JPH10512594A - ヒトの黄斑変性を治療するための純粋なゼアキサンチンの３ｒ−３’ｒ立体異性体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト、特に黄斑変性患者により薬剤またはビタミン類として用いられる、ゼアキサンチンの唯一の検出可能な異性体として３Ｒ−３Ｒ'立体異性体を製造および精製するための方法および処方を開示する。望ましい３Ｒ−３Ｒ'立体異性体のみを含有するゼアキサンチン製剤は、Ｆ.multivorum株（ＡＴＣＣ寄託番号５５２３８）から製造される。細菌醗酵により合成された後、ゼアキサンチンは、溶媒抽出などの簡単で安価な手段により５−２０％（重量）まで濃縮される。所望なら、他の方法により、さらに高濃度にまで精製することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトの黄斑変性を治療するための純粋なゼアキサンチンの ３Ｒ−３'Ｒ立体異性体発明の背景 本発明は、生化学の分野に属し、そしてゼアキサンチン（ＺＸと略す）と呼ば れる黄色ピグメントのある種の異性体に関する。医薬又はビタミンとしてヒトに 投与したとき、このピグメントは、網膜を損ない、老人の失明の主な原因となる 黄斑変性と呼ばれる病気を治療し又は予防することができる。 網膜は眼球の奥に存在する組織である。 網膜は極端に複雑であって、１ダー スの異なった層を有する。これについては、Gittinger 1988,and Vaughn and As bury 1992（完全引用は末尾参照）などの多くの医学教科書に記載されている。 黄斑と呼ばれる特殊な円形の領域が網膜の中心に存在し、ヒトで直径が約１− １.５ｍｍである。黄斑は網膜の他の部分と異なる２つの特徴がある。第一に、 黄斑は桿体が比較的少なく、その光受容体の大部分は錐体形をしている（斑点の 中心そのものに存在する窩（fovea）には、桿体は全く存在しない）。第二に、 黄斑は、ルテインおよびゼアキサンチンと呼ばれる２種のピグメントに因る顕著 な黄色を有している。両者は“カロテノイド”と呼ばれる分子群に属している。 これらのカロテノイドピグメントの化学は、黄斑変性の概要の次に後記する。黄斑変性 “黄斑変性”は、網膜の中心部における黄色斑領域での網膜細胞または光受容 錐体に対する進行性障害を含む状態を意味する。これについては、Taylor 1993, Gittinger 1988，and Vaughan and Asbury 1992などの文献および教科書に記載 されている。 黄斑変性には数種のタイプがある。最も普通のタイプは、“年齢関連黄斑変性 ”と言われるもので、通常ＡＭＤ（いくつかの文献ではＡＲＭＤ）と略号される 。ＡＭＤは視力障害を引き起こすことがあり、それは僅かな視力低下から盲目に ま で至る。 ２種のＡＭＤがあり、しばしば“ウエット”型および“ドライ”型と称せられ る。ウエット型は毛細管および他の血管が網膜で攻撃的な成長をなすことを含み 、血管が網膜層の固有の組織を崩壊あるいは破壊するまでに至る。この型のＡＭ Ｄは、新たに形成する血管を切除するレーザーの使用により治療できるが、レー ザー処置は暫時、血管の成長を遅らすに過ぎないし、ほぼ全視力の終局的喪失を 通常は阻止できない。ウエットＡＭＤはほとんど常に最後には全盲またはほぼ全 盲に導く。ウエット型はただ、ＡＭＤ患者の約５−１０％である。 いま一つの型は“ドライ”ＡＭＤと呼ばれる。これは全例の少なくとも９０％ で起きるので、しばしば単にＡＭＤと言われる。この型のＡＭＤは通常、全盲に まで至らないが、患者の視力に重い障害をもたらし、よく知ったもの、例えば友 人あるいは親戚の顔が分からなく、または識別できなくする。このように、この ＡＭＤは、しばしば機能的盲目をもたらし、運転あるいは公の場所の歩行をでき なくし、また通常の活動を不可能にする。 症候の一つとして黄斑変性を有する種々の疾患もある。それには、スターガル ツ（Stargardt）病、ベスト（Best）病、バッテン（Batten）病、スジョグレン −ラルソン（Sjogren-Larsson）症候群、錐体−桿体ジストロフィー、羊セロイ ド・リポフスチン症が挙げられる。これらについて記載した文献としてDorey et al 1993 がある。さらに、リソソーム貯蔵問題（タイ−サッシュ（Tay-Sach） 病など）または進行性神経細胞変性（アルツハイマー病など）を有する他の疾患 も黄斑変性に相関する。 これらの疾患の多くは、家族継承があることから明らかなように、遺伝素因を 有している。これらの疾患を起こす遺伝子のいくつかは単離されており、遺伝子 スクリーニング試験で欠陥遺伝子の保持者が分かる。遺伝子試験または家族歴か ら、かかる遺伝子を有し、あるいは有すると思われる者は、黄斑変性になる高い 危険性がある。 視力を徐々に奪うことで、ＡＭＤは患者に非常な苦痛をもたらしている。これ は、生産性の喪失および関係者の重い負担において年に数十億ドルを費やしてい る。関係者には、その家族、保険業者、社会福祉機関はもちろんのこと、盲目あ るいは重い視力障害に苦しむ者に医療介護および他の援助を提供すべき、あるい は手助けをする関係者が含まれる。 ＡＭＤに因る問題からして、科学者および医師は、数十年にわたって、黄斑変 性による盲目および他の視力消失を治療あるいは予防する方法を探し求めて来た 。しかし、半世紀以上に及ぶすべての努力にもかかわらず、今日でも有効な治療 法が見つかっていない。診断：ドルセンおよびリポフスチン 黄斑変性は網膜の特殊な撮影により通常診断される。ひとつの診断方法では、 医師が患者に蛍光剤を注射し、体内を循環する時間をおいて、アンギオグラムと 言う網膜の拡大撮影を行う。次いで、映像を解析して、２種の細胞破片のいずれ か、あるいは両者の存在および濃度を測定する。 細胞破片の一つはドルセンとよばれ、数十年にわたって知られ、研究されてき た。それには二つの異なる型がある。少量のハード・ドルセン（直径６３μｍ以 下の小粒子）が４０歳以上のすべての者の眼に常に存在している。異常なレベル で存在しない限り、ハード・ドルセンは網膜の障害を示さない。 一方、多量の大きいソフト・ドルセン（ウエット・ドルセンとも言う）の沈着 は、実質的な網膜障害が生じているか、始まっていることを示している。なぜな ら、ソフト・ドルセンの大きい斑点群は、網膜層の破壊あるいは組織崩壊を起こ し、そして網膜細胞が血液から適当な栄養を摂取するのを阻害し得るからである 。網膜に顕著な量のソフト・ドルセンを含有する患者は黄斑変性に罹患している と、通常考えられる。 黄斑変性の患者に通常存在する他の型の網膜破片は、リポフスチンと称せられ る。リポフスチンとＡＭＤとの相関関係はやっと最近に明らかになった（すなわ ち、Weiter et al 1988,and Dorey et al 1993）。カロテノイド化学 「カロテノイド」の用語は大きなクラスの分子群に関し；６００以上の天然の カロテノイドが同定されている。これらの分子は、以下に示す幾つかの特長を持 っ ている： １．カロテノイドは、５個炭素の分子であるイソプレン分子を連結す ることにより産生される。この建造ブロックが５個の炭素原子を含んでいるので 、大概のカロテノイドは５個の炭素原子の多量体を含んでいる。 ２．カロテノイドは多数の不飽和結合を有する。これは、それらにス ペクトルの青色及びほぼ紫外領域で高エネルギー光波を吸収させる。 ３．カロテノイドはスペクトルの青色及びほとんど紫外領域の波長を 吸収するが、スペクトルの他の領域の長い波長は吸収しないので、カロテノイド は通常、黄色、オレンジ色、褐色又は赤色を有する。「カロテノイド」の名称は ニンジンに由来する；初めて知られたカロテノイドはニンジンにオレンジ色を与 えるピグメントとして同定された。溶液中のカロテノイドによって生じる色彩は 、濃度および他の化合物の存在などの様々な因子に依存する。 ４．カロテノイドは“共役”二重結合を有する。この用語は、二重結 合が一重結合と互い違いになっており、鎖中の各炭素原子は１個の他の炭素原子 と二重結合するが、いずれの炭素も２個の他の炭素原子と二重結合しないことを 示す。この配置は、β−カロテン、ＺＸおよびルテインの構造を表す図１を見れ ば理解できる。 異なるカロテノイドは異なった程度の共役を有し、一般的により高い共役の分 子は高エネルギー光線照射による“光毒性”障害に対して大きい保護を提供する 。例えば、図１に示される３種のカロテノイドにおいて、各分子の完全直鎖部分 は交互に二重結合及び単結合と共役する。β−カロテノイドおよびＺＸでは、共 役は両端環の第一結合にまで伸びる。対照的に、ルテインの一方の末端の環にお ける二重結合は完全な共役のための適当な配置を持たないので、ルテインはより 低い共役程度である。ＺＸとルテインの唯一の差異は、末端環の一方（だが両方 でない）における二重結合の位置である。 カロテノイドは青色及びほぼ紫外光線の潜在的に有害なエネルギーを吸収する ように設計され、選択されている（進化を通じて）ので、自然界で保護ピグメン トとして使用される。大概の植物の機能の目標の一つは、青色、紫外、ほぼ紫外 光線の照射によって引き起こされる細胞及びDNAの障害を最小にしながら、出来 るだけ多くの日光を吸収する必要があるので、カロテノイドは植物に広範に存在 している。紫外線照射の植物に対する障害は大きな問題であって、カロテノイド はそれを最小にするのを助ける。 カロテノイド分子は光毒性に対して細胞及びDNAを保護するのに理想的である ので、動物も又カロテノイドを光保護ピグメントとして利用すべく経路（進化を 通じて）を獲得している。動物はその体内でカロテノイドを合成出来ないので、 植物源からカロテノイド（もしくはカロテノイド先駆体）を摂取しなければなら ない。β−カロテンは一例である；ほ乳類の細胞はそれを合成できないので、そ れを植物源すなわち食物から取得しなければならない。ほ乳類の体内に入ると、 β−カロテンは、それを二等分することによって得られるビタミンA（レチノー ル）などの他の分子に変換される。 カロテノイドは二つの主なクラス、カロテンとキサントフィルに分けられる。 カロテンは酸素分子を含んでいない；炭素及び水素のみから形成される真の炭化 水素である。一方、キサントフイル(ＺＸやルテインなど)は酸素原子を含む。 図１は、ＺＸの左右の末端環における炭素原子の番号づけを示す。慣習により 、左末端環の炭素原子は１から６までの番号がつくが、右末端環の炭素原子は３ '炭素（「３プライム」と発音される）など「プライム」番号によって言及され る。ＺＸは左右の末端に関して完全にシンメトリーであるので、「左」及び「右 」の用語は単に慣習であり、議論を単純化するために用いられる。しかしながら 、注意すべきは、ルテインはシンメトリーでない；「左」環の二重結合の位置は 「右」環の二重結合の配置と同じではない。 ＺＸは、その両端の＃３の炭化水素に２個のヒドロキシ（−０Ｈ）基を加える ことによって形成されるので、化学名はジヒドロキシ−カロテンである；をカロ テン−ジオールと呼ぶ化学者もいる。この分子は、トウモロコシにその黄色を与 えるピグメントとして同定されたので、名称“ゼアキサンチン”が与えられた； トウモロコシの科学名はゼア・メイズ（Ｚea mays）である。 上で示したように、６００個以上の天然カロテノイドが同定されている。数十 種は生化学及び商業で重要である。ＺＸ及びルテインは、ほ乳類及び大概の他の 動物の網膜に存在するので、本発明において特に重要である。 ルテインは、買物客や消費者の嗜好にあわせて、チキンの皮膚や卵黄に黄色を 一層与えるために、チキンへの餌に広く入れられるので（主にマリーゴールドか らの植物抽出物の形態で）、商業的に重要である。 ＺＸは、同じ効果を有し、ルテインよりも強力であるが、ＺＸ源は家禽飼料の 用途には高価過ぎる。