295730B (zh) * 2021-05-25 2022-06-10 中国核动力研究设计院 精细表面单相及两相对流传热传质实验装置及其制备方法

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1545975A (en) * 1975-12-16 1979-05-16 Asahi Chemical Ind Dry image forming material
US4089747A (en) * 1976-08-09 1978-05-16 Eastman Kodak Company Compositions for the detection of hydrogen peroxide
NL7610608A (nl) * 1976-09-24 1978-03-29 Akzo Nv Werkwijze voor het stabiliseren van peroxidase- -bevattende composities.
US4436899A (en) * 1978-09-26 1984-03-13 Occidental Research Corporation Layered organophosphorus inorganic polymers
US4487922A (en) * 1979-07-24 1984-12-11 Occidental Research Corp. Layered organophosphorous inorganic polymers containing cyclic groups
US4276409A (en) * 1979-07-02 1981-06-30 Occidental Research Corporation Layered cyano end terminated organophosphorus inorganic polymers
US4276411A (en) * 1979-07-24 1981-06-30 Occidental Research Corporation Layered organophosphorus inorganic polymers containing acyclic groups
US4276410A (en) * 1979-07-02 1981-06-30 Occidental Research Corporation Layered organophosphorus inorganic polymers containing mercapto or thio groups
US4235990A (en) * 1978-10-17 1980-11-25 Occidental Research Corporation Layered carboxy end terminated organophosphorus inorganic polymers
US4235991A (en) * 1978-12-04 1980-11-25 Occidental Research Corporation Layered sulfonate end terminated organophosphorus inorganic polymers
US4374242A (en) * 1979-07-24 1983-02-15 Occidental Research Corporation Layered organoarsenous inorganic polymers
US4256872A (en) * 1978-09-26 1981-03-17 Occidental Research Corporation Process for preparing layered organophosphorus inorganic polymers
US4258001A (en) * 1978-12-27 1981-03-24 Eastman Kodak Company Element, structure and method for the analysis or transport of liquids
JPS57101761A (en) * 1980-12-17 1982-06-24 Konishiroku Photo Ind Co Ltd Analyzing element
US5116401A (en) * 1981-11-05 1992-05-26 Union Oil Company Of California Herbicide and method with the glyphosate-urea adduct of sulfuric acid
US4722986A (en) * 1981-11-05 1988-02-02 Union Oil Company Of California Acid catalysts and methods of use
CA1240445A (en) * 1982-03-09 1988-08-09 Wayne A. Bowman Chill-gelable polymers
US4670385A (en) * 1984-05-21 1987-06-02 Eastman Kodak Company Compositions and elements containing triarylmethane leuco dyes and methods using same
US4607000A (en) * 1985-04-04 1986-08-19 Eastman Kodak Company Amido substituted divalent chalcogenide fog inhibiting agents for silver halide photography
US4670381A (en) * 1985-07-19 1987-06-02 Eastman Kodak Company Heterogeneous immunoassay utilizing horizontal separation in an analytical element
DE3872999T2 (de) * 1987-09-18 1993-03-11 Eastman Kodak Co Verknuepfung von verbindungen mit polymeren teilchen unter verwendung von carbamoyloniumvebindungen.
US5164524A (en) * 1990-02-06 1992-11-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Process for preparing tetra (organyl) telluride compounds
DE69125042T2 (de) * 1990-04-02 1997-06-19 Fuji Photo Film Co Ltd Verarbeitungsverfahren für farbphotographisches Silberhalogenidmaterial
US5155166A (en) * 1990-06-18 1992-10-13 Eastman Kodak Company Use of 1-(1-pyrrolidinylcarbonyl)pyridinium salts to attach compounds to carboxylated particles and a kit containing same
JP2869577B2 (ja) * 1990-09-28 1999-03-10 富士写真フイルム株式会社 ハロゲン化銀写真感光材料、およびそれを用いた画像形成方法
US5395556A (en) * 1990-12-12 1995-03-07 Enichem S.P.A. Tricyanovinyl substitution process for NLO polymers
SE9200502D0 (sv) * 1992-02-20 1992-02-20 Astra Ab Novel antioxidants
JP3392480B2 (ja) * 1993-10-26 2003-03-31 日水製薬株式会社 免疫測定方法およびその装置
US5696193A (en) * 1994-04-25 1997-12-09 Clinical Diagnostic Systems, Inc. Immunoassay elements comprising polymers containing vandium IV (V+4) ions
US5516645A (en) * 1994-04-25 1996-05-14 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Immunoassay analytical elements containing vanadium IV(V+4)ions
US5496702A (en) * 1994-09-01 1996-03-05 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Immunoassay elements having stable leuco dye coatings
US5686254A (en) * 1995-06-07 1997-11-11 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Reduction in first slide bias and improved enzyme stability by the incorporation of diaryl tellurides in thin-film immunoassay elements

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001299386A (ja) * 2000-04-21 2001-10-30 Mitsubishi Chemicals Corp 酵素濃度の測定方法および酵素濃度の測定装置

Also Published As

Publication number Publication date
EP0903583A2 (en) 1999-03-24
EP0903583A3 (en) 2001-04-11
EP0903583B1 (en) 2003-11-12
AU736764B2 (en) 2001-08-02
SI0903583T1 (en) 2004-04-30
DE69819646T2 (de) 2004-12-02
KR100597818B1 (ko) 2006-12-01
CA2247723A1 (en) 1999-03-23
ATE254281T1 (de) 2003-11-15
JP4243372B2 (ja) 2009-03-25
US5928886A (en) 1999-07-27
AU8615498A (en) 1999-04-15
PT903583E (pt) 2004-04-30
CA2247723C (en) 2008-07-08
ES2210679T3 (es) 2004-07-01
KR19990030045A (ko) 1999-04-26
DK0903583T3 (da) 2004-03-08
DE69819646D1 (de) 2003-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5714340A (en) Immunoassay elements having a receptor zone
JPH11503829A (ja) 抗体検出用化学発光イムノアッセイ
EP0252750B1 (en) Composition and analytical element having stabilized peroxidase
CA1285872C (en) Binder composition and analytical element having stabilized peroxidase in layer containing the composition
US5496702A (en) Immunoassay elements having stable leuco dye coatings
JP4243372B2 (ja) 乾式イムノアッセイ分析要素およびそれを使用したアッセイ方法
EP0848819B1 (en) Analytical element and method for the determination of a specific binding ligand using a vanadium bromoperoxidase as a signal-generating enzyme
EP0684473B1 (en) Immunoassay elements comprising polymers containing vanadium IV (V (+4)) ions
JP3545536B2 (ja) 乾式免疫分析要素及び免疫学的に反応性のリガンドの分析方法
JPS6327760A (ja) 水溶性ポリマ−を有する分析要素
EP1130398B1 (en) Analytical elements
US5516645A (en) Immunoassay analytical elements containing vanadium IV(V+4)ions
EP0603962A1 (en) Immunoassay elements having a seperate receptor layer
JPH0843394A (ja) 多層乾式イムノアッセイ要素およびイムノアッセイの実施方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20050922

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050922

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20070629

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080304

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080603

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080606

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080904

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20081202

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20090105

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120109

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees