JPH10513551A - 被検体の磁気緩和測定での検出のための方法及び化合物並びにそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、液相及び固相中の被検体を磁気緩和測定により定量的に検出する方法、磁気緩和測定での検出のための化合物、並びに分析及び免疫マグネトグラフィーにおけるそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 被検体の磁気緩和測定での検出のための方法及び化合物並びにそれらの使用 本発明は、請求の範囲を特徴とするもの、即ち液体及び固体相において被検体 を磁気緩和測定(magnetorelaxometrischen)で定性的及び／又は定量的に検出す るための方法、磁気緩和測定での検出のための化合物、並びにそれらの分析及び 免疫磁気記録法（Immunomagnetographie）における使用に関する。 イムノシンチグラフィーは、以下にマーカーとしても言及される放射能標識構 造特異的物質により生体内の病的構造を検出するのを可能にすることが知られて いる。この目的に、γ線でラベルされた抗体又は抗体フラグメントが通常用いら れる。更に、例えばペプチド又はオリゴ核酸もしくはポリ核酸のような他の構造 特異的物質も用いられ、又は調査される。しかしながら、特異的に結合した放射 能の部分は一般に、全てのこれらの部分において小さい。結果として、これらの 研究の場合、特異的に結合せず、これにより血液中に循環するか、又は肝臓、腎 臓、輸出性尿路、又は膀胱のような器官中に蓄積するマーカーのレベルは極めて 高い。多くの場合、この高いバックグラウンド放射は病的構造の適切な検出を妨 げる。それゆえ、Panchapakesan〔Immunol.Cell.Biol.，10（1992）295〕及びZi egler〔New England Journal of Medicine，324 （1991）430〕は、イムノシン チグラフィーを改良する方法を示す。このような方法は、EP 0 251 494にも記載 される。それらのほとんどの方法の目的は、特異的に結合する放射能の除去を加 速することである。 更に、生体内の病的構造に局在化するために常磁性もしくは超常 磁性物質と接合した抗体又は抗体フラグメントの使用が種々の場合に提案されて いる。今日まで、磁化率の変化に基づく核スピン断層撮影又は磁力測定(WO 93／ 05818及びWO 91／15243)がこのようなラベルされた抗体のための検出方法として 与えられている。これらの検出方法の場合、マーカーの未結合の部分のため、及 び組織の磁化率及び緩和率の自然の変化のためのシグナルの可変部分の問題も存 在している。更に、その方法は、しばしば少し小さな量の特異的に結合したマー カーを検出することができるのに十分な感度がない。 しかしながら、結合したマーカーの部分のみを検出することを可能にし、これ により未結合のマーカーの程度により影響を受けない方法は知られていない。 定量的イムノアッセイ及び他の結合アッセイ（例えばレセプター結合アッセイ ）は、種々の組成のサンプルにも生物的に関連し得る極めて大量の物質を測定す ることを可能にすることも知られている。しかしながら一般に、アッセイ中のサ ンプル当り１つのパラメータのみがこの方法において決定される。存在する種々 の測定方法の１つは、T．Chard〔An Introduction to Radioimmunoassay and Re lated Techniques：Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bi ology，4th ed.，Elsevier Science Publishers，Amsterdam（1990）〕である。 全ての結合アッセイの基礎はアイソトープでラベルされた化合物の高い検出感度 であり、又はリガンド−レセプター反応の高い特異性でのいくつかの他の手段に よる。 しかしながら、周知のアッセイ方法は、次の欠点がある： 同じサンプル内で種々の被検体を同時に測定するための方法は、被検体への種 々の放射能、蛍光又は酵素標識プローブの結合に基づく。この場合、被検体の定 量的測定のためのプローブの未結合又は 結合活性は、次の分離及び洗浄の後に一般に測定される。この場合、利用できる 異なるプローブラベルの量は、かなり限定される。これにより、例えばプローブ ラベルとしての異なるラジオアイソトープの場合、個々のシグナルの量的正確さ の迅速な損失を導くいわゆるオーバーラッピング現象がおこる。プローブラベル としての種々の酵素の組合せは、その系における酵素反応の同時測定を許容する 反応条件についての必要な調査により、その実行可能性が更に妨げられることに よるかなりの問題を引きおこす。 その方法の感度は、例えばマトリックスとプローブとの間の非特異的相互作用 により、又はプローブの部分への限られた標識能力により、限定される。その方 法を上手く行うには、得られたサンプル材料が精密に検査されることが必要とさ れる（例えば、全血液からの血清又は血漿の生産、有機溶媒でのサンプルの抽出 、クロマトグラフィー法を用いる被検体の濃縮）。 その方法を上手く行うために、結合及び未結合レセプター又はリガンドの分離 に用いられる分離及び洗浄ステップがほとんどの場合に本質的である。 ラジオイムノアッセイを行うために、高価で取扱いの複雑な放射性核種を用い ることが必要である。 実際、以前に用いたマーカーの保存は、それらが不安定である（ラジオイムノ アッセイ）ため新しく作られなければならないか、又は環境的影響への感受性に より反応するかのいずれかであるので、しばしば問題を引きおこす。 それゆえ本発明の目的は、先行技術の欠点を克服し、特に放射性物質及び結合 したマーカーの程度を用いることなく、未結合のマーカーの先の分離を必要とせ ず、保持部位を検出することができる新しい方法及び物質を開発することである 。 この目的は本発明により達成される。 