米国特許５,３０８,７５９及び５,４２７,７８３号（ギア ハルト(Ｇierhardt)よりの譲受人アップライド・フード・バイオテクノロジー； 本件の出願人）は、ＺＸが動物飼料の用途のためには高価過ぎるという問題に取 り組むことを意図していた。これらの特許は、着色の目的のために家禽及び魚に ＺＸを与えることができるように、商業的な量でゼオキサンチンを生産するため に細菌を用いることに関する。 いくつかのカロテノイドは、植物以外に、ある種のバクテリアによっても合成 される。これらのバクテリアは、直接日光に晒される場所において生育し、その カロテノイドは植物におけると同様の光線保護の役割を果たす。バクテリアのカ ルチノイドについて記載した文献及び特許としては、マックダモットら(ＭcＤer mott et al)１９７２年及び米国特許５,４２９,９３９(Ｍisawa et al)があり、 さらに両者に引用された他の文献がある。 米国特許５,４２９,９３９(Ｍisawa et al)は、ＺＸを含む種々のカロテノイ ドの生合成に関与する酵素をコードする多数の遺伝子の DNA 配列を記載する。 ＺＸの創造における各主要遺伝子（ｃｒｔＥ，ｃｒｔＢ，ｃｒｔＩ，ｃｒｔＹお よびｃｒｔＺを含む）の役割についても記載されている。これらの遺伝子含有プ ラスミドを含む細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（エル ウイニア・ウレドボラ(Ｅrwinia uredovora)ＡＴＣＣ １９３２１やエルウイニ ア・ヘルビコラ(Ｅrwinia herbicola)ＡＴＣＣ ３９３６８など）及び微工研（ 例えば、イー・コーリ(Ｅ.coli)ＦＥＲＭ ＢＰ２３７７）に寄託されている。ゼアキサンチン立体化学及び異性体 カロテノイド化学の重要な一面は「立体化学」及び「立体異性体」である。こ の事項は、有機化学に関する大学教科書のすべてに説明されている。 有機分子が４個の相違する原子または分子基と結合した炭素原子を有している と、この炭素原子は“キラル”炭素原子と呼ばれる。 キラル炭素原子が有機分子中に存在するときはいつでも、そのキラル炭素原子 に結合する４個の異なった基は、２種の空間配置のいずれにも配置され得る。こ の相違する配置を立体異性体と言う。これら立体異性体の一つが「右手の方法」 で偏光を回転させ、一方、今一つの立体異性体は「左手の方法」で偏光を回転さ せる。右手の回転を引き起こす異性体は、Ｒ立体異性体とよばれる（Ｄ立体異性 体とも呼ばれる）。左手の回転を引き起こす異性体は、Ｓ立体異性体と呼ばれる （Ｌ立体異性体とも呼ばれる）。 ＺＸには＃３および＃３'炭素原子の二つがキラルであるので、ＺＸは４個の 可能な立体異性体を有する。３Ｒ−３Ｒ'異性体において、＃３及び＃３'キラル 炭素原子の両者はＲ立体配置をとる。３Ｓ−３'Ｓ異性体において、＃３及び＃ ３'キラル炭素原子の両者はＬ立体配置をとる。便宜的に、これらの両立体異性 体は、ここではＲ−Ｒ異性体及びＳ−Ｓ異性体と称する。 第３及び第４の異性体は二つの「混合」又は「メソ」（一方はＲ、他方はＳ） の異性体である：３Ｒ−３'Ｓ異性体及び３Ｓ−３'Ｒ異性体である。ＺＸは中点 について完全にシンメトリであるので、これらの両異性体は全ての点で同一であ り；もし紙面上で３Ｒ−３'Ｓ異性体を描き、単に紙面を回転させれば、３Ｓ− ３'Ｒ異性体となる。実際に、単一の「メソ」異性体は、Ｓ−ＲおよびＲ−Ｓ異 性体の両方により形成される。 ＺＸを合成するために標準的な化学手法を用いると、４種の可能な異性体はそ れぞれ全体の約２５％存在する。しかし、Ｓ−ＲとＲ−Ｓ異性体は実際には同じ であるので、その“メソ”異性体は全体の５０％であり、一方、Ｒ−ＲおよびＳ −Ｓ異性体はそれぞれ約２５％存在する。３種の立体異性体すべての混合物は“ ラセミ”混合物と呼ばれる。 しかし、網膜組織におけるカロテノイドの細胞及び酵素の特異性は極めて厳密 であり、相違する異性体および立体異性体で互換性はない。ルテインとＺＸとは 、 通常の化学用語においては互いに異性体であると見なされうるものであるが（そ れらは同数の炭素、水素、及び酸素原子を有しているので）、完全に相違する独 特の分子として網膜細胞により扱われる。 生物学的要因からして、ここで関連する唯一の異性体は立体異性体である。こ こで用いられるＺＸの「異性体」は、特定のＺＸの立体異性体を意味し、ルテイ ンを含まない。ルテインとＺＸは、まったく相違するカロテノイドと考える。 カロテノイドにおける立体異性体上の差異は、小さくて、微妙で、ほとんどと るに足りないと見られるかもしれないが、網膜組織に達するときには、事実上極 めて重要である。明らかに、ヒトの網膜細胞によって適当に取り込まれ、用いら れる唯一のＺＸ立体異性体は、Ｒ−Ｒ異性体（すなわち、３Ｒ−３'Ｒ立体異性 体）である。 網膜組織中に微量のメソ異性体が見つけられたと言う報告がある。しかしなが ら、この微量は、ルテイン先駆体からメソ−ゼアキサンチンの生成を導く、何ら かの条件下に同時に生じうる、ある分子転換に恐らく由来するものであろう（ボ ン、ランドラム、ら(Bone，Landrum，et al)、１９９３年及び１９９４年）。 研究室において、キラル・カラム・クロマトグラフィー（参照、例えば、ボー ン、ランドラムら(Bone，Landrum，et al)、１９９３年）又はサーキュラー二色 性分析（参照、例えば、ブリトン(Ｂritton)、１９９４年）などの方法を用いて 、ＺＸの異性体をそれぞれ識別できる。黄斑におけるＺＸ及びルテイン １９７０年までに光毒性に対する植物の保護におけるカロテノイドの役割は、 よく知られていた。また、カロテノイドが動物組織中に存在すること、及び動物 はカロテノイドを合成することができないので、動物組織中の全てのカロテノイ ドは本来植物源に由来することも、知られていた。その情報に基づき、種々の文 献で、動物及び植物のカロテノイドの類似性が指摘され、カロテノイドは動物に おける光毒性に対して保護すると、結論されている。 動物におけるカロテノイドの光保護の役割が認められた後に、研究者は網膜に おけるカロテノイドの化学及び役割を研究し始めた。研究の一つの方向は、カロ テノイドを含まない穀物や種子（マイロ種子など）から調製されたカロテノイド を全く含まない餌を実験動物に与える試験を行った。その結果、カロテノイドが 与えられない実験動物の網膜では黄色の黄斑領域が成長しないで、これらの網膜 に異常に高い量のソフト・ドルセンが含まれ、網膜障害を示すことが明らかにな った。（マリナウら(Malinow et al)１９８０年、キルシュフェルド(Kirschfeld )１９８２年、ハムら(Ham et al)１９８４年及びスノダリら(Snodderly et al) １９８４年）。これらの知見から、研究者は、カロテノイドが健全な網膜に必須 と思われることを示唆した。これらの研究者は実際に、人参や葉の多い緑色野菜 が目によいものを含んでいるとの古くからの知恵を支持する分子を探し始めた。 しかしながら、科学者達は、網膜中の黄色ピグメントが最終の形で直接摂取しな ければならないかどうか、又はそれらがβ−カロテンもしくはリコペンなどの他 の前駆体を用いて動物細胞中に合成できるかどうかを、なお知らなかった。 ルテインは黄斑中の黄色ピグメントの一つとして同定された（ウオルド(Wald) １９４９年）。ＺＸは相当のちまで他の黄斑ピグメントとしては同定されなかっ た(Bone et al、1985)。１９８０年代中頃および後期までに黄斑について知られ ていることをまとめた文献として、Handelman and Dratz 1986，Werner et al 1 987，Pease et al 1987，Haegerstrom-Portnoy 1988,and Handelman et al 1988 がある。とりわけ、これらの文献は、ＺＸ（それは十分に共役し、それ故に、光 エネルギーによって引き起こされる損傷に対して、ルテインよりも何らかの優れ た保護を提供する）が黄斑の中心での小さな領域の窩(fovea)における優勢なピ グメントであることを、確立した。窩から同心的に離れ黄斑の外周に向かうに従 って、ＺＸの量は徐々に減少し、ルテインの量が増加し、黄斑外周末梢ではルテ インが圧倒的な黄色ピグメントである。網膜の老化及び損傷の様々な局面に向け て、さらに網膜における保護剤としてカロテノイドに特に焦点を合わせている最 近の文献としては、スペルダトら(Sperduto et al)１９９０年、ゲルスタ(Gerst er)１９９１年、シャルフ(Schalch)１９９２年及びセドンら(Seddon et al)１９ ９４年が挙げられる。 要約すると、ルテイン及びＺＸが黄斑におけるピグメントであることは１０年 以上前から知られており、これら二つのピグメントが光毒性による障害に対して 黄斑を保護することは科学者により推測されていた。 しかしながら、これらの発見及び示唆が全て１０年以上前になされていたと言 う事実にもかかわらず、未だ誰も、黄斑変性の段階的な進行を有意義に予防又は 遅滞させる（単に逆戻りさせる）ことに有効である、どの様な型の医薬も、どの 様な栄養剤も、ダイエット補助剤も、その他の型の治療形態も開発していない。 β−カロテン、ビタミンＡ、及びビタミンＥは全て、網膜組織の保護を助ける につき、何らかの程度の有効な効果を持つことが知られているので、前の文は幾 分条件をつける必要がある（参照、例えば、米国特許5,310,764、バラノウイツ ら(Baranowitz et al)１９９４年及び以下に引用する眼病ケース制御研究グルー プによる二つの論文）。これらの特許及び論文は、β−カロテン、ビタミンＡ、 及びビタミンＥが、黄斑変性に関連した障害を予防もしくは減少せしめるのに検 出できる作用を持ち得ることを主張または示唆してきた。 その様な主張は、カロテノイド、ビタミンＡ及びビタミンＥの一般的な酸化作 用からして正しいであろう。しかしながら、網膜においてβ−カロテン、ビタミ ンＡ、及びビタミンＥによりもたらされた利益は極めて制限的であって、本当に 有効な治療の程度に達していないことも、残念ながら真実である。全ての実際的 な目的において、黄斑変性は、予防できない、阻止できない、回復できないもの である。また広範なスペクトルの抗酸化剤（β−カロテン、ビタミンＡ、及びビ タミンＥなど）は単なる緩和策である。本当に有効であるものは何も入手出来な いので、これらのビタミン類は、黄斑変性により引き起こされた容赦のない障害 を遅くする試みのために用いられてきた(極めて限定的な、不満足な成功である) 。 先行技術の問題として、同じく注意すべきは、多くの健康食品店が目及び視力 に有益であるとラベルしたカロテノイド製剤を販売していることである。β−カ ロテン及びビタミンＡが一般的な抗酸化剤として目に有益であると知られている （上記の通り）ので、カロテノイド合剤についての該ラベルは理にかなっている のかもしれない。しかしながら、市販されているカロテノイド合剤は極端に少量 の“痕跡”以上にはＺＸを含んでいない。健康食品店で販売されているカロテノ イド合剤中の大部分のカロテノイドは非ＺＸカロテノイド（主にβ−カロテン及 びビタミンＡ）である。 幾つかの主要な政府機関及び研究財団の現状および研究目標にも注意を払うべ き価値がある。米国において、ＮＩＨ（ナショナル・インスティテュート・オブ ・ヘルス）（ＮＥＩ（ナショナル・アイ・インスティテュート）及びナショナル ・アドバイザリー・カウンスルを経由して行動）は、最新の二つのレポートを発 行した。これら二つのレポートは「視力研究：国家計画１９９４−１９９８」，ＮＩＨ Ｐublication Ｎo.93-3186 （1994; 特に５５−６５頁参照）及び「年齢 に関連した眼病研究」ＮＩＨ Ｐublication No．93-2910(1993)である。