JPH1099098A - トレハロース分析用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ムタロターゼ２〜40単位／ml、グルコー
スオキシダーゼ 100〜500 単位／mlおよびカタラーゼ20
00〜5000単位／mlを少なくとも含有するグルコース消去
前処理試薬と、トレハロースホスホリラーゼ 0.055〜0.
11単位／ml、アジ化ナトリウム 0.1〜0.5 重量％、ペル
オキシダーゼ10〜100 単位／ml、4-アミノアンチピリン
0.5〜５mMおよび水素供与体 0.5〜５mMを少なくとも含
有する生成グルコース検出試薬との組み合わせからな
る、トレハロース分析用試薬。 【効果】 被検液中に存在する、測定ブランクを大きく
し、トレハロースの酵素的測定の妨げとなるグルコース
による影響を消去でき、ブランク測定を行うことなく、
簡便にかつ正確にトレハロースの測定を行うことができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検液中のトレハ
ロースを酵素的に定量する反応系において、該被検液中
に原始的に含まれるグルコースの定量を別個行うことな
く、簡便にかつ正確に測定を行うことのできるトレハロ
ース分析用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、トレハロースの定量方法につ
いては幾つかの方法が知られている。その一つは、アン
スロン法等で全糖量を測定するとともに、グルコース等
の還元糖の量をネルソン法などで測定し、その還元糖の
量を全糖量から差引くことで非還元糖たるトレハロース
の測定を行う方法である。しかし、非還元糖はトレハロ
ース以外にもあり（例えば、シュークロース）、全糖量
から還元糖量を差し引いても正確なトレハロースの定量
はできない。また、測定工程が非常に繁雑であり、時間
と労力を要するばかりでなく、誤差も生じやすい。

【０００３】他の方法として、高速液体クロマトグラフ
ィーによる定量方法が挙げられるが、１検体の測定に長
時間を要し、多数の検体を短時間で測定するのには適さ
ないといった欠点、さらにはトレハロースを含んだ未知
の検体を測定する際に、トレハロースと同じ保持時間を
有する物質が含まれていた場合には、正しい測定値が得
られないといった欠点がある。また別の方法として、ト
レハラーゼを用いた酵素的定量方法が知られている。こ
の方法は、トレハロースをトレハラーゼで処理すること
により２分子のグルコースに分解し、生成したグルコー
スを定量するといった原理に基づくものである。しか
し、被検体中にトレハロースの他にグルコースが当初か
ら含まれている場合には、そのグルコースの量だけを別
に測定しておき、その分を全グルコース量から差引く必
要があり、工程が繁雑であるとともに誤差要因も多いと
いう欠点がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、被検
液中のトレハロースを酵素的に定量するための試薬にお
いて、該被検液中に原始的に含まれるグルコースの定量
を別個行うことなく、簡便かつ正確に複数の検体の同時
定量が可能なトレハロースの分析用試薬を提供すること
である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者らは、被検液中に存在するグルコース
を前もって消去し得る試薬と、トレハロースを分解する
とともに生成したグルコースを定量し得る試薬とを組み
合わせて用いれば、１検体につき２回以上の測定を行う
必要がなく、簡便かつ正確にトレハロースの測定を行う
ことができることを見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、ムタロターゼ２〜40
単位／ml、グルコースオキシダーゼ100〜500 単位／ml
およびカタラーゼ2000〜5000単位／mlを少なくとも含有
するグルコース消去前処理試薬と、トレハロースホスホ
リラーゼ 0.055〜0.11単位／ml、アジ化ナトリウム 0.1
〜0.5 重量％、ペルオキシダーゼ10〜100 単位／ml、4-
アミノアンチピリン 0.5〜５mMおよび水素供与体 0.5〜
５mMを少なくとも含有する生成グルコース検出試薬との
組み合わせからなる、トレハロース分析用試薬である。