液体及び／又は固体相における被検体の定性的及び／又は定量的検出が、イム ノアッセイ又は他の結合アッセイで同定されるべき磁気ラベリングとして強磁性 又はフェリ磁性コロイド状粒子を用いる場合に可能になり、そしてそれらの磁化 が測定変数として測定されることを見い出した。 以下に、イムノアッセイ又は他の結合アッセイを行うための周知の方法の欠点 を克服する方法が最初に記載される。 本発明による方法は、（以下に被検体としても言及される）同定されるべき物 質又は構造特異的物質と組み合わされた以下に磁気ラベリングとしても言及され るコロイド状強磁性又はフェリ磁性物質を用いることに基づく。このような、本 出願に更に詳説される被検体又は構造特異的物質との磁気ラベリングの本発明に よる組合せも磁気マーカーとして以下に言及される。コロイド状物質又はコロイ ド状粒子という言葉の使用を通して、コロイドの大きさの範囲における粒子又は 物質の径の範囲、即ち１nm〜約1000nmの範囲とほとんどの場合水性である適切な 分散媒体中の分散された相としてのそれらの使用との両方が記載される。改良さ れた保存性及び輸送性を確実にするために、コロイド状物質又は粒子は乾燥形態 又は凍結されて存在し得；しかしながら、測定が行われる場合、それらは分散さ れた状態で液相に存在する。 更に、本方法は、磁気ラベリング又は磁気マーカーを磁化した後、磁化の緩和 を測定することを可能にする特別の測定技術に基づく。本願により詳細に記載さ れる本発明によるこのような測定方法は、磁石緩和測定（Magnetrelaxometrie） もしくは磁気緩和測定又は磁石緩和測定検出（magnetrelaxometrische）として も以下に言及される。 本発明の重要な原理は、外部磁場を除去した後、自由に動くことができる強磁 性又はフェリ磁性コロイド状粒子の磁化を２つの異なるメカニズム： ｉ）時定数が粒子をとりまくパラメータを主に反映するシェルを含む粒子の流 体力学的径、液状担体の粘度、及び温度に依存することによる、周囲の液体内部 の全コロイド状粒子の回転；このメカニズムは以下にBrownian緩和又は外来性超 常磁性としても言及される及び ii）時定数が用いられる粒子の材料及び形状（用いられる粒子材料の異方性定 数）、容量及び温度に極めてセンシティブに依存することによる、コロイド状粒 子内の内部磁化ベクターの回転；これらは基本的に粒子の固有のパラメータであ り；このメカニズムは以下 によって測定時間内に緩和することである。 本発明による目的は、イムノアッセイ又は他の結合アッセイにお an緩和により速い強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子を同定されるべき磁気ラ ベリングとして用いることにより達成される。結合により引きおこされる、主要 な緩和メカニズムの変化又は粒子容量のスケールアップのため、このような強磁 性又はフェリ磁性コロイド状粒子の使用が、測定サンプル中に同時に存在する未 結合の磁気マーカーに加えて、結合した磁気マーカーの部分を特異的に測定する ことを可能にする。 本発明による方法の場合、センシティブな測定方法を用いることにより、液相 又は固相の両方において行われ得る極めて高感度な結合特異的イムノアッセイ又 は他の結合アッセイが、強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子を用いて組み立て られる。特に高感度の測定 方法として、サンプルを磁場で磁化した後、及びその場を除去した後、（例えば 超電導量子干渉装置（SQUIDs）、インダクションコイル、フラックスゲート磁力 計、巨大磁気抵抗センサー、又は磁気抵抗コンバーターのような）高感度の磁場 ディテクターにより、磁化の緩和が測定され得、又はサンプルの複合体磁化率が 磁場の度数の関数として測定され得る。 更に、本発明による液相及び固相における被検体の磁石緩和測定定量検出のた めの方法において、最初に被検体に結合する構造特異的物質が強磁性又はフェリ 磁性コロイド状粒子でラベルされる。 これらの磁気的に標識された構造特異的物質は、測定されるべき液体又は固定 化されたサンプルにおいて用いられ、測定されるべきサンプルは、外側から適用 された磁場により磁化される。外部の場が除かれた後、磁気マーカーの磁化の緩 和が磁場センサーにより測定される。 測定結果の評価は、当業者に周知である方法に従って、以下に記載される直接 的アッセイ法においても行われる。 本発明による液相及び固相における被検体の磁石緩和測定定量検出のための方 法は、被検体を最初に ｉ）強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識し、そして、 ii）これらの磁気的に標識された被検体を測定されるべき液体又は固体サンプ ルに用いて、被検体に特異的に結合する物質を加え、そして測定されるべきサン プルを外部から適用される磁場により磁化させ、外部磁場を除去した後、磁気マ ーカーの磁化の緩和が磁場センサーにより測定される。 測定結果の評価は、当業者に周知である方法において、以下に記載される比較 アッセイ法、即ち、イムノアッセイ又はラジオアッセイに用いられるような方法 と同様の方法においても行われる。 先の両方の場合において、結合により変化される磁気ラベリング又は磁気マー カーの複合体感受率の測定は、分析のための頻度の関数としても用いられ得る。 例外的な場合にのみ先に行われ得る結合したマーカーと未結合のマーカーとの 区別は、それらの異なる緩和メカニズムの使用又は結合により引きおこされる磁 気マーカーの緩和時間の影響により可能になる。 固相に結合した被検体は、特に最初に ｉ）測定の時間範囲に緩和する強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識さ れ、それにより強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子 を有するように選択され、そして ii）これらの磁気的に標識された物質が測定されるべき固定化されたサンプル に用いられ、そして測定されるべきサンプルが外部から適用される適切な強度の 磁場により磁化され、そして外部の場が除去された後、磁気マーカーの磁化の緩 和が磁場センサーにより測定され、それにより固相に結合した磁気マーカー及び 未結合の磁気マーカーの異なる緩和行動が分析に用いられる。 被検体に結合する構造特異的物質により、本発明により同定され得る。測定変 数として、サンプルの複合体磁化率度数の関数として測定され得る。 この場合も、構造特異的物質のかわりに同定されるべき被検体を磁気ラベリン グに組合わせることが可能である。 液相において、本発明による被検体は、特に、最初に ｉ）強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識され、それにより強磁性又は フェリ磁性コロイド状粒子が、測定条件下で、Browni そして ii）これらの磁気的に標識された物質が測定されるべきサンプルに用いられ、 そして測定されるべきサンプルが外部から適用される適切な強度の磁場により磁 化され、そして外部の場が除去された後、磁気マーカーの磁化の緩和が磁場セン サーにより測定され、それにより未結合の磁気マーカーに対する被検体と結合し た磁気マーカーの異なる緩和行動が分析に用いられる。 被検体に結合する構造特異的物質により、検出され得る。測定変数として、サ ンプルの複合体磁化率度数の関数として測定され得る。 この場合も、構造特異的物質のかわりに同定されるべき被検体を磁気ラベリン グに組合わせることが可能である。 構造特異的物質は、特定の構造に特異的に結合する全ての物質として定義され る。構造特異的物質は、特に、抗体、抗体フラグメント、ビオチン又はアビジン 及びストレプトアビジンのようなビオチンに結合する物質、サイトカイン、リン ホカイン、エンドセリンもしくはそれらのアンタゴニストのようなアゴニスト、 特異的ペプチド及び蛋白質、レセプター、酵素、酵素基質、ヌクレオチド、リボ 核酸、デオキシリボ核酸、炭水化物、リポ蛋白質等として定義される。構造特異 的物質としては、その結合定数が10⁵〜10¹⁵(mol／ｌ)^-1の範囲である物質が好ま しい。特に好ましいのは、その結合定数が10⁷〜10¹⁵(mol／ｌ）^-1の範囲である 物質である。 同定されるべき構造特異的物質又は被検体は、免疫化学、ペプチド化学及び蛋 白質化学と同様である方法によって、強磁性又はフェリ磁性粒子で標識され得る 。特に有利なのは、同定されるべき構造特異的物質又は被検体と強磁性又はフェ リ磁性粒子の安定化シェルを形成する物質との間の共有結合である。特に適切な 方法の例は、 カルボジイミドによる活性化及びカップリング〔Jakoby and Wilchek，eds．；M ethods Enzymol．(1974)34〕、次に更なる安定化のために任意に還元される過ヨ ウ素酸塩を炭水化物を含む化合物へ露出した後のシック塩基の形成(Wichek and Bayer，eds.，Methods Enzym．184：177)、グルタルジアルデヒドによるカップ リング (Heitzmann and Richards，Proc.Natl.Acad.Sci USA 71（1974）3537)、 チオール開裂物質とのブロモアセチル化粒子の架橋（Angerer et al.；Cell 9（ 1976）81）及び還元性アルキル化(Bayer et al.：J.Histochem.Cytochem．24（1 976）933)である。 強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子は、任意に例えば蛋白質、炭水化物のよ うな他のアジュバント及び天然、合成、部分合成表面活性物質等の存在下で、粒 子を製造後に構造特異的物質の溶液内に直接入れることにより、又は構造特異的 物質の存在下で直接製造することにより、同定されるべき構造特異的物質又は被 検体から作られた安定化シェルでも作られ得る。 これらの粒子を含む適切なコロイド状粒子及び懸濁液は、例えばWO 92／12735 、WO 92/22586、EP 0 186 616及びUS 4,101,435に記載される。 本発明による方法は、例えば受精、組織適合性、アレルギー学、毒物学、病理 学、環境分析及び医療診断に用いられ得る。 本発明の他の目的は、自由に動くことができる強磁性又はフェリ磁性粒子のコ ロイド状懸濁液及び同定されるべき構造特異的物質又は被検体からなる、磁石緩 和測定検出のための化合物である。ここで構造特異的物質は、特に、抗体、抗体 フラグメント、ビオチン、又はアビジン及びストレプトアビジンのようなビオチ ンに結合する物質、サイトカイン、リンホカイン、エンドセリン又はそれらのア ンタゴニストのようなレセプターに特異的に結合するアゴニスト、 他の特異的ペプチド及び蛋白質、レセプター、酵素、酵素基質、ヌクレオチド、 リボ核酸、デオキシリボ核酸、炭水化物、リポ蛋白質等として定義される。 磁石緩和測定検出のための化合物は、識別され得る緩和時間とのいくつかの強 磁性又はフェリ磁性粒子の組合せからもなり得る。なぜなら、個々に識別され得 る測定結果は、緩和時間の極めてせまい分布及び／又はサンプル内の種々の構造 特異的物質又は被検体についての磁気モーメント各々を有する異なる磁気ラベリ ングの使用を通して達成され得る。結果として、いくつかの被検体の直接同時の 定量測定が可能になる。 懸濁媒体として、コロイド状粒子が自由に動くことができる全ての液体が適し ている。特に適切なのは、水、表面活性アジュバントの水溶液、例えば界面活性 剤又はオリゴマーもしくはポリマー炭水化物及び蛋白質、並びにアルコール、例 えばグリセロール及びポリエチレングリコールとの水の混合物である。懸濁媒体 は、例えば一般的な塩のような浸透圧を変化させるアジュバントを更に含み得る 。更に、例えばホスフェートのようなpHを決定する緩衝物質が含まれ得る。 強磁性又はフェリ磁性コロイド状材料から、同定されるべき構造特異的物質又 は被検体と共に作られた化合物は、任意に他のアジュバント、例えば乾燥を容易 にし、又は（例えば凍結乾燥物として）乾燥産物の安定性を増加させるものと組 み合わせて、乾燥形態でも存在し得る。 被検体を見い出すのは、分離及び洗浄ステップで、又はそれらなしで行われ得 る。結合した磁気マーカーと未結合の磁気マーカーとの間の分離ステップで測定 を行うことにおいて、本発明による全ての強磁性又はフェリ磁性コロイド状物質 が、磁気緩和測定検出のた めの磁気ラベリングとして用いられ得る。これらの場合において、 や行われる必要はない。 物理的メカニズムに基づく結合の同定のため、非特異的測定シグナル（マトリ ックス現象）は大きく除外される。これによりその過程の特異性は構造特異的物 質の“本当の”特異性（抗体の交差反応、リガンドの非特異的結合）にのみ依存 する。 本発明による方法の高い感度のため、一般に出くわす結合アッセイの検出限界 下にあることが容易である。 磁気ラベリングの物質として、磁気緩和測定検出に適した媒体中にコロイド状 に分散され得る全ての強磁性又はフェリ磁性材料が用いられ得る。結合及び非結 合磁気マーカーの間の分離ステップなしに行われる磁気緩和検出のための物質を 用いる場合、測定条件下の 時間より長くなければならない。特に適しているのは、10^-8〜10^-1 緩和時間を有する全ての強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子である。分離ステ ップなしに測定を行うために、用いられる分散媒体の粘度は、懸濁媒体が基本的 にBrownian緩和の時定数を決定するので、強磁性及びフェリ磁性粒子の緩和時間 並びに測定時間に適合されなければならない。 より長い鉄、酸化鉄、バリウムフェライト、ストロンチウムフェライト、コバル ト、ニッケル、ニッケルフェライト、コバルトフェライト及び二酸化クロムから 作られた強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子である。 せまい分布の粒径及び／又は磁気モーメントを有する磁気ラベリ ングの使用が一般に有利である。せまい分布の粒径を有する画分への磁気ラベリ ングの分離は、例えばクロマトグラフィー法により、又は特定のろ過方法（例え ばガラスキャピラリーシステム又はタンジェントろ過(tangential filtration) ）により、分子ふるいを用いることにより、又は遠心により、行われ得る。出来 る限り均一であるモーメントを有する磁気ラベリングが、例えば磁気勾配場にお ける分類により作られ得る。 強磁性及びフェリ磁性物質は、オリゴマーもしくはポリマー炭化水素、蛋白質 、ペプチド、ヌクレオチド、界面活性剤、他のモノマー、オリゴマー、又はポリ マー及び／又は脂質から作られたシェルで安定化され得る。 強磁性及びフェリ磁性物質の粒径は有利には、１nm〜400nm の間である。特に 好ましいのは、１nm〜100nm の粒径である。 本方法によれば、磁石−緩和測定検出は、最初に、適切な磁場により研究され るべきサンプルを磁化することを可能にし、次にその磁気マーカーの磁気緩和を 測定する測定配置で行われる。本実施例で用いた磁石緩和測定検出のための測定 配置を図１に示す。全ての他の既に周知である方法(JP−235774及び WO 91／152 43)と対照的に、本発明による方法における磁化の緩和の測定において、それは 測定される磁場の存在下での静磁化でなく、むしろ磁場の欠損下での時間変化で ある。これによるデータは利用できるマーカーの結合状態に基づくデータのみで ある。更に、反磁性又は常磁性構成物又は混入物による測定シグナルの影響がこ れにより避けられる。更に、測定感度は決定的に増加する。 磁場の存在下での例えば SQUIDのような高感度センサーにより磁場を適切に変 化させることによるマーカーの振動数依存の磁化の測定（振動数の関数としての 複合体磁化率の決定）を行うことが更に 可能である。この場合、別個に決定され得る反磁性又は常磁性構成物の振動数依 存性と反対に、磁気マーカーの磁化率の特定の振動数依存性が用いられる。また 、この方法は、 WO 91／15243 で提唱される超常磁性物質の磁化率を決定する ための方法から異なる。WO91／15243 においては、磁気マーカーの磁化率の振動 数も、この特性を用いるための方法も記載されていない。 本発明の他の態様は、血液中を循環するマーカーから影響を受けずに保持部位 及び特異的に結合したマーカーの程度を検出することを可能にする方法に関する 。これらの方法において、先行技術のシンチグラフィー方法を行うことを避ける ことができない過去のもののような放射能物質の使用が避けられる。 本発明による方法は、液体中の結合した及び未結合の磁気マーカーの間の緩和 時間の差、並びに磁気マーカーが固相に結合することによる支配的な緩和メカニ ズムの変化が生体内の物質又は構造の磁石緩和測定検出のためにも用いられ得る という事実に基づく。このような方法は、以下に免疫マグネトグラフィー又はイ ムノマグネトグラフィーとしても言及される。 測定の時間範囲内でヒトに用いられる緩和性磁気マーカーの空間的分布の生体 内測定は、次の２つの異なる測定方法によって行われ得る。 １．有利な体積で可能な限り均一な磁場の形成、その場の除去、そしてマルチ チャンネルセンサーによる緩和性磁場の空間的分布の測定。前記センサーは可能 な限り完全に測定対象物を囲うべきである。十分な測定情報を形成するために、 測定対象物の連続的推察(Abrasterung)での繰返し測定も可能である。 ２．空間内に限定された局所的な場の連続的な形成、その場の除去、そして単 一チャンネルセンサーによる緩和性磁場の空間的分布 の測定。マルチチャンネルセンサーの使用も可能である。 両方の方法において、測定対象物の磁化と全ての３つの空間的方向において結 果として生ずる磁場の測定との両方の可能な限り多くのデータを得ることが好ま しい。 測定は、生体電流の磁場の分析にも用いられるようなモデルにより記載され得 る。磁気双極子、多極子又は多重双極子のモデルが基質として用いられる。モデ ル、特に双極子又は多極子の部位の特別のパラメータは、測定データとモデルパ ラメータとの間の偏差を最小にとる適切な近似方法によって見い出される。これ らのパラメータは、磁化粒子の空間的分布に基づく情報を提供する。 