両出版 及びそこに記載された研究プロジェクトは、ＡＭＤを治療するために最も期待で きる化合物として、（ＺＸよりもむしろ）β−カロテンに焦点を当てている。出 願人の知る限りでは、そのテーマについてＮＥＩの職員と議論がなされた後に、 ＮＥＩもナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルスと親密な関係にある他 の機関も、ＡＭＤの潜在的な治療法としてＺＸに関するいかなる研究にも資金を 出す気はないし、また最近に資金を出したことはなかった。一方、ＮＩＨ及び税 金が使われている他の機関は、ＡＭＤを治療し、予防するため、最も有望な候補 薬剤としてβ−カロテンについての研究を行うために数百万ドルを当てている。 注目に値する他の研究グループは、「眼疾患症例コントロール試験グループ」 である。このグループは、「抗酸化剤事情及び新生血管の年齢に関連した黄斑変 性」、Ａrch．Ｏphthalmol.11：104-109(1993)及び「新生血管の年齢に関連した 黄斑変性の危険因子」、Ａrch．Ｏphthalmol.10：1701-1708(1992)と言う表題の 二つの論文を最近発表した。公式のＮＩＨレポートにおけるように、これらの論 文は、いづれもＡＭＤを治療するための薬剤としてＺＸの使用を教示または示唆 していない。この財団もまた、ＡＭＤを治療あるいは予防するための潜在的な薬 剤としてのＺＸの研究に基金を出していないし、あるいは出すのを拒絶してきた 。 同じく注目すべきことに、カロテノイドが特にガンを治療または予防する点(P eto et al、１９８１)およびコレステロール生成を阻害し、さらに動脈内のプ ラーク沈着を減少する点(Jialal et al 1991)に大きい興味がある。カロテノイ ドの種々の生物学的活性を扱った膨大な科学文献があり、ルテイン及びＺＸを含 む、多数の重要なカロテノイドを合成する方法に大きな興味があった。しかしな がら、過去数十年の全てのカロテノイド研究及び合成努力にもかかわらず、黄斑 変性を治療もしくは予防する有効な方法を誰も未だ報告していない。黄斑変性の 社会や犠牲者に与える巨大な費用および苦痛を考慮すると、それは、対処しなけ ればならない大きな課題である。 従って、本発明の主題は、（１）黄斑変性に罹患していると診断された患者を 治療するための安全かつ有効な薬剤、及び（２）中年以降に黄斑変性になる危険 性を減少せしめることを願うすべての者により摂取され得る、ビタミン剤に匹敵 するような栄養補助剤を提供することであり、非常に重要な躍進をもたらす。ルテイン及びゼアキサンチンの合成：先行技術 先行技術にＺＸを製造する様々な方法が記載されている。これらの項目は二つ の種類に分けられる：微生物が製造方法において重要な役割を演ずる発酵法；及 び純粋に化学反応が用いられる非発酵合成法。先行技術のほとんどは、ＺＸが、 肉の色を薄黒くして、肉をより魅力的なものにするために、家禽や魚のおける添 加物などとして、既知の目的のため用いられることを示唆している。しかしなが ら、これらの努力はいずれも、商業的な量のＺＸを現実に製造したり、販売する ことにまで至らなかった。 １９９５年１０月現在で、精製した形で、又はＺＸを製剤重量の５％以上を含 む、半濃縮の形で、ＺＸを購入する唯一の方法は、ミリグラム量のＺＸを、アト メルジック・ケミカルズ・コーポレイション（ニュウヨーク・ファルミングダー ル）、スペクトラム・ケミカル・マニュファクチャリング・カンパニー（カルフ ォルニア、ガーデナ）などの専門化学会社からの購入することを必要とする。所 望でないＳ−Ｓ異性体及びＳ−Ｒ異性体を含む合成ラセミ混合物として、これら の専門メーカーから精製ＺＸの１９９５年の購入価格はmg当たり約＄９０〜約＄ １２５であり、それはラセミ混合物のＺＸｇ当たり、約＄１００,０００に相当 する。明らかに、これらのものは、その価格および望ましくなく、かつ危険なＳ − Ｓおよびメソ異性体からして、薬剤または栄養補助剤として使用する現実的価値 はなかった。本発明以前には、精製または半精製ゼアキサンチンはいかなる形態 においても一般に利用できなかった。 微生物発酵によるＺＸの製造を記載する先行技術の項目は、次の通りである： （１）カーリントン及びグドウィン(Courington and Goodwin)１９５５年 は、フラボバクター属の微生物によるＺＸの製造を記載した最も早い既知文献で ある。 （２）米国特許３,８９１,５０４（ショチャー及びウイス(Ｓchocher & Ｗiss)、１９７５年、ホフマン・ラロッシュへ譲渡）。この特許もフラボバクタ ー細胞によるＺＸの製造を記載する。ＺＸを含む細胞はニワトリに与えられ、適 当な着色がもたらされた。 （３）米国特許３,８４１,９６７(ダセクら(Dasek et al)１９７４年、ネ ッスルへ譲渡)および米国特許３,９５１,７４３（シェファードら(Shepherd et al)１９７６年、同じくネッスルへ譲渡）。細菌によって製造されるＺＸの量を 増やすために使用できる方法及び栄養培地を記載。 （４）最近二つのさらなる特許（米国特許5,308,759及び5,427,783、とも にギアハートにより発明され、本出願と同一譲受人であるアップライド・フード ・バイオテクノロジー・インク．へ譲渡）は、ミズーリ河から単離した細菌の菌 種（フラボバクテリウム・マルチボラム(Flavobacterium multivorum)）を記載 する。これらのバクテリアは、相当量の他のカロテノイドを製造せずに、ＺＸを 製造することが発見された。このことは、家禽や魚の肉をより薄黒くするために 、重要である。なぜなら、カロテノイド類は互いに、動物が食した後に血中への 取り込みにおいて競合するからである。Gierhart により同定された F．multivo rum 株からは他のカロテノイドが存在しないので、動物組織のためのピグメント としてＺＸをより利用でき、従って、その効力および効果が増大する。 ’７５９特許は、ＡＦＢのエフ・マルチフォルム(F．multivorum)菌を用いて 、ＺＸを製造する方法をクレームする。’７８３特許は、分割出願であるが、餌 混合物をクレームする。これらの両特許は家禽や魚の餌にＺＸを用いることに限 定 されており、ヒトを治療するためにＺＸを用いることについては、一言もふれて いない。 ふたつのＧierhart特許はいずれも、ＺＸの特殊な立体異性体に言及していな い。その理由は、（１）出願時の１９８９年には、AFBの F．multivorum 細胞か らつくられるＺＸ異性体の状態が分かっていなかった、（２）家禽または魚の餌 としてＺＸを使用することに特許の関心があったので、相違する異性体に気をつ けねばならない明白な理由はなかったことである。 ＡＦＢのＦ．multivorum 野生種はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号５ ５２３８を受けた。これらの細菌は、スフィンゴリピドと呼ばれる脂質の一種を 生成するので、ＡＴＣＣは、これらの細菌をSpingobacterium multivorumとして 再分類し、この名前でカタログに掲載している。このカタログでの名称は、微生 物組織学の公式の指針であるBergy's Manual of Systematic Bacteriology（Int ernational Journal of Systematic Bacteriology により追加され最新のものに される）引用として現れていない。 標準的化学手段（微生物発酵を使用しないで）によりＺＸを合成するための様 々な努力が、過去２０年にわたって報告されてきた（例えば、米国特許4,153,61 5，Saucy，1979; 4,952,716，Lukac et al，1990; 5,227,507，Lukac et al，19 93）。しかしながら、非発酵法には重大な欠点がある。それは、典型的に多数の 反応工程を要し、それぞれの工程は１００％に達しない収率を示すので、多数工 程プロセスの終わりのＺＸの最終収率は比較的低い。さらに、化学合成は、通常 、酸化されたゼアキサンチン及び直鎖部分及び／又は末端環における１もしくは ２個以上の二重結合を失ったゼアキサンチン分子などの様々な転換生成物および 分解生成物と同様に、望ましくないＳ−Ｓ及びＳ−Ｒ立体異性体を生成する。 要約すると、本発明以前には、薬剤または栄養補助剤としてヒトに用いるのに 適した精製Ｒ−Ｒゼアキサンチン源は知られていなかった。 従って、本発明の一つの目的は、ＡＦＢのエフ・マルチヴォラム(F.multivoru m)株(ＡＴＣＣアクセス番号５５２３８)及びその突然変異株が、検出できる量の 望ましくないＳ−ＳおよびＳ−Ｒ異性体なしに、唯一の検出できる異性体とし てＺＸのＲ−Ｒ立体異性体を製造することを、開示することにある。 本発明の他の目的は、黄斑変性、とりわけ年齢と関連した黄斑変性を患ってい ると診断された患者を治療する薬剤の製造に、ＡＦＢのエフ・マルチヴォラム(F .multivoraum)(ＡＴＣＣアクセス番号５５２３８)からの細胞を利用する方法を 開示することである。 本発明の他の目的は、中高年における黄斑変性のおそれを減少させるため、ビ タミン類に類似した形で、あるいはマーガリンなど食品への添加剤として、栄養 補助剤の製造に、ＡＦＢのエフ・マルチヴォラム(F.multivorum)株(ＡＴＣＣア クセス番号５５２３８)からの細胞を利用する方法を開示することである。 本発明の第３の目的は、唯一もしくは極めて優勢な異性体としてＲ−Ｒ立体異 性体を含有するゼアキサンチン製剤を開示することであり、その処方は、網膜疾 患または変性を治療する薬剤として、あるいは老人における視力喪失の危険性を 減少せしめる栄養補助剤として、ヒトの経口摂取に適している。 これらの及び 他の目的は、下記の発明の要約及び発明の説明において一層明らかになるであろ う。 発明の要約 本発明は、薬剤もしくは栄養補助剤としてヒトが摂取するのために、唯一もし くは極めて優勢な立体異性体として、３Ｒ−３'Ｒ立体異性体(あるいはＲ−Ｒ異 性体またはＲ−Ｒゼアキサンチンともいう)を含むＺＸ製剤を製造する方法を開 示する。ヒトの網膜の中心の黄斑細胞中に天然に存在する黄色ピグメントである ＺＸは、青色及び近接した紫外の光線照射を吸収し、それにより光毒性障害から 黄斑細胞を保護する。望ましいＲ−Ｒ異性体のみを含むＺＸ製剤は、フラヴォバ クテリウム・マルチヴォラム(Flavobacterium multivorum)細胞の菌種(ＡＴＣＣ アクセス番号５５２３８)により生産される。これらの微生物は、検出できる量 の望ましくないＳ−Ｓ及びＳ−Ｒ立体異性体を生産しないし、またそれらは、経 口摂取後、栄養の吸収においてＺＸと競合するおそれのあるβ−カロテンやルテ インなどの他のカロテノイドを、いかなる有意義な量でも生産しない。これらの 細菌による生産後、ＺＸは、溶媒抽出などの方法により精製され、さらに黄斑変 性の患者のための医療薬剤として、あるいは凡そ５０歳あるいは６０歳を越える 人々に多い年齢に関連した黄斑変性に罹患する危険性を減らしたいと思う者は誰 でも栄養補助剤として、経口で服用できる。簡便に摂取できる組成物として、( １)植物性オイルなどの担体に混合したＲ−Ｒゼアキサンチンを含む防水性カプ セル；（２）添加剤としてＲ−ＲＺＸを含む、様々な食品（例えば、マーガリン 、乳製品、シロップ、クッキーねり粉、激しい調理を要しない肉製品）；及び（ ３）スープ、サラダ、飲料、その他の食品に添加される粒状組成物などが開示さ れる。図面の簡単な説明 図１は、β−カロテン、ルテイン及びゼアキサンチンの分子構造を描き、３種 のカロテノイド全ての構造及び末端環の番号付けシステムを示す。これらの構造 は先行技術によって知られている。 