【０００７】また、本発明は、グルコース消去前処理試
薬が、さらにリン酸緩衝液およびウシ血清アルブミンを
含有することを特徴とする上記トレハロース分析用試薬
である。さらに、本発明は、生成グルコース検出試薬
が、さらにリン酸緩衝液、エチレンジアミン四酢酸、界
面活性剤およびウシ血清アルブミンを含有することを特
徴とする上記トレハロース分析用試薬である。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のトレハロース分析用試薬は、グルコース消去前
処理試薬(I) と、生成グルコース検出試薬(II)との組み
合わせからなる。グルコース消去前処理試薬(I) は、少
なくともムタロターゼ、グルコースオキシダーゼおよび
カタラーゼを含有するが、溶媒としてリン酸緩衝液等を
使用することができる。また、これ以外にも、酵素の安
定化のためにウシ血清アルブミン、酵素の賦活化のため
に界面活性剤などを含有してもよい。溶媒としてリン酸
緩衝液を使用するのが好ましく、またウシ血清アルブミ
ンを含有するのが好ましい。

【０００９】このグルコース消去前処理試薬(I) におけ
るムタロターゼの含有量は２〜40単位／mlであり、グル
コースオキシダーゼの含有量は 100〜500 単位／mlであ
り、カタラーゼの含有量は2000〜5000単位／mlである。
ムタロターゼの含有量を２〜40単位／ml、グルコースオ
キシダーゼの含有量を 100〜500 単位／mlとすることに
より、被検液中に原始的に存在するグルコース（α−Ｄ
−グルコース，β−Ｄ−グルコース）を確実に消去する
ことができる。また、カタラーゼの含有量を2000〜5000
単位／mlとすることにより、トレハロースの酵素的定量
反応に影響を与える過酸化水素を確実に分解することが
できる。

【００１０】生成グルコース検出試薬(II)は、少なくと
もトレハロースホスホリラーゼ、アジ化ナトリウム、ペ
ルオキシダーゼ、4-アミノアンチピリンおよび水素供与
体を含有する。この生成グルコース検出試薬(II)は、溶
媒としてリン酸緩衝液等を含有することができ、そのリ
ン酸は、トレハロースホスホリラーゼによるトレハロー
スとの反応に供与することができる。また、リン酸緩衝
液以外にも、トレハロースホスホリラーゼの安定化のた
めにエチレンジアミン四酢酸；酵素、特にトレハロース
ホスホリラーゼの賦活化のために界面活性剤；酵素の安
定化のためにウシ血清アルブミン；及び検体の濁りを軽
減するために界面活性剤、例えばニッコーケミカル社製
のＯＰ１０、ニッコーケミカル社製のＢＴ７などを含ん
でいてもよい。溶媒としてリン酸緩衝液を使用するのが
好ましく、またエチレンジアミン四酢酸、界面活性剤お
よびウシ血清アルブミンを含有するのが好ましい。

【００１１】水素供与体としては、フェノール、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）や、それらの
誘導体、例えばＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３−メトキシアニリンなどが挙げ
られ、各々単独でまたは適宜組み合わせて使用すること
ができる。

【００１２】この生成グルコース検出試薬(II)における
トレハロースホスホリラーゼの含有量は 0.055〜0.11単
位／mlであり、アジ化ナトリウムの含有量は 0.1〜0.5
重量％であり、ペルオキシダーゼの含有量は10〜100 単
位／mlであり、4-アミノアンチピリンの含有量は 0.5〜
５mMであり、水素供与体の含有量は 0.5〜５mMである。
トレハロースホスホリラーゼの含有量を 0.055〜0.11単
位／mlとすることにより、検体中のトレハロースを確実
にα−Ｄ−グルコースに変換することができ、アジ化ナ
トリウムの含有量を 0.1〜0.5 重量％とすることによ
り、グルコース消去前処理試薬(I) で使用したカタラー
ゼの酵素活性を十分に阻害することができる。また、ペ
ルオキシダーゼの含有量を10〜100 単位／ml、4-アミノ
アンチピリンの含有量を 0.5〜５mM、水素供与体の含有
量を 0.5〜５mMとすることより、発色反応によってβ−
Ｄ−グルコース、ひいてはトレハロースを正確に定量す
ることができる。