同様の試みは、生体電流の磁場の分析について周知であり、証明されている。 免疫マグネトグラフィーに適した方法及び化合物として、磁石緩和測定検出に ついて言及される全ての方法及び物質が用いられ得る。 免疫マグネトグラフィーを行うのに特に適しているのは、生分解可能な適合す る磁気ラベリングである。これは、酸化鉄からなる磁気ラベリングが特に適して いる。 生体内で結合特異的磁石緩和測定検出を行うために、体液で体温において構造 特異的物質と共にヒトの体に導入される強磁性又はフ 短いことが必要である。 免疫マグネトグラフィーにおいて、構造特異的物質は特に同定されるべきヒト の体の構造に特異的に結合する全ての物質として規定される。特に適しているの は、抗体、抗体フラグメント、レセプターに特異的に結合するアゴニストもしく はそれらのアンタゴニスト、特異的ペプチド及び蛋白質、レセプター、酵素、酵 素基質、ヌク レオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、炭水化物、又はリポ蛋白質である。レ セプターに結合するアゴニストの中で、特にサイトカイン、リンホカイン、又は エンドセリンが適している。 更に適しているのは、10⁵〜10¹⁵(mol／ｌ）^-1の範囲の結合定数を有する全て の構造特異的物質である。特に適しているのは、10⁷〜10¹⁵(mol／ｌ）^-1の範囲 の結合定数を有する全ての構造特異的物質である。 以下の実施例は、本対象を限定する目的でなく、本発明の対象をより詳細に説 明するのに用いられる。 実施例１ 以下にアンチコラーゲンIIIとして言及されるコラーゲンIIIに対するモノクロ ーナル抗体 100μｇを 0.1Ｍ重炭酸ナトリウム溶液 500μｌ中に溶かす。１ｌ当 り１mol のFeを有し、粒径約40nmのデキストランコートされた磁鉄鉱懸濁液（Me ito Sangyo）１mlをSephadexカラム（Pharmacia PD10）を通して 0.1Ｍ重炭酸ナ トリウムで緩衝する。その懸濁液に10mmolの過酸化ナトリウム 0.5mlを加える。 その溶液を２時間、暗所に放置する。次にそれを 0.1Ｍ重炭酸ナトリウム溶液で PD10を通して溶出する。その溶液にアンチコラーゲンIII溶液を加える。その混 合物を４℃で３時間、暗所に放置する。次に５mgの NaBH₄を固体として加え、簡 単にかきまぜる。その混合物を４℃で８時間、暗所に放置し、次に（以下に mag −アンチコラーゲンIIIとして言及される）磁鉄鉱でラベルされたアンチコラー ゲンIIIをリン酸緩衝された一般的塩溶液（以下、PBS、pH 7.4）でPD10カラムを 通して溶出する。 200μｌの緩衝液（リン酸緩衝された一般的な塩溶液(PBS)）中に５μｇのコラ ーゲンIIIの溶液をポリスチレンサンプリング容器内でインキュベートする。次 にその液相を捨てる。そのサンプリング 緩衝された一般的な塩溶液で３回、流す。200μｌのPBST中の mag−アンチコラ ーゲンIII ５μｌをサンプルに加える。それを室温で１時間、インキュベート する。次にそのサンプルを、スクイドディテクター下４cmに２mTの強度の場内の 磁気的にシールドされたチャンバー内で磁化する（図１を参照のこと）。磁場を 切った後 400ミリ秒に、100秒間にわたって、緩和測定を行う。サンプル中で、 減少する場から緩和を同定する。コラーゲンIIIを含むサンプルの緩和シグナル は図２に示される。 実施例２ pH 7.4の PBS緩衝液 200μｌ中のコラーゲンＶ ５μｌの溶液をポリスチレン サンプリング容器内でインキュベートする。次に、その液相を捨てる。そのサン プリング容器をpH 7.4のPBST洗浄緩衝液で３回洗浄する。200μｌのPBST中の実 施例１により作られた mag−アンチコラーゲンIII ５μｌをサンプルに加える 。それを室温で１時間、インキュベートする。次に、サンプルを SQUIDディテク ターの下４cmで２mTの強度で場の中の磁気的にシールドされたチャンバー内で磁 化する（図１を参照のこと）。磁場を切った後、サンプルを測定する。磁場を切 った後 400ミリ秒に、緩和測定を 100秒間にわたって行う。コラーゲンを含むサ ンプル中において、測定信頼度の限界内で減衰する磁場は検出され得ない（図３ を参照のこと）。 実施例３ 100μｌのグルタルジアルデヒド溶液（水中３％）を１mlの PBS中 100μｇの コラーゲンIIIの溶液に加える。その溶液を４℃で24時間、撹拌して、次に遠心 してとる。その沈殿は沈殿した架橋されたコラーゲンIIIを含んでいる。その架 橋されたコラーゲンIIIを１mlの PBS中に懸濁する（サンプル１）。100μｌのグルタルジアルデヒド溶液（水中 ３％）を１mlの PBS中 100μｇのコラーゲンＶの溶液に加える。その溶液を４℃ で24時間、撹拌し、次に遠心してとる。そのペレットは沈殿した架橋されたコラ ーゲンＶを含んでいる。架橋されたコラーゲンＶを１mlの PBS中に懸濁する（サ ンプル２）。実施例１の mag−アンチコラーゲンIII懸濁液の各々をサイクル１ 及び２に加える。それを37℃で１時間、インキュベートする。次に両方のサンプ ルをSQUIDディテクターを通して２mTの強度で磁場内のシールドされたチャンバ ー内で磁化する。磁場を切った後 400ミリ秒に、緩和測定を行う。サンプル１の 場合、減衰する場を測定する。サンプル２の場合、減衰する場は検出され得ない 。 実施例４ PBS(pH 7.4)中 1.9mg／mlのコラーゲンIII溶液10mlから、次の希釈液：10,000 ng／ml、1,000ng／ml、100ng／ml、10ng／ml、１ng／mlの各々５mlを作る。 各々の希釈液からポリスチレンチューブ（2.5ml容量）に各々１mlで３回、ピ ペットする。それを37℃で１時間、阻害する。次にそのチューブの成分を捨てる 。そのチューブを各々１mlのPBSTで３回、洗浄する。 実施例１により作られた磁鉄鉱標識抗体の１：100 希釈液１mlを各々のチュー ブに加える。そのチューブを室温で１時間、放置する。