図２は、立体異性体として純粋な３Ｒ−３'Ｒゼアキサンチンを合成する微生 物により生産されるＺＸを発酵し、精製する主要な工程を描くフローチャートを 含む。好ましい態様についての説明 本発明は、黄斑変性すなわち視力障害をもたらし、失明に至るかも知れない疾 患症状を予防あるいは軽減するために、ヒトに投与される薬剤または栄養補助剤 を製造するための方法を開示する。ヒトに摂取されるゼアキサンチン製剤は、“ 極めて圧倒的な”異性体としてＺＸの３Ｒ−３'Ｒ立体異性体を含有する。ここ に定義するように、“極めて圧倒的な異性体”とは、製剤中に全ゼアキサンチン 製剤に対し少なくとも９０％以上のＲ−Ｒ異性体を含有し、望ましくないＳ−Ｓ またはＳ−Ｒ−異性体は１０％以下であることを意味する。望ましくは、ヒトに 用いられる製剤は唯一の検出されるＺＸの異性体としてはＲ−Ｒ異性体のみを含 み、望ましくないＳ−ＳまたはＳ−Ｒ異性体は含有しないことである。かかる製 剤をここに開示する。 キラル・カラム・クロマトグラフィー解析（Bone et al.,1993に記載）を用い て、Applied Food Biotechnology(AFB)により分離されたF.multivorum菌種（ATC C accession number 55238）が、実施例のように醗酵せしめたときに、唯一の検 出できるＺＸ異性体としてＲ−Ｒ異性体のみを産生することが最近に発見された 。実施例４に記載するように、Landrum教授の分析によると、この下F.multivorm 株からの細胞の醗酵によって産生されるＺＸ製剤中には、Ｓ−Ｓ異性体もＲ−Ｓ メソ異性体も検出されなかった。 ゼアキサンチンのＲ−Ｒ、Ｒ−ＳまたはＳ−Ｓ−異性体間における相違は、Ｚ Ｘ製剤が薬剤あるいは栄養補助剤としてヒトに投与される際には、非常に重要で ある。なぜなら、ヒト網膜に天然に存在する唯一のＺＸ異性体はＲ−Ｒ異性体で あるからである。Ｒ−５およびＳ−Ｓ異性体の有意な量の摂取は、医学的観点か ら非常に望ましくなくかつ危険であると考えられる。その理由は、（１）Ｒ−Ｓ およびＳ−Ｓ異性体はヒト網膜には天然には生起しない。ただ例外的にルテイン が網膜細胞中で変性したときに副産物として極めて少量で形成されるのみである 。（２）Ｒ−ＳおよびＳ−Ｓ異性体は網膜組織中で望ましいＲ−Ｒ異性体と競合 的に置き換わることがあり、重大な長期の細胞障害および医学的合併症をもたら しかねない。 F.multivorum菌種の醗酵により製造されるＺＸ製剤が立体異性的に純粋である ことは、ＺＸを化学的に合成した後に立体異性体を分離することが非常に困難か つ費用のかかるので、非常に価値がある。立体異性体の分離は小規模な実験室で 可能であるが、商業的な量については費用の点から避けるべきことである。ＡＭＤ患者への処方薬としての使用 本発明の第１点は、開示のＲ−Ｒゼアキサンチン製剤を、黄斑変性であると診 断された患者あるいは症候または状態として黄斑変性をおこし得る疾患、例えば スターガルツ病、ベスト病、バッテン病、ジョグレン−ラーソンシンドローム、 錐体−桿体ヂストロフィー、羊セロイド・リポフスチン沈着症、あるいはタイ− ザッファ病などのリソソーム貯蔵病に罹患している患者を治療するために医師が 処方できる薬剤として調剤し、投与することである。 かかる治療において、ＺＸ製剤は治療的レベルに達するのに充分な量のＺＸの Ｒ−Ｒ異性体を下記するようにヒトへの投与に適した担体中および形態（カプセ ルなど）で、含有すべきである。望ましい実施態様において、医学的処置のため のＺＸは、カプセルまたは錠剤などの単位含量形態中に包装される。各用量は、 望ましくは少なくとも約１ｍｇのＲ−Ｒゼアキサンチン製剤を含むべきであり、 よりよい医療効果のためには約３−１０ｍｇの範囲のゼアキサンチン製剤を含有 する。 本発明の第２点は、開示のＲ−Ｒゼアキサンチン製剤を予防薬として、上記し た疾患のいずれかについて家族歴あるいは遺伝子診断によって、黄斑変性になる 可能性が高いと診断された患者に、調剤し投与することである。ＡＭＤの危険性 は高いが、まだ実際にはＡＭＤになっていないような患者に対する投与において は、その製剤単位含量は、例えば約０.１−２ｍｇとより少ない含量である。 これらの含量は、ここでの開示を利用して商業的に合理的な費用で提供される 。油性液状担体中に２５ｍｇ（またはそれ以下）を含有するカプセルは、溶媒抽 出工程と結合した微生物醗酵を用いて、商業的方法で製造される。高量を含有す る粉末製剤は、実施例４記載の方法などの拡大精製を用いて、製造することがで きる。ビタミンまたは栄養補助剤としての使用 本発明の第３の観点において、黄斑変性に現在は罹患していないが、後半に黄 斑変性になる危険性を低減しようとする者に用いるために、ＺＸはビタミンまた は栄養補助剤または食品添加剤の形態で製造され、包装される。この目的のため に摂取されるときは、適当な用量は、健康食品の店で通常的に販売されている粉 末中の量よりも実質的に多くなければならないが、ＡＭＤと診断された者に薬剤 としてＺＸが用いられるときよりも少量である。かかる用量は、毎日摂取される 用量として、約０.０５−５ｍｇの範囲であろう。例えば、０.０５−１.０の用 量がＲ−Ｒゼアキサンチンが多種ビタミン錠またはカプセルの多くの有効成分の １つであるときには、０.０５−１.０の用量が適当であり、一方、より高用量を 望む者への店頭での販売には１−５ｍｇの用量が提供され得る。 治療剤あるいは栄養補助剤のいずれで用いられても、ヒト用のＺＸ製剤はＺＸ の唯一または“極めて圧倒的な立体異性体”としてＲ−Ｒ異性体を含有していな ければならない。用語“極めて圧倒的な立体異性体”は混合物中に全ゼアキサン チン製剤に対し少なくとも９０％以上のＲ−Ｒ異性体を含有し、望ましくないＳ −ＳまたはＳＲ−異性体は１０％以下の製剤について用いられる。 望ましくは、すべてヒト用の製剤においてＲ−Ｒ異性体が唯一の検出可能な異 性体であるべきである。このことは、本発明により、Ｆ.multivorum細菌ライン がＺＸの唯一の検出可能な立体異性体としてＲ−Ｒ異性体のみを産出するので商 業的な量および合理的な費用において可能である。精製後に醗酵混合物中にＳ− ＳまたはＳ−Ｒ異性体が存在していても、その量は少なくて、実施例４の方法に より検出されない。 加うるに、多くの菌種と異なり、ここに記載のＦ.multivorum細胞はカロテノ イドの混合物を産生しない。該細胞は唯一の検出可能なカロテノイドとしてＲ− Ｒゼアキサンチンを産生する。このことは、食物の取り込みおよび組織沈着にお いてＺＸが他のカロテノイドと競合するので、経口摂取後のＺＸ取り込みおよび 網膜沈着を増大さすために、特に、黄斑変性と診断された病気の治療にＺＸを薬 剤として用いる際に、有用である。細菌醗酵による商業規模での製造 当業者がよく承知しているように、実験室で用いられた醗酵法を大きい製造操 作にすることは、費用がかかり、難しい。従って、出願人は、Ｆ.multivorum細 胞の商業的使用のための栄養素および方法を改善してきた。この改善された栄養 素および方法は、米国特許第５,３０８,７５９および５,４２７,７８３に記載さ れた培地および条件に比して操作が簡単であり、ＺＸのｇ当たりで費用が非常に 低い。望ましい栄養素および条件は実施例１に記載される。 醗酵後、精製中のＺＸの変性を防止するために１以上の安定剤を細胞に加える ことができる。細胞がまだ醗酵容器中にあり、殺菌または他の処置を始める前に 、安定剤を添加することができる。種々の可能と考えられる安定剤が出願人によ って試験された。今日までに得られた最良の結果は実施例２に掲げる安定剤の併 用である。 安定剤を加えた後、ＺＸに影響を与えずに細菌を殺すために５５℃まで２５分 間で加熱して殺菌する。次いで、培養物を室温に冷し、十字流精密濾過などの機 械的手段により細胞液体を除去する。これによって細胞および固体の濃度が容量 で最初の約１０％から約６０−８０％の濾過濃度に増加する。 Ｆ.multivorum細胞をそのままおよび生存状態で、生存または殺−しかし−損 傷微生物細胞を含む他の食品（チーズ、ヨーグルト、ビール等）と同様に、ヒト の直接の摂取に供することも可能である。Ｆ.multivorum細胞には病原性は知ら れていない。この細胞は冷水から分離されるものであり、冷水中で生存するのに 適しているので、人体内の温度ではうまく生存また繁殖できない。さらに、該細 胞はいかなる既知毒性成分も有していない。グラム陰性であり、グラム−陽性菌 を特徴ずける細胞壁構造を有していない。魚や鳥に細胞ペーストの形態で直接与 えたとき、細菌細胞は運搬体として非常に適しているようである。細胞が動物に より消化されると、ＺＸが放出され、血流に吸収され、そして種々の組織（網膜 を含む）の適当な部位に沈着する。 従って、Ｒ−Ｒゼアキサンチンを含む無傷のＦ.multivorum細胞は、次の３形 態のいずれでも直接的なヒトの摂取に適し得る。（１）無傷の生存形態、（２） 殺菌または他の適当な処置後の無傷の死滅形態、（３）細菌細胞を殺し、その壁 を破壊して、細胞をむきだしにしてＺＸにより接近しやすくした製剤。これは、 超音波（高周波音波を用いて）、高圧、または粉砕の手段でなし得る。別法とし て、細胞壁を破棄するような溶媒抽出方法を用いたときは、この手段は省略でき る。 所望により、細胞製造手順に細胞水洗手順が含まれ、醗酵が完了した後に、安 定剤、保存剤、芳香剤などの望ましい成分を含有する溶液で細胞を流洗すること により、残りの栄養素および無駄な代謝物を除去する。精製 所望により、細胞ペスト（無傷または破壊細胞のいずれか）は、細胞の濃度を 上げそして乾燥塊（マス）のＺＸ濃度を増すために、乾燥できる。これは、噴霧 乾燥（熱を用いて）または凍結乾燥（真空下での凍結−乾燥）などの機械的手段 によりなされる。乾燥を用いたときは、得られた固体残留物は通常、乾燥バイオ マスと呼ぶ。これは、約１−１０重量％のＺＸを含み、他の細胞固形物、醗酵培 地からの固形残査および上述の安定剤をも含む。 破壊または乾燥の前または後（またはそれに代わって）に、主に細胞壁に蓄積 しているＺＸの濃度を上げるために抽出工程を実施することができる。抽出のた めの適当な溶媒は一般的に極性有機溶媒である。現在までに確認されている最善 の溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）であり、これは細胞壁をよく攻撃し、分 離膜破壊を不必要とする。ＴＨＦを実験室で用いるときは、撹拌は不必要である が、商業ベースでの製造においては、溶媒混合工程中の撹拌がおそらく必要であ ろう。 他の溶媒も試験したが、また試験しているが、今日までのところＴＨＦほどの ものは見つかっていない。試験した非環状有機溶媒（アセトンおよびジエチルエ ーテルなど）はＺＸ溶解度が低く、他方、メタノール、エタノールおよびヘキサ ンなどの他の溶媒はより低いＺＸ溶解度である。 溶媒は、溶媒がゼアキサンチンをできるだけ多く溶解するような条件で、細胞 ペストまたは乾燥バイオマスと混合される。次いで、遠心分離または濾過などの 機械的手段を用いて、溶解液体分画を固体から分離する。固体は捨てるか、また は他の製法工程の材料とする（所望により、溶媒抽出サイクルを繰り返す）。液 体分画は、通常、蒸発によって、溶媒を除去するよう処置する。Ｒ−Ｒゼアキサ ンチンを含む粘稠な油分と、溶媒により細胞ペストから取り出された他の溶解成 分が残留する。ＴＨＦを１−３重量％のＺＸを含む細胞について単一抽出方法で 用い、次いでＴＨＦを蒸発で除去すると、得た液体は約５−約２０重量％のＺＸ を含有していた。 予備的によい結果が得られた他のタイプの溶媒抽出に、超−臨界液体(すなわ ち、大気圧では通常は気体であるが、加圧下では溶媒として作用する液体になる )の使用がある。二酸化炭素が超臨界抽出で最も広く用いられている溶媒であり 、商業的規模のＣＯ₂抽出システムは利用可能である。