【００１３】本発明のトレハロース分析用試薬を使用し
た場合、図１に示すように反応が進行する。なお、本発
明において測定対象となり得るトレハロース含有検体
（被検液）としては、トレハロース生産能を有する微生
物のスクリーニングのための反応液や、微生物菌体、動
物組織、植物組織の破砕液などが挙げられるが、これら
に限定されるものではない。当初から検体中に存在する
グルコースはトレハロースの酵素的定量反応において妨
害因子となり得るが、本発明における検体は、トレハロ
ースの他にグルコースが含まれることが予想されるもの
であってもよいし、予想されないものであってもよい。

【００１４】(a) グルコース消去前処理試薬(I) の使用 検体中にα−Ｄ−グルコースが存在する場合、そのα−
Ｄ−グルコースはムタロターゼによりβ−Ｄ−グルコー
スに変換される。変換されたβ−Ｄ−グルコース（検体
中にβ−Ｄ−グルコースが当初より存在する場合には、
さらにそのβ−Ｄ−グルコース）は、グルコースオキシ
ダーゼにより酸素および水と反応し、β−Ｄ−グルコノ
−δ−ラクトンと過酸化水素を生成する。ここで生成し
た過酸化水素もトレハロースの酵素的定量反応に影響を
与えるため、カタラーゼにより水と酸素に変換される。
このように、グルコース消去前処理試薬(I) を使用して
前処理を行うことにより、被検液中に原始的に存在する
グルコースは、トレハロースホスホリラーゼを用いたト
レハロースの酵素的測定方法に関与しなくなるため、目
的物質であるトレハロースを高感度に直接測定すること
ができる。

【００１５】(b) 生成グルコース検出試薬(II)の使用 生成グルコース検出試薬(II)中のアジ化ナトリウムは、
上記前処理で使用したカタラーゼの酵素活性を阻害す
る。カタラーゼは、グルコースの定量に利用される過酸
化水素を分解してしまうため、その酵素活性を阻害する
ことよりグルコースを正確に定量することができる。検
体中のトレハロースは、まずトレハロースホスホリラー
ゼによってリン酸と反応し、α−Ｄ−グルコースおよび
グルコース−１−リン酸を生成する。次いで、生成した
α−Ｄ−グルコースは、ムタロターゼによりβ−Ｄ−グ
ルコースに変換される。この遊離、生成したβ−Ｄ−グ
ルコースはグルコースオキシダーゼにより酸素および水
と反応し、β−Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンと過酸化水
素を生成する。なお、この反応過程におけるムタロター
ゼおよびグルコースオキシダーゼは、グルコース消去前
処理試薬(I) に含まれるものをそのまま利用することが
できるが、これには限定されない。

【００１６】生成した過酸化水素は、ペルオキシダーゼ
により、4-アミノアンチピリンおよび水素供与体と反応
して発色するため、この発色した過酸化水素について、
500〜600 nm、望ましくは542 nm付近の吸光度を測定す
ることにより、β−Ｄ−グルコース、ひいてはトレハロ
ースを定量することができる。なお、最大吸収波長は54
2 nmであり、自動生化学分析機で設定可能な波長は546
nmである。本発明のトレハロース分析用試薬を用いたト
レハロースの酵素的測定は、例えば以下のようにして行
うことができる。

【００１７】まず、被検液とグルコース消去前処理試薬
(I) とを混合し、一定温度、例えば37℃で、一定時間、
例えば20分間又はそれ以上の時間インキュベートし、被
検液中のグルコースを消去する。このようにして前処理
を行った被検液と、生成グルコース検出試薬(II)とを混
合し、一定温度、例えば37℃で、一定時間、例えば５分
間又はそれ以上の時間インキュベートし、発色反応の結
果を 542nm付近における吸光度により測定する。