次にそのサンプルを図１ に概説される測定配置で磁化（２mT）し、磁場を切った後、100秒間にわたって 緩和を測定する。磁場を切った後 200ミリ秒及び 100秒の測定された磁束密度Ｂ の差の評価をサンプル中のコラーゲン濃度に基づく図４に再現する。 実施例５ 以下にアンチコラーゲンIIIと言及されるコラーゲンIIIに対するモ ノクローナル抗体 100μｇを 0.1Ｍ重炭酸ナトリウム溶液 500μｌ中に溶かす。 リッター当り１mol のFeを有し、粒径約40nmのデキストランコートされた磁鉄鉱 懸濁液１mlを 0.1Ｍ重炭酸ナトリウムでSephadexカラム（Pharmacia PD10）を通 して緩衝する。その溶液を２時間、暗所に放置する。次に、それを 0.1Ｍの重炭 酸ナトリウム溶液でPD10を通して溶出する。アンチコラーゲンIII溶液を懸濁液 に加える。次に５mgの NaBH₄を固体として加え、簡単にかきまぜる。その混合物 を４℃で８時間、暗所に放置する。次に（mag−アンチコラーゲンIIIとして以下 に言及される）磁鉄鉱標識されたアンチコラーゲンIIIをリン酸緩衝された一般 的な塩溶液(PBS,，pH 7.4)でPD10カラムを通して溶出する。 mag−アンチコラーゲンIII懸濁液の各々20μｌを、更に 0.1％のPBSTを含むpH 7.4のリン酸緩衝された一般的な塩溶液 390μｌで希釈し、各々の 500μｌの容 量を有するポリアクリル酸が作られた３つのサンプリング容器内に充填する。ヒ ト血清アルブミンの水溶液(ml当りアルブミン１mg)100μｌを第１のサンプリン グ容器に加える（サンプル１）。PBST中のコラーゲンの溶液(ml当り１μｇのコ ラーゲン)100μｌを第２のサンプリング容器に加える（サンプル２）。PBST中コ ラーゲンIIIの溶液(ml当り１μｇのコラーゲン)100μｌの第３のサンプリング容 器に加える（サンプル３）。蛋白質溶液を加えた後 200秒に、サンプルを図１に 概説される測定配置で磁化（２mT）し、そして磁場を切った後20ミリ秒に、各々 の場合１秒で始まる磁気緩和を測定する。サンプル１及び２において、減衰する 磁場は測定の信頼度の限界内で検出され得ない。しかしながら、サンプル３にお いて、減衰する磁場が検出され得る。サンプリング容器を空にし、各々500μｌ のPBSTを３回、流した後、測定をくり返す。測定信頼度の限界内で減衰する磁場 が検出され得るサンプリン グ容器はない。 実施例６ 100μｇのアビジンを 500μｌの 0.1Ｍ重炭酸ナトリウム溶液中に溶かす。リ ッター当り１molの Feを有し、粒径約40nmのデキストランコートされた磁鉄鉱懸 濁液１mlを 0.1Ｍ重炭酸ナトリウムで、Sephadexカラム（Pharmacia PD10）を通 して緩衝する。10mmolの過酸化ナトリウム溶液 0.5mlをその懸濁液に加える。そ の溶液を暗所で２時間、放置する。次にそれを 0.1Ｍ重炭酸ナトリウム溶液でPD 10を通して溶出する。アビジン溶液を懸濁液に加える。その混合物を４℃で３時 間、暗所に放置する。次に５mgの NaBH₄を固体として加え、簡単にかきまぜる。 その混合物を４℃で８時間、暗所に放置する。次に（以下、mag−アビジンとし て言及される）磁鉄鉱標識されたアビジンをリン酸緩衝された一般的な塩溶液(P BS,，pH 7.4)でPD10カラムを通して溶出する。 １mgのウシ血清アルブミンをビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドと接合し （以下ビオチンアルブミンと呼ぶ）、PBSで１μｇ／mlの濃度に希釈する。 １mlのビオチン−アルブミン希釈液をポリスチレンサンプリング容器内で室温 で３時間、インキュベートする。次にその液相を捨て れた一般的な塩溶液（PBST）で３回洗浄する。そのサンプルに５μｌの mag−ア ビジンを加える。それを室温で１時間、インキュベートする。次に、そのサンプ ルをスクイドディテクター下４cmで２mTの強度で場内に磁気的にシールドされた チャンバー内で磁化する（図１を参照のこと）。磁場を切った後 400ミリ秒に、 100秒間にわたって、緩和測定を行う。サンプル中で、減衰する磁場を測定する 。 PBS中のウシ血清アルブミンの希釈液(0.1mg／ml) １mlをポリスチレンサンプ リング容器内で室温で３時間、インキュベートする。次に、その液相を捨てる。 そのサンプリング容器を、0.1％ Tween サンプルに５μｌの mag−アビジンを加える。それを室温で１時間、インキュベ ートする。次にそのサンプルを、スクイドディテクター下４cmで、２mTの強度で 場内に磁気シールドされたチャンバー内で磁化する（図１を参照のこと）。磁場 を切った後 400ミリ秒に、 100秒間にわたって、緩和測定を行う。サンプル中で 、測定信頼度の限界内で減衰する磁場は測定されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トラームス，ルッツ ドイツ連邦共和国，デー−12103 ベルリ ン，ラインハルトシュトラーセ ５ (72)発明者 ブンテ，トマス ドイツ連邦共和国，デー−12307 ベルリ ン，ヒルベルトシュトラーセ ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液相及び／又は固相中の被検体を定性的及び／又は定量的に検出するため の方法であって、イムノアッセイ又は他の結合アッセイにおいて同定されるべき 磁気ラベリングとして強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子が用いられ、そして それらの磁化の緩和が測定変数として測定されることを特徴とする方法。 ２．磁気緩和測定により液相及び固相中の被検体を定量的に検出するための方 法であって、イムノアッセイ又は他の結合アッセイにおいて同定されるべき磁気 ラベリングとして強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子が用いられ、該粒子の測 定条件下でのブラウン（Br 徴とする方法。 ３．振動数の関数として複合体磁化率を測定することにより、液相及び固相中 の被検体を定量的に検出するための方法であって、イムノアッセイ又は他の結合 アッセイにおいて同定されるべき磁気ラベリングとして強磁性又はフェリ磁性コ ロイド状粒子が用いられ、ここで測定条件下での該粒子のブラウン緩和がネール 緩和より迅速に進行することを特徴とする方法。 ４．液相及び固相中の被検体を定量的に検出するための方法であって、前記被 検体に結合する構造特異的物質が、最初に、 ｉ）強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識され、次に、 ii）これらの標識された構造特異的物質が、測定されるべき液体の又は固定化 されたサンプルにおいて用いられ、前記測定されるべきサンプルが、外部から適 用される磁場により磁化され、そして前記外部からの場を除去した後、磁気マー カーの磁化の緩和が磁場センサーにより測定される ことを特徴とする方法。 ５．液相及び固相中の被検体を定量的に検出するための方法であって、前記被 検体が、最初に、 ｉ）強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識され、次に、 ii）これらの磁気的に標識された被検体が、測定されるべき液体の又は固定化 されたサンプルにおいて用いられ、該サンプルに前記被検体に特異的に結合する 物質が添加され、そして前記測定されるべきサンプルが、外部から適用される磁 場により磁化され、そして前記外部からの場を除去した後、磁気マーカーの磁化 の緩和が磁場センサーにより測定される ことを特徴とする方法。 ６．固相に結合した被検体を定量的に検出するための方法であって、前記被検 体に結合する構造特異的物質が、最初に、 ｉ）測定の時間範囲において緩和する強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で 標識され、それにより測定条件下でブラウン緩和がネール緩和より短い緩和時間 を有するように、前記強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子が選択され、次に ii）これらの磁気的に標識された物質が、測定されるべき固定化されたサンプ ルにおいて用いられ、そして前記測定されるべきサンプルが、外部から適用され る磁場により磁化され、そして前記外部からの場を除去した後、磁気マーカーの 磁化の緩和が磁場センサーにより測定され、それにより未結合の前記磁気マーカ ーに対する前記被検体に結合した前記磁気マーカーの異なる緩和挙動が分析のた めに用いられる ことを特徴とする方法。 ７．測定の時間範囲において緩和する強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で 同定されるべき被検体が標識され、ここで測定条件下 での前記粒子のブラウン緩和がネール緩和より短い緩和時間を有し、そして更に 、前記被検体に特異的に結合する物質が前記測定されるべきサンプルに添加され るか、又は前記被検体に特異的に結合する物質が前記サンプル中に固定化されて 存在することを特徴とする請求項６に記載の方法。 ８．液相中に存在する被検体を定量的に検出するための方法であって、前記被 検体に結合する構造特異的物質が、最初に、 ｉ）強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識され、ここで測定条件下での 前記粒子のブラウン緩和がネール緩和より短い緩和時間を有し、次に、 ii）これらの磁気的に標識された物質が測定されるべきサンプルにおいて用い られ、そして該測定されるべきサンプルが、外部から適用される磁場により磁化 され、そして前記外部からの場を除去した後、磁気マーカーの磁化の緩和が磁場 センサーにより測定され、それにより未結合の前記マーカーに対する前記被検体 に結合した前記磁気マーカーの異なる緩和挙動が分析のために用いられる ことを特徴とする方法。 ９．同定されるべき被検体が強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識され 、ここで測定条件下での前記粒子のブラウン緩和がネール緩和より短い緩和時間 を有し、そして更に、前記被検体に特異的に結合する物質が前記測定されるべき サンプルに添加されることを特徴とする請求項８に記載の方法。 10．検出のために、振動数の関数としての複合体磁化率の測定が用いられるこ とを特徴とする請求項１又は４〜９のいずれかに記載の方法。 11．前記構造特異的物質が、抗体、抗体フラグメント、ビオチン、又はアビジ ン及びストレプトアビジンのようなビオチンに特異的 に結合する物質、レセプターに特異的に結合するアゴニストもしくはそれらのア ンタゴニスト、特異的ペプチド及び蛋白質、レセプター、酵素、酵素基質、ヌク レオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、炭水化物、又はリポ蛋白質であること を特徴とする請求項１〜10のいずれかに記載の方法。 12．前記レセプターに結合するアゴニストが、サイトカイン、リンホカイン、 又はエンドセリンであることを特徴とする請求項11に記載の方法。 13．前記構造特異的物質が、10⁵〜10¹⁵(mol／ｌ)^-1の範囲の結合定数を有する ことを特徴とする請求項11又は12に記載の方法。 14．前記構造特異的物質が、10⁷〜10¹⁵(mol／ｌ)^-1の範囲の結合定数を有する ことを特徴とする請求項11又は12に記載の方法。 15．磁場センサーとして、超電導量子干渉計(SQUID)、誘導コイル、フラック スゲート(flux gate)磁力計、巨大磁気抵抗センサー、又は磁気抵抗性コンバー ターが用いられることを特徴とする請求項１〜14のいずれかに記載の方法。 16．測定がサンプル中の２以上の異なる被検体で行われることを特徴とする請 求項１〜15のいずれかに記載の方法。 17．識別され得るブラウン又はネール緩和時間を有する２以上の強磁性又はフ ェリ磁性物質が用いられることを特徴とする請求項16に記載の方法。 