このようなシステムにお いて、液化二酸化炭素は、高圧反応器中で細胞ペストまたは乾燥バイオマスと混 合する。次いで液体を、段階的に圧を減じた一連の室に通す。ＺＸは、かなりの 高圧において溶液から沈殿し、初期の減圧段階で寄せ集めることができ、一方、 不 純物の大半は、二酸化炭素に溶けたままであり、そして圧をさらに減じた他の反 応室に移す。超臨界溶媒抽出の効率は、共沸剤（エタノール、プロピレングリコ ール、エチルアセテートなど）を用いることによりさらに増大せしめ得る。これ らの共沸剤のいくつかは、予備的試験で用いられ、超臨界二酸化炭素中のゼアキ サンチンの溶解性を増大することが示された。 二酸化炭素は最も広く使用されている超臨界剤であるが、種々の他の化合物（ 種々の窒素またはクロロフルオロ炭素化合物を含む）も商業的規模のシステムに おいて同じ目的で用いられる。圧によって気体および液体相の両者となるような 化合物は、ここに記した微生物からゼアキサンチンを精製するのに適しているか 試みることができる。 所望により、溶媒または超臨界抽出により生じたＺＸを含む油状の流体は、親 油性担体物質（植物油など）と混合し、次いでゼアキサンチンをさらに精製する ことなく、直接ヒト用のカプセルに封入できる。これは、Ｒ−Ｒゼアキサンチン の半精製消化型をつくるのに適した経済的な方法を提供するものであり、黄斑変 性の患者に対する薬剤として、あるいは高齢期に黄斑変性になる恐れを減らそう とする者に対する栄養補助剤として用いることができる。 また、半精製型のＲ−Ｒゼアキサンチンは、ＺＸ濃度を増大し、不純物を除去 するために、さらに精製することができる。これは、（１）２選択溶媒の併用に よる２−溶媒システム、（２）ＺＸの結晶化をもたらす基質（織編フィルター床 など）上での吸収、または（３）向流クロマトグラフィー。ＺＸを約９８％の純 度に精製するのに用いたクロマトグラフィー法は、実施例４に記載する。 他のカノチノイドについての他の精製方法は、特許第５,３８２,７１４号（Kh achik 1995）および米国特許４,８５１,３３９（Hills 1989）に開示されている 。投与方法 経口摂取が網膜保護のためヒトにＺＸを投与するのに最も望ましい方法であり 、下記するように毎日または週ごとのカプセルあるいはゼアキサンチン−補強食 品または食品添加物として用いられる。このような摂取は、（毎日または週ごと ピルのような）一定間隔で定期的になされることは要しないで、不定期断続的な 摂 取でもって黄斑組織に少量のゼアキサンチンを適当にかつ徐々に蓄積するように 、服用間隔をあける合理的な期間（１日またはそれ以上、望ましくは１週間以内 ）が適している。ビタミン補助として一回服用でも、有益であろうが、適当な少 量服用を１年以上なすほどには有益でない。ヒトおよび試験動物におけるカロテ ノイド摂取の薬力学的研究によれば、血液濃度に示される“積み”因子により、 毎日摂取が週または他の間隔での摂取よりも好ましいことが指摘されている。 経口摂取後のカロテノイドの取り込みは比較的少ないので、重い黄斑変性の患 者に対しては他の投与形態、例えば筋注、静注または徐放植込みなどを利用する ことが望まれる。注射用の基剤の処方は、水、緩衝液およびプロピレングリコー ル、デキストラン、シクロデキストラン化合物のような水酸基を複数有する有機 化合物を含む。 酸化からＺＸを保護し、またＺＸの油状性を保持し得る限り、経口摂取につき 種々の包装形態が用いられる。 経口接種のための適切な組成物の例は次のものを含む。 （ａ）消化できる防水性カプセルおよびその中に含有される液体からなり、カプ セルおよび液は飲み込みやすい大きさおよび形状であり、薬理学的に許容される ものであり、液体はＲ−Ｒゼアキサンチンを植物油などの適当な担体または希釈 剤と共に含む。所望により、液体化ＺＸは、実施例９また１０に記載のようにミ クロカプセル化すなわちミセル中に封入されて、胃中での変性からＺＸを保護す る。該カプセルは、比較的硬く造ることができるが、ビタミンＥ含有カプセルに 通常用いられている硬質材料または軟質材料からなる。カプセルが胃酸に対し耐 容性があり、腸内で酵素により消化されるときは、ＺＸは胃中での変性から保護 され、ＺＸの生物学的利用性は増大する。しかし、少なくとも、咀嚼された植物 マスの成分として胃に入ったＺＸの部分は作用を受けずに胃を通過できる。従っ て、胃酸からＺＸを保護することは必須ではなく、カプセル材料の選択は、科学 的な要請よりも経済的観点からなされるであろう。 （ｂ）ヒトに経口摂取される錠剤はＲ−Ｒゼアキサンチンと加圧結合剤を含む。 この結合剤は、適当な圧力で圧縮した後に錠剤が形を保ちうるためであり、錠剤 は、薬理学的に許容され、支障なく飲み込むのに適した大きさである。所望によ り錠剤はコーティングされて、胃酸からＺＸが保護される。 （ｃ）ヒト用の食材を含む組成物で、栄養学的に許容され、味も優れ、ゼアキサ ンチンの基質として適当であり、添加物としてＲ−Ｒゼアキサンチンを含有する 。ＺＸは、黄−オレンジ色のピグメントであって、植物油、ショートニング、チ キン脂などと一般的に同一の疎水性である。ＺＸはまた、β−カロテンなどの他 のカロテノイド食品色素と類似である。従って、ＺＸは、マーガリン、乳製品、 シロップ、焼食品材、クッキーダウ、ブラウニー、苛酷な調理をなさない肉類お よびスープ成分などの種々の食品材料に添加し得る。他の適当な食品材料には顆 粒化処方のもので、スープ、サラダ、ベーキングなどの添加物に用いる塩、香、 味などをつけた混合物などである。所望によって、顆粒化処方において保護コー ティングをして、ＺＸの胃酸により変性を低下することができる。β−カロテン および他のカロテノイドの食品色素および栄養添加剤としての処方および利用に 関連する多数の文献がある。その文献には、例えばＫlaui et al 1970；Ｋlaui and Ｂauernfeind 1981；Ｃolombo and Ｇerber 1991，が含まれ、一方、関連す る米国には米国特許第４,５２２,７４３(Ｈorn et al 1985)、５,１８０,７４７ （Ｍatsuda et al 1993）、５,３５０,７７３（Ｓchweikert et al 1994）およ び５,３５６,６３６（Ｓchneider et al 1994）が含まれる。その非常に近い化 学的類似性および物理的性質により、ヒトの摂取を意図したいかなるタイプの食 品におけるβ−カロテンまたはルテインを添加する技術、付加、他の方法は、Ｒ −Ｒゼアキサンチンに直接的に適用可能でもある。 ｄ）ヒト経口摂取用の食材を含む組成物で、その食材はヒトに無毒で、ゼアキサ ンチンのＲ−Ｒ異性体を含有する細菌細胞を含む。該食材は、チーズ、ヨーグル ト、ミルクおよびビールから選択し得る。細菌細胞は、生きていてもよいし、所 望によって殺菌またはフラグメンテーションにより殺されていてもよい。 他の形態の包装も容易であり、種々の使用に好ましいであろう。動物におけるＲ−Ｒゼアキサンチンの試験 ＡＴＣＣ ５５２３８株からのフラボバクテリウム・マルチボラム細胞を用い て合成したＺＸを、通常は日本ウズラと呼ばれているＣoturnix coturnix japon icaを選択して、網膜保護について、試験した。この種は、下記のようないくつ かの理由によってヒトの黄斑変性について有用な動物モデルを提供する。 （１）日本ウズラの全網膜はいくつかの重要な点においてヒト網膜の斑領域に 似ている。例えば、ウズラの網膜はＺＸとルテインの両方を含み、ヒトの斑のよ うに光線レセプターの錐体に杆体よりも豊富である。 （２）日本ウズラの網膜はヒトの網膜といくつかの同じ病理を表す。例えば、 日本ウズラの網膜は、ヒトにおけるＡＭＤの発生と大きく相関するソフト結晶腔 およびリポフシンを蓄積する。 （３）ウズラの網膜は、ヒトの網膜よりも非常に小さいが、ＺＸおよびルテイ ンの存在により黄色である。このことは、ヒト網膜の中心の小さい斑領域のモデ ルとして役立つことを可能にし、解析および観測をより容易にする。 （４）日本ウズラの網膜は、駆血的であり、ヒト網膜の窩領域に類似した構造 を有する。 （５）日本ウズラは、おおまかに雌で１−１.５年、雄で３−４年の寿命を有 する。このことは、より長く生きる他の種では非常に難しいであろう加齢過程に ついての“長さ”の研究を可能にする。 これらの理由については、より詳細にＦite et al 1991およびＦite et al 19 93に述べられている。 これらの試験は実施例５−８に記載されている。結果は、優れており、Ｆ.mul tivorumによりつくられたＲ−Ｒゼアキサンチンが、（１）経口摂取後、適切に 黄斑に蓄積し、（２）光毒性損傷に対して網膜細胞を保護するのに非常に効果的 であること、を明白に示している。 さらに、実施例８で論じるように、予備的な結果は、光毒性損傷から網膜を保 護するのにＲ−ＲのＺＸがβ−カロテンよりもはるかに強力で効果的であること を示している。β−カロテンを試験動物に高用量与えたとき、β−カロテンによ る小さい保護利点も統計的有意のレベルに達しなかった。これと対照的に、同量 のＲ−ＲのＺＸを動物に与えたとき、測定した網膜細胞損傷の指標と死亡の指標 を完全に阻止し、予防した。Ｒ−Ｒゼアキサンチンの微生物源 ここで開示したフラボバクテリウム・マルチボラム細胞は、ＡＴＣＣに寄託さ れている（ＡＴＣＣ５５２３８；上記のようにＡＴＣＣカタログではＳphingoba cterium multivorumと書かれているが、Ｂergy's Ｍanualでは変わっていない） 。この細胞ラインは、異性体的に純Ｒ−ＲのＺＸを微生物学的につくるため、い くつかの選択を当業者に提供する。 最初に、これらの細胞の直接的かつ非修飾の子孫を、他の望ましくない立体異 性の測定可能な量には有していない、Ｒ−Ｒゼアキサンチンをつくるために、用 いることができる。これらの細胞により生じる全カロテノイドは９０％以上のＺ Ｘ、求めるカロテノイドを含んでいる。 第２に、ＡＴＣＣ ５５２３８株の子孫をＺＸのＲ−Ｒ異性体の生産レベルが 増加するように修飾した後に使用することができる。かかる突然変異および他の 変種は、無作為または半−無作為によるいくつかの方法のいずれかでつくられ、 増加したＺＸ産生系を有するコロニーを同定するためのスクリーニングテストを 行う。無作為または半−無作為の発生を用いる技術は、（１）野生タイプＡＴＣ Ｃ ５５２３８子孫を紫外線またはＸ線の照射などの無作為的作用突然変更源ま たはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの種々の既知化学 的突然変異源で処理すること、（２）フラボバクテリウム・マルチボラム細胞を 、微生物間において接合およびＤＮＡ交換を促進する他のタイプの微生物と混合 することにより性的組合せをおこさせること、（３）フラボバクテリウム・マル チボラム細胞を、比較的大量のＤＮＡの再配列をおこし得る微生物トランスポゾ ンまたはウイルスで処理すること、を含む。これらおよび他の当業者に知られた 技術は、子孫細胞の何千あるいは何百万の夫々に突然変異あるいは他の変化した 遺伝子を有する制御不能で無作為な変化を効果的に導入する。従って、これらの 技術は、望ましいゼアキサンチンの産生の増大した系を有する子孫の少量分画を 同定し、分離するために、クローニングおよびスクリーニング技術と共に接合に おいて使用されなければならない。 スクリーニング試験は、ＺＸを産生する生合成経路に含まれる１以上の酵素を 阻害する化学物質（ジフェニルアミン、ニコチンまたはロバスタチンなど）を用 いることにより、容易に実施することができる。layman'sの用語において、これ らの阻害剤は、異常に多量のＺＸを産生する突然変更細胞系によってのみ克服さ れうるハードルまたは障害を形成する。