【００１８】この測定は、一般的に用手法またはオート
法により行うことができる。用手法とは、測定者が、定
められた時間毎に定められた量の試薬をピペット等を用
いて入れ、一定時間後に測定する方法であり、オート法
とは、一般に臨床検査に用いられる生化学自動分析機
（オートアナライザー）を用いて測定する方法である。
本発明のトレハロース分析用試薬によれば操作が簡便で
あり、自動分析（オート法）にも極めて適している。

【００１９】以上説明した本発明のトレハロース分析用
試薬によれば、被検液中のグルコースをあらかじめ消去
した後、そのまま引き続いてトレハロースホスホリラー
ゼを用いたトレハロースの酵素的定量測定を行うことが
できるため、従来、検体ブランクをとるために１検体で
２回以上の測定を要したのに比べ、操作が簡単であり、
しかも精度が高い。したがって、本発明のトレハロース
分析用試薬は、特にトレハロース検出のスクリーニング
に極めて適している。また、本発明の試薬は、トレハロ
ース合成酵素生産微生物の検索用試薬としても使用する
ことができる。

【００２０】

【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるも
のではない。 （実施例１）トレハロースの定量：用手法 下記の組成を有する試薬を調製した。

【００２１】 グルコース消去前処理試薬（Ｒ１） リン酸緩衝液（pH 6.9） ２００ｍＭ ムタロターゼ １０単位／ｍｌ グルコースオキシダーゼ １００単位／ｍｌ カタラーゼ ２０００単位／ｍｌ ウシ血清アルブミン ０．０２重量％ 生成グルコース検出試薬（Ｒ２） リン酸緩衝液（pH 6.9） ２００ｍＭ アジ化ナトリウム ０．２重量％ エチレンジアミン四酢酸 ２ｍＭ ４−アミノアンチピリン ２ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３− スルホプロピル）−３−メトキシアニリン ２ｍＭ Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１重量％ ペルオキシダーゼ １０単位／ｍｌ トレハロースホスホリラーゼ ０．０５５単位／ｍｌ ウシ血清アルブミン ０．０２重量％

【００２２】被検液としては、３g/l のグルコースを含
むトレハロース水溶液（トレハロース濃度：０g/l,１g/
l,２g/l,３g/l,４g/l,５g/l,６g/l,７g/l,８g/l,９g/l,
10g/l ）を使用した。この被検液50μl に、50μl のＲ
１を加え、37℃で20分間インキュベートした後、500 μ
l のＲ２を加え、37℃で正確に20分間インキュベートし
た。この発色反応について、542 nmの吸光度を測定し
た。結果を図２のグラフに示す。図２に示されるよう
に、本発明のトレハロース分析用試薬（用手法）によれ
ば、１〜10g/l（約2.6 〜26mM）の濃度のトレハロース
の定量を行うことができる。

【００２３】（実施例２）トレハロースの定量：オート
法 トレハロースホスホリラーゼの濃度を0.11単位／mlとす
る以外、実施例１同様の試薬を調製した。被検液として
は、１g/l のグルコースを含むトレハロース水溶液（ト
レハロース濃度：０g/l,１g/l,２g/l,３g/l,４g/l,５g/
l,６g/l,７g/l,８g/l,９g/l,10g/l ）を使用した。この
被検液20μl に、200 μl のＲ１を加え、37℃で５分間
インキュベートした後、200 μl のＲ２を加え、37℃で
５分間インキュベートした。この発色反応について、54
6 nmの吸光度を測定した。結果を図３のグラフに示す。
図３に示されるように、本発明のトレハロース分析用試
薬（オート法）によれば、１〜10g/l（約2.6 〜26mM）
の濃度のトレハロースの定量を行うことができる。