18．磁気緩和測定により、又は振動数の関数としての複合体磁化率により液相 及び固相中の被検体を定量的に検出するための化合物であって、構造特異的物質 又は同定されるべき物質との強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子の組合せから なることを特徴とする化合物。 19．磁気緩和測定により、又は振動数の関数としての複合体磁化 率の測定により、液相及び固相中の被検体を定量的に検出するための化合物であ って、該化合物が、構造特異的物質又は同定されるべき物質との強磁性又はフェ リ磁性コロイド状粒子の組合せからなり、ここで測定条件下での前記粒子のブラ ウン緩和が、ネール緩和より迅速に進行することを特徴とする化合物。 20．前記強磁性及びフェリ磁性物質が、１〜400nm の範囲の粒径を有すること を特徴とする請求項１〜17のいずれかに記載の方法。 21．前記強磁性及びフェリ磁性物質が、１〜100nm の範囲の粒径を有すること を特徴とする請求項１〜17のいずれかに記載の方法。 22．前記強磁性及びフェリ磁性物質が、オリゴマーもしくはポリマー炭水化物 、蛋白質、ペプチド、ヌクレオチド、及び／又は脂質から作られたシェルで安定 化されることを特徴とする請求項１〜17のいずれかに記載の方法。 23．前記強磁性及びフェリ磁性物質が、１〜400nm の範囲の粒径を有すること を特徴とする請求項18又は19に記載の方法。 24．前記強磁性及びフェリ磁性物質が、１〜100nm の範囲の粒径を有すること を特徴とする請求項18又は19に記載の方法。 25．前記強磁性及びフェリ磁性物質が、オリゴマーもしくはポリマー炭水化物 、蛋白質、ペプチド、ヌクレオチド、界面活性剤、ポリマー及び／又は脂質から 作られたシェルで安定化されることを特徴とする請求項18，19，23又は24のいず れかに記載の方法。 26．前記構造特異的物質が、抗体、抗体フラグメント、ビオチン、又はアビジ ン及びストレプトアビジンのようなビオチンに結合する物質、レセプターに特異 的に結合するアゴニストもしくはそれらのアンタゴニスト、特異的ペプチド及び 蛋白質、レセプター、酵素、酵素基質、ヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ 核酸、炭水化物、又はリポ蛋白質であることを特徴とする請求項18，19，23又は 24のいずれかに記載の方法。 27．受精、組織適合性、アレルギー学、感染学、衛生学、遺伝学、ウィルス学 、細菌学、毒物学、病理学、環境分析又は医療診断における請求項１〜17又は20 〜22のいずれかに記載の方法の使用。 28．受精、組織適合性、アレルギー学、感染学、衛生学、遺伝学、ウィルス学 、細菌学、毒物学、病理学、環境分析又は医療診断における請求項18，19又は23 に記載の化合物の使用。 29．構造特異的物質との強磁性もしくはフェリ磁性物質の組合せ又は請求項１ 〜17又は20〜22のいずれかに記載の方法で同定されるべき被検体との強磁性もし くはフェリ磁性物質の組合せの使用。 30．ヒトの体内に導入される強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子を磁気緩和 測定で検出するための方法であって、前記粒子の磁化のネール緩和が、磁場を除 去した後に測定されることを特徴とする方法。 31．免疫マグネトグラフィーの方法であって、構造特異的物質が、最初に、 ｉ）フェリ磁性又は強磁性コロイド状粒子で標識され、次に ii）これらの標識された構造特異的物質が生きている生物内に導入され、関心 の生物の容量が外部から適用される磁場により磁化され、そして前記外部からの 場が除去された後、磁気マーカーの磁化の緩和が磁場センサーにより測定される ことを特徴とする方法。 32．前記構造特異的物質が、抗体、抗体フラグメント、ビオチン、又はアビジ ンもしくはストレプトアビジンのようなビオチンに特異的に結合する物質、レセ プターに特異的に結合するアゴニストもしくはそれらのアンタゴニスト、特異的 ペプチド及び蛋白質、レセプター、酵素、酵素基質、ヌクレオチド、リボ核酸、 デオキシリボ 核酸、炭水化物、又はリポ蛋白質であることを特徴とする請求項30又は31に記載 の方法。 33．前記レセプターに結合するアゴニストが、サイトカイン、リンホカイン、 又はエンドセリンであることを特徴とする請求項22に記載の方法。 34．前記構造特異的物質が、10⁵〜10¹⁵(mol／ｌ)^-1の範囲の結合定数を有する ことを特徴とする請求項32又は33に記載の方法。 35．前記構造特異的物質が、10⁷〜10¹⁵(mol／ｌ)^-1の範囲の結合定数を有する ことを特徴とする請求項32又は33に記載の方法。 36．磁場センサーとして、超電導量子干渉計(SQUID)、誘導コイル、フラック スゲート(flux gate)磁力計、巨大磁気抵抗センサー、又は磁気抵抗性コンバー ターが用いられることを特徴とする請求項30〜35のいずれかに記載の方法。 37．緩和測定のかわりに、振動数の関数としての複合体磁化率の測定が評価の ために用いられることを特徴とする請求項30〜36のいずれかに記載の方法。 38．請求項30〜37のいずれかに記載の方法における請求項17又は21〜24のいず れかに記載の化合物の使用。 39．請求項30〜37のいずれかに記載の方法における構造特異的物質との強磁性 又はフェリ磁性物質の組合せの使用。 40．構造特異的物質との生分解可能フェリ磁性又は強磁性物質の組合せからな ることを特徴とする請求項30〜37のいずれかに記載の方法に用いるための化合物 。 41．構造特異的物質との生分解可能フェリ磁性又は強磁性物質の組合せからな り、それにより体液中での体温での構造特異的物質との前記フェリ磁性又は強磁 性物質の組合せのブラウン緩和時間が、ネール緩和時間より短いことを特徴とす る請求項30〜37のいずれか に記載の方法に用いるための化合物。 42．前記フェリ磁性又は強磁性物質が生分解可能な酸化鉄であることを特徴と する請求項41に記載の化合物。