都合のよいことに、多量生産突然変更株 を同定するのに用いられる分析試験は簡単、迅速そして容易である。ＺＸが黄色 ピグメントであるので、望ましい系を有する突然変更コロニーを同定するのに、 培養プレートの簡単な視覚観察が用い得る。望ましいのは、（１）よい細胞生長 速度（２）黄色ピグメントを異常に多量に産生する能力を有するものである。所 望により、自動装置（４８−ウエルまたは９６−ウエルのプレート読み器、サイ トメーターに接続した細胞選別器）も突然変異段階後のスクリーニング試験に用 いられ得る。 これらの突然変異およびスクリーニング技術は、この技術分野で通常かつ周知 のものである。無作為または半作為を突然変異子孫細胞に導入すべく用いた特殊 な方法または試薬にもかかわらず、ＡＴＣＣ ５５２３８株から直接由来するす べて細胞は、たとえ修飾され、突然変異をうけ、また他の細胞系と性的組合せら れていても、上記したいかなる方法において、野生タイプＡＴＣＣ ５５２３８ 細胞の子孫とみられる。 ３番目の別の試みとして、非子孫微生物細胞が、所望のゼアキサンチンのＲ− Ｒ異性体の合成を行い、ＡＴＣＣ５５２３８細胞系単離されたか、またはそうで なければ由来のものである遺伝子を含むものを製造できる。このような遺伝子は 既知の技術を用いて、分離および同定し得る。ハイブリダイゼーション・プロー ブとして例えば、米国特許第５,４２９,９３９号（Ｍisawa et al，1995、上記 ）に列記のカロテノイド−産生“crt”遺伝子配列から得たＤＮＡ配列は、ＡＴ ＣＣ５５２３８細胞系のゲノムと相同のＤＮＡ配列を有するカロテノイド−産生 遺伝子を研究するためにハイブリダイゼーション・プローブとして用いられる。 これらの細胞から単離されたカロテノイド−産生遺伝子は、プラスミド、コスミ ド、ファージまたは所望の型の宿主細胞、例えばエシェリキア・コリ細胞、酵母 細胞、 昆虫細胞または哺乳類細胞への遺伝子的形質転換に使用できる他の好適なベクタ ーに挿入できる。この型の制御可能遺伝子工学は、ＡＴＣＣ５５２３８細胞から 得られる遺伝子を用いて、形質転換細胞がＲ−Ｒゼアキサンチンを産生するのを 可能にする。 加えて、ＡＴＣＣ５５２３８細胞由来のゼアキサンチン−産生遺伝子のタンパ ク質−コード部分（すなわち、メッセンジャーＲＮＡに転写され、続いてＺＸ合 成に関与する酵素への翻訳をする遺伝子の部分）は、非常に強力および／または 誘導可能遺伝子プロモーターの制御下に置くことができる。異なる遺伝子から得 たこのような遺伝子プロモーターを伴う“キメラ”遺伝子は、種々の目的、例え ば（１）ＺＸ−産生遺伝子の細胞生育相の間の抑制および次いで醗酵中の細胞に よるＺＸ産生の大きい増加および（２）商業的使用に好適な宿主細胞の新しい型 、例えば非常に確立された高度に最適化された発酵、操作および生成技術により 有利である、広く使用される細胞型であるエシェリキア・コリ細胞または酵母細 胞に遺伝子を挿入するために、使用できる。 ＡＴＣＣ ５５２３８細胞系から単離されたＺＸ−産生遺伝子はまた、当業者 に既知の他の遺伝子工学技術により促進できる。一例として、細菌細胞はしばし ばmＲＮＡコード配列中の“非好適”コドンを使用し、mＲＮＡ分子から翻訳され るタンパク質の量を制御する。この天然制御機構の回避のために、ＡＴＣＣ５５ ２３８細胞系から単離したＺＸ−産生遺伝子のmＲＮＡコード配列の非好適コド ンを、選択した型の宿主細胞におけるＺＸ−産生酵素の発現を増加させるであろ う“好適”コドンに置換できる。 他の例として、システイン残基は酵素の活性または安定性を、同じまたは他の タンパク質分子中の他のシステイン残基と望ましくないジスルフィド結合を形成 することにより、抑制できる。したがって、酵素の活性または安定性は、一個ま たはそれ以上のシステイン残基を、活性の少ないアミノ酸残基に置換することに より増加できることがある(例えば、米国特許第４,７３７,４６２号、Ｍark)。 加えて、タンパク質の発現は、しばしばグリシンのような一般的アミノ酸のコド ンを、あまり一般的でなく、タンパク質のmＲＮＡからの発現を遅延または減少 させる傾向にあるメチオニンおよびトリフトファンに置換することにより増加で きる。この性質のアミノ酸置換をもたらす合成遺伝子の製造後、修飾タンパク質 を、より多い量または安定形で発現し、所望の酵素活性を残すかどうか測定する ために試験できる。 これらは、修飾が所望の型の細菌、酵母または他の宿主細胞によるＺＸの産生 を促進できるか測定するために、ＡＴＣＣ ５５２３８細胞系から単離されたＺ Ｘ−産生遺伝子の評価をできる遺伝子工学技術の例である。 “フラボバクテリウム・マルチホルの菌株ＡＴＣＣ寄託番号５５２３８由来の 細胞から得たＤＮＡ配列を含有する、少なくとも一つのゼアキサンチン合成遺伝 子を含むように、遺伝子学的に構築される細胞”と言う特許請求の範囲中の文言 は、ＡＴＣＣ５５２３８細胞系またはその子孫により測定されたＤＮＡまたはm ＲＮＡ配列を使用して化学的合成されたＤＮＡ配列含有遺伝子を含む細胞を含む 。自動ＤＮＡ合成機械は既知であり、既知の選択遺伝子配列を、元の宿主細胞の 複製の必要なしに２倍にするために使用できる。“ゼアキサンチン合成遺伝子” は、ゼアキサンチン生物構成経路に関与する酵素または他のタンパク質を発現し 、好適な宿主細胞中に挿入した場合、ゼアキサンチン合成の増加に使用できる遺 伝子を含み、遺伝子がコードするＺＸ生合成経路の特定の酵素を考慮していない 。 実施例実施例１：商業規模発酵 フラボバクテリウム・マルチボラムの最初の小規模研究室試験のために、出願 人に好適な培地は、米国特許第５,３０８,７５９号（Ｇierhart 1994）および第 ５,４２７,７８３号（Ｇierhart 1995）の実施例３の栄養培地Ｅであると同定さ れた。この栄養培地は高価で処理が難しい幾つかの成分を含んでいた。高い値段 および不便さを減少させるため、良い商業規模の栄養培地を製造するための実質 的な研究が、これらの出願の最初の出願日以後に行われた。商業規模の発酵に現 在のところ好ましい栄養培地は、トウモロコシ粉および他の幾つかの成分を除外 している。これらの好ましい培地は、１から１０％w／vの濃度でトウモロコシを 浸けた酒０.５から４％w／vと共に高マルトースコーンシロップまたはサトウダ イコン糖蜜のいずれか；硫酸アンモニウム七水和物０.５％w／v；塩化ナトリウ ム０.５％w／v；硫酸マグネシウム七水和物０．１％w／v；酢酸ナトリウム０.１ ％w／v;硫酸第１鉄０.００１％w／v;酵母抽出液０.２％w／v；チアミン−ＨＣｌ ０.０１％w／v；加水分解カゼイン（ＮＺ Ａmine ＨＤ、Ｓheffield Ｐroduc ts，Ｄivision of Ｑuest Ｉnternational，Ｎorwich，ＮＹ販売のような）１か ら６％w／vの間；および植物油１％v／vを含む。 これらの成分を互いに混合した後、充分なＮaＯＨを添加し、pＨを６.５に上 昇させる；対照的に、米国特許第５,３０８,７５９号および第５,４２７,７８３ 号に記載のように栄養培地をpＨ７.５に調節した場合、多すぎる固体がトウモロ コシを浸けた酒から沈殿する。 培養培地を１２１℃、３０分オートクレーブで滅菌し、次いで２７℃に冷却し 、Ｓ−ＳまたはＳ−Ｒ立体異性体の産生なしにＲ−Ｒゼアキサンチンを製造する フラボバクテリウム・マルチボラムの株を含む“液体前培養”を、５から１０％ v／v接種する。 液体前培養の製造に使用する細胞を平板計数寒天（plate count agar）の斜面 管に維持する。これらの斜面培養に、出願人がＡＴＣＣに寄託した（ＡＴＣＣ受 託番号５５２３８）株の子孫のフラボバクテリウム・マルチボラムのクローンコ ロニーを接種する。４８時間、２８℃でのインキュベーションの後、貯蔵斜面を 、液体培地の接種物として使用するまで４℃に冷却する。生存細胞はまた慣用の 冷凍庫、ドライアイスまたは液体窒素を使用して長い貯蔵のために凍結できる。 液体前培養を寒天斜面から取った細胞を使用して製造し、３００mＬ隔壁フラ スコ内の上記のように製造した液体培地３０mＬに接種する。成育条件は、２８ ℃、pＨ７.２から７.６、２５０rpmの撹拌による酸素補給および２４時間の培養 である。最初の２４時間のインキュベーションの後、１個またはそれ以上の３０ mＬ前培養フラスコに含まれる細胞を、好適な大きさの発酵容器中の１０倍量の 栄養培地への接種に使用する。次いで、細胞を４８から７２時間、２８℃でイン キュベートする。pＨを６.８０から７.２０の間にＮaＯＨおよび／またはリン酸 を使用して維持する。溶解酸素濃度を、容器を４００から１０００rpmで撹拌し ながら、容器を通した濾過空気を空気１容量／液体１容量／分の速度でバブリン グすることにより、飽和の３０から４０％に保つ。定期的サンプリングおよび高 速液体クロマトグラフィーを使用した試験は、細胞をこれらの条件で発酵させた 場合、ＺＸの最大量が通常約７２時間以内に産生されることを示した。実施例２：安定化剤の添加 実施例１に記載の発酵方法により産生されたＺＸは、続く精製および製剤を容 易にするためおよび純度を確実にするために安定化する必要がある。製造または 精製工程の間に、安定化化合物をフラボバクテリウム・マルチボラム細胞（また はＺＸ含有細胞抽出物）に添加できる；一般に、細胞が発酵容器中にある間に、 １種またはそれ以上の最初の安定化剤を細胞に添加すべきである。 種々の安定化剤候補を出願人は試験した。現在まで、最も良い結果が、安定化 剤の混合物を使用した場合に得られ、それは少量の好適な溶媒（２０リットルの 発酵容器について約２ミリリットルのエタノールのような）中で、細胞に添加す る前に混合する。好ましい安定化剤混合物は、第３級ブチルヒドロキノン（ＴＢ ＨＱと略称；２−(１,１−ジメチル)−１,４−ベンゼンジオールとも呼ばれる） を、細胞と混合した後、最終濃度約２５０μｇ／Ｌ(マイクログラム／リットル) から約５０mg／Ｌの範囲になるような量；混合後濃度が約２５０μg／Ｌから約 ２５０mg／Ｌの範囲のエトキシキン；約２５０μg／Ｌから約２５０mg／Ｌの濃 度範囲のα−トコフェロール；および約５００μg／Ｌから約５００mg／Ｌの濃 度範囲のＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含む。好適な濃度は広範囲 で変化でき、続く精製工程および包装および摂取の意図される形に依存する。こ れらの安定化剤の好ましい濃度は、一回通過ＴＨＦ抽出、続く植物油との混合お よびビタミン型丸薬への防水カプセル包含に使用するために、約２５から５０mg ／ＬのＴＢＨＱ；２５０から５００μg／Ｌのエトキシキン、２５０から５００ μg／Ｌのα−トコフェロール；および５００から１０００μg／ＬのＥＤＴＡで ある。 安定化剤添加後、細胞培養を５５℃、２５から５０分加熱することにより、低 温殺菌する。これは、細菌を、それらが産生したＺＸに障害を与えることなく殺 す。次いで、培養物を室温に冷却し、ＺＸ含有細胞および培養ブロスに存在する 他の固体を液体相から、細胞／固体濃度を最初の値から約１０から１５％増加さ せる交差流動微小濾過系で分離し、濾過した濃度を約６０から８０容量％にする 。この工程は、栄養培地の残余固体をまた幾つか含む細胞ペーストをもたらす。 実施例５−７に記載のように、網膜試験における日本ウズラ(Ｊapanese quail )食べさせるＺＸ製剤のために、細胞を−７０℃で凍結し、次いで完全真空で２ ５℃で凍結乾燥により乾燥させ、約２から１０重量％ＺＸを含む乾燥バイオマス を製造する。過去の試験において、各バッチのＺＸ量を個々に測定し、異なる濃 度のバッチを組み合わせ、互いに混合し、ウズラ試験のための一貫した濃度を確 保した。 ヒト摂取のためのＺＸを製造するために、実施例３記載のように、溶媒抽出物 を使用し、粘性油状液体を産生する。実施例３：油状液体への半精製 実施例２記載のように細胞ペーストを製造した後、種々の方法で処理できる。 