【００２４】（実施例３）グルコースの影響の測定：用
手法 被検液として、０g/l,0.5 g/l,１g/l,1.5 g/l,２g/l,2.
5 g/l,３g/l,４g/l,５g/l のグルコースを含むトレハロ
ース水溶液（トレハロース濃度：５g/l ）を使用する以
外、実施例１と同様の測定を行った。結果を図４のグラ
フに示す。

【００２５】図４に示されるように、本発明のトレハロ
ース分析用試薬（用手法）によれば、被検液中にグルコ
ースが存在する場合であっても、少なくとも５g/l のグ
ルコースを処理してその影響を消去することができ、ト
レハロースの定量を正確に行うことができる。

【００２６】（実施例４）グルコースの影響の測定：オ
ート法 被検液として、０g/l,0.5 g/l,１g/l,1.5 g/l,２g/l,2.
5 g/l,３g/l のグルコースを含むトレハロース水溶液
（トレハロース濃度：５g/l ）を使用する以外、実施例
２と同様の測定を行った。結果を図５のグラフに示す。
図４に示されるように、本発明のトレハロース分析用試
薬（オート法）によれば、被検液中にグルコースが存在
する場合であっても、グルコースの濃度が１g/l 以下で
あれば、その影響を消去してトレハロースの定量を正確
に行うことができる。

【００２７】

【発明の効果】本発明のトレハロース分析用試薬によれ
ば、被検液中に存在する、測定ブランクを大きくし、ト
レハロースの酵素的測定の妨げとなるグルコースによる
影響を消去でき、ブランク測定を行うことなく、簡便に
かつ正確にトレハロースの測定を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のトレハロース分析用試薬による反応過
程を示す図である。(a) はグルコース消去前処理試薬
(I) による反応過程を示すものであり、(b) は生成グル
コース検出試薬(II)による反応過程を示すものである。

【図２】実施例１におけるトレハロースの定量結果（用
手法）を示すグラフである。

【図３】実施例２におけるトレハロースの定量結果（オ
ート法）を示すグラフである。

【図４】実施例３における被検液中のグルコースの影響
を測定した結果（用手法）を示すグラフである。

【図５】実施例４における被検液中のグルコースの影響
を測定した結果（オート法）を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山岸 政昭 静岡県焼津市西小川５丁目17番地−12 (72)発明者 戸塚 好之 静岡県静岡市下川原２丁目14−２ (72)発明者 窪田 悟夫 静岡県静岡市池田1004番地 (72)発明者 大口 真央 静岡県静岡市登呂４丁目25番８号 (72)発明者 和田 正 静岡県静岡市聖一色25−１ ディアス川口 Ｂ201 (72)発明者 佐野 孝文 静岡県庵原郡富士川町南松野1759−４

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ムタロターゼ２〜40単位／ml、グルコー
   スオキシダーゼ 100〜500 単位／mlおよびカタラーゼ20
   00〜5000単位／mlを少なくとも含有するグルコース消去
   前処理試薬と、トレハロースホスホリラーゼ 0.055〜0.
   11単位／ml、アジ化ナトリウム 0.1〜0.5 重量％、ペル
   オキシダーゼ10〜100 単位／ml、4-アミノアンチピリン
   0.5〜５mMおよび水素供与体 0.5〜５mMを少なくとも含
   有する生成グルコース検出試薬との組み合わせからな
   る、トレハロース分析用試薬。
2. 【請求項２】 グルコース消去前処理試薬が、さらにリ
   ン酸緩衝液およびウシ血清アルブミンを含有することを
   特徴とする、請求項１記載のトレハロース分析用試薬。
3. 【請求項３】 生成グルコース検出試薬が、さらにリン
   酸緩衝液、エチレンジアミン四酢酸、界面活性剤および
   ウシ血清アルブミンを含有することを特徴とする、請求
   項１記載のトレハロース分析用試薬。