上記のように、望ましい場合、超音波(高頻度音波)、高圧または挽くような手段 で、細胞の温度を約３０℃以下に保ち、酸化を防ぎながら、細胞膜を破壊し、細 胞を開け、ＺＸをより近付き易くする。しかしながら、この工程は、テトラヒド ロフラン（ＴＨＦ）が機械的補助なしに細胞膜を破壊するのに非常に有効である ため、溶媒抽出好適にＴＨＦを使用する場合、必要ではない。撹拌は、ＴＨＦを 研究室規模操作に使用する場合は必要ではない；しかしながら、溶媒混合工程中 の撹拌は、商業的製造操作においては恐らく有利であろう。 今日まで行われた試験において、ＴＨＦ抽出物は、約８から２０容量の精製濾 過ＴＨＦと６０−８０％固体を含む細胞ペースト１容量を、２５℃以下の温度で ２から２４時間混合することを含む。ＴＨＦは積極的に細胞を攻撃し、綿状沈殿 固体の懸濁液の液体を産生する。２０,０００重力までの数分の遠心後、ほとん どのＴＨＦはデカントにより回収できる。残ったＴＨＦは真空下で蒸発させ、粘 性油状物を残す。１から３％ＺＸ含有細胞ペーストをＴＨＦ抽出物で一回通過操 作により処理した場合、得られる油状物は通常約５から２０重量％のＺＸを含ん でいた。実施例４：１００％純粋Ｒ−Ｒ異性体の高度に精製したゼアキサンチンの乾燥粉 末形での製造 乾燥粉末形の高度に精製したＺＸ製剤は、実施例３に記載のＴＨＦ抽出油状液 体を以下のような液体クロマトグラフィーで処理することにより製造した。油状 ＺＸ−含有液体をヘキサンに溶解し、次いで中性アルミナ粉末含有クロマトグラ フィーカラムを通過させる。２カラム容量のヘキサンをカラムの洗浄に使用し、 β−カロテンおよびリコペンのようなようなカロテノイド不純物および液体およ び他の汚染物を除去した、ヘキサン：アセトン８０：２０の混合物を次いでカラ ムを通し、ＺＸを遊離させた。出てきた溶解ＺＸを真空で乾燥させた。クロマト グラフィー分析は、少なくとも９８％純粋ＺＸを示唆した；痕跡量の不純物のみ が検出可能であった。 相対的に非保護状態（通常、正常冷蔵庫で、サンプリングのために適度な頻度 で除去して、抗酸化剤含有なしにおよび空気中酸素との接触を妨げるために気を 付けることなく）でおおよそ６カ月貯蔵した後、このＺＸ製剤のサンプルをＦlo rida，ＭaiamiのＦlorida Ｉnternational ＵniversityのＪohn Ｌandrum教授（ Ｂone，Ｌandrum et al紙の共著者）に送った。ジカルバメート誘導体のキラル カラムクロマトグラフィーを使用した彼の分析は、６カ月たった非保護製剤が９ ２％ＺＸを含有することを示唆した。不純物は主に、ＺＸ前に前溶出するケト− カロテノイド類であることが明らかになった；ケト−カロテノイド類は、カロテ ノイドのどこかに結合した余分の酸素原子を有し、カロテノイドを酸化に対して 保護せずに貯蔵した場合の通常の副産物である。Ｌandrum博士のキラル分析は、 製剤中のＺＸの１００％が所望のＲ−Ｒ異性体であることを示唆した。望ましく ないＺＸのＳ−ＳまたはＳ−Ｒ立体異性体は検出可能量はなかった。 上記のようなクロマトグラフィー精製が、完全に実行でき、非常に有効である が、商業量で高度に精製されたＺＸを産生するのに理想的に適してはいないこと は認識されている。米国特許第５,３８２,７１４号（Ｋhachik 1995；またＫhac hik et al，1991も参照）に記載され、冷エタノール−水混合物を２溶媒抽出系 で使用し、凍結乾燥する、ルテインの精製のために開発された別法が、商業生産 使用のための評価のために良好な候補方法を提供する。実施例５：異なる食餌群を使用した日本ウズラにおけるＺＸの試験 ウズラを含むすべての試験は、Ａpplied Ｆood Ｂiotechnology，Ｉnc.（本出 願の譲受人）との契約の下、Ｈarvard Ｍedical Ｓchool（Ｂoston，Ｍassachus etts）のＳchepens Ｅye Ｒesearch Ｉnstituteで行った。すべての処置または 対照群は統計的に有意な数の鳥を含んだ。ほとんどの場合、対照群は処置群と同 じ数であった。 カロテノイド欠損鳥餌をＰurina Ｍills（Ｓt．Ｌouis，Ｍissouri）から得た 。これらの鳥餌は実験用のみに売られており、天然にカロテノイド類を含まない 通常の穀物（ミロ種子のような）を使用して得る。 ウズラに食べさせるすべてのＺＸ製剤は、発酵させ、実施例２に記載の試薬で 安定化し、細胞を殺すために低温殺菌し、凍結乾燥を使用して乾燥したフラボバ クテリウム・マルチボラム細胞由来の乾燥バイオマスの形であった。これらの発 酵および製造工程は、Ａpplied Ｆood Ｂiotechnology，Ｉnc.のＯ'Ｆallon，Ｍ issouriの施設で行った。 すべての試験動物は、カロテノイド欠損卵から孵化した。これらは鳥が成熟し た後、親世代（Ｐ１鳥と呼ぶ）にカロテノイド欠損餌のみを食べさせて作った。 その卵を破壊して開け、卵がカロテノイド欠損になるまでカロテノイドを分析し た。完全にカロテノイド欠損親鳥から続けて生まれた卵を、すべての試験および 対照鳥を孵化させるのに、使用した。 試験および対照鳥を、異なった餌を与える大きい４群に分けた。これらの群は 、餌でどのカロテノイド類を摂取するかに依存して、Ｃ＋群、Ｃ−群、ＢＣ＋群 、ＺＸ(＋５)群およびＺＸ(＋５０)群と命名した。 Ｃ＋群の鳥は、幾つかのカロテノイドを含む標準商品餌を食べた；この餌はま た合成α−トコフェロール（ビタミンＥ）を添加剤として含む。 Ｃ−群の鳥は、上記のように実質的にすべてのカロテノイド類が欠損している 餌を食べた。しかしながら、この餌は他のすべての必須栄養素を含み、また合成 ビタミンＡおよびＥを添加剤として含む。 ＢＣ＋群の鳥は、高用量ＺＸ群に使用したのと同量（すなわちβ−カロテン５ ０mgを餌kg当たりに添加）の添加剤としてのβ−カロテン以外のすべてのカロテ ノイド類が欠損している餌を食べた。ＢＣ＋群の鳥は、β−カロテンを含む餌に 、光障害工程開始７日前に移した。この群は、β−カロテンと、同様に光障害７ 日前にまたは欠損餌からＺＸ添加餌に移されたＺＸ補給鳥の一つのサブグループ との直接の比較を可能にする。実施例８に記載のように、この直接の比較は、Ｚ Ｘが光毒性障害予防に非常に有効であるが、一方β−カロテンの保護効果は非常 に弱く、統計的に有意な濃度に到達しないことを示す。 ＺＸ＋群の鳥は、すべての他のカロテノイドを欠くが、ＡＦＢのフラボバクテ リウム・マルチボラム細胞由来のＲ−ＲＺＸを含む乾燥バオマスを含む、２つの 異なる用量のＺＸを鳥に食べさせ、網膜障害の種々の指標に関して評価および関 連すべき用量および効果関係を可能にする。ＺＸ(＋５)群の鳥は、相対的に少量 のＺＸ、平均餌キログラム当たり５mgのゼアキサンチンを添加したものを食べた 。ウズラは一日当たり約２５から３５ｇの餌を食べるため、約０.１２５から０. １７５ミリグラムのＺＸが、低用量群で鳥当たり一日当たり摂取された。ＺＸ( ＋５０)群は、１０倍量(５０mgＺＸ／kg餌)を食べ、鳥当たり一日当たり平均１. ２５から１.７５ミリグラムのＺＸの消費をもたらす。 対照、欠損およびＺＸ餌におけるカロテノイド濃度は、高速液体クロマトグラ フィー（ＨＰＬＣ）で、Ｓtacewicz−Ｓapuntzakis et al 1993に記載の方法を 使用して分析した。結果を表１に示す。 すべての鳥は、正常ひな保育籠で成育および保持した。下記する以外、正常の 広範囲スペクトルの１日当たり１０から１４時間照明の下に保持した。実施例６：経口摂取ゼアキサンチンの網膜堆積 化学的分析を行い、実施例５に記載の種々の食餌群の鳥の網膜に堆積したＺＸ （および他のカロテノイド）の濃度を測定した。 これらの分析を行うために、カロテノイド欠損卵から孵化し、少なくとも６カ 月間、それぞれの餌で飼育した鳥を頸椎脱臼により殺した。網膜組織を核出眼の 切開により回収し、一個の網膜由来の組織を蒸留脱イオン水２５０μＬ中で、ガ ラスまたはポリテトラフルオロエチレン(テフロン(商標))乳棒を使用してほとん ど均一まで挽いた。均質物１０μＬを回収し、種々の網膜サンプルの結果を標準 化するために、均質物のタンパク質の分析に使用した。２％w／vピロガロール含 有メタノール２５０μＬおよび６０％w／v水酸化カリウム５０μＬを、残ってい る網膜組織懸濁液２４０μＬに添加した。混合物を水浴で７０℃に１時間加熱し 、次いで５０％v／vエタノール５００μＬ、続いてヘキサン２mＬを添加した。 混合物をボルテックスにかけ、激しく混合し、次いで分離が起きるまで５℃で放 置した。ヘキサンおよび抽出カロテノイド類、トコフェロール類、およびレチノ ール類を含む上相(すなわち、残った液体の上に浮いている軽い相)を回収した。 更なるヘキサン２mＬを組織均質物に添加し、混合物をボルテックスにかけ、再 び分離させた。この上相を回収し、最初のものと合わせた。この工程を更に１回 繰り返し、３回目の抽出サイクルにおいて、完全なカロテノイド類、トコフェロ ール類およびレチノイド類の抽出を確実にした。 次いで、合わせたヘキサン抽出物を水１mＬで洗浄し、残った水酸化カリウム を回収した。更なるヘキサンをヘキサン−水混合物に添加し、次いでヘキサン相 （上相）を注意深くピペットで回収した。次いでヘキサンを窒素ガスの一定の流 れの下で蒸発させた。残った残渣は、カロテノイド類、トコフェロール類、レチ ノール類および他の未同定ヘキサン−抽出可能物質が含まれていた。この残渣を 次いで溶媒（メタノール：クロロホルム：トリエチルアミン）に溶解し、上記の ようにＨＰＬＣで分析した。 高強度光暴露後の損傷レベルをまた示す結果を下記表２に列記する。 β−カロテンが記載した餌の鳥から取った網膜から検出されなかったことは注 目すべきである。 表２に列記したこれらの網膜濃度は、フラボバクテリウム・マルチボラム（Ａ ＴＣＣ受託番号５５２３８）に由来する細胞の発酵により製造した経口摂取ゼア キサンチンは、実際、餌添加剤として、食物添加物としてＲ−Ｒゼアキサンチン を投与された試験動物の網膜に堆積した。ＺＸは、通常の方法で消化され、腸障 壁を通過し、血流に入り、鳥の眼の網膜細胞に、網膜細胞を光毒性障害から防護 するために充分な濃度で取り込まれなければならないため、これらは重要な発見 である。これらの障害のすべては、本明細書に記載の細菌発酵性Ｒ−Ｒゼアキサ ンチン製剤により克服された。実施例７：Ｒ−Ｒゼアキサンチンによる網膜の保護 各食餌群の鳥の数匹を、１時間の光、続く２時間のほとんど真っ暗のサイクル を使用した２,０００から３,０００luxの高強度可視光に２８時間付した。光サ イクル期間に続き、鳥を殺す前にほとんど真っ暗に１４時間おいた。この量の高 強度光暴露は、予備試験でカロテノイド欠損群の鳥において一貫してひどい障害 をもたらし、対照(通常の餌)群の鳥において緩和な障害をもたらすことが測定さ れている。予備試験において、光暴露後の１４時間の時間は、非保護(カロテノ イド欠損)鳥における枯死円錐核の最大数を測定するために必要であることがま た測定されていた。 対照餌を食べる鳥は、最大枯死を暴露後約２４時間で示すが、一方ＺＸ添加餌 を食べる鳥は、２４時間より長い時間に最大枯死を示した。障害前の時間の長さ は、それ自体およびそれ自体のためにＺＸの保護効果の強い指標として測定でき る。 これらの鳥の網膜は、微小解剖により単離し、キシレンに固定し、エタノール で脱水しパラプラスト（オックスフォート、５６℃）に埋め込んだ。次いで、パ ラプラスト中の網膜組織を分画し、Ｇallyas 1990の方法にしたがってまたはヨ ウ化プロピジウムで染色し、枯死を特徴付ける核濃縮核を可視化する。４００× （直線）倍の単一顕微鏡視野で見られる核濃縮核の数を計数した。各処置群につ いて少なくとも６から８の別の領域の核を計数し、値を平均化した。 表２の結果は、網膜細胞死亡および障害は：（１）通常対照餌を与えられた鳥 と比較して、低ＺＸ(＋５)濃度でさえ、細菌合成Ｒ−Ｒゼアキサンチンにより、 非常に減少および／または遅延された；（２）高いＺＸ(＋５０)用量により更に 減少された。ＺＸ(＋５０)処置群の網膜における核濃縮核の完全な欠損は、フラ ボバクテリウム・マルチボラム細胞系（ＡＴＣＣ受託番号５５２３８７）由来の Ｒ−Ｒゼアキサンチンは、光毒性障害に対する網膜細胞の保護の劇的および並外 れた飛躍を提供するという注目すべき証拠を提供する。出願人の知識および信念 の限りでは、現在まで試験した他の医薬は、このレベルの保護に到達または近付 きさえしなかった。実施例８：網膜組織保護におけるＲ−Ｒゼアキサンチン対β−カロテンの直接の 比較 上記のように、ＢＣ＋食餌群の鳥は、ＺＸ(＋５０)群のゼアキサンチンの用量 と同じのβ−カロテン（５０mg／餌kg）の用量を食べていた。これは、光毒性障 害に対する網膜細胞の保護の、β−カロテン対ＺＸの直接の比較を可能にした。 結果は、ＢＣ＋群の光毒性障害は非常に少ない差であった(平均で約１０％ま たはそれ以下)。対照群における標準分布と比較して、この減少は統計的に有意 ではない；少ない減少が単に無作為変動によるものであるという確率は０.１２ から０.１４であった。 網膜組織における光毒性障害に対する良好な保護を付与するためのβ−カロテ ンの失敗、一方Ｒ−Ｒゼアキサンチンが細胞障害および死の同じ指標で全１００ ％の減少を付与することは、本発見の重要性を完全に証明する。微生物発酵によ り合成したＲ−Ｒゼアキサンチンは、先に既知の試薬を遥かに上回る大きな飛躍 を付与する。実施例９：吸収を高めるための製剤 ゼアキサンチン含有“ミセル”は、直径が１ミクロン以下であり、望ましいゼ アキサンチンのＲ−Ｒ異性体のみを含有し、Olson 1994記載のように、ある種の 胆汁塩を用いて、実施例３記載のようなバイオマス溶媒抽出物または油状液体の いずれかから得られる。Ｒ−Ｒゼアキサンチン含有の油状液体は、Marcor Devel opment Company of Hackensack,New Jerseyにより販売されているグリコ−また はタウロチコレートのリン酸塩などの適当な胆汁塩と共に、あるいはSalzman Co rporation of Davenport,Iowa販売の胆汁塩の混合物を含有する胆のう抽出物の 使用により混合できる。この胆汁物は溶媒抽出または油状マスのいずれかと共に 、および塩化ナトリウム、塩化カルシウムあるいは塩化カリウムなどの一定の他 の塩と共に混合できる。この混合物は、回転柄などの混合器を有する機械的ホモ ゲナイザーに、通常の実験で最適とされる回転速度および回転時間で、かける。 柄の大きさ、形状、回転速度および時間の様々な複合によってミセルの大きさが 変わってくる。得たミセルから溶媒を除き、必要とあれば、植物油などの担体ま たは希釈液体を用いて、望む濃度に希釈する。この混合物は、服用するのに役立 ち、また胃酸による変性からミセルを保護するカプセルなどに封入される。 小さい粒子径の乳剤を形成するのに、他の乳化剤およリピドを用いることがで きる。ツインおよびスパンなどの非イオン性の洗剤がOlson 1994記載のように用 いることができる。また、ホスフォリヒドおよびスフィンゴリピドなどのリピド 類も用いられ、小さい径（１ミクロン以下）のリピド小胞を形成する。実施例９：ミクロ−カプセル化ゼアキサンチン この実施例はミクロカプセル化形態におけるゼアキサンチン製剤について記載 する。ミクロカプセルは核材（Ｒ−Ｒゼアキサンチンなど）からなる１０−１０ ００μｍの範囲の固体粒子でコーティング物質すなわち外被によってカプセル化 され、ゼラチン、アラビアゴム、でんぷん、ゼイン（トウモロコシからの１種の タンパク質）などの種々の物質からつくることができる。外被材の製造中に、形 状柔軟性、安定性あるいは得る製剤についての望ましい特性を保有するために、 他の化合物を添加し得る。かかる物質には、乳化剤、ソルビトール、ＴＢＨＱま たは２−［１,１−ジメチル］−１,４−ベンゼンジオールなどの抗酸化剤および カラゲーナンなどのゲル化剤がある。 純粋または部分的精製のゼアキサンチンを適当な溶媒、例えばエタノール、ア セトンまたはＴＨＦに溶解する。溶解したＺＸを水に加えることにより溶液中に おいて、直径１０ミクロン以下のミクロ結晶が形成する。この工程は、溶媒中で ゼアキサンチンが結晶化した水をツイン８０などの乳化剤の存在下に高頻度で超 音波処理すると、改善される。 ミクロ結晶が形成されると、外被材を水、ゼアキサンチンおよび溶媒の混合物 に加える。ゼラチンなどの外被材と共に、混合物を６０℃の温度に２時間まで保 持することを要する。外被材が完全に溶けると、結晶を再−乳化するために、全 混合物を５−１０分間超音波器にかける。 ミクロカプセルの形成は、噴霧乾燥、米国特許第４,６７５,１４０のような、 Ｓparks et al法による回転ディスク法などの適当な方法で核および外被材の混 合物を乾燥することにより完了する。噴霧乾燥剤は食品およびえさの工業におい て広く用いられている。回転ディスクは、コントロール条件下である温度で保持 できるディスク（約４”径）からなる機器である。これは、１分間１,０００− １０,０００回転（ｒｐｍ）の範囲の種々な速度で操作される。核と外被材の混 合物は、ディスクが例えば４０００ｒｐｍの速度で回転しているときに、ディス クの中心に加えられる。液体が加熱されている回転ディスクに接触したときに、 ミクロカプセルが形成される。ミクロカプセルは、遠心力によりディスクの中心 から放出され、疎水性でんぷんまたはデキストリンなどの“収集剤”または“捕 獲剤”であらかじめコートされた平たい面に収集される。ミクロカプセルは、光 および空気から保護する容器に入れられて、経口摂取用のカプセルに詰められる まで冷蔵状態で保管される。 ヒト用のＲ−Ｒゼアキサンチンを含有する薬剤を製造する方法、微生物学的に 合成されたＲ−Ｒゼアキサンチンを含有する処方、および黄斑変性の予防および 治療への使用についての新しい有用な手段を記載してきた。本発明はある具体的 実施態様を参考にして、説明および記載の目的で例示されているが、当業者には 説明実施例の多くの変化、置換および類似物が可能であることが明白であろう。 本明細書の教示に直接由来し、本発明の精神および範囲から逸脱しないこのよう な変更は、本発明によりカバーされている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト黄斑変性の治療のための薬剤の製造におけるゼアキサンチンの３Ｓ- ３'Ｒ立体異性体の使用。 ２．薬剤がヒトに投与するのに適した単位用量形態で製造され、かつ、黄斑変 性の患者に医療効果をもたらすのに充分な量のゼアキサンチンを含有し、かつ、 生理的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む、請求項１の使用。 ３．単位用量形態が少なくとも約１ｍｇのゼアキサンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異 性体を含む、請求項２の使用。 ４．黄斑変性の危険性を低下せしめるために、ヒトによる経口摂取に適した栄 養補助剤の製造におけるゼアキサンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異性体の使用。 ５．栄養補助剤がスターガルツ病、ベスト病、バッテン病、スジグレンーラル ソン症候群、コーンロッドジストロフィー、羊セロイド・リポフシノシス、リソ ソーム貯蔵に問題のある疾患または黄斑変性になる可能性が遺伝的に高い疾患の 患者の治療のためである、請求項４の使用。 ６．少なくとも約０.１ｍｇのゼアキサンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異性体を含有 する単位投与形態において、栄養補助剤が製造される、請求項４または５の使用 。 ７．細胞による合成の全カロテノイドの少なくとも９０％のレベルでゼアキサ ンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異性体を合成する細胞を、ゼアキサンチン合成を促進す る条件で、液体培地中で培養することを含む方法により、ゼアキサンチンを製造 する、請求項１−６のいずれかの使用。 ８．ゼアキサンチンの他の立体異性体を検出可能な量では合成することなしに 、細胞がゼアキサンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異性体を合成する、請求項７の使用。 ９．細胞がフラボバクテリウム・マルチホルムの菌株（ＡＴＣＣ寄託番号５５ ２３８）由来の細菌細胞である、請求項５の使用。 １０．フラボバクテリウム・マルチホルムの菌株（ＡＴＣＣ寄託番号５５２３ ８）由来の細胞から得たＤＮＡ配列を含有する、少なくとも一つのゼアキサンチ ン合成遺伝子を含むように、細胞が遺伝子学的に構築される、請求項５の使用。 １１．ヒトの医療上有用な量のゼアキサンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異性体を含有 し、組成物中においてゼアキサンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異性体が全ゼアキサンチ ンの少なくとも約９０％であり、かつ、Ｓ−ＳおよびＳ−Ｒ立体異性体が全ゼア キサンチンの約１０％以下である組成物。 １２．ヒト経口摂取用の担体または希釈剤中に、ヒト黄斑変性の治療または予 防に医療上有用な量でゼアキサンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異性体を含有する組成物 。 １３．組成物中においてゼアキサンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異性体が全ゼアキサ ンチンの少なくとも約９０％であり、かつ、Ｓ−ＳおよびＳ−Ｒ立体異性体が全 ゼアキサンチンの約１０％以下である、請求項１２の組成物。 １４．ゼアキサンチンのＳ−ＳおよびＳ−Ｒ立体異性体を実質的に含有しない 、請求項１２の組成物。 １５．各単位用量形態がゼアキサンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異性体の少なくとも 約０.１ｍｇ含有する、単位用量形態における請求項１１−１４のいずれかの組 成物。 １６．各単位用量形態がゼアキサンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異性体の少なくとも 約１ｍｇ含有する、単位用量形態における請求項１１−１４のいずれかの組成物 。 １７．担体がヒト摂取用の食物材料である、請求項１１−１４のいずれかの組 成物。 １８．ゼアキサンチンが胃中でのゼアキサンチン変性を低下せしめるための保 護コーティング有している、請求項１１−１７のいずれかの組成物。 １９．細菌細胞マスのフラクションとして少なくとも約２重量％の濃度でゼア キサンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異性体を含有する非病原性細菌細胞を含む、請求項 １１−１７のいずれかの組成物。 ２０．細胞による合成の全カロテノイドの少なくとも９０％のレベルでゼアキ サンチンの３Ｓ-３'Ｒ立体異性体を合成する細胞を、ゼアキサンチン合成を促進 する条件で、液体培地中で培養することを含む方法により、ゼアキサンチンを製 造する、請求項１１−１９のいずれかの組成物。 ２１．細胞がフラボバクテリウム・マルチホルムの菌株（ＡＴＣＣ寄託番号５ ５２３８）由来の細菌細胞である、